influence d'un traitement probiotique (lactobacillus … · en preparation. communications...

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THESE

présentée

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries

Filière : Qualité et Sécurité des Aliments

par

Afifa AIT BELGNAOUI

Influence d’un traitement probiotique (Lactobacillus farciminis) sur les

altérations de la sensibilité viscérale liées au stress : rôle de la barrière

épithéliale colique

Soutenue le 11 décembre 2006, devant le jury :

Pr. P. Ducrotte Rapporteur Pr. M.J. Butel Rapporteur Dr. V. Theodorou Directeur de Thèse Pr C. Roques Membre du jury Dr. L. Bueno Membre du jury Dr. H. Durand Membre invité du jury

Unité de Neuro-Gastroentérologie et Nutrition, INRA Toulouse

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LES TRAVAUX PRESENTES DANS CE MEMOIRE ONT DONNE

LIEU AUX ARTICLES ORIGINAUX ET COMMUNICATIONS

SUIVANTES :

PUBLICATIONS

Ait-Belgnaoui A., Bradesi S., Fioramonti J., Theodorou V., Bueno L. Acute stress-induced hypersensitivity is linked to an increase of colonic paracellular permeability: role of myosin light chain kinase. Pain 2005; 113(1-2):141-47.

Ait-Belgnaoui A., Lamine F., Han W, Eutamene H., Fioramonti J., Bueno L.,

Theodorou V. A probiotic strain (Lactobacillus farciminis) prevents stress-induced increase of colonic permeability and visceral sensitivity to distension in rats. Nutrition Aliment Fonctionnel

Aliment Santé 2005; vol 3 HS: p59-63. Ait-Belgnaoui A., Han W., Lamine F., Eutamene H., Fioramonti J., Bueno L.,

Theodorou V. Lactobacillus farciminis treatment suppresses stress-induced visceral hypersensitivity: a possible action through an interaction with epithelial cells cytoskeleton contraction in rats. Gut 2006; 55(8): 1990-4.

Han W., Mercenier A., Ait-Belgnaoui A., Pavan S., Lamine F., vanSwam I.I.,

Kleerebezem M., Savaldor-Cartier C., Hisbergues M., Bueno L., Theodorou V., Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lacid acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis 2006; 12:1044-1052.

Ait-Belgnaoui A., H. Eutamene, E. Houdeau, Han W., Fioramonti J., Bueno L.,

Theodorou V. Antinociceptive effect of Lactobacillus farciminis on stress-induced visceral hyperalgesia in spinal and supra spinal c-Fos expression. En preparation.

COMMUNICATIONS ORALES

Ait-Belgnaoui A., Lamine F., Han W., Fioramonti J., Bueno L. et Theodorou V. Effet

d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur l’hypersensibilité et l’augmentation de la perméabilité colique induite par un stress aigu chez le rat. XVII

ème réunion annuelle du Club

Français de Motricité Digestive, Honfleur, 19-20 juin 2003. Ait-Belgnaoui A., Lamine F., Han W., Eutamene H., Fioramonti J., Bueno L. et

Theodorou V. Effect of Lactobacillus farciminis treatment on colonic hypersensitivity and increase of paracellular permeability induced by stress in rats. International symposium on

Gastrointestinal motility, Barcelone, 5-8 octobre 2003. Ait-Belgnaoui A., Eutamene H., Houdeau E., Bueno L., Fioramonti J. et Theodorou V.

Un traitement par Lactobacillus farciminis diminue la surexpression spinale de la protéine Fos induite par un stress aigu précédent une distension colorectal chez le rat. Les journées

francophones de pathologie digestive, Paris, 2-6 avril 2005. Han W., Ait-Belgnaoui A., Mercenier A., Larauche M., Theodorou V., Bueno L. et

Fioramonti J. Lactic acid bacteria producing superoxide dismutase abolish stress-induced visceral hyperalgesia an dincrease in paracellular permeability independently of SOD. International symposium on Gastrointestinal motility, Toulouse, 3-6 july 2005.

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Ait-Belgnaoui A., Eutamene H., Houdeau E., Bueno L., Fioramonti J. et Theodorou V. Lactobacillus farciminis treatment decreases stress-induced overexpression of Fos protein in spinal cord after colorectal distension in rats. 13

th United European Gastroenterology week,

Danemark, 15-19 octobre 2005.

COMMUNICATIONS AFFICHÉES Ait-Belgnaoui A., Bradesi S., Fioramonti J., Theodorou V. et Bueno L. Acute stress-

induced hypersensitivity is linked to an increase of colonic paracellular permeability : role of myosin light chain kinase. International symposium on Gastrointestinal motility, Barcelone, 5-8 octobre 2003.

Ait-Belgnaoui A., Lamine F., Han W., Eutamene H., Fioramonti J., Bueno L. et

Theodorou V. Lactobacillus farciminis prevents stress-induced increase colonic permeability and sensitivity to distension in rats : role of nitric oxide. Annual Meeting of the American

Gastroenterological Association, New Orleans, 15-20 mai 2004. Ait-Belgnaoui A., Bradesi S., Fioramonti J., Theodorou V., Bueno L. Acute stress-

induced hypersensitivity is linked to an increase of colonic paracellular permeability: role of myosin light chain kinase. . Annual Meeting of the American Gastroenterological Association,

New Orleans, 15-20 mai 2004. Ait-Belgnaoui A., Lamine F., Han W., Eutamene H., Bueno L., Fioramonti J. et

Theodorou V. Lactobacillus farciminis prevents stress-induced increase of paracellular permeability and sensitivity to distension in rats : role of nitric oxide. Symposium Aliment Santé, 20-21 octobre 2004.

Eutamene H., Lannebere L., Ait-Belgnaoui A., Bueno L., Fioramonti J. et Theodorou

V. Oral vs intracolonic Lactobacillus farciminis treatment differently affects Nippostrongylus

Brasiliensis-induced gut and lung inflammmation in rats. Annual Meeting of the American

Gastroenterological Association, Chigago, 14-19 mai 2005. Holger Sann, Ait-Belgnaoui A., Bueno L. Anti-inflammatory influence of the NK1

antagonist Slv317 on trinitrbenznesulfonic Acid (TNBS)-induced ileitis and colitis in guinea-pigs and rabbits. Annual Meeting of the American Gastroenterological Association, Chigago, 14-19 mai 2005.

Ait-Belgnaoui A., Wei H., Eutamène H., Fioramonti J., Bueno L., Theodorou V. Lactobacillus farciminis diminue l’hyperalgésie viscérale induite par un stress chez le rat en inhibant la contraction MLCK-dépendante du cytosquelette des colonocytes. Les journées

francophones de pathologie digestive, Paris, 18-22 mars 2006.

Ait-Belgnaoui A., Han W., Eutamene H., Fioramonti J., Bueno L. et Theodorou V. Lactobacillus farciminis treatment suppresses stress-induced visceral hypersentivity throught inhibition of colonic cells myosin light chain kinase (MLCK). Annual Meeting of the American

Gastroenterological Association, Los Angeles, 20-25 mai 2006.

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INDEX DES FIGURES

Figure 1 : Composition de la microflore intestinale humaine (Holzapfel et al., 1998) Figure 2 : Lactobacillus farciminis CIP 103136 (coloration Gram) Figure 3 : Les différents ligands des recepteurs Toll-like (Medzitov, 2001.) Figure 4 : Reconnaissance des recepteurs Tool-like 9 (Bauer, 2006) Figure 5 : Les voies de signalisation induites par la fixation des ligands sur les recepteurs Toll-like (Akira, 2003) Figure 6 : Coupe transversale de la paroi du tube digestif Figure 7 : Représentation schématique générale de la structure de l’épithélium digestif Figure 8 : (A) Représentation schématique d’une cellule épithéliale et ces jonctions intercellulaires. (B) Détail de la partie apicale des cellules épithéliales, à la jonction entre deux cellules Figure 9 : Structure des jonctions serrées. Figure 10 : Organisation des complexes protéiques au sein des jonctions serrées (Aktories and Barbieri, 2005). Figure 11 : Image en microscopie électronique de l’ouverture des jonctions serrées par la contraction de l’anneau perijonctionnel d’actino-myosine. (Moriez et al., 2005). Figure 12 : Modèle de régulation des jonctions serrées par le cytosquelette (Turenr, 2000) Figure 13 : Régulation de la perméabilité paracellulaire par Rho. La régulation de la MLCP et de la MLCK par Rho permet une modulation de l’activité contractile de la myosine et de l’ouverture des jonctions serrées (Fukata et al., 2001). Figure 14 : Relation entre intensité et sensation (Gebhart, 1999) Figure 15 : Substances algogènes impliquées dans l’activation/sensibilisation des nocicepteurs. Figure 16 : (A) Entrée des fibres nerveuses dans le système nerveux central (d’après Fields, 1987). (B) Les différences couches de la substance grise médullaire (d’après Rexed, 1954). Figure 17 : Médiateurs et récepteurs identifiés au niveau des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière et impliqués dans la transmission des messages nociceptifs (Bueno et al., 2000). Figure 18 : Voies de la douleur : faisceau spinothalamique latérale et spinoréticulaire Figure 19 : Les différentes voies de la douleur et ses composantes. Figure 20 : Projections cérébrales des voies nociceptives Figure 21 : Schématisation des voies nociceptives et antinociceptives

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Figure 22 : Schéma représentant les voies majeures impliquées dans la médiation de l'anti-nociception descendante (Mayer et Gebhart, 1994). Figure 23 : Modulation de la sensibilité des afférences sensitives (Mac Mahon et al., 2004) Figure 24 : Vue d'ensemble de la régulation neuroendocrinienne et neuro-humorale impliquée dans la réponse au stress (Söderholm et Perdue, 2006). Figure 25 : Distribution cérébrale de la protéine c-Fos induite par différents stimuli. Figure 26 : Mécanismes par lequel le stress favorise le développement d’une hypersensibilité viscérale (Bradesi et al., 2002). Figure 27 : Mécanismes physiopathologique du SII (Kellow et al., 2006). Figure 28 : Protocole expérimentale relatif à l’effet antinociceptif d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur l’étude de l’activité neuronale induite par un stress en réponse à une distension colorectale. Figure 29 : Mécanisme impliqué dans la genèse de l’hyperalgésie viscérale induite par un stress en réponse à une distension (Ait-Belgnaoui et al., 2005). Figure 30 : Mécanisme d’action potentielle de Lactobacillus farciminis sur la barrière épithéliale intestinale.

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INDEX DES TABLEAUX

Tableau 1 : Micro-organismes considérés comme probiotiques (d’après Hozalpfel et al., 1998). Tableau 2 : Quelques souches probiotiques commerciales utilisées en santé humaine. Tableau 3 : Les différents types de jonctions intercellulaires des cellules épithéliales. Tableau 4 : Etudes cliniques récentes testant les effets des préparations probiotiques sur les patients SII. Tableau 5 : Variations du nombre de cellules c-Fos positives activées lors d’un stress en réponse à une distension colorectale après un traitement par Lactobacillus faricminis.

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ABREVIATIONS Caco2 human caucasian colon adenocarcinoma CCK cholecyctokinine CGRP calctonin gene related peptide CMH complexe majeur d’histocompatibilité DAG diacylglycerol DSS dextran sulfate sodium EDTA ethylenediamine tetraacetic acid EIEC Escherichia coli enteroinvasif ENK enkephaline EPEC Escherichia coli enteropathogène GRAS generally regarded as safe GUK guanylnyl kinase-like 5-HT 5-hydroxytryptamine ou serotonine HPA hypothalamic-pituitary-adrenal axis HT-29 human tumor colon adenocarcinoma i.c.v intracérébroventriculaire i.p. intrapéritonéale IASP IgA immunoglobuline A INF interferon JAM junctionnal adhesion molecule LPS lipopolysacharride MDCK Madin-Dardy canine kidney MeA medial amygdaloid nucleus MLC myosin light chain MLCK myosin light chain kinase MP myosin phosphatse NF-κβ nuclear factor κβ NK neurokine NO nitric oxyde NPY neuropeptide Y PAMPs pathogen associated molecular patterns PBMC peripheral blood mononuclear cell PKA/C phosphokinase A/C p-MLC phosphorylated MLC PP2A phospholipase PVN paraventricular nucleus S1-S2 premier et deuxième segment sacré de la moelle épinière

SII syndrome de l’intestin irritable SII-PI SII-post infectieux SNC système nerveux central SNE système nerveux entérique SP substance P TER transepithelial resistance TFI troubles fonctionnels intestinaux TGF transforming growth factor TIRAP toll-interleukin 1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein TLR toll-like recpetor TNBS trinitrobenzen sulfonic acif TNF tumor necrosis factor VIP vaso intestinal peptide ZO zonula occludens

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SOMMAIRE RESUME 1 SUMMARY 2 INTRODUCTION 3 PARTIE 1 : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES 7

CHAPITRE 1 : MICROFLORE INTESTINALE ET PROBIOTIQUES 9 1. MICROFLORE INTESTINALE : UN ECOSYSTEME COMPLEXE 10 1.1. Généralité 10 1.2. Composition de la microflore intestinale 11 1.3. Fonction de la microflore 13 2. LES PROBIOTIQUES 15 2.1. Définitions 15 2.2. Les micro-organismes probiotiques 15 2.2.1. Les bactéries lactiques « alimentaire » 16 2.2.2. Lactobacillus farciminis 18 2.3. Mécanismes d’action des probiotiques 19 2.3.1. « Cross-talk » entre bactéries 19 et bactéries/cellules épithéliales 2.3.2. Maintient de l’équilibre de la barrière intestinale 21 2.3.3. Effet immunomodulateur 22 CHAPITRE 2 : EPITHELIUM DIGESTIF - ANATOMIE FONCTIONNELLE 30 1. DE LA PAROI DIGESTIVE A LA CELLULE EPITHELIALE 31

1.1. Structure pariétale 31 1.2. L’épithélium 32 2. LES JONCTIONS INTERCELLULAIRES 34 2.1. Les cellules épithéliales 34 2.2. Les jonctions serrées 36 2.2.1. Généralités 36 2.2.2. Structure des jonctions serrées 36 2.2.3. Organisation moléculaire des jonctions serrées 37 a) Les protéines transmembranaires 37 b) Les protéines cytoplasmiques 39 2.3. Formation des jonctions serrées 41 2.3.1. La protéines Kinase A (PKA) 41

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2.3.2. Les protéines G 41 2.3.3. Les protéines kinases C (PKC) 42 2.3.4. La famille des Rho GTPase 43 2.4. Régulation fonctionnelles des jonctions serrées par la contraction du cytosquellete 44 2.4.1. La MLCK (myosin light chain kinase) 44 2.4.2. La famille GTPase Rho 46 CHAPITRE 3 : LA DOULEUR VISCERALE 48 1. INTRODUCTION 49 1.1. Définition 50 1.2. Propriété de la douleur viscérale 51 1.3. Nature des stimuli nociceptifs 51 2. MECANISMES PERIPHERIQUES DE LA NOCICEPTION 52 2.1. Les récepteurs à la douleur ou nocicepteurs 52 2.2. Neuromédiateurs de la nociception 53 3. MECANISMES CENTRAUX DE LA NOCICEPTION 54 3.1. Au niveau spinal 54 3.1.1. Trajet des fibres afférentes sensitives viscérales 54 3.1.2. Neurones de la corne dorsale de la moelle épinière 56 3.1.3. Mécanismes de sensibilisation au niveau spinal 57 3.2. Au niveau supra-spinal 60 3.2.1. Faisceaux ascendants et structures supra-spinales de la 60

nociception 3.2.2. Structures corticales 63

4. SYSTEMES ENDOGENES MODULANT LA DOULEUR 64 4.1. Contrôles descendants d’origine supra-spinale 65 4.1.1. Contrôles inhibiteurs descendants 65 4.1.2. Contrôles excitateurs descendants 66 4.2. Modulation au niveau spinal 67 4.3. Modulation au niveau périphérique 68

CHAPITRE 4 : STRESS ET FONCTIONS DIGESTIVES 71 1. PHYSIOPATHOLOGIE DU STRESS 72 1.1. Définition 72 1.2. Physiologie du stress : « le syndrome d'adaptation » 72 1.2.1. L’axe corticotrope 74 1.2.2 L’axe catecholaminergique 79 1.3. La protéine c-Fos activé par le stress 79

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2. STRESS ET ALTERATIONS DES FONCTIONS DIGESTIVES : LES TROUBLES

FONCTIONNELS INTESTINAUX 82 2.1. Généralité 81 2.2. Stress et sensibilité viscérale 83 2.2.1. Nature des effets 83 2.2.2. Mécanismes impliqués 84 2.3. Stress et immunité 85 2.3.1. La composante inflammatoire 85 2.3.2. Mécanismes impliqués dans l’activation

du système immunitaire par le stress 87 2.4. Stress et perméabilité épithéliale 87 2.4.1. Effet du stress sur la perméabilité épithéliale intestinale 87 2.4.2. Mécanismes impliqués dans les altérations 89 de la perméabilité

3. PROBIOTIQUES ET TROUBLES FONCTIONNELS INTESTINAUX 91 3.1. Normalisation de la microflore, effets métaboliques 92 3.2. Effet immunomodulateurs et propriété anti- inflammatoires 92 3.3. Effet neuro-immunomodulateur 93 3.4. Quelques essais thérapeutiques et préventifs 94 PARTIE 2 : OBJECTIFS 97

PARTIE 3 : RESULTATS EXPERIMENTAUX 100 RÉSULTATS 1 101 Acute stress-induced hypersensitivity to colonic distension depends upon increase in paracellular permeability: role of myosin light chain kinase RÉSULTATS 2 110 Lactobacillus farciminis treatment suppresses stress induced visceral hypersentivity: a possible action thought interaction with epithelial cell cytoskeleton contraction RÉSULTATS 3 117 Antinociceptive effect of Lactobacillus farciminis on stress-induced visceral hyperalgesia in spinal and supra spinal c-Fos expression PARTIE 4 : DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSIONS 133 1. Aspect Méthodologique 135 1.1. Le traitement probiotique utilisé 135 1.2. Modèle de stress de contrainte 136 1.3. Modèle de distension coloretale 137

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2. Mécanisme impliqué dans les altérations de la sensibilité viscérale lors d’un stress : rôle de la barrière épithéliale colique 138 3. Influence d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur l’hyperalgésie viscérale induite par un stress : maintient de l’intégrité de la barrière épithéliale 143 3.1. Rôle du monoxyde d’azote 144 3.2. Effet sur la barrière épithéliale colqiue 146 4. Influence de Lactobacillus farciminis sur les voies nerveuses spinales et supraspinales activées lors d’un stress aigu suivi d’une distension colorectale 149 5. Conclusions 152 PARTIE 5 : REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 153

RESUME

1

De nombreuses études précliniques et cliniques plaident en faveur de potentialités thérapeutiques des probiotiques en particulier vis-à-vis des pathologies digestives. Parmi ces pathologies le syndrome de l’intestin irritable (SII) souvent associé à des événements de vie stressants est caractérisé par une hypersensibilité viscérale associé à la distension de la paroi intestinale et une augmentation de la perméabilité intestinale. Bien que quelques études cliniques ont montré une efficacité des traitements probiotiques dans le SII, les effets ainsi que les mécanismes d’action des ces agents microbiens dans les anomalies sensitives viscérales restent très peu étudiés. Ainsi, l’objectif de ce travail était d’évaluer les effets, et les mécanismes d’action impliqués dans un traitement par une souche probiotique Lactobacillus farciminis sur l’hyperalgésie viscérale en réponse à une distension colorectale, induite par un stress aigu (stress de contrainte) chez le rat. Le choix de la souche a été basé sur des études précédentes ayant montré une efficacité d’un traitement par L. farciminis vis-à-vis d’une colite expérimentale et la douleur viscérale associée par un mécanisme d’action impliquant le monoxyde d’azote (NO) libéré par cette souche dans la lumière intestinale. Dans un premier temps nous avons montré que le stress de contrainte induit une augmentation de la perméabilité paracellulaire colique, par contraction du cytosquelette des cellules épithéliales via l’activation de la kinase de chaînes légères de myosine (MLCK) et que cette augmentation est responsable de l’hyperalgésie viscérale induite par le stress. Le traitement par L. farciminis diminue l’hyperalgésie viscérale, l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique et la phosphorylation de la MLC au niveau des colonocytes, induites par le stress. Cet effet antinociceptif implique également une action directe ou indirecte du NO libéré par ce probiotique dans la lumière intestinale. Enfin, nous avons montré que le stress aigu potentialise l’expression de la protéine c-Fos des neurones au niveau spinal et supraspinal induite par une distension colorectale. Le traitement par L. farciminis diminue cette potentialisation. L’ensemble de nos travaux montre que chez le rat, le traitement par L. farciminis diminue l’hyperalgésie viscérale en réponse à une distension colorectale induite par un stress aigu, via une diminution de la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales et l’ouverture des jonctions serrées qui en résulte. Cette effet antinociceptif implique également un mécanisme NO dépendant et résulte d’une diminution de l’activation/sensibilisation des neurones sensitifs au niveau spinal et supraspinal induite par le stress. Mots clés : stress, douleur viscérale, perméabilité intestinale, probiotiques, Lactobacillus farciminis, cellules épithéliales, monoxyde d’azote, MLCK

SUMMARY

2

A large body of literature underlines potential beneficial effect of various probiotic strains in gastrointestinal diseases. Among these diseases, irritable bowel syndrome (IBS) frequently associated with psychological distress is characterized by hypersensitivity to intestinal wall distension and increased intestinal permeability. Despite some clinical evidence on positive effects of probiotics in IBS the role and mechanisms of action of these micro-organisms in visceral pain remains poorly investigated. The goal of this study was to determine the effect and mechanisms of action involved in a probiotic (Lactobacillus farciminis) treatment on visceral hypersensitivity in response to colorectal distension induced by an acute stress (restraint stress) in rats. The use of L. farciminis was based on previous studies showing that this strain improves an experimental colitis and reduces visceral hyperalgesia in colitis rats through the delivery of nitric oxide (NO) by this strain in the gut lumen. In a first part of this study, we have shown that restraint stress increases colonic paracellular permeability resulting from epithelial cell cytoskeleton contraction through myosin light chain kinase (MLCK) activation and this increase is responsible for stress-induced rectal hypersensitivity. L. farciminis treatment prevents stress-induced hypersensitivity, increase of colonic paracellular permeability and colonocyte MLC phosphorylation. This antinociceptive effect involves also a direct or indirect action of NO delivered intraluminally by this probiotic. Moreover we have shown that the restraint stress enhances c-Fos protein expression induced by colorectal distension in a spinal and supraspinal level, and L. farciminis treatment reduces this enhancement. Finally this work shows that L. farciminis treatment in rats, suppresses stress-induced visceral hypersensitivity in response to colorectal distension through an inhibition of the epithelial cell cytoskeleton contraction and the subsequent tight junction opening. This antinociceptive effect involves also a direct or indirect NO-dependent action and results from a decrease in the stress-induced activation/sensitization of sensory neurons at the spinal or supraspinal level. Keywords: stress, visceral pain, intestinal permeability, probiotics, Lactobacillus

farciminis, epithelial cells, nitric oxide, MLCK

- 3 -

INTRODUCTION

INTRODUCTION

4

Les populations occidentales ont connu au cours de deux derniers siècles des

évolutions sans précédent de leur mode de vie en général et de leur alimentation en

particulier. Dans ce paysage et suite à des conséquences négatives de ces évolutions sur

la santé avec l’apparition des maladies dites de civilisation, la réflexion sur la

prévention de la santé devient indissociable de la réflexion sur l’alimentation. En effet,

l’alimentation est susceptible de moduler diverses fonctions de l’organisme, et peut

aussi contribuer à diminuer le risque de certaines pathologies. Ces dernières années

plusieurs études ont été entreprises afin d’évaluer l’impact sur la santé de certaines

composantes de l’alimentation à caractère non nutritionnel telles que les

micronutriments, les prébiotiques et les probiotiques.

La définition des probiotiques a connu des évolutions au cours du temps, les

probiotiques sont généralement définis en tant que micro-organismes vivants exerçant

une action bénéfique sur la santé de l’hôte qui les ingère en améliorant l’équilibre de la

flore intestinale (Fuller, 1991). Bien que les probiotiques représentent seulement une

faible proportion de la masse microbienne du système gastro-intestinal de l’hôte, ils

semblent y jouer des rôles biologiques déterminants par des mécanismes qui doivent

être élucidés. Ils établissent ainsi des interactions avec la barrière intestinale physique

(interactions avec le mucus, action trophique sur la muqueuse, modulation de la

perméabilité paracellulaire) et fonctionnelle (immunomodulation locale et systémique).

D’une manière générale, les probiotiques sont considérés comme des agents

protecteurs vis-à-vis des risques d’apparitions de pathologies digestives. Parmi les effets

les mieux documentés figurent l’effet antidiarrhéique dans le cadre d’une

antibiothérapie (Gill, 2003 ; Surawicz et al., 1989), ou encore l’amélioration des

troubles intestinaux associés à l’intolérance au lactose (Pettoello et al., 1989). Plus

récemment, des études expérimentales et cliniques montrent une efficacité des

traitements probiotiques dans le cadre des colites expérimentales (Matsumoto et al.,

2001) et des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (Gupta et al., 2000 ;

Venturi et al., 1999) respectivement. Parmi les pathologies digestives, les troubles

fonctionnels intestinaux (TFI) sont des pathologies de faible gravité mais de forte

prévalence. Elles affectent environ 20% de la population des pays occidentaux et

concernent 20 à 50% des consultations en gastro-entérologie. Les TFI et en particulier le

syndrome de l’intestin irritable (SII) sont caractérisés par différents symptômes tels que

INTRODUCTION

5

l’alternance de diarrhées et de constipation, des ballonnements et des douleurs

abdominales. De plus, le SII, souvent associé à des événements de vie stressants est

caractérisé par une hypersensibilité viscérale associé à la distension de la paroi

intestinale. Chez l’animal, le stress aigu ou chronique se traduit également par une

hyperalgésie viscérale et des troubles du transit colique (Gue et al., 1997; Bradesi et al.,

2002). Par ailleurs, les études cliniques montrent qu’environ un patient sur trois ayant

présenté une infection bactérienne développe dans les trois mois qui suivent la fin de

l’infection les symptômes du SII, appelé dans ce cas syndrome de l’intestin irritable

post-infectieux (SII-PI). De plus, une augmentation de la perméabilité intestinale a été

décrite aussi bien chez les patients souffrant du SII-PI (Spiller et al., 2000) que les

patients souffrant du SII. Des modifications de la flore fécale des patients souffrant du

SII ont également été mises en évidence, se traduisant par une diminution du nombre de

lactobacilles et des bifidobactéries (Balsari et al., 1982). Bien que la muqueuse

intestinale des patients souffrant du SII ait un aspect « normal » à l’examen

endoscopique et histologique, elle contient un nombre élevé de cellules immunitaires

telles que des lymphocytes T et des mastocytes (Chadwick et al., 2002). Ces cellules

sont susceptibles de libérer des médiateurs activant la composante épithéliale, neuronale

ou musculaire intestinale aboutissant ainsi à des altérations fonctionnelles. L’ensemble

de ces données renforce le concept de l’existence d’un état micro-inflammatoire de la

muqueuse intestinale dans le cadre du SII.

Une application thérapeutique des probiotiques pourrait être envisagée dans le

traitement du SII où des altérations de la barrière intestinale et de la réponse

immunitaire ainsi qu’un déséquilibre de la flore ont été décrits. Ainsi, bien que le rôle

de la microflore ou de ses métabolites sur les anomalies sensitives (dénominateur

commun des TFI) ait été très peu étudié, il pourrait être envisagé que les probiotiques en

palliant les déficiences d’une flore résidente ou aux altérations de la barrière épithéliale

intestinale préviennent l’apparition des TFI et la douleur viscérale. Dans ce contexte, il

semble évident qu’un effort considérable doit être fourni pour la compréhension et la

détermination des mécanismes d’action impliqués dans les effets exercés par les

probiotiques à l’aide des modèles précliniques appropriés, même si la transposition des

résultats à l'homme reste difficile en particulier à cause de la spécificité de l'écologie

microbienne de chaque espèce. De plus, les évaluations des effets exercés par les

INTRODUCTION

6

probiotiques par des études in vitro et in vivo pourrait constituer une approche plus

rationnelle dans la sélection de ces agents microbiens afin de préjuger de leurs

potentialités thérapeutiques.

Notre travail se situe dans la continuité des travaux précédents au laboratoire

ayant montré qu’un traitement par Lactobacillus farciminis diminuait la sévérité d’une

colite expérimentale et la douleur viscérale associée à cette inflammation par un

mécanisme impliquant un métabolite de cette bactérie, le monoxyde d’azote, libéré dans

la lumière intestinale. De plus ces travaux ont permis de valider le statut de

Lactobacillus farciminis en tant qu’agent probiotique en montrant que cette bactérie

partageait d’autres mécanismes d’action (modulation de la flore endogène, diminution

de la perméabilité intestinale et de la translocation bactérienne, modulation du profil

cytokinique) communément attribués aux probiotiques. Ainsi, l’objectif de ce travail

était d’élargir l’évaluation des effets de ce probiotique et des mécanismes d’action

impliqués, dans des conditions non inflammatoires, sur l’hypersensibilité viscérale en

réponse à une distension colorectale induite par un stress aigu chez le rat, en vue de

détermination des potentialités thérapeutiques de ce probiotique dans le SII. Concernant

l’évaluation des mécanismes d’action impliqués, nous nous sommes orientés sur deux

pistes de travail : la possibilité d’une action de ce probiotique sur la barrière épithéliale

colique et la possibilité d’action via la libération du monoxyde d’azote dans la lumière

intestinale par cette souche.

Pour ce faire, notre première partie d’étude a été de déterminer une relation de

cause à effet entre les altérations de la barrière épithéliale intestinale et l’hyperalgésie

viscérale induite par un stress aigu chez le rat ainsi que le rôle de la contraction du

cytosquelette des colonocytes dans ces altérations. Dans un deuxième temps, nous

avons évalué les effets d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur l’hyperalgésie

viscérale induite par un stress aigu ainsi que les mécanismes impliqués, en termes

d’implication du monoxyde d’azote apporté par cette souche dans la lumière colique et

de prévention des effets délétères du stress sur l’intégrité de la barrière épithéliale

digestive. Enfin, la dernière partie de ce travail a été consacrée à l’évaluation de

l’activation des voies spinales et supraspinales impliquées dans l’hypersensibilité

viscérale induite par le stress suite à une distension colorectale et l’influence d’un

traitement par Lactobacillus farciminis sur cette activation.

INTRODUCTION

7

L’ensemble de ce travail vise à apporter un éclairage dans un domaine très peu

exploré à l’heure actuelle qui est l’influence des probiotiques sur les anomalies

sensitives viscérales. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les

effets de Lactobacillus farciminis sur l’hyperalgésie viscérale induite par le stress

renforcera des pistes de valorisation de cette souche dans le cadre des pathologies

digestives telles que le SII. De façon plus générale, l’approche mécanistique concernant

les effets de Lactobacillus farciminis in vivo à l’aide de différents modèles

physiopathologiques, entreprise depuis les six dernières années, permet de consolider le

brevet déposé par l’INRA en 2002 en vue de l’utilisation de cette souche dans la

prévention ou le traitement de pathologies digestives.

8

PARTIE 1

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES

CHAPITRE 1 : MICROFLORE INTESTINALE ET PROBIOTIQUES

9


1. LA MICROFLORE INTESTINALE : UN ECOSYSTEME COMPLEXE

1.1. Généralités

1.2. Composition de la microflore intestinale

1.3. Fonction de la microflore intestinale

2. LES PROBIOTIQUES

2.1. Définitions

2.2. Les micro-organismes probiotiques

2.2.1. Les bactéries lactiques « alimentaires »

2.2.2. Lactobacillus farciminis

2.4. Mécanismes d’action

2.3.1. « Cross-talk » entre bactéries et bactéries/cellules épithéliales

2.3.2. Maintien de l’équilibre de la barrière intestinale

2.3.3. Effet immunomodulateur


10

MICROFLORE INTESTINALE ET PROBIOTIQUES

1. La microflore intestinale : un écosystème complexe

1.1. Généralités

De la naissance à leur mort, les animaux ainsi que l’homme vivent en équilibre

avec une flore microbienne extrêmement dense et variée qu’ils abritent, pour

l’essentiel, dans la cavité de leur tube digestif. La flore microbienne est estimée

numériquement 10 fois supérieure au nombre de cellules de l’organisme (Savage,

1977). Elle représente un écosystème très complexe d’au moins 500 espèces dont 30 à

40 espèces dominantes regroupant 99 % de la flore totale (Tannock, 1999).

L’approche écologique de cette microflore tient compte de plusieurs

écosystèmes microbiens successifs. La composition de cette flore est extrêmement

stable chez un individu sain, mais très variable d’un individu à un autre, en fonction

notamment des habitudes alimentaires. En effet, la flore microbienne forme avec

l’hôte qui l’héberge un écosystème dont l’équilibre dépend de la nature des

interactions entre différents composants : d’une part, des composants biotiques

comme les microbes établis à demeure ou en transit, cellules du tractus intestinal qui

délimitent le biotope et, d’autre part, des composants abiotiques tels que le pH, le

degré d’anaérobiose, la disponibilité de substrats, les sites d’adhérence potentiels des

micro-organismes à l’épithélium ou au mucus, le transit intestinal et les sécrétions

endogènes (salive, sécrétions gastriques, hépatiques et intestinales, cellules issues du

renouvellement de la muqueuse). Changer l’un des éléments de cet écosystème risque

de déstabiliser l’ensemble de toutes les composantes biotiques et abiotiques

interagissant entre elles pour aboutir à un équilibre. Ces mécanismes d’interaction

sont très complexes et bien loin d’être élucidés.


11

1.2. Composition de la microflore intestinale

La composition de la microflore intestinale varie en fonction de l’espèce

animale et de son alimentation (Drasar et Barrow, 1985). La flore normale est définie

par la présence constante de certaines espèces dans l’intestin. Chez un individu donné,

il existe également des variations quantitatives et qualitatives en fonction de la région

intestinale (Drasar, 1974). Si l’on exclut la bouche, directement en contact avec le

milieu extérieur, les populations bactériennes présentes dans la lumière du tube

digestif augmentent progressivement de l’estomac jusqu’aux selles (Figure 1).

Figure 1 : Composition de la microflore intestinale humaine (Holzapfel et al., 1998)

L’estomac contient toujours une flore plus abondante lorsque le pH est élevé

comme chez le rat, le veau ou le porc et plus faible lorsque le pH est acide comme chez

l’homme. En fait, seul les micro-organismes à Gram positif aérobies ou anaérobies

Anaérobies facultatives

à Gram positif

Anaérobies facultatives ou strictes

Anaérobies strictes

à Gram positif et négatif

(101-104 UFC/g)

Lactobacillus

Streptococcus

Levures

Lactobacillus

Enterobacterium

Streptococcus

Bacteroides

Bifidobacterium

(104-108 UFC/g)

Estomac

Duodénum

Jéjunum

Iléon

Côlon

Bacteroides

Bifidobacterium

Clostridium

Enterobactéries Enterococcus

Eubactéries Lactobacillus

Fusobacterium

Peptostreptococcus

(1010-1012 UFC/g)


12

facultatives acidotolérantes sont capables d’y survivre. Cependant, des bactéries

anaérobies strictes résistantes à l’acidité gastrique peuvent s’y implanter, c’est

notamment le cas d’ Helicobacter pylori capable de se loger dans la sous-couche du

mucus. La principale flore résidente de l’estomac est composée de streptocoques et de

lactobacilles.

A l’inverse, l’intestin grêle n’est pas un organe où les bactéries peuvent se

multiplier chez un sujet sain, et constitue une région de transit. Lorsque les bactéries y

prolifèrent, en particulier parce qu’elles possèdent des facteurs leur permettant

d’adhérer à la muqueuse, il s’agit toujours d’un phénomène pathologique. En effet, la

croissance bactérienne dans l’intestin grêle est limitée par le transit rapide, les

bactériocines des cellules de Paneth (Porter et al., 2002) et les sécrétions biliaires et

pancréatiques (Salminen et al., 1998). Les premiers segments de l’intestin grêle

comportent une flore très faible, constituée seulement par les bactéries gastriques en

transit. Au fur et à mesure que l’on se rapproche de l’extrémité distale de l’iléon, une

augmentation importante de la flore en nombre et en variété a été observée (Gorbach et

al., 1967). Ainsi des espèces anaérobies facultatives à Gram négatif (entérobactéries)

apparaissent à côté des espèces à Gram positif.

Les espèces anaérobies strictes augmentent progressivement le long du tractus

digestif. Ainsi, au niveau du côlon, leurs proportions deviennent 100 à 1000 fois plus

abondantes que les espèces anaérobies facultatives. Le côlon est le segment le plus

peuplé (1010 à 1012 bactéries/g de contenu). Les bactéries représentent environ 50 % du

poids sec des selles (Finegold et al., 1983). Un profil bactérien quantitatif et qualitatif

caractérise la flore du côlon de chaque espèce animale. Certains genres bactériens

comme les Bacteroides, Eubactérium, Clostridium, Ruminococcus, Peptostreptococcus

appartiennent communément à la flore dominante de plusieurs espèces animales.

Cependant, le genre Lactobacillus rencontré dans la flore dominante des rongeurs et du

porc, ne se trouve que très occasionnellement dans la flore dominante de l’homme.

Inversement, le genre Bifidobacterium appartenant à la flore dominante chez l’homme

n’est pas répertorié chez les rongeurs.

La microflore fécale est constituée de l’ensemble de micro-organismes qui

provient des différents biotopes du tube digestif. Elle reflète surtout l’équilibre

microbien existant dans les régions caeco-coliques. Les fèces constituent ainsi un


13

écosystème bactérien. Du fait de la facilité de prélèvement, l’écosystème fécal est le

plus étudié chez l’animal et l’homme (Marteau et al., 2001a). Il a été constaté que les

populations anaérobies strictes et facultatives sont co-dominantes dans le côlon

proximal alors que seules les anaérobies stricets sont dominanets dans le côlon distal et

les matières fécales. Par conséquent, les études de l’écosystème bactérien fécal

renseignent particulièrement sur la microflore présente dans la partie terminale du

côlon.

1.3. Fonctions de la microflore colique

La relative stabilité de l’écosystème intestinal suggère la présence de

mécanismes de régulation et de défense propres à l’hôte ou à la microflore résidente.

Ainsi, il apparaît la notion de synergie, de symbiose et de commensalisme entre l’hôte

et sa microflore. L’utilisation de modèles animaux axéniques ou gnotoxéniques

(animaux axéniques inoculés avec des souches bactériennes connues) a permis de

réaliser des progrès considérables dans l’étude des fonctions de la flore du tube digestif

(Ducluzeau et Raibaud, 1980; Raibaud et al., 1980; Romond et al., 1990). Les

populations microbiennes peuvent affecter les fonctions digestives et la physiologie de

l’épithélium intestinal par leur activité métabolique (Roberfroid et al., 1995). En effet,

les bactéries intestinales participent à la décomposition de substances non digérées, en

particulier les glucides alimentaires (fibres, amidons résistants, sucres non absorbés)

(Gibson et Roberfroid, 1995) et de substances endogènes telles que le mucus. Par

exemple, les sucres sont essentiellement transformés en acides organiques et acides gras

à chaîne courte (acétate, propionate et butyrate) (Rumney et Rowland, 1992). Ces

derniers, particulièrement le butyrate, sont absorbés par le côlon et sont utilisés comme

source d’énergie par les colonocytes (Pryde et al., 2002). Le butyrate stimule également

la prolifération des cellules épithéliales et favorise l’absorption du Ca2+, Mg2+ et Fe2+

(Delzenne et Roberfroid, 1994).

Une autre fonction importante exercée par la flore intestinale est la maturation et

la stimulation du système immunitaire de l’hôte. Le système immunitaire local associé à

la muqueuse digestive ainsi que le système immunitaire général sont fortement stimulés

ou parfois inhibés, par certaines bactéries de la flore du tube digestif. Plusieurs études

ont montré que la flore intestinale stimule l’activité phagocytaire (Nicaise et al., 1993),


14

la sécrétion des cytokines par les macrophages (Nicaise et al., 1999), les lymphocytes

intraépithéliaux (Bandeira et al., 1990), ou encore le nombre de plaques de Peyer

(Ducluzeau et Raibaud, 1979). Les bactéries de la flore intestinale modulent donc

l’activité du système immunitaire de façon à établir la tolérance de l’hôte à leur égard et

éviter une réponse contraire à leur implantation. Cette interaction entre le système

immunitaire muqueux et la microflore intestinale maintient cette muqueuse dans un état

« d’inflammation physiologique » contrôlée (Berg et Savage, 1975 ; Shroff et al., 1995).

D’ailleurs, à l’état basal, le micro-environnment intestinal est caractérisé par la présence

de cytokines à fonction immunosuppressive telles que l’IL-10 et le TFG-β produites par

les cellules Th3 (Strober, 1998) les cellules épithéliales, mésenchymateuses et

dendritiques (Fagarasan et Honjo, 2003; de Jong et al., 2002). L’intestin manifeste

naturellement une réponse immunitaire T régulatrice traduisant une prédisposition à

l’induction de la tolérance locale vis-à-vis d’antigènes de l’environnement,

particulièrement ceux d’origine bactérienne (Powrie et al., 1994). La reconnaissance de

la microflore endogène par le système immunitaire de l’hôte se traduit en effet par la

production d’anticorps locaux et systémiques (Apperloo-Renkema et al., 1993). En

atteignant la lumière intestinale, les IgA de la lamina propria exercent une action

protectrice contre les antigènes microbiens (Matsunaga and Rahman, 1998) par

régulation de l’adhésion et la croissance bactérienne (Brandtzaeg et al., 1989).

Différents facteurs endogènes associés à l’hôte, aux bactéries et à

l’environnement contribuent à maintenir la composition et le bon fonctionnement de la

microflore, contrôlant ainsi l’homéostasie intestinale. La physiologie du système

digestif de l’hôte, ainsi que les nutriments endogènes et l’habitat colique interviennent

donc dans la régulation et la stabilité de la microflore. Parmi ces facteurs endogènes, on

retrouve le pH ou le potentiel d’oxydoréduction, les interactions microbiennes, la

muqueuse épithéliale intestinale, le péristaltisme, les sécrétions acides et bilio-

pancréatiques, et la production de mucus (Holzapel et al., 1998). Les facteurs exogènes

tels que la composition du régime alimentaire et des circonstances environnementales

(contamination par des pathogènes, antibiothérapie, chimiothérapie, climat, stress,

hygiène…) peuvent également modifier le fonctionnement et la composition de la

microflore (Mitsuaka, 1989).


15

2. Les probiotiques

2.1. Définitions

Le terme probiotique a bénéficié de plusieurs définitions qui ont évolué dans le

temps en fonction des connaissances scientifiques et des avancées technologiques. La

notion de probiotiques a été développée principalement grâce aux travaux de

Metchnikoff ayant suggéré que l’ingestion de bactéries lactiques vivantes accroît la

longévité en réduisant dans le tube digestif la population de bactéries putréfiantes ou

produisant des toxines (Metchnikoff, 1907). Une des premières définitions des

probiotiques comme « facteurs promoteurs de croissance produits par des micro-

organismes » a été proposé par Lilly et Stillwell en 1965. Ensuite, Parker élargit cette

définition à des « organismes et substances qui contribuent à l’équilibre de la flore »

(Parker, 1974). Cette définition inclut potentiellement des produits métaboliques

microbiens y compris les antibiotiques. Plus tard, Fuller propose une définition très

proche du sens actuel : « supplément alimentaire microbien vivant qui affecte de façon

bénéfique l’hôte en améliorant l’équilibre de sa flore intestinale » (Fuller, 1989). Par

opposition aux précédentes définitions, la définition suivante introduit la notion de

souche définie bien caractérisée d’un point de vue taxonomique ainsi que la notion de

quantité apporté à l’homme. La FAO (Food and Agriculture Organization) et l’OMS

(Organisation modiale de la santé ; WHO) ont établi récemment des lignes directrices

pour l’utilisation du terme « probiotiques » dans les aliments (FAO/OMS, 2002) et

formulent la définition suivante : « micro-organismes vivants qui lorsqu’ils sont

administrés en quantités adéquates, exercent une action bénéfique sur la santé de l’hôte

qui les ingère».

2.2. Les micro-organismes probiotiques

Sont considérés comme probiotiques différentes souches bactériennes ainsi que

les levures. Les bactéries probiotiques sont principalement des bactéries lactiques et des

bifidobactéries (Tableau 1) :


16

Tableau 1 : Micro-organismes considérés comme probiotiques (d’après Hozalpfel et al., 1998).

2.2.1. Les bactéries lactiques

Depuis très longtemps, les bactéries lactiques sont consommées dans les produits

fermentés (produits dérivés du lait, de la viande.et du poisson, le vin, la bière, le pain,

les produits végétaux…). Elles sont devenues les principaux candidats probiotiques et

bénéficient d’un statut GRAS (Generally Regarded As Safe). Concernant les produits

métaboliques, le point commun de ces bactéries lactiques est leur capacité à produire de

l’acide lactique suite à la fermentation des glucides. Elles peuvent être

homofermentaires (70% du produit métabolique est de l’acide lactique) ou

hétérofermentaires (50 % acide lactique complété par d’autres composés tels que l’acide

acétique, le CO2 ou l’éthanol). Les bactéries lactiques se présentent le plus souvent sous

la forme de coques ou de bacilles à Gram positif, non sporulés, non mobiles, négatifs à

la catalase et dépourvus de cytochrome. Elles sont en outre résistantes à l’acide et

aérotolérantes.

Lactobacillus Bifidobacterium Autres bactéries lactiques Autres micro-organismes

L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis Bacillus spp,

L. amylovirus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia coli strain Nissle

L. brevis B. bifidum Lactococcus lactis Propionibacterium freudenreichii

L. casei B. breve Leuconstoc mesenteroides Saccharomyces cerevisae

L. cellobius B. infantis Pediococcus acidilactici Saccharomyces bourlardii

L. crispatus B. lactis Sporolactobacillus inulinus

L. curvatus B. longum Streptococcus thermophilis

L. delbrueckii B. thermophilum Streptococcus diacetylactis

L. farciminis

L. fermentum Streptococcus intermedius

L. gallinarum

L. gasseri

L. johnsonii

L. paracasei

L. plantarum

L. reuteri

L. rhamnosus


17

Les effets bénéfiques attribués aux probiotiques sont nombreux, mais les preuves

confirmant les différentes allégations qui leur sont attribuées nécessitent de plus amples

investigations. Néanmoins, plusieurs études ont abouti à la commercialisation de

probiotiques alimentaires (Tableau 2).

Souches Producteur Produits Allégations Références

Lactobacillus rhamnosus GG Valio Dairy (Finlande) Yaourts à boire Prévention des allergies (Kalliomaki et al., 2003)

Yaourts à boire Traitement des allergies (Majamaa and Isolauri, 1997)

Compléments Stimulation de la production d'IL-10 (Pessi et al., 2000)

alimentaires Diminution de l'incidence des diarrhées (Vanderhoof et al., 1999)

Diminution des diarrhées à rotavirus (Majamaa et al., 1995)

Lactobacillus johnsoni La1 (Lj1) Nestlé (Suisse) Yaourts à boire Inhibition du développement de Helicobacter pylori (Michetti et al., 1999)

Yahourts Stimulation de l'activité phagocytaire (Schiffrin et al., 1997)

Lactobacillus casei Shirota Yakult (Japon) Laits fermentés Diminution des diarrhées infantiles (Nagao et al., 2000)

Yaourts Facilite la digestion de lactose (Marteau et al., 2001b)

Formules infantiles

Compléments

alimentaires

Lactobacillus acidophilus NCFM

Rodhia (Etats-Unis)

Laits fermentés

Yaourts

Formule infantiles

Capsule

Diminution des diarrhées infantiles

Facilite la digestion du lactose

(Sanders and Klaenhammer,

2000)

Lactobacillus plantarum 299v ProViva (Suède) Jus de fruits Prévention des maladies cardiovasculaires (Naruszewicz et al., 2002)

Lactobacillus casei DN-114001

Danone (France)

Yaourts à boire

Stimulation de la production d’IgA

Diminution de l’incidence des diarrhées

(Faure et al., 2001)

(Pedone et al., 2000)

Lactobacillus casei Bb12

Chr. Hansen (Etat-

Unis)

Formules infantiles

Stimulation de la production d'IgA

(Fukushima et al., 1998)

Diminution de l'eczema atopique (Isolauri et al., 2000)

Stimiulation de l'activité phagocytaire (Schiffrin et al., 1997)

Stimulation de la croissance des bébés (Nopchinda et al., 2002)

Modulation de la composition de la flore (Kirjavainen et al., 2002)

Prévention des diarrhées à rotavirus (Saavedra et al., 1994)

VSL#3 (mélanges de 7 souches) CSL (Italie) Compléments Prévention de la pouchite (Gionchetti et al., 2003)

L. casei; L. plantarum; L. acidophilus alimentaires Prévention des rechutes de pouchite (Gionchetti et al., 2000)

L. bulgaricus; B. longum; B. breve;

B. infantis; S. thermophilus

Tableau 2 : Quelques souches probiotiques commerciales utilisées en santé humaine.


18

2.2.2. Lactobacillus farciminis

Lactobacillus farciminis (L. farciminis) est une bactérie à Gram positif, catalase

négative, mobile et asporulée n’appartenant pas à la flore commensale. Il s’agit d’une

bactérie homofermentaire stricte qui fermente les hexoses par la voie d’Embden-

Meyerholf en produisant presque exclusivement de l’acide lactique. Sa température de

croissance est comprise entre 15 et 42°C avec une croissance optimale à 35 °C et à pH

7. Décrite et isolée à partir de saucisses (Reuter, 1970), elle est identifiée et déposée

dans la collection allemande en 1983 sous le nom de Lactobacillus farciminis

(DSM20184). Ce lactobacille naturellement présent dans les saucisses, les produits

carnés et le levain de panification, est utilisé comme additif alimentaire dans l’industrie

agro-alimentaire. A l’heure actuelle, il est disponible dans de nombreuses collections

(DSM 20184, ATCC 29644…), pour nos travaux nous avons utilisé la souche de la

collection de l’institut pasteur : CIP 103136 (Figure 2).

L. farciminis produit du NO in vitro à partir de la réduction des nitrites par une

nitrite réductase (Wolf et al., 1990). Cette propriété est également connue pour d’autres

bactéries. Ainsi, Propionabacterium acidipropionici Pa1 (Avice et al., 1999) et

Lactobacillus fermentum LF1 (Xu et Verstraete, 2001) sont capables de réduire les

nitrates en nitrite et en NO. Ce NO peut aussi être produit indirectement par des

bactéries par une stimulation de la NO synthase inductible de l’hôte (NOSi). C’est le cas

de Lactobacillus GG qui est capable d’activer la NOSi et d’induire in vitro de faibles

Figure 2 : Lactobacillus farciminis CIP 103136 (coloration Gram)


19

niveaux de production de NO. Ceci a été également observé sur des lignées cellulaires

de macrophages murins et des cellules épithéliales coliques humaines stimulées

respectivement par l’INF-γ et des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α)

(Korhonen et al., 2001). Enfin, L. grasseri, L. helveticus, L. reuteri et Bifidobacterium

Bf-1 entraînent une inhibition de la production des cytokines et de NO dans les

macrophages péritonéaux (Tejada-Simon et al., 1999).

Des travaux récemment menés au laboratoire ont montré la capacité de L.

farciminis CIP 103136 à produire du NO in vivo dans la lumière colique (Lamine et al.,

2004a). De plus, ces travaux ont montré qu’un traitement oral par L. farciminis réduit la

sévérité d’une colite expérimentale chez le rat (Lamine et al., 2004a,b) ainsi que

l’hyperalgésie viscérale associée à l’inflammation colique par une implication du NO

délivré par cette souche. Ces travaux ont motivé le dépôt d’un brevet n°020391 en 2002

par l’INRA, intitulé « Utilisation de L. farciminis pour la prévention et le traitement des

pathologies digestives ».

2.3. Mécanismes d’action des probiotiques

Les mécanismes d’action des probiotiques impliqués dans les effets bénéfiques

exercés par ces bactéries sur l’hôte sont complexes, souvent multiples et dépendent de la

souche bactérienne considérée. Les effets des probiotiques sont classiquement attribués

à une modulation direct ou indirecte de la flore endogène ou du système immunitaire

local (Rambaud, 1993). Ceci suggère qu’un contact direct de ces probiotiques avec les

différents constituants de la barrière intestinale, tels que la microflore endogène, le

mucus intestinal, les cellules épithéliales, les immunocytes, est necessaire.

2.3.1. « Cross-talk » entre bactéries et bactéries/cellules

épithéliales

L’existence d’une communication ou encore « cross-talk » entre les probiotiques

et les cellules présentatrices d’antigène de l’intestin, telles que les cellules M, a été

observée par microscopie électronique (Karimi et al., 2003). Cette interaction suppose

que les probiotiques doivent être capables d’atteindre leur lieu d’action en nombre

suffisant, de coloniser et de s’y multiplier afin d’exercer leur effet bénéfique. En effet,

la consommation de probiotiques induit en général une modification transitoire de la


20

microflore endogène. Outre l’augmentation du nombre de cellules viables de la souche

probiotique, les populations totales de lactobacilles et de bifidobactéries sont parfois

modifiées. Par exemple, une consommation de L. casei Shirota (1011 UFC/j/4 semaines)

(Spanhaak et al., 1998) ou de L. plantarum 299v (2x1010 UFC/j/21 jours) (Johansson et

al., 1998) entraîne une augmentation des lactobacilles et des bifidobactéries dans les

selles. De plus, l’adhésion et la colonisation des probiotiques semble être essentielle

pour le contrôle de la croissance de micro-organismes potentiellement pathogènes

d’origine bactérienne, virale ou fongique (Bengmark, 1998). En effet, l’administration

d’un mélange de 19 lactobacilles pendant 10 jours induit une augmentation de

streptocoques et une diminution des clostridies au niveau des biopsies du jéjunum, ainsi

qu’une réduction des bactéries anaérobies Gram positif et des enterobactéries au niveau

de biopsies rectales (Johansson et al., 1993). Une autre étude confirme la diminution

des clostridies dans les selles après consommation de L. plantarum 299v pendant 3

semaines (Johanson et al. 1998). Le principal mécanisme impliqué dans l’inhibition de

bactéries pathogènes est expliqué par l’action de substances anti-microbiennes produites

par les bactéries probiotiques et en particulier lactiques. En effet, cette activité anti-

microbienne a été largement montrée in vivo dans des modèles de souris axéniques ou

conventionnelles infectées par des souches de salmonelles ou d’E. coli (Hudault et al.,

1997 ; Bernet-Camard et al., 1997 ; Coconnier et al., 1997 ; Suzuki et al., 1997 ; Shu

and Gill, 2001 ; Mangell et al., 2002). Il a également été observé que certains

probiotiques réduisent la prolifération des bactéries pathogènes en diminuant le pH

intraluminal et en augmentant la production d’acide gras à courte chaîne (Kruis et al.,

1997).

Certains probiotiques modifient la glycosylation apicale des cellules épithéliales,

ce qui peut être associé à l’inhibition, observée avec certains probiotiques, de

l’adhérence apicale intestinale de divers micro-organismes pathogènes. La colonisation

de la flore conventionnelle de l’intestin est nécessaire à la fucolysation complète des

glycoprotéines des membranes des entérocytes (Bry et al., 1996). Ainsi, il a été observé,

in vitro, que L. casei DN-144 001 modifie la galactosylation à la surface de cellules

épithéliales de lignée HT-29 MTX (Freitas et al., 2003) et par conséquent, inhibe

fortement l’infection de ces cellules par le rotavirus.


21

D’autres probiotiques tels que L. rhamnosus GG, L. acidophilus et B. bifidum ne

dégradent pas les glycoprotéines du mucus intestinal, ce qui serait un gage de leur

sécurité (Ruseler-Van Embden et al., 1995). De plus, certains probiotiques augmentent

l’expression de mucines sur des lignées intestinales humaines, et modifient ainsi la

glycosylation apicale des cellules pouvant être reliée aussi à l’inhibition de l’adhérence

intestinale de certains micro-organismes. Mack et al. ont montré que l’adhésion de L.

plantarum aux cellules épithéliales des lignées HT-29 se traduit par l’augmentation de

la sécrétion extracellulaire de mucines MUC2 et MUC3 (mucines prédominantes de

l’iléon et du côlon) et une inhibition de l’adhésion d’E. coli entéroinvasive (Mack et al.,

1999).

Par ailleurs, d’autres études ont montré que l’ingestion de certaines souches de

lactobacilles ou de bifidobactéries pouvaient modifier de manière reproductible

certaines activités enzymatiques endogènes (Marteau et al., 1993). D’ailleurs, les effets

bénéfiques des probiotiques telles que L. farciminis produisant naturellement du

monoxyde d’azote (Lamine et al., 2004a) ou L. plantarum génétiquement modifié pour

produire des superoxyde dismutases (Han et al., 2006) se traduit par une modification

respective de la concentration d’enzymes (NOSi) ou radicaux libres impliqués dans le

processus d’inflammation colique induite expérimentalement.

2.3.2. Maintien de l’équilibre de la barrière intestinale

Plusieurs souches probiotiques présentent in vitro et in vivo un effet favorable

sur la fonction barrière de l’intestin augmentant ainsi la résistance transépithéliale et

diminuant la perméabilité intestinale. Une réduction de l’augmentation de la

perméabilité intestinale chez la rat a été observée après un traitement par L. reuteri et L.

plantarum dans un modèle de colite expérimentale (Fabia et al., 1993), ou encore par le

cocktail VSL#3 dans le modèle de colite spontanée chez la souris déficiente en IL-10

(Madsen, 2001). De la même façon, L. brevis (Garcia-Lafuente et al., 2001) et L.

rhamnosus GG (Isolauri et al., 1993) réduisent l’augmentation de la perméabilité

induite par des germes bactériens ou des agents viraux.

L’effet des probiotiques sur la résistance transépithéliale est généralement

accompagné par un maintien de l’intégrité fonctionnelle du cytosquelette des cellules

épithéliales intestinales, régulée par les jonctions serrées. L. acidophilus et S.


22

streptococcus vivants préviennent des modifications de la perméabilité induites par les

souches Escherischia coli enteroinvasifs (EIEC) en évitant la déphosphorylation des

protéines de jonctions et du cytosquelette (Resta-Lenert & Barret, 2003). La capacité de

ces probiotiques à prévenir la redistribution de l’actine, de l’occludine et de la ZO-1,

serait en partie liée à la modulation de la voie de signalisation intracellulaire incluant les

MAP-kinases et les Rho-GTPases (Trivedi et al., 2003). La rupture du cytosquelette

d’actine associée à l’adhésion de souches d’E. coli isolées de patients atteints de la

maladie de Crohn est également prévenue par L. GG (Khaled et al., 2003). De même, L.

plantarum exerce un effet bénéfique contre une souche d’E. coli EPEC altérant les

protéines des jonctions serrées (Wonodi & Panigrahi 2003).

Les effets des probiotiques sur l’inhibition de la croissance des bactéries

pathogènes Gram négatif, et sur la stabilisation de la barrière épithéliale sont également

associés à une diminution de la translocation bactérienne. Ainsi chez l’animal, le

traitement par certains probiotiques tels que B. longum (Suzuki et al., 1997) ou S.

bourlardii (Berg et al., 1993) diminue la translocation bactérienne.

2.3.3. Effet immunomodulateur

La plupart des probiotiques stimulent généralement le système immunitaire de

l’hôte de façon non spécifique, en stimulant l’activité phagocytaire et la production

d’immunoglobulines A sécrétoires (IgA), néanmoins quelques études suggèrent une

diminution de la réponse immunitaire de l’hôte (Berg, 1998). En effet, les bactéries

présentes dans la lumière intestinale sont capables d’adhérer aux cellules épithéliales, de

libérer des composés dans la lumière intestinale susceptibles d’être absorbés par

l’épithélium intestinal et d’agir sur les cellules immunitaires (Eckmann et al., 1995).

De nombreuses études in vitro ont montré que les probiotiques stimulent la

sécrétion de cytokines, en activant la réponse de type Th1, par les cellules immunitaires

avec des effets dépendants des souches. Ainsi, S. thermophilus stimule la sécrétion de

cytokines (TNF-α, IL-6), l’intensité de la réponse étant souche et dose-dépendantes

(Marin et al., 1998; Miettinen et al., 1996). De la même façon, chez l’animal et chez

l’homme, certaines études ont confirmé également la capacité de différentes souches de

lactobacilles et de bifidobactéries à entraîner une réponse immunitaire et une activation

de mécanismes de défense non spécifiques. En effet, plusieurs lactobacilles (L.


23

acidophilus, L. casei, L. johnsonii LA1) aussi bien que des bifidobactéries (B. bifidum,

B. lactis) sont capables d’augmenter la phagocytose (Arunachalam et al., 2000;

Perdigon et al., 1988) et par conséquent l’élimination des micro-organismes pathogènes.

Une autre étude menée, chez l’homme, a montré que l’ingestion pendant 3 semaines de

lait fermenté composé de L. johnsonii LA1 et de bifidobactéries entraîne une

augmentation de la production d’ IgA totales et spécifiques chez les sujets sains soumis

à un stimulus infectieux avec Salmonella thyphimurium atténué (Link-Amster et al.,

1994). De même, un traitement par B. lactis ou L. rhamnosus suivi d’un challenge avec

une souche d’E. coli entérohemoragique se traduit chez la souris par une augmentation

d’IgA (Shu et Gill, 2001).

L’immunité innée constitue la première ligne de défense immunologique non

spécifique permettant l’élimination d’un grand nombre des micro-organismes

pathogènes. Certains composés exo ou endocellulaires des micro-organismes

(pathogènes ou non) sont impliqués dans les effets immunomodulateurs et permettent à

l’hôte de discriminer le soi du non-soi. Ces composés sont appelés PAMPs (pathogen-

associated molecular patterns) (Medzhitov et al., 1997). Les PAMPs regroupent des

composants de la paroi cellulaire bactérienne tels que les lipopolysaccharides (LPS), les

peptidoglycanes (PG), les acides lipotéchoïques (LTA) des parois bactériennes, mais

aussi les nucléotides bactériens tels que les motifs CpG non méthylés de l’ADN

bactérien, l’ARN double brin de certains virus, ou encore les mannanes spécifiques des

parois bactériennes. De manière générale, l’hôte distingue les signaux émis par les

micro-organismes grâce à des récepteurs transmembranaires TLRs (Toll-like receptors)

présents sur les cellules épithéliales intestinales et les cellules immunitaires

(macrophages, neutrophiles, cellules dendritiques…) (Beutler et al., 2003).

Actuellement 10 récepteurs de type Toll ont été clonés chez l’homme (Aderem et

Ulevitch, 2000) (Figure 3). Les TLRs induisent l’expression de gènes très variés,

incluant des gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires, des chémokines, des

facteurs anti-microbiens tels que la NO synthase inductible et les peptides anti-

microbiens, des molécules de co-stimulatrices à la surface des cellules présentatrices

d’antigènes, des molécules du CMH et d’autres encore qui permettent d’armer les

cellules de l’hôte contre les pathogènes envahisseurs.


24

Figure 3 : Les différents ligands des recepteurs Toll-like (Medzitov, 2001)

a) TLR4

TLR4 est le premier recepteur TLR a avoir été décrit par Metdzihitov en 1997. Il

joue un rôle essentiel dans la reconnaissance du LPS, composant majeur de la paroi des

bactéries Gram négatives. Les souris C3H/HeJ (possédant une mutation dans le

domaine TIR du gène TLR4) ou B10.ScCR (déficiente pour le gène TLR4) ne

répondent pas à une stimulation par le LPS (Poltorak et al., 1998; Qureshi et al., 1999).

La reconnaissance du LPS par le récepteur TLR4 est complexe et nécessite d’une part

un co-récepeteur, le CD14 (Wright et al., 1999) et d’autre part un transporteur du LPS,

la LBP (LPS Binding Protein) (Wright et al., 1989). La molécule CD14 est également

essentielle pour la reconnaissance du LPS puisque les souris invalidées pour CD14 ne

répondent pas ou peu à la stimulation par le LPS (Moore et al., 2000; Haziot et al.,

1996). Une autre molécule MD2 est aussi impliquée dans la reconnaissnce du LPS en se

liant au recepteur TLR4 (Shimazu et al., 1999).

Outre la reconnaissance du LPS, le recepteur TLR est aussi impliqué dans la

reconnaissance des LTA (Takeuchi et al., 1999), de la proteine HSP60 (Vabulas et al.,

2001) et de la proteiné de fusion du virus respiratoire syncytial (Kurt-Jones et al, 2000).


25

b) TLR2

TLR2 est certainement le recepteur qui reconnait le plus grand nombre de

ligands tels que le pepdidoglycane (Schwandner et al., 1999), les lipoprotéines

bactériennes (Aliprantis et al., 1999), le LPS de Pophyromonas gingivitis (Hirschfeld et

al., 2001) et de Leptospira interrogans (Werts et al., 2001), le lipide

glycosylphosphatidyllinositol de Trypanosoma cruzi (Campos et al., 2001) et le

zymozan, un composé des parois des levures (Underhill et al., 1999).

c) TLR5

Ce recepteur reconnait spécialment la flagelline, un composant des flagelles

bactériennes (Hayashi et al., 2001). Ce recepteur a d’abord été décrit comme étant situé

à la face basolatérale des cellules épithéliales intestinales (Gewirtz et al., 2001)

entraînant ainsi son activation après translocation de la flagelline vers le pôle basal de la

cellule. Cependant, une récente étude a montré que la présence de flagelline sur la face

apicale de cellules épithéliales intestinales induit la sécrétion de cytokines

proinflammatoires (Bambou et al., 2004).

d) TLR9

TLR9 reconnait les motifs CpG non méthylés des ADN bactériens. Ces oligo-

nucléotides sont connus pour stimuler la prolifération des cellules B et pour activer les

macrophages et les cellules dendritiques (Hemmi et al., 2000). Contrairement aux autres

TLRs qui sont membranaires, le TLR9 est exprimé au niveau du réticulum

endoplasmique (Latz et al., 2004). Après activation cellulaire, les TLR9 migrent vers

les compartiments endosomaux et lysosomaux où ils interragissent avec l’ADN CpG

endocytés (Rutz et al., 2004). D’ailleurs, Hacker et al. (1998) a montré in vitro que la

chloriquine et la bafilomycine A1, utilisé comme inhibiteurs de la maturation des

endosomes, préviennent l’activation des recepteurs TLR9 par l’ADN CpG (Figure 4).


26

Figure 4 : Reconnaissance des recepteurs Toll-like 9(Bauer, 2006)

e) Voies de signalisation des TLRs

Les voies de signalisation des TLRs sont complexes et entraînent différentes

réponses biologiques. Le LPS entraîne aussi bien la production de cytokine

inflammatoire, dépendante de protéines adaptatrices MyD88 et TIRAP (TIR domain-

containing adaptater protein), que la secrétion d’IFN-β indépendante de ces protéines.

IFN-β est régulé par la phosphorylation et la translocation nucléaire du facteur de

régulation IRF-3. L’activation des TLR2 par des ligands tels que les lipoprotéines de

mycoplasme ou les peptidoglycanes entraîne aussi la libération de cytokines

inflammatoires par la voie de signalisation MyD88/TIRAP. Néanmoins, la production

de cytokines via les recepteurs TLR5, TLR7 et TLR9 dépend seulement de la protéine

adaptatrice MyD88 (Figure 5).


27

Figure 5 : Les voies de signalisation induites par la fixation des ligands sur les

recepteurs Toll like (Akira, 2003).

Une cascade de signaux intracellulaires conduit ensuite à la translocation nucléaire du

facteur NF-ĸB et résulte de la transcription de gènes modulant l’expression des

cytokines pro-inflammatoires par les lymphocytes, les cellules épithéliales et les

monocytes (Aderem et Ulevitch, 2000).

Les TLR semblent contrôler la balance entre les différentes communautés

bactériennes et expliquent sans doute la capacité du système immunitaire inné à établir

une différence entre les bactéries pathogènes, les bactéries commensales ou encore les

probiotiques. Par exemple, les TLR2 et TLR4 sont faiblement exprimés au niveau des

cellules épithéliales minimisant ainsi la reconnaissance des PAM (Cario et Podolsky,

2000) par ces cellules. Un contact permanent entre les composés bactériens et les

cellules épithéliales se traduit chez ces derniers par un état de « non-réponse » à l’égard

de bactérie. Cette non-réponse ne dépend pas d’un défaut d’expression des TLRs mais

plutôt d’une diminution du nombre de ces récepteurs à la surface des cellules

épithéliales (Otte et Podolsky, 2004).

Les probiotiques pourraient également interagir avec les récepteurs TLRs et

entraîner un effet immunomodulateur. D’ailleurs, il a été montré in vitro sur des co-

cultures de Caco2/PBMC (cellules épithéliales/cellules mononucléées de sang

périphérique) qu’un Escherichia coli humain non pathogène et des lactobacilles

appartenant à la flore commensale humaine induisent la production de cytokines telles


28

que le TGF-β (Haller et al., 2000). En revanche, une stimulation des co-cultures

Caco2/PBMC par des souches d’Escherichia coli entéropathogènes induit la production

de cytokines pro-inflammatoires et se traduit par une inflammation (Haller et al., 2002).

De plus, des souches non virulentes de Salmonella sont capables après leur

reconnaissance d’exercer un effet anti-inflammatoire en bloquant la voie de

signalisation NF-ĸB de cellules épithéliales (Neish et al., 2000).

Peu d’information est disponible concernant le type de TLR impliqués dans la

reconnaissance de probiotiques. Toutefois à l’heure actuelle, seule une reconnaissance

de l’ADN bactérien par récepteurs TLR, ainsi que la conséquence immunitaire ont été

décrite (Hemmi et al., 2000; Martin-Orozco et al., 1999 ). L’ADN bactérien contient

des dinucléotides CpG non-méthylés présentant des propriétés immuno-stimulatrices,

contrairement à l’ADN des cellules eucaryotes (Krieg, 1995). Ce motif CpG non-

méthylé est généralement présent à l’intérieur d’un héxamère palindromique (ISS).

L’ISS-ADN ou son homologue synthétique l’oligodéoxynucléotide (ISS-ODN ou CpG-

ODN) active l’immunité innée via le TLR9 (Krieg, 2002) et s’avère efficace dans le

traitement de différents modèles de colite tels que la colite induite par le DSS chez la

souris, la colite spontanée chez les souris IL-10 déficientes, en réduisant les taux d'IL-1β

et de TNF-α au niveau de la muqueuse colique (Rachmilewitz et al., 2002). Des

résultats similaires ont été obtenus avec l’ADN bactérien du cocktail VSL#3 montrant

l’implication des TLR et plus particulièrement du TLR9 dans l’effet anti-inflammatoire

de ces probiotiques dans la colite au DSS, au TNBS et dans la colite spontanée chez les

souris IL-10 déficientes (Rachmilewitz et al., 2004).

Plus récemment, quelques études se sont intéressées à la reconnaissance des

probiotiques par les cellules dendritiques via les récepteurs DC-SIGN (dendritic cell-

specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin). Le récepteur DC-

SIGN est une lectine de type C qui a été décrite initialement comme spécifique des

cellules dendritiques et pouvant lier la protéine gp120 du VIH (virus immunodéficient

humain) (Curtis et al., 1992). En effet, Smits et al. (2005) ont montré que certains

lactobacilles tels que L. reuteri et L. casei induisaient une réponse cellulaire T

régulatrice associée à une augmentation de cytokines IL-10 via une interaction avec les

récepteurs DC-SIGN. En revanche, L. plantarum ne possède pas ces propriétés

immunorégulatrices. Cependant, cette hypothèse ne prend pas en compte certains


29

facteurs retrouvés in vivo telles que les différences d’adhésion des probiotiques au

niveau des cellules épithéliales, ou encore les changements de la microflore endogène

par des bactéries pathogènes.

CHAPITRE 2 : EPITHELIUM DIGESTIF- ANATOMIE FONCTIONNELLE

30

CHAPITRE 2 : EPITHELIUM DIGESTIF - ANATOMIE FONCTIONNELLE

1. DE LA PAROI DIGESTIVE A LA CELLULE EPITHELIALE

1.1. Structure pariétale

1.2. L’épithélium

2. LES JONCTIONS INTERCELLULAIRES

2.1. Les cellules épithéliales

2.2. Les jonctions serrées

2.2.1. Structure des jonctions serrées

2.2.2. Organisation moléculaire

a) Les protéines transmembranaires

b) Les protéines cytoplasmiques

2.3. Formation des jonctions serrées

2.3.1. La protéines Kinase A (PKA)

2.3.2. Les protéines G

2.3.3. Les protéines kinases C (PKC)

2.4. Régulation des jonctions serrées

2.4.1. La MLCK (myosin light chain kinase)

2.4.2. La famille GTPase Rho


31

EPITHELIUM DIGESTIF - ANATOMIE FONCTIONNELLE

1. De la paroi digestive à la cellule épithéliale

1.1. Structure pariétale

L’ensemble du tube digestif présente une organisation caractéristique (Smith and

Calhoum, 1968) avec, de l’extérieur vers l’intérieur, quatre tuniques successives : la

séreuse, la musculeuse, la sous-muqueuse et la muqueuse (Figure 6).

Figure 6 : Coupe transversale de la paroi du tube digestif

La séreuse est une tunique fine, formée de cellules mésothéliales en continuité

avec le mésentère, recouvrant un tissu lâche, et adhérant de façon intime à la


32

musculeuse sur les faces et le bord libre du conduit. Cette disposition est favorable aux

changements de diamètre que présente l’intestin dans son fonctionnement.

La musculeuse est constituée de fibres musculaires lisses disposées en deux

couches : une longitudinale externe et une circulaire interne. Entre les couches circulaire

et longitudinale s’insère le plexus nerveux myentérique ou plexus d’Auerbach.

La sous-muqueuse se compose d’un tissu conjonctif lâche à fibres de collagène

et quelques fibres élastiques, permettant le glissement de la muqueuse par rapport à la

musculeuse. Elle abrite un riche réseau artériel, veineux et lymphatique, ainsi qu’un

important plexus nerveux sous-muqueux ou plexus de Meissner.

La muqueuse diffère considérablement d’un segment intestinal à l’autre,

reflétant ainsi des activités fonctionnelles différentes. Elle est constituée de trois

couches successives:

• la muscularis mucosae (musculaire muqueuse), constituée de deux couches

musculaires minces orientées de façon longitudinale puis circulaire

• la lamina propria, composé d’un tissu conjonctif fin et réticulé, chargé en

lymphocytes et en polynucléaires éosinophiles, les lymphocytes s’y accumulant souvent

sous forme de nodules.

• l’épithélium de type monostratifié

Tous les éléments de la lamina propria et de la muscularis mucosae se prolongent dans

les villosités dont elles constituent le support axial.

1.2. L’épithélium

L’épithélium monostratifié est un mince revêtement qui s’étale sans interruption,

aussi bien sur les villosités, que dans les glandes de la muqueuse. Il est constitué d’une

seule assise d’entérocytes, entre lesquels s’intercalent, en nombre plus restreint, les

cellules caliciformes à mucus, les cellules entérochromaffines, les cellules endocrines

sécrétrices, et les cellules de Paneth exocrines. L’épithélium peut être subdivisé en deux

compartiments morphologiquement et fonctionnellement distincts :

• les cryptes, invaginations de l’épithélium, contenant les cellules souches, les

cellules en prolifération et les cellules de Paneth.

• les villosités, évaginations de l’épithélium, constituées de cellules différenciées.

En effet, les cellules des cryptes qui étaient en prolifération (à l’exception des cellules


33

de Paneth qui sont différenciées et restent au niveau des cryptes) cessent de se diviser et

se différencient au niveau de la jonction crypto-villositaire. Les cellules migrent au

sommet des villosités pour être exfoliées.

L’épithélium colique présente des cryptes plus profondes et, à ce niveau, les

villosités ont disparu, les plaques de Peyer se font rares et les cellules à mucus

constituent alors la population majoritaire. (Figure 7).

Figure 7 : Représentation schématique générale de la structure de l’épithélium digestif

Cet épithélium possède une capacité de prolifération et de différenciation

cellulaire importante. En effet, son renouvellement s’effectue en 2-3 jours chez le rat et

en 4-5 jours chez l’homme. Le renouvellement de l’épithélium se fait à partir de cellules

souches (Gordon et Hermiston, 1994). Ces cellules souches pluripotentes n’ont pas

encore été identifiées. Elles se divisent soit de façon symétrique (10% des cas) génèrant

deux cellules souches, soit de façon asymétrique (90% des cas). La division

asymétrique donne naissance à une nouvelle cellule souche et à une cellule qui entre en

phase active de prolifération puis de différenciation. Les contrôles mis en jeu dans la

crypte

villosité


34

régulation de la division sont encore inconnus (Potten et Loeffler, 1990). La division

cellulaire est ensuite suivie d’une migration et d’une différenciation des cellules le long

de l’axe crypto-villositaire. Les travaux de Cheng et Leblond (1974) ont montré que les

cellules souches sont à l’origine des quatre types cellulaires présents dans l’épithélium

digestif.

Ces cellules différenciées sont polarisées et liées entre elles par des systèmes de

jonctions inter-cellulaires. Les interactions cellules–cellules ou cellules-protéines de la

lame basale activent, via des récepteurs spécifiques (cadhérines ou intégrines), des voies

de signalisation responsables de la transcription de gènes de la prolifération et de la

différenciation cellulaire. Certains de ces réseaux d'interactions sont activés

spécifiquement au cours du développement ou le long de l'axe des cryptes chez l'adulte.

Toute dérégulation d'un des éléments de la cascade peut réactiver ou inhiber ces voies et

aboutir au développement de tumeurs.

2. Les jonctions intercellulaires

2.1. Les cellule épithéliales

L’épithélium intestinal est représenté par des enterocytes tapissés de

microvillosités (environ 600 à 2000 par cellules), ce qui augmente la surface

d’absorption de la muqueuse intestinale. Ces microvillosités sont soutenues par une

armature centrale de microfilaments qui s’insère dans la barre terminale. Sur chaque

microvillosité s’insèrent des atténules constituant le glycocalyx (ou fuzzy coat), chaînes

glucidiques de glycoprotéines et de glycolipides situées à la surface de la membrane.

La structure de ces molécules leur permet de reconnaître un très grand nombre de

signaux, tels que les hormones, bactéries, toxines et virus, de capter l’information et de

les transmettre à l’intérieur de la cellule. A cet ensemble très actif viennent s’ajouter

des enzymes hydrolysantes comme les disaccharidases, les peptidases, les phosphatases

alcalines. Les cellules épithéliales présentent une distribution très asymétrique des

composants de leur cytoplasme (pôle basal et apical) et de leur membrane basolatérale

et apicale. Les cellules épithéliales interagissent fortement entre elles par

l’intermédiaire de système de jonctions intercellulaires. Celles-ci permettent de

maintenir une cohérence mécanique et chimique et de favoriser la communication entre

les cellules, c’est là que se trouve la véritable frontière entre la lumière intestinale et le


35

milieu intérieur. Les dispositifs de jonctions intercellulaires peuvent être, soit très

localisés, en forme de pastille (macula), soit diffus entourant l’ensemble de la cellule

(zonula) (Figure 8).

Figure 8 : (A) Représentation schématique d’une cellule épithéliale et ces jonctions intercellulaires

(B) Détail de la partie apicale des cellules épithéliales, à la jonction entre deux cellules

Il existe quatre types de jonctions intercellulaires différentes, caractérisées par une

structure protéique et des fonctions spécifiques et en général une connexion avec un

élément précis du cytosquelette pour assurer la solidité mécanique du système (Tableau

3).

Nom Largeur Cytosquelette Rôle

Desmosomes / Hémidesmosomes (Macula adherens)

25 à 35 nm Filaments intermédiaires chez les vertébrés Microtubules chez les

invertébrés.

Solidité mécanique et répartition des forces dans les épithéliums

Jonctions intermédiaires (Zonula adherens)

25 à 35 nm Actine-myosine Cohésion des tissus épithéliaux et rôle

morphogénétique

Jonctions serrées / Tight Junctions

(Zonula occludens) 0 Actine-myosine

Assure l'étanchéité des épithéliums entre deux compartiments tissulaires

Jonction communicantes / Gap

junctions (Macula occludens)

2 nm (vertébrés)

4 nm (invertébrés)

Aucun Assure la communication entre le

cytoplasme de deux cellules, couplage électrique entre cellules

Tableau 3: Les différents types de jonctions intercellulaires des cellules épithéliales

Barre terminale Adherens junctions

Glycocalyx

Membrane apicale

Filaments centraux

Membrane latérale

Tight junctions

Microvillosité

Desmosomes

Membrane apicale B A

Adherens junctions

Desmosomes

Tight junctions

Hémidesmosomes Membrane basale


36

2.2. Les jonctions serrées

2.2.1. Généralités

Les jonctions serrées sont localisées au pôle apical des cellules épithéliales. Ces

jonctions sont encore appelés Zonula Occludens (ZO) parce qu’elles forment un anneau

ceinturant le pourtour de la cellule, permettant une occlusion complète de l’espace

intercellulaire. Les jonctions serrées forment une barrière sélective régulant le passage

des ions et molécules à travers l’espace paracellulaire en empêchant les protéines et les

lipides de la membrane apicale de diffuser dans la membrane basolatérale, et

inversement, elles contribuent également au maintien de la polarité cellulaire. Ces

jonctions serrées se caractérisent par une complexité structurale en formant un

échafaudage macromoléculaire composé de protéines membranaires et cytoplasmiques

essentielles au maintien de l’adhérence cellule-cellule et au contrôle de la prolifération

et de la polarité cellulaires.

2.2.2. Structure des jonctions serrées

Les jonctions serrées se présentent en microscopie électronique comme une série

de particules fibrillaires intramembranaires ou plages jonctionnelles anastomosées. Le

nombre de plages et leurs ramifications sont dépendants du type cellulaire, produisant

une variation de morphologie des jonctions serrées. Chaque plage jonctionnelle est

associée avec la membrane plasmique et avec une autre plage jonctionnelle sur la

membrane opposée des cellules adjacentes pour former un espace intercellulaire

anastomosé (Figure 9).

Figure 9 : Structure des jonctions serrées. (a) image de microscopie électronique en cryofracture de cellules

épithéliales intestinales. Les jonctions serrées apparaissent comme un réseau de fibrilles anastomosées (tête de

flèches) avec une partie complémentaire (flèches). (Mv : microvillosité, Ap : membrane apicale, Bl : membrane

basolatérale). (b) vue transversale d’une jonction serrée. Au point d’encrage l’espace intracellulaire est nul (tête de

flèche). (c) représentation schématique des jonctions serrées.


37

2.2.3. Organisation moléculaire des jonctions serrées

Sur le plan moléculaire, on retrouve au niveau de la partie transmembranaire : de

l’occludine, des claudines et les JAM (Junction Adhesion Molecule). Les protéines

membranaires constituent le noyau de l’échafaudage moléculaire relié à une multitude

de protéines cytoplasmiques. Les trois types de molécules qui participent donc à la

formation des jonctions serrées sont :

• des protéines transmembranaires qui interagissent avec d’autres molécules

transmembranaires situées en vis-à-vis.

• des protéines d’attachement intracellulaire qui forment une plaque cytoplasmique

• des molécules du cytosquelette qui s’insèrent sur les protéines de la plaque.

a) Les protéines transmembranaires

Les occludines

Les anticorps dirigés contre l’occludine se fixent exclusivement au niveau des plages

jonctionnelles. L’intensité de l’immuno-coloration est corrélée avec le nombre de plages

jonctionnelles, la densité de molécules d’occludine par plage est constante (Saitou et al.,

1997). Les plages jonctionnelles peuvent aussi se former sans l’occludine dans certains

types cellulaires, dont les cellules endothéliales non cérébrales et les cellules de Sertoli

(Hirase et al., 1997; Moroi et al., 1998). Bien que de nombreuses études menées sur les

cellules épithéliales en culture aient indiqué l’importance de l’occludine dans la

fonction de barrière des jonctions serrées, son rôle n’est pas encore clairement établi.

Cependant, les souris déficientes pour le gène codant pour l’occludine sont viables,

possèdent des jonctions serrées, mais elles présentent une inflammation gastrique

L’occludine est une des premières protéines jonctionnelles

identifiée (Ando-Akatsuka et al., 1996). Elle est formée de

quatre domaines transmembranaires, un long domaine

cytoplasmique carboxy-terminal et un domaine amino-

terminal plus court et également cytoplasmique


38

chronique et une hyperalgésie. (Saitou et al., 2000). L’occludine peut se lier à plusieurs

protéines « signal », et leur fonction principale peut être le recrutement et la

coordination des voies cellulaires des jonctions serrées. Par exemple, sa liaison aux

récepteurs TGF-β (transforming growth factor- β), localisés au niveau des jonctions

serrées entraîne leur désorganisation structurale des jonctions avec une transformation

de la cellule épithéliale en cellule mésenchymateuse (Barrios-Rodiles et al., 2005).

Les claudines

A ce jour, 24 membres de cette famille ont été identifiés chez la souris et chez l’homme

(Morita et al., 1999a; Tsukita and Furuse, 1999). Les claudines sont exclusivement

localisées au niveau des plages jonctionnelles dont elles forment l’armature (Morita et

al., 1999a; Morita et al., 1999b; Morita et al., 1999c). L’expression exogène de

claudines entraîne une agrégation avec ces protéines au niveau des points de contact

cellule-cellule (Kubota et al., 1999) en formant un réseau protéique ressemblant aux

jonctions serrées (Furuse et al., 1998). L’occludine seule ne peut pas reconstituer des

plages bien organisées mais, lorsqu’elle est transfectée au niveau de cellules exprimant

les claudines, elle est incorporée dans les plages reconstituées par la claudine.

Le type de claudine exprimé varie considérablement suivant le type de tissu

(Furuse et al., 1998; Morita et al., 1999a). Certaines claudines sont spécifiques d’un

type cellulaire, par exemple la claudine 5 est exprimée au niveau des cellules

endothéliales (Morita et al., 1999b) et la claudine 11 au niveau des oligodendrocytes et

des cellules de Sertoli (Morita et al., 1999c). La plupart des types cellulaires expriment

plusieurs types de claudines qui forment, au niveau des plages jonctionnelles, des

hétéropolymères s’associant avec ceux de la cellule voisine de manière homotypique ou

hétérotypique (Furuse et al., 1999; Tsukita and Furuse, 2000). Les claudines sont donc

Les claudines présentent quatre domaines

transmembranaires mais ne possèdent aucune séquence

commune avec l’ occludine (Furuse et al., 1998).


39

capables de se polymériser et de former des pores qui permettent une diffusion sélective

des ions et des molécules à travers l’espace paracellulaire. La perméabilité sélective de

ces pores dépend de la concentration et le type de claudine exprimé par les cellules

épithéliales (Tsukita et Furuse, 2002).

Les molécules d’adhésion jonctionnelles (JAM)

Les JAM s’associent latéralement à la claudine et sont impliquées dans l’adhésion

cellule-cellule mais aussi dans l’extravasation des monocytes à travers l’endothélium

(Bazzoni et al., 2000; Liu et al., 2000; Martin et al., 1975; Palmeri et al., 2000).

Contrairement aux claudines et à l’occludine, JAM est exprimé dans les plaquettes et les

leucocytes.

b) Les protéines cytoplasmiques

Les protéines membranaires (occludines, claudines et JAM) constituent le noyau

de l’échafaudage moléculaire relié à une multitude de protéines cytoplasmiques citées

ci-dessus.

Les protéines zonula occludens (ZO)

La première protéine cytoplasmique identifiée en association avec les jonctions

serrées est la protéine ZO-1 (Zonula Occludens -1) (Stevenson et al., 1986). ZO-1 co-

immunoprécipite un lysat de cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney) avec deux

autres protéines ZO-2 et ZO-3, ces deux protéines étaient, elles aussi, associées aux

Les trois types de JAM appartiennent à la superfamille

des immunoglobulines : elles possèdent un seul domaine

transmembranaire et leur partie extracellulaire possède

deux domaines immunoglobulin-like (Palmeri et al.,

2000).


40

jonctions serrées et ont été nommées ZO-2 et ZO-3 (Balda et al., 1993; Gumbiner et al.,

1991) (Figure 9). Ces protéines ZO possèdent des séquences communes : 3 domaines

PDZ (PDS 95: Post Synaptic Density 95, Dig : disc large, ZO), un domaine SH-3

(sequence homology 3) et un domaine GUK (guanylyl kinase-like). Le domaine PDZ se

lie à des séquences de quatre acides aminés se terminant par une valine. A l’exception

de la claudine 12, toutes les claudines possèdent au niveau de leur extrémité

carboxyterminale une séquence valine et peuvent se lier au domaine PDZ présent sur les

protéines ZO (Furuse et al., 1998; Morita et al., 1999). Ainsi, ZO-1, ZO-2 et ZO-3 se

lient directement aux claudines par l’intermédiaire de leur domaine PDZ1. Elles se lient

également à l’occludine, mais ni leur domaine GUK, ni leur domaine PDZ ne sont

impliqués dans cette interaction (Fanning et al., 1998; Furuse et al., 1994; Haskins et

al., 1998). Les ZO sont recrutées au niveau des jonctions serrées chez des souris

déficientes pour le gène codant pour l’occludine suggérant que la liaison avec

l’occludine n’est pas essentielle pour leur localisation peri-jonctionnelle (Itoh et al.,

1999; Saitou et al., 2000). Les JAM concentrées en périphérie des plages jonctionnelles

peuvent également se lier aux protéines ZO (Bazzoni et al., 2000; Ebnet et al., 2000) et

à d’autres molécules possédant un domaine PDZ (Martinez-Estrada et al., 2001).

(Figure 10).

Figure 10: Organisation des complexes protéiques au sein des jonctions serrées

(Aktories et Barbieri, 2005).

Adherens junction

Tight junction

Desmosome

Gap junction


41

Comme les filaments d’actine se lient à la portion C-terminale de ZO-1 et de

ZO-2 (Fanning et al., 1998; Itoh et al., 1997; Itoh et al., 1999), ce complexe permet de

relier le cytosquelette aux jonctions serrées, cette interaction a un rôle prépondérant

dans la régulation des jonctions serrées.

Par conséquent, les protéines à domaine PDZ sont des adaptateurs moléculaires

permettant la liaison de diverses protéines membranaires au cytosquelette d’actine ou à

des protéines régulatrices (Rab 13, Cdc 42, cinguline, symlekine, PKCa, ZONA B,

huASH1 ou SAF-B).

2.3. Formation des jonctions serrées

Les voies de signalisation intracellulaire qui régulent l’assemblage et les

fonctions des jonctions serrées ont été récemment étudiées et le modèle le plus utilisé

est celui de la cellule épithéliale en culture MDCK (Madin-Darby canine kidney). Dans

ce modèle cellulaire l’établissement de contact cellule-cellule se fait d’abord par le biais

de l’E-cadhérine dépendante du calcium et ensuite un complexe jonctionnel constitué de

protéines des jonctions adhérentes et serrées se met en place (Behrens et al., 1985;

Gumbiner et Simons, 1986). Plusieurs voies de signalisation permettant l’assemblage

des jonctions serrées ont été mises en évidence et font intervenir les protéines de

signalisation suivantes:

2.3.1. La protéine Kinase A (PKA)

La stimulation de la PKA prévient la perte de structure des jonctions serrées

induite par un anticorps dirigé contre la E-cadhérine ou par le blocage des mouvement

calciques (Balda et al., 1991; Behrens et al., 1985). Les effets de la PKA sur les

jonctions serrées et la perméabilité sont controversés ; ils seraient dépendants du

stimulus et de la réponse croisée avec une autre voie de signalisation.

2.3.2. Les protéines G

Le traitement des cellules épithéliales par la toxine pertussique indique que

l’inhibition de Gi/G0 stimule l’assemblage des jonctions serrées (Balda et al., 1991). De

plus la protéine Gαi2 est retrouvée au niveau des jonctions et est colocalisée avec ZO-1

(De Almeida et al., 1994; Denker et al., 1996). Néanmoins, la sous-unité αi peut aussi


42

stimuler l’assemblage des jonctions serrées (Denker et al., 1996). Similairement à la

PKA, cette contradiction entre les études pharmacologiques et les études de transfection

n’est pas claire mais pourrait être due à l’inhibition par la toxine pertussique de

différentes protéines Gαi/α0. L’implication de différentes protéines Gαi dans la

régulation des jonctions est renforcée par une étude récente mettant en évidence que

l’expression de Gαi2 augmente la perméabilité paracellulaire par l’intermédiaire de ZO-

1 (Meyer et al., 2002).

2.3.3. Les protéines kinases C (PKC)

La famille des PKC sérine/thréonine kinase est divisée entre les classiques

(cPKC), les nouvelles (nPKC) et les atypiques (aPKC). Les isoformes α, β et γ des

cPKC et les isoformes δ, ε, η et θ des nPKC sont activées par le diacylglycérol (DAG),

la phosphosérine et les esters de phorbol. A l’inverse des nPKC, les cPKC ont besoin du

calcium pour être activées. Les aPKC (ζ, λ, et PRK, « PKC-related kinase ») sont

insensibles au calcium et ne répondent pas aux esters de phorbol (Mellor et Parker,

1998).

L’activation des nPKC et des cPKC par l’ester de phorbol provoque une perte de

structure des jonctions serrées de différentes lignées cellulaires, tandis que l’inhibition

des PKC bloque cette perte de structure des jonctions serrées. En fait, l’activation

transitoire des PKC est importante dans les propriétés dynamiques des jonctions (Balda

et al., 1991; Citi et al., 1994; Nigam et al., 1991). L’activation des PKC par le DAG

joue également un rôle central dans la régulation des jonctions. En effet, l’injection

intracellulaire d’un analogue du DAG, le dioctanoyl-glycérol, stimule partiellement

l’assemblage des jonctions serrées quand l’adhésion des cellules entre elles par la E-

cadhérine est bloquée (Balda et al., 1993).

Il a été montré que les aPKC forment un complexe avec la protéine Par-3 ou

ASIP, « PKC isotype-specific interacting protein » et Par-6 (Izumi et al., 1998; Tabuse

et al., 1998). Les protéines JAM servent de point d’ancrage à Par-3 permettant ainsi le

recrutement du complexe Par-6/Par-3/PKC au niveau des jonctions serrées (Ebnet et al.,

2000). La formation du complexe aPKC-Par3-Par6 au niveau des jonctions serrées est

important pour leur formation des jonctions et la polarisation des cellules épithéliales

(Joberty et al., 2000; Lin et al., 2000; Suzuki et al., 2001). Par-6 se lie également à


43

Cdc42 (GTPase de la famille Rho) qui est essentielle pour la polarité cellulaire

(Kroschewski et al., 1999) et permet de réguler l’activation du complexe aPKC/Par-

3/Par-6 nécessaire pour promouvoir la maturation des jonctions serrées fonctionnelles.

La aPKC est négativement régulée par la protéine phosphatase 2A (PP2A) qui la

déphosphoryle. L’expression de la sous-unité catalytique PP2A dans les cellules MDCK

provoque la déphosphorylation des protéines des jonctions serrées ZO-1, occludine et

claudine-1, et inhibe l’assemblage des jonctions serrées. Inversement, l’inhibition de

PP2A par l’acide okadaïque stimule la phosphorylation et le recrutement des protéines

ZO-1, occludine et claudine-1 au niveau des jonctions serrées (Nunbhakdi-Craig et al.,

2002). Ces études mettent en évidence le rôle des épisodes de

phosphorylation/déphosphorylation, via la aPKCa et la PP2A, dans l’assemblage et

désassemblage des jonctions serrées.

2.3.4. La famille des Rho GTPase

Trois types de GTPase sont liés de manière fonctionnelle ou physique aux

jonctions serrées : Ras, Rab et la famille des Rho. La fonction des protéines Rab liées

aux jonctions serrées n’est pour l’instant que très peu renseignée (Zahraoui et al., 2000).

Néanmoins comme les Rab, elles régulent le transport membranaire et pourraient jouer

un rôle au niveau de l’assemblage des jonctions ou de leur régulation au cours du

transport membranaire (Marzesco et al., 2002; Yeaman et al., 1999).

La famille des protéines Rho est impliquée dans la formation des jonctions et

dans la régulation de la perméabilité paracellulaire sélective. La microinjection de

transférase C3 (une toxine inhibitrice des Rho) inhibe la formation de jonctions serrées

(Nusrat et al., 1995; Takaishi et al., 1997). Lorsque RhoA est activée dans les cellules

MDCK après la transfection du récepteur aux prostaglandines couplé à une protéine G,

une diminution de la perméabilité ionique et une augmentation de la perméabilité

paracellulaire sont observées (Hasegawa et al., 1999). En revanche, l’expression de la

forme active de RhoA et Rac1 altère les fonctions des jonctions serrées. Elle provoque

dans les cellules MDCK, la désorganisation et une redistribution anarchique de

l’occludine et de ZO-1 (Braga et al., 1999; Jou et al., 1998). La régulation des jonctions

serrées par les Rho varie ainsi en fonction du type cellulaire et/ou du stimulus qui induit

la réponse (Braga et al., 1999). Etant donné le rôle crucial de Rho et de Rac dans la


44

dynamique du cytosquelette et l’importance de ce dernier dans l’établissement et le

maintien de l’intégrité des jonctions serrées, il est probable que ces deux protéines (Rho

et Rac) modulent localement le réseau d’actine-myosine requis pour l’immobilisation de

complexes macromoléculaires au niveau des jonctions serrées.

2.4. Régulation fonctionnelle des jonctions serrées par la contraction du

cytosquellette

2.4.1. La MLCK (myosin light chain kinase)

Les jonctions serrées de la barrière épithéliale intestinale sont en continu sous le

contrôle de différents facteurs exogènes ou endogènes comme la microflore,

l’alimentation, les enzymes digestives et plus particulièrement protéolytiques secrétées

dans la lumière. De nombreuses études expérimentales ont mis en évidence

l’importance de ces facteurs extracellulaires dans la régulation de l’intégrité de la

barrière épithéliale mettant en avant plus particulièremetnt le rôle de la kinase des

chaînes légères de myosine (MLCK : myosin light chain kinase). La phosphorylation

de la chaine légère de myosine (MLC) par la MLCK a été montrée dans différentes

études concernant la régulation des jonctions serrées comme une étape. Par exemple,

une augmentation de la phosphorylation de la MLC a été observée après une infection

des cellules épithéliales par EPEC (enteropathogenic Escherichia coli) accompagnée

d’altérations de la barrière épithéliale (Yuhan et al., 1997). Goeckeler et al. ont montré

que la réorganisation du cytosquelette au niveau apical et l’augmentation de la

perméabilité paracellulaire intestinale via l’ouverture des jonctions serrées apparaissent

de façon constitutive avec la phosphorylation de la MLC. De plus, l’utilisation

d’inhibiteurs de la MLCK prévient l’augmentation de ces paramètres (Goeckeler et

Wysolmerski, 1995). L’activation de la MLCK chez les animaux traités par du LPS est

corrélée à une augmentation de la phosphorylation de la chaîne légère de myosine

(MLC) responsable de la contraction du cytosquelette. D’ailleurs, des observations en

microscopie électronique ont montré que cette contraction du cytosquellette était

visualisée par une « bulle » entre les deux membranes cellulaires au niveau de la

jonction serrée (Figure 11) (Moriez et al., 2005).


45

Figure 11: Image en microscopie électronique de l’ouverture des

jonctions serrées par la contraction de l’anneau perijonctionnel

d’actino-myosine (Moriez et al., 2005).

La régulation de la phosphorylation de la MLC entraînant la contraction de

l’anneau perijonctionnel d’actino-myosine semble être un mécanisme essentiel dans la

régulation de l’ouverture des jonctions serrées. Lorsque l’anneau perijonctionnel

d’actino-myosine est relâché, la tension sur les jonctions serrées est réduite entraînant

leur fermeture et une diminution de la perméabilité (Figure 12a). La phosphorylation de

la myosine (par exemple par activation de la MLCK) entraîne une contraction de

l’anneau perijonctionnel d’actino-myosine associée à une augmentation de la tension sur

les jonctions serrées et à une augmentation de la perméabilité (Figure 12b). En

revanche, en présence de cytochalasin D, connu pour détruire les filaments d’actine,

entraîne une importante désorganisation des microfilaments, la contraction de l’anneau

perijonctionnel d’actino-myosine et par conséquent, une augmentation de la

perméabilité des jonctions serrées (Figure 12c) (Turner, 2000).

Figure 12: Modèle de régulation des jonctions serrées par le cytosquelette (Turner, 2000).

a)

b) c)


46

2.4.2. Les Rho-GTPase

Les modifications de la perméabilité paracellulaire induites par RhoA impliquent

la kinase associée à Rho (ROCK) (Figure 7) (Fujita et al., 2000; Hirase et al., 2001). Le

cytosquelette d’actine possède un rôle crucial dans la régulation des jonctions serrées à

travers une interaction directe entre le cytosquelette d’actine et des protéines des

jonctions comme l’occludine, la cinguline et les ZO (Fanning et al., 1998). Connaissant

l’importance de la famille Rho GTPase dans la régulation du cytosquelette d’actine, il

est probable que les Rho GTPase régulent les jonctions serrées auxquelles le

cytosquelette est lié (Etienne-Manneville et Hall, 2002). Néanmoins, Rho peut aussi

interagir directement avec les jonctions, par exemple il a été mis en évidence que Rho

pouvait phosphoryler l’occludine, régulant ainsi son interaction avec le cytosquelette et

donc la fonction de perméabilité sélective (Hirase et al., 2001). Rho, à travers la

protéine ROCK, peut également moduler les jonctions serrées par des mécanismes

impliquant la régulation de la contraction de l’actine par les protéines motrices de

myosine (Figure 13).

CaM

MLCK

Ca 2+

Ins(1,4,5)P3

PLC

SR

Gq

Contraction

MP

Y27632 Rho-kinase

P

CPI-17 CPI-17

GTPRho

GEFs ?

AA

MBS MBS

P

inactive activeM20 M20 catcat

MLC

P

MLC

G12/13

CaM

MLCK

Ca 2+

Ins(1,4,5)P3

PLC

SR

Gq

Contraction

MP

Y27632 Rho-kinase

P

CPI-17 CPI-17

GTPRho

GEFs ?

AA

MBS MBS

P


MLC

P

MLC

G12/13

CaM

MLCK

Ca 2+

Ins(1,4,5)P3

PLC

SR

Gq

Contraction

MP

Y27632 Rho-kinase

P

CPI-17 CPI-17

GTPRho

GEFs ?

AA

MBS MBS

P


MLC

P

MLC

G12/13

Figure 13: Régulation de la perméabilité paracellulaire par Rho. La régulation de la MLCP et de la

MLCK par Rho permet une modulation de l’activité contractile de la myosine et de l’ouverture des

jonctions serrées (Fukata et al., 2001).

En utilisant un inhibiteur spécifique de ROCK, le Y 27632 (Tada et al., 2001), et

une approche de transfection par un dominant négatif, mutant de ROCK sur des cellules

Caco-2, une réduction de la résistance trans-épithéliale (TER) corrélée à une


47

augmentation de la perméabilité a été mise en évidence (Walsh et al., 2001). ROCK

régulerait donc la perméabilité paracellulaire en maintenant un cytosquelette d'actino-

myosine dynamique au pôle apical des cellules épithéliales via deux processus: l’un en

phosphorylant la protéine inhibitrice (CPI 17) de la myosine-phosphatase (MP) qui

inactive cette dernière, l’autre en phosphorylant directement la MLC (Fukata et al.,

2001)

CHAPITRE 3 : LA DOULEUR VISCERALE

48


1. INTRODUCTION

1.1. Définition

1.2. Propriétés de la douleur viscérale

1.3. Nature du stimuli

2. MECANISMES PERIPHERIQUES DE LA NOCICEPTION

2.1. Les récepteurs à la douleur ou nocicepteurs

2.2. Neuromédiateurs de la nociception

3. MECANISMES CENTRAUX DE LA NOCICEPTION

3.1. Au niveau spinal

3.1.1. Trajet des fibres afférentes sensitives viscérales

3.1.2. Neurones de la corne dorsale de la moelle épinière

3.1.3. Mécanisme de sensibilisation au niveau spinal

3.2. Au niveau supra-spinal

3.2.1. Faisceaux ascendants et structures supra-spinales de la

nociception

3.2.2. Structures corticales

4. SYSTEMES ENDOGENES MODULANT LA DOULEUR

4.1. Contrôles descendants d’origine supra-spinale

4.1.1. Contrôles inhibiteurs descendants

4.1.2. Contrôles excitateurs descendants

4.2. Modulation au niveau spinal

4.3. Modulation au niveau périphérique


49

LA DOULEUR VISCERALE

1. Introduction

1.1. Définition

La douleur peut être qualifiée de signal d’alarme qui met en jeu des reflexes de

protection et de défense chez les mammifères. En plus des modalités sensorielles, la

douleur constitue une expérience personnelle et subjective impliquant non seulement

une composante neurophysiologique mais aussi une composante affective et cognitive.

En 1979, l’Association Internationale pour l’étude de la Douleur (IASP : International

Association for the Study of Pain) adopte la définition suivante «la douleur est une

expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire,

réelle ou potentielle, ou décrite en termes d’un tel dommage». La perception de la

douleur ne peut jamais être prouvée mais présumée sur un faisceau d’arguments qui se

fondent sur une cause probable, un contexte et des changements de comportement. Il a

été dès lors suggéré que le terme de nociception était plus approprié pour évaluer la

perception douloureuse. La nociception dépend de l’intégrité de l’appareil sensoriel, des

récepteurs qui sont impliqués dans la réponse aux stimuli douloureux, de la transmission

et de l’intégrité de cette information par la moëlle, et enfin de sa projection au niveau du

cerveau du sujet conscient.

1.2. Propriétés de la douleur viscérale

La douleur viscérale est typiquement diffuse et difficile à localiser. Elle est

souvent projetée aux structures cutanées et cette irradiation somatique rend le diagnostic

topographique difficile. La caractérisation de la douleur viscérale est souvent source de

difficultés pour l’expérimentateur ce qui explique pourquoi elle reste encore


50

mystérieuse sur bien des points (Cambier, 1979). Parmi ces difficultés, deux doivent

être plus particulièrement mises en avant:

• la caractérisation de la douleur viscérale chez l’homme est malaisée et

imprécise. Parfois, la notion même de sensations douloureuses pose problème : les

sensations de gène et d’inconfort, particulièrement fréquente dans le territoire viscéral,

peuvent être ressenties chez certains sujets comme de véritables douleurs.

• les stimuli douloureux viscéraux sont difficiles à mettre en jeu et à reproduire

dans des conditions expérimentales, contrairement à leurs homologues somatiques.

Cette difficulté a conduit à distinguer les stimuli douloureux, qui provoquent une

douleur, des stimuli nociceptifs, qui induisent des réactions pseudo-affectives sans

évoquer forcément une sensation douloureuse.

Classiquement, on admet qu’il existe deux types de douleur rapportée, l’hyperalgésie

primaire et secondaire, étant définies suivant le type de localisation par rapport au site

de lésions. L’une est limitée aux métamères correspondant au viscère pathologique

décrite par un phénomène d’hyperalgésie primaire avec un abaissement du seuil. Elle

est caractérisée par une augmentation des réponses à des stimuli mécaniques,

thermiques et est lié à une sensibilisation des nocicepteurs périphériques. Les autres

nocicepteurs, beaucoup plus étendues, sont associées à l’hyperalgésie secondaire. En

revanche, celle-ci est définie par une augmentation des réponses uniquement à des

stimuli mécaniques. L’hyperalgésie secondaire semble être liée à un accroissement de la

réactivité de certains neurones du système nerveux central qui ont été «sensibilisés» par

l’activation initiale des nocicepteurs. Il est aussi important de noter que, souvent dans le

domaine de la douleur viscérale, l’apparition d’une inflammation de la muqueuse

provoque un phénomène d’allodynie : c'est-à-dire qu’une stimulation mécanique,

n’étant normalement pas douloureuse, le devient par suite de l’irritation chimique de la

muqueuse (Figure 14).


51

1.3. Nature des stimuli nociceptifs

Un parallèle est généralement établi entre sensation spécifique et sensation

douloureuse d'une part, et entre sensation générale et sensation non douloureuse d'autre

part. La douleur est souvent considérée comme le seul type possible de sensation

spécifique allant de la sensation modérément désagréable à l'inconfort intense. S'il est

vrai que la douleur est l'unique sensation engendrée par certains viscères comme la

vésicule biliaire, les différentes partie du tube digestif (œsophage, estomac, intestin

grêle, côlon et rectum) peuvent donner lieu à des sensations non-douloureuses (Cervero,

1987). En 1988, Cervero propose alors qu'un stimulus nocif ne peut pas se définir

comme un stimulus provoquant des lésions, mais plutôt un stimulus entraînant une

douleur (Cervero, 1988).

Finalement, les stimuli viscéraux nociceptifs entrent dans deux catégories distinctes, en

fonction du lieu où s’exerce leur action :

• ceux qui agissent sur les terminaisons nerveuses elles mêmes. Ils comprennent la

distension et la contraction forte, résultant d’une cause externe (bol alimentaire,

obstruction, présence d’un corps étranger) ou d’une cause interne (formation de calculs,

inflammation de la muqueuse qui, secondairement entraîne des troubles de la motricité).

Figure 14 : Relation entre intensité et sensation (Gebhart, 1999).


52

• ceux qui agissent sur les récepteurs. Ils peuvent être la conséquence d’un

dysfonctionnement d’un viscère.

2. Mécanismes périphériques de la nociception

2.1. Les récepteurs à la douleur viscérale ou nocicepteurs

La présence de sensations douloureuses au niveau des viscères suppose

l'existence de récepteurs sensoriels, appelés encore nocicepteurs, capables d'être activés

par des stimuli périphériques. Des études histologiques n’ont pas identifié de structures

particulières différenciées pouvant être considérée comme nocicepteurs. Ceux-ci sont,

en effet, constitués par des terminaisons libres de fibres nerveuses amyéliniques

(extrémités distales de l’axone) constituant des arborisations plexiformes dans la paroi

des viscères. Ils sont donc distincts des récepteurs de la sensibilité générale ou

récepteurs somesthésiques (localisés dans les tissus cutanés, musculaires et articulaires).

Les nocicepteurs viscéraux se rencontrent dans la totalité des organes internes.

Toutefois, suivant leur localisation (sous muqueuse, musculeuse ou muqueuse), ils

donnent naissance à des douleurs différentes (torsion, crampes ou brûlures). En général,

il semble que la proportion des récepteurs sensibles à des stimuli nociceptifs par rapport

aux récepteurs qui répondent à des stimuli physiologiques soit plus élevée dans la

séreuse que dans la musculeuse et la muqueuse.

Les douleurs observées lors de la mise en tension de viscères creux (côlon) ou de

certains canaux (hépatique et néphritique) évoquent la participation des

mécanorécepteurs (fibres A∂ ou fibres C) décrits dans ces divers organes (Floyd et al.,

1976; Iggo, 1955; Mei, 1970). Les terminaisons des fibres C sont essentiellement

localisées dans la couche musculaire intestinale, la séreuse et le mésentère. Celles des

fibres A∂ sont localisées dans la muqueuse (Sengupta and Gebhart, 1994). Ces

récepteurs sont activés lors de la distension ou de la contraction modérée des viscères et

accroissent leurs décharges avec l'augmentation de la stimulation (Zimmermann, 1999).

Ces fibres afférentes à faible seuil représentent envrion 75 % de la population

d’afférences viscéales. Les autres fibres afférentes viscérales (20 à 25 %) représentent

des caractéristiques de haut seuil à des stimlations mécaniques. Ces récepteurs sont

alors qualifiés de recepteurs polymodaux. En général, les afférences viscérales, telles


53

que celles provenant du côlon et empruntant les nerfs splanchniques, ont été identifiées

comme étant de type polymodal, donnant des réponses excitatrices à la bradykinine, au

chlorure de sodium hypertonique, à l'ischémie et à la distension colorectale (Blumberg

et al., 1983; Haupt et al., 1983).

Il existe des recepteurs silencieux dans les conditions normales ou lors de

stimulations de forte intensité qui présentent un seuil tellement élevé qu’ils ne peuvent

être activés que par des stimuli pathologiques ou dans des conditions d’inflammation

(Ness et Gebhart, 1990). Ces recepteurs décrits comme des nocicepteurs silencieux sont

répartis de façon ubiquitaire (Cervero et Janing, 1992). La stimulation non douloureuse

de ces récepteurs silencieux est à l’origine d’hyperalgésie et/ou allodynie observées

aussi bien dans les tissus viscéraux que dans les zones somatiques superficielles et

profondes (Cervero and Janig, 1992).

Ces récepteurs viscéraux agiraient en parallèle pour transmettre les évènements

nociceptifs au système nerveux central (SNC). Il se pourrait que l'activation des

nocicepteurs viscéraux spécifiques soit à l'origine des douleurs viscérales définies,

aiguës et non étendues, alors que les formes vagues et sourdes d'inconfort seraient dues

à la stimulation générale des récepteurs viscéraux non spécifiques (Cervero, 1991).

2.2. Neuromédiateurs de la nociception

La naissance du message douloureux est liée à la libération locale de substances

algogènes capables d’activer les différents nocicepteurs. Ces substances algogènes,

neuropeptides ont été identifiés dans les fibres afférentes viscérales et nous pouvons

répertorier la substance P (SP), le calcitonin gene-related peptide (CGRP), la

somatostatine, la cholecystokine (CCK) , le vaso-intestinal peptide (VIP) , la peptide

histidine méthionine (PHM), le neuropeptide Y (NPY), la gastrine, la neurotensine

(NT), les enképhalines (ENK) et les pro-dynorphines (Chayvialle et al., 1980; Chery-

Croze et al., 1988; Molander et al., 1987; Mulderry et al., 1985; Schultzberg et al.,

1980). Ces neuropeptides sont synthétisés dans les afférences digestives puis transportés

et sécrétés au niveau des extrémités centrales et périphériques des neurones (Levine et

al., 1993). L'intégration centrale des messages afférents et le type des réponses

efférentes qu'ils induisent dépendent de la nature des peptides libérés et de leur

interaction au niveau des sites post-jonctionnels (Figure 15).


54

Figure 15 : Substances algogènes impliquées dans l’activation/sensibilisation des nocicepteurs

Ces neuromédiateurs sont également libérés dans la paroi du tube digestif, soit

par les dendrites des neurones intrinsèques, soit directement par les axones des fibres

afférentes via une sécrétion "antidromique" (réflexe d'axone). Les neuromédiateurs ainsi

libérés participent à des fonctions effectrices (vasorégulation, sécrétion, contraction ou

relaxation du muscle lisse digestif, réaction inflammatoire,...) et modulent à leur tour

l'activité des récepteurs sensitifs. La complexité de ces phénomènes rend compte de

certains effets parfois contradictoires de ces peptides sur la viscéro-perception. Ainsi, la

SP peut avoir, en fonction de la voie utilisée, une action analgésique ou hyperalgésique

(Frederickson et al., 1978) et la sérotonine se comporte comme un médiateur

antinociceptif au niveau des centres médullaires et nociceptif au niveau périphérique

(Cramer et al., 1989)..

3. Mécanismes centraux de la nociception

3.1. Au niveau spinal

3.1.1. Trajet des fibres afférentes sensitives viscérales

Après avoir emprunté un trajet nerveux périphérique, l’influx nociceptif se dirige

vers la moelle épinière. La majorité des fibres périphériques afférentes possèdent un

Neuromédiateurs

Libération de substances pro-nociceptives

(SP, CGRP…)

Libération de substances

pro-nociceptives (SP, CGRP…)


55

corps cellulaire situé sur la racine dorsale au niveau du ganglion rachidien. Les

afférences de la vessie ou du côlon empruntent la voie parasympathique afin de

transmettre les messages douloureux en provenance des viscères (Jänig, 1993). Il existe

une organisation spatiale des fibres sensitives en fonction de leur destinée médullaire et

l’existence ou non d’une gaine de myéline. Elles se séparent en deux groupes à

l’approche de la moëlle épinière : un contingent de grosses fibres Aα/β amyélinisés

prend la position dorso-médiane dans la racine, alors que les fibres Aδ et C occupent la

position ventro-latérale de la racine, cheminant ensuite dans la voie de Lissauer (Figure

16A).

La transmission de l’information est donc assurée par les fibres sensitives Aδ et

C, en rappelant que les fibres Aβ transmettent les signaux qui déclenchent les sensations

tactiles et proprioceptives. Les fibres afférentes viscérales se terminent dans les couches

superficielles I (couche marginale de Waldeyer) et II (substance gélatineuse de Roland)

de la corne dorsale spinale, aussi autour du canal épendymaire mais surtout au niveau de

la couche V, constitué de neurones convergents, appelés ainsi en raison d’une véritable

convergence anatomique d’afférentes nociceptives cutanées, musculaires et viscérales.

Les terminaisons des fibres afférentes sont considérées en fonction de leur subdivision

cytoarchitectonique de la substance grise médullaires (Rexed, 1954). Cette lamination

de Rexed permet de distinguer 9 couches orientées dans le sens dorso-ventral et la

couche X formant la région périépendymaire (Figure 16B).

Figure 16 : (A) Entrée des fibres nerveuses dans le système nerveux central (d’après Fields, 1987)

(B) Les différentes couches de la substances grise médullaire (d’après Rexed, 1954)

A B


56

De plus, dans la moelle, les projections des afférences viscérales établissent

aussi des connexions avec les soma et les dendrites des neurones pré-ganglionnaires

sympathiques et parasympathiques. Même si l'évidence des connexions

monosynaptiques entre les neurones viscéraux afférents et efférents est rare, la

proximité des voies afférente et efférente a sans nul doute une implication

physiologique dans l'organisation des mécanismes réflexes autonomes (De Groat,

1986).

3.1.2. Neurones de la corne dorsale de la moelle épinière

La sensation produite par l'activation des afférences viscérales est ressentie au

niveau des structures somatiques et de manière mal localisée. L'interprétation

physiologique de cette douleur projetée est basée sur l'intégration viscéro-somatique,

c'est-à-dire la convergence des messages provenant des viscères et des structures

somatiques vers les neurones de second ordre spinaux dont l'activation conduit à une

douleur somatique (Cervero, 1991). La convergence des messages viscéraux et

somatiques sur les neurones de la moelle a été largement décrite dans la littérature

(Besson and Chaouch, 1987; Cervero, 1987). On peut distinguer deux types de neurones

de second ordre dans la moelle thoracique :

• les neurones somatiques qui peuvent être excités par la stimulation de récepteurs

cutanés et sous-cutanés,

• les neurones viscéro-somatiques qui répondent à la stimulation des structures

somatiques mais aussi qui peuvent être commandés par la stimulation des viscères

(Cervero, 1988).

L'existence d'un nombre significatif de neurones de la moelle ou d'une voie

sensorielle recevant exclusivement des messages viscéraux n'a pas pu être démontrée.

Tous les neurones somatiques et viscéro-somatiques peuvent être excités par la

stimulation naturelle des champs récepteurs somatiques, mais la nature des stimuli

efficaces diffère entre les deux groupes. La majorité des cellules somatiques est

exclusivement commandée par des stimulations de faible intensité comme le toucher ou

l'effleurement (mécanorécepteurs). En revanche, la plupart des neurones viscéro-

somatiques peuvent être activés exclusivement par des stimuli nociceptifs comme le


57

pincement ou la chaleur (nocirécepteurs) ou bien conjointement par des stimuli

nociceptifs et des stimuli de bas seuil (multirécepteurs).

L'étude des propriétés du message des neurones viscéro-somatiques, de leurs

projections ascendantes ainsi que la nature et l'ampleur de leur contrôle supra-spinal a

conduit à regrouper les neurones viscéro-somatiques en deux grandes catégories

(Cervero, 1991; Mayer et Raybould, 1990) :

• les neurones viscéro-somatiques à champ récepteur viscéral large : ils sont

encore désignés sous les termes de "neurones à convergence", "neurones polymodaux",

"neurones multiréceptifs" ou "neurones nociceptifs non spécifiques". Ils sont soumis à

des contrôles inhibiteurs et excitateurs descendants. Ces neurones représentent le plus

grand groupe de neurones viscéro-somatiques. Ils sont localisés dans les structures

profondes des cornes dorsales et ventrales et ont des champs récepteurs multiréceptifs.

Ils peuvent discriminer le caractère nociceptif ou non nociceptif du stimulus sur la base

de la fréquence de décharge de la réponse. Ce même paramètre permet aussi le codage

de l'intensité de la stimulation nociceptive elle-même.

• les neurones viscéro-somatiques à champ récepteur viscéral restreint : ils sont

encore désignés sous le terme de "neurones nociceptifs spécifiques". Ils sont soumis à

un contrôle inhibiteur descendant. Ils sont peu nombreux, localisés dans la corne dorsale

superficielle et sont sensibles uniquement à des stimulations nociceptives viscérales

mécaniques et/ou thermiques. Ces neurones se projettent dans le cerveau via les voies

spino-thalamiques. Ils sont soumis aux contrôles inhibiteurs segmentaires et à

l'inhibition descendante d'origine supra-spinale. Ils peuvent être inhibés par la

stimulation électrique du noyau du raphé. Ces cellules sont de bons candidats pour un

système de transmission qui pourrait assurer les effets sensoriels immédiats résultant de

la stimulation douloureuse des viscères.

3.1.3. Mécanismes de sensibilisation au niveau spinal

L’application d’un stimulus douloureux périphérique induisant une douleur

provoque au niveau de la corne dorsale la libération de neurotransmetteurs soit par les

fibres afférentes, sait que les neurones spinaux ou les fibres descendantes. Les

principaux neurotransmetteurs qui véhiculent l’information entre les afférences

nociceptives et les neurones nociceptifs spinaux sont les neuropeptides tels que les


58

tachykinines (SP, NKA, NKB), le CGRP, la somatostatine, le VIP, la galanine, la

bombésine, la NT mais aussi les acides aminés excitateurs (le glutamate ou l'aspartate)

(Figure 17).

Figure 17 : Médiateurs et récepteurs identifiés au niveau des neurones de la corne dorsale de la

moelle épinière et impliqués dans la transmission des messages nociceptifs (Bueno L. et al., 2000).

AMPA : acide-γ-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole ; CGRP : calcitonin gene-related peptide ;

CGRP1 : récepteur au CGRP de type 1 ; GABAA : récepteur à l'acide γ-aminobutyrique de type A ; NKA

: neurokinine A ; NKB : neurokinine B ; NMDA : N-méthyl D-aspartate ; NK1, NK2, NK3 : récepteurs

aux tachykinines de type 1, 2 et 3 ; 5-HT1 et 5-HT3 : récepteurs à la sérotonine de type 1 et 3 ; SST3 :

récepteur à la somatostatine de type 3 ; SP : substance P ; VIP : Vasoactive intestinal polypeptide.

Il a été largement démontré que les fibres afférentes amyéliniques A∂ et C

peuvent être activées par de nombreux stimuli nociceptifs qu'ils soient de nature

chimique, mécanique, thermique ou électrique, et induire une libération de SP à

l'intérieur de la corne dorsale (Donnerer et al., 1993; Duggan et al., 1988; Holland and

Goldstein, 1990; Kantner et al., 1985; Kuraishi et al., 1989; Schaible et al., 1990).

Plusieurs études ont montré que l'injection intrathécale de SP induit des comportements

évoquant la douleur (Gamse and Saria, 1986; Hylden and Wilcox, 1981; Piercey et al.,

1981) et une diminution du seuil de douleur chez l'animal (Hylden et Wilcox, 1983).

Les récepteurs à la SP ont été essentiellement localisés au niveau postsynaptique des


59

neurones de la corne dorsale et des motoneurones (Helke et al., 1986) produisant une

dépolarisation au niveau des neurones ascendants (ou neurones de second ordre) de la

corne dorsale. La SP joue ainsi le rôle de neuromodulateurs des influx nociceptifs à

travers les fibres afférentes primaires, en agissant préférentiellement sur les récepteurs

NK1 (Fleetwood-Walker et al., 1990).

La présence du CGRP dans le ganglion trigéminal et dans les ganglions

rachidiens, connus pour relayer les informations nociceptives de la périphérie vers le

SNC, a suggéré également son implication dans la perception et/ou la modulation de

l'information nociceptive, hypothèse renforcée par sa co-localisation avec la SP (Levine

et al., 1993). Cependant, son rôle dans les mécanismes de la douleur reste encore

controversé. En effet, il a été observé que le CGRP, administré par voie

intracérébroventriculaire (ICV), aurait une action antinociceptive (Candeletti et Ferri,

1990; Pecile et al., 1987) alors qu'administré par voie intrathécale ou en périphérie, le

CGRP est un transmetteur algogène, directement ou indirectement en synergie avec la

SP (Oku et al., 1987; Yu et al., 1994).

Outre la SP et le CGRP, les acides aminés excitateurs, tels que le glutamate et

l'aspartate, jouent aussi un rôle-clé dans la transmission des informations nociceptives

au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière (Dickenson, 1994; Watkins et al.,

1990). Les acides aminés excitateurs agissent par l'intermédiaire des récepteurs de type

N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et non-NMDA (le récepteur acide-α-amino-3-hydroxy-

5-méthyl-4-isoxazole-AMPA, les récepteurs métabotropiques et le récepteur au

kaïnate). L'existence d'antagonistes sélectifs de ces différents récepteurs a permis

d'élucider en partie leur rôle fonctionnel dans les processus spinaux de la douleur

(Watkins et al., 1990). Les récepteurs NMDA ont un rôle clé dans les états de douleur

chroniques et les phénomènes d'hyperalgésie et/ou d'allodynie (Coderre, 1993;

Dickenson, 1994). En effet, la participation de ces récepteurs dans le phénomène de

"wind-up", qui correspond à l'augmentation progressive de la décharge cellulaire en

réponse à des stimuli électriques identiques mais réitérés (Mendell, 1966), a largement

été montrée et étudiée, et ceci dans différents modèles de douleur neuropathique,

d'inflammation viscérale ou encore d'inflammation au niveau articulaire (Benett, 1994;

Urban et Gebhart, 1998). La stimulation répétée à intensité constante des fibres de type

C induit une réponse initiale des neurones de la corne dorsale de la moelle qui est


60

médiée par les récepteurs AMPA. Après un certain nombre de stimulations, l'action des

neurokinines au niveau des récepteurs NK1 et NK2 postsynaptiques entraîne la mise en

jeu des récepteurs NMDA, induisant ainsi un phénomène de "wind-up". L'amplification

de la réponse peut donc sous-tendre l'hyperalgésie et l'allodynie dans certains

syndromes douloureux. Récemment, l'implication des récepteurs AMPA spinaux a été

montrée dans la médiation des messages nociceptifs d'origine viscérale (Coutinho et al.,

1996; Song et Zhao, 1999).

L’implication indirecte d’un autre médiateur, le monoxyde d’azote (NO) dans la

transmission prolongée des messages nociceptifs a été rapporté dans la littérature (Haley

et al., 1992; Meller et Gebhart, 1993), en particulier dans les états de douleur chronique,

participation associée à l'activation des récepteurs NMDA (Malmberg et Yaksh, 1993;

Radhakrishnan et Henry, 1993). Il a été proposé que l'activation des récepteur NMDA

associée à un courant Ca2+ puisse générer du NO. Il pourrait ainsi agir soit comme un

transmetteur rétrograde influençant les neurones présynaptiques, soit sur les cellules

gliales adjacentes, soit sur les neurones postsynaptiques.

Enfin, il existe également d’autres peptides modulant la transmission de

messages nociceptifs : comme de la somatostatine (Mollenholt et al., 1988) et la

galanine (Cridland et Henry, 1988; Post et al., 1988). Ces peptides ont essentiellement

une fonction inhibitrice au niveau de la corne dorsale, même si quelques études

montrent le contraire.

3.2. Au niveau supraspinal

3.2.1. Faisceaux ascendants et structures supra-spinales de la

nociception

A partir des relais de la corne dorsale, s’organisent des circuits reflexes spinaux

par l’intermédiaire de chaînes d’interneurones. Le message nociceptif se poursuit alors

par les voies spinales ascendantes jusqu’aux centres supraspinaux via les neurones de

2ème ordre. Deux voies principales vehiculent le message nociceptif (Figure 18) :

• la voie spinothalamique latérale

• la voie spinothalamique médiane ou spinoréticulaire


61

Figure 18 : Voies de la douleur : faisceaux spinothalamique latéral et médial

Faisceau spinothalamique latéral

Au niveau lombaire, les neurones spinothalamiques sont essentiellement

localisés au niveau de trois zones : la lame I (contenant les fibres Aδ), les lames IV et V,

et les régions les plus ventrales (substance grise et corne antérieure). Cette voie se

termine au niveau de trois zones du thalamus : la région ventro-postéro-latérale,

postérieure et médiane qui relaye ensuite l’information vers le cortex sensoriel. La

rapidité de conduction des fibres Aδ et les champs récepteurs de la voie

spinothalamique sont responsables de la localisation et de la perception de l’intensité de

la douleur (Berkley, 1980; Craig et Burton, 1981; Peschanski et al., 1983).

Faisceau spinoréticulaire

Ce faisceau se compose surtout des fibres C qui transmettent la douleur lente et

diffuse. Ses synapses s’articulent avec les noyaux de la formation réticulée du tronc

cérébral et les noyaux thalamiques médians. Les messagers afférents sont ensuite

transmis vers le cortex frontal et le système limbique, deux régions responsables des

émotions et de la mémoire. La faible vitesse de conduction des fibres C, le caractère

1er

relais spinal

2eme

relais thalamique

Tronc cérébral


62

diffus des grands champs récepteurs ainsi que les structures supérieures impliquées dans

cette voie en font une candidate type pour la perception de la composante désagréable

de la douleur.

D’autres voies ascendantes et structures impliquées dans la nociception ont été

nouvellement décrites :

• Le faisceau spino-parabrachio-amygdalien. Cette voie joue également un rôle

important dans la transmission des messages douloureux vers les centres supérieurs

(Bernard et Besson, 1990). Située dans la partie dorsolatérale du pont, le noyau

parabrachial est un site de projection majeur des neurones nociceptifs spécifiques de la

couche I de la corne dorsale de la moelle. Ces neurones sont activés par des stimulations

cutanées, mais également par des stimulations viscérales. Ils se projettent au niveau du

noyau central de l'amygdale.

• Le faisceau spino-parabrachio-hypothalamique. La partie parabrachiale de

cette voie, parallèle à la précédente, relaie au niveau du noyau parabrachial

mésencéphalique, où les caractéristiques des réponses neuronales sont comparables à

celles décrites pour le niveau pontique (Bester et al., 1995). Les sites de projection ont

été localisés dans le noyau ventro-médian de l'hypothalamus. Compte tenu de la densité

de ces projections, cette voie pourrait jouer un rôle majeur dans les composantes

végétatives et endocriniennes de la douleur.

En résumé :

Figure 19 : Les différentes voies de la douleur et ses composantes.

Les voies de la douleur et les composantes

Faisceau spino-thalamique latéral

via la région ventro-postero-laterale thalamique et le cortex

Transmission des aspects sensori-discriminatifs Reconnaissance des caractères physiques de la douleur

Faisceau spino-réticulaires via les formations réticulées et

cortex

Assure des liens entre douleur et vigilance

Faisceau spino-parabrachio-amygdalien

Notau amygdalien (système limbique)

Perception de la composante affective et émotionnelle de la douleur

Faisceau spino-mésencéphalique

Projection sur la substance grise péri-aqueducale

DOULEUR

Contrôle analgésique endogène des messages nociceptifs

Faisceau spino-parabrachio-

hypothalamique Projection sur la

substance grise péri-aqueducale

Rôle dans les composantes végétatives et endocriniens de la douleur


63

3.2.2. Structures corticales

L’information nociceptive est transmisse du thalamus au cortex cérébral via les

neurones de 3ème ordre. Le thalamus est un lieu de convergence de multiples voies

nociceptives directes ou indirectes. En fait, l’information véhiculée par les faisceaux

spinaux ascendants se projette respectivement sur :

• les noyaux du thalamus postérieur avant d’être envoyée directement vers le

cortex somatosensoriel. Ces structures interviennent donc dans le codage,

l’identification et la localisation du stimulus nociceptif. Cette voie est ainsi responsable

de l’aspect sensori-discriminatif de la douleur.

• la substance réticulée du tronc cérébral et les noyaux du thalamus médian

comportant ensuite des vastes projections sur le cortex pré-frontal, les structures

limbiques, l’hypothalamus, le striatum… Cette voie de conduction lente est responsable

après stimulation nociceptive, de la douleur sourde et mal systématisée (non-

discriminative). Elle met en jeu des comportements d’éveil et de reflexe. Elle est ainsi à

l’origine des comportements affectifs et cognitifs de la sensation douloureuse.

Finalement, il est possible de distinguer au sein des afférences nociceptives 2 voies

anatomiques empruntant, d’une part un système latéral et, d’autre part un système

médian (Figure 20).

CORTEX FRONTAL

HYPOPHYSE

NOYAUX HYPOTHALAMIQUES

NOYAUX THALAMIQUES

Figure 20 : Projections cérébrales des voies nociceptives


64

4. Systèmes endogènes modulant la douleur

Les organismes vivants sont dotés d’une capacité à moduler les sensations

douloureuses. Le contrôle de la douleur est alors défini par le terme d’antinociception.

La transmission de l’information douloureuse est contrôlée et modulée à plusieurs

niveaux du système nerveux central (corne dorsale spinale, tronc cérébral, thalamus…).

Cette modulation apparaît hiérarchiquement organisée par un système de contrôle

descendant de la douleur pouvant être classé selon l’origine spinale ou supraspinale. Ces

différents sites se situent (Figure 20)

• au niveau supraspinal, regroupant les facteurs émotionnels et les contrôles

inhibiteurs descendants ;

• au niveau de la moëlle épinière, où se trouvent les systèmes descendants

inhibiteurs et excitateurs et les contrôles segmentaires ;

• au niveau des ganglions prévertébraux recevant les messages de la périphérie et

du SNC ;

• et, enfin, au niveau des neurones sensoriels.

Cortex cérébral

MOELLE EPINIERE

MESENCEPHALLE

Voie nociceptive Voie antinociceptive

Corne dorsale

Thalamus

SGPA

NRM LC Formation réticulée

Aδ C

Glutamate Aspartate SP CGRP

Opioïdes NE 5-HT GABA ACh

Médiateurs

Nociceptifs : Antinociceptifs :

MEDULLA

Figure 20 : Scématisation des voies nociceptives et antinociceptives


65

4.1. Contrôles descendants d’origine supraspinale

La modulation descendante en provenance du cortex peut être transmise

directement à la moelle épinière par l'intermédiaire, soit du tractus cortico-spinal, soit

d'un relais au niveau du tronc cérébral. Les voies descendantes modulant ainsi les

sensations viscérales peuvent être, soit excitatrices, soit inhibitrices. L'origine des

contrôles est située dans le mésencéphale au niveau de la substance grise périaqueducale

(SGPA) et dans la médulla au niveau du noyau du raphé magnus (NRM) et du noyau

latéral de la formation réticulée (Basbaum et Fields, 1984; Cervero et al., 1985; Gebhart

et Ness, 1991).

4.1.1. Contrôles inhibiteurs descendants

Ils s'exercent principalement à partir de certaines régions du tronc cérébral dont

les neurones sont à l'origine des voies inhibitrices descendantes. Initialement, il a été

mis en évidence, chez le rat, que la stimulation de la substance grise périaqueducale

(SGPA) entraîne des effets analgésiques importants (Reynolds, 1969). Ces effets ont

principalement pour origine la région ventrale de la SGPA, riche en corps cellulaires

sérotoninergiques (Oliveras et al., 1974). D’autres noyaux du raphé au niveau du pont et

du bulbe exercent également des effets analgésiques extrêmement puissants.

Les systèmes descendants sont très complexes. Schématiquement, il faut retenir

la participation inhibitrice des voies bulbo-spinales sérotoninergiques dont l’implication

a été démontrée. D’autres systèmes inhibiteurs peuvent intervenir comme le système et

noradrénergique, mais les études comportementales restent insuffisantes, ou encore les

endorphines. En effet, l'administration de naloxone réduisant les effets analgésiques

d’un pincement au niveau des pattes induits par la stimulation de la subtance grise

périaqueducale (Akil et al., 1976) ou le noyaux raphé magnus (Oliveras et al., 1977),

suggèrent une libération d'endorphines.

Ainsi, différents auteurs ont proposé l'existence d'un système analgésique endogène

dans lequel SGPA et NRM feraient partie d'une boucle de rétroaction négative mise en

jeu par des stimulations et entraînant en retour l'inhibition de la transmission des

messages nociceptifs au niveau médullaire. Dans ce cas, certains neurones nociceptifs

de la corne dorsale qui possèdent un champ excitateur périphérique bien localisé


66

peuvent être inhibés par des stimulations nociceptives appliquées sur n'importe quelle

partie du corps de l'animal.

La morphine pourrait également renforcer l'activité des contrôles inhibiteurs

descendants. En effet, l’effet analgésique induit par administration de morphine au

niveau de la SGPA ou du NRM est similaire à celle induite par stimulation de la SGPA

et du NRM ce qui renforce cette hypothèse. Néanmoins, la démonstration d’un

renforcement des contrôles inhibiteurs par la morphine reste très controversée (Le Bars

et al., 1983).

Figure 21 : Schéma représentant les voies majeures impliquées dans la médiation de l'anti-

nociception descendante (Mayer et Gebhart, 1994). A6 : locus coeruleus ; NE : noradrénaline ; PAG :

periaqueducal gray (substance grise périaqueducale) ; RVM : rostroventral medulla (moelle

rostroventrale) ; * sensibilité aux opioïdes.

4.1.2. Contrôles excitateurs

Alors que le rôle et les mécanismes des voies descendantes inhibitrices ont été

très étudiés (Fields, 1992 ; Maier et al., 1992), le concept de systèmes descendants

facilitant la douleur n'a pas été élucidé. Cependant, plusieurs études ont montré que

l'activité des neurones de la corne dorsale, chez le singe éveillé, peut augmenter avant

même que le stimulus nociceptif ne soit appliqué (Duncan et al., 1987).

La stimulation afférente vagale, en plus de son implication dans les mécanismes

descendants inhibant la douleur (Randich et Gebhart, 1992), peut faciliter les réflexes

Stress Douleur Exercice Peur

Stimulation viscérale

Perception de la douleur

Tractus ascendant - spinothalamique - spinomésencéphalique - spinoréticulaire

Stress Douleur Exercice Peur

Stimulation viscérale

Perception de la douleur

Tractus ascendant - spinothalamique - spinomésencéphalique - spinoréticulaire


67

nociceptifs et les réponses des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière

(neurones spino-thalamiques) à des stimuli nociceptifs somatiques et viscéraux

(Randich and Gebhart, 1992; Ren et al., 1991a). L'activation directe des neurones du

bulbe rachidien rostro-ventral facilite la transmission nociceptive spinale (Zhuo et

Gebhart, 1991; Zhuo et Gebhart, 1992).

Alors que la modulation inhibitrice descendante du tronc cérébral est généralement

contenue dans la moelle épinière dorso-latérale, la modulation excitatrice, activée par la

stimulation afférente vagale ou l'activation des neurones du bulbe rachidien rostro-

ventral, descend dans la moelle épinière ventrale (Randich et Gebhart, 1992; Ren et al.,

1991a; Ren et al., 1991b; Zhuo et Gebhart, 1991; Zhuo et Gebhart, 1992).

Les médiateurs impliqués dans la modulation des neurones de la corne dorsale

par les voies descendantes incluent : la noradrénaline via les récepteurs α2

adrénergiques, la 5-HT interagissant avec les récepteurs 5-HT1, 5-HT2 et 5-HT3

(Danzebrink et al., 1991), et les peptides opioïdes interagissant avec les récepteurs µ

(Basbaum et al., 1984; Fields et al., 1989).

4.2. Modulation au niveau spinal

L'interaction des activités afférentes entre les fibres de gros et de fin diamètre au

niveau de la corne dorsale de la moelle épinière est connue depuis longue date

(Noordenbos, 1959). Ce contrôle médullaire est illustré par la "théorie du portillon

médullaire", élaborée en 1965 par Wall et Melzack, selon laquelle la transmission des

messages nociceptifs est réglée par un effet de balance entre des influences excitatrices

(d'origine périphérique) et des influences inhibitrices (d'origine périphérique ou supra-

spinale). Des interneurones situés dans les couches II et III de la corne dorsale de la

moelle inhibent la transmission des influx nociceptifs vers les couches plus profondes,

par une inhibition présynaptique des afférences. A la manière d'un portillon, ces

interneurones réguleraient l'accès au SNC du flot global d'informations. Ainsi, les

afférences de gros diamètre (Aα et ß) augmenteraient l'activité de ces interneurones

(fermeture du portillon) tandis que l'activation des fibres fines (A∂ et C) déprimerait ce

tonus inhibiteur (ouverture du portillon). La douleur ne survient que lorsqu'il y a rupture

de cet équilibre.


68

4.3. Modulation au niveau périphérique

C'est au niveau périphérique que s'effectue la transmission, c'est-à-dire

l'ensemble des processus grâce auxquels un stimulus nociceptif, quelle que soit sa

nature, génère un potentiel de récepteur (dépolarisation locale des terminaisons

afférentes due à des modifications des conductances ioniques). Dès cette première

étape, de nombreux phénomènes de modulation peuvent intervenir.

Ces contrôles s'exercent soit directement sur le site, soit sur le corps cellulaire localisé

dans le ganglion rachidien. Dans les deux cas, il pourra en résulter une modification de

transfert des informations vers les centres.

Les systèmes efférents parasympathiques et sympathiques activent les cellules

effectrices intestinales (Janig et Mclachlan, 1992). Les messages centraux sont donc

fidèlement transmis aux organes et cela est à la base de la régulation précise des

fonctions organiques dans des conditions normales. Or, ces systèmes peuvent aussi

altérer la sensibilité des terminaisons nerveuses des fibres afférentes primaires

viscérales. En effet, la proximité de ces terminaisons nerveuses avec des cellules

immunitaires, des neurones intrinsèques et des cellules musculaires lisses, permet une

modulation de l'activité de ces terminaisons périphériques par son environnement.

Ainsi, les nerfs sympathiques et parasympathiques peuvent moduler l'activité motrice et

la tonicité de la paroi intestinale via le système nerveux entérique, augmentant ou

diminuant l'activité des tensio-récepteurs. L'activation des mastocytes entraîne la

libération locale de médiateurs pouvant alors sensibiliser les terminaisons des fibres

afférentes primaires. La libération, à la fois, de neuropeptides de ces terminaisons

nerveuses ("réflexe d'axone") et de cytokines des cellules immunitaires environnantes

peuvent également moduler l'activité des terminaisons nerveuses afférentes. Enfin, la

présence de récepteurs α-adrénergiques sur ces terminaisons nerveuses montre que

l'activité des fibres afférentes primaires peut être modulée directement par la

noradrénaline libérée par les fibres efférentes sympathiques (Mayer et Raybould, 1990).

Suivant la nature du stimulus (mécanique ou thermique) une importante batterie

de médiateurs est capable d’activer et sensibiliser les terminaisons (McMahon et al.,

2003). Ainsi, l’activation de récepteurs couplés à la protéine G, tels que les récepteurs à

la bradykinine (Cesare et al., 1996), aux prostaglandines (England et al., 1996), à

l’adénosine triphosphate (Tominaga et al., 2001) ou encore les recepteurs β2 adrenaline,


69

activent et sensibilisent également les terminaisons sensitives (Figure 22A). Suivant la

nature du stimulus ; différentes voies intracellulaires sont impliquées dans la

sensibilisation des afférences primaires. La protéine kinase A (PKA) (Khasar et al.,

1999; Aley et al., 1999), la protéine kinase C (PKC), ou encore les « extracellular

regulated kinase (ERK) » sont impliquées dans les phénomènes de sensibilisation (Aley

et al., 2001 ; Dai et al., 2002) (Figure 22B). Le recrutement de ces différentes voies

intracellulaires aboutit à la modulation, souvent par phosphorylation, des canaux

sodiques, potassiques ou calciques, modifiant ainsi la sensibilité des afférences

primaires (Gold et al., 1996; England et al., 1999) (Figure 22C).


70

Figure 22 : Modulation de la sensibilité des afférences sensitives. (A) Nature des stimuli capables de

sensibiliser les afférences primaires. (B) Représentation schématique des différentes voies intracellulaires

impliquées dans les mécanismes de sensibilisation des afférences primaires. (C) Illustration des différents

mécanismes effecteurs impliqués dans la réponse des afférences sensitives (Mc Mahon et al., 2004).

CHAPITRE 4 : STRESS ET FONCTIONS DIGESTIVES

71


1. PHYSIOPATHOLOGIE DU STRESS

1.1. Définition

1.2. Physiologie du stress : "le syndrome d'adaptation"

1.2.1. L’axe corticotrope

1.2.2 L’axe catecholinergique

1.3. La protéine c-Fos activée par le stress

2. STRESS ET ALTERATIONS DES FONCTIONS DIGESTIVES :

TROUBLES FONCTIONNELLES INTESTINAUX

2.1. Stress et motricité intestinale

2.1.1. Les effets moteurs coliques du stress

2.1.2. Mécanismes impliqués dans les modifications motrices par le

stress

2.2. Stress et sensibilité viscérale

2.2.1. Les effets sensitifs digestifs du stress

2.2.2. Mécanismes impliqués dans les altérations de la sensibilité

viscérale par le stress

2.3. Stress et immunité

2.3.1. La composante inflammatoire

2.3.2. Mécanismes impliqués dans l’activation du système immunitaire

par le stress

2.4. Stress et perméabilité intestinale

2.4.1. Effet du stress sur la perméabilité épithéliale intestinale

2.4.2. Mécanismes impliqués dans les altérations de la perméabilité

3. PROBIOTIQUES ET TROUBLES FONCTIONNELS INTESTINAUX

3.1. Normalisation de la microflore, effets métaboliques

3.2. Effets immunomodulateurs et propriétés anti- inflammatoires

3.3. Effets neuro-immunomodulateurs

3.4. Quelques essais thérapeutiques et préventifs


72

STRESS ET FONCTIONS DIGESTIVES

1. Physiopathologie du stress

1.1. Définition

La réaction de stress peut être définie comme l’ensemble des réponses de

l’organisme à une sollicitation de l’environnement mettant en jeu des mesures

compensatoires adaptées, correspondant au « Syndrome d’Adaptation Générale » ou

GAS (Seyle et Fortier, 1949). Le stress désigne ainsi la réponse de l’organisme aux

facteurs d’agression physiologiques et psychologiques, ainsi qu’aux émotions qui

nécessitent une adaptation. Quels que soient les agents ou processus physiques,

psychiques ou émotionnels, les principales réponses au stress sont étonnement

identiques et ciblent le maintien de l’homéostasie. En effet, les mécanismes de défense

biologique de l’organisme face à des évènements stressants conduisent à une réponse

comportementale, à l'activation de systèmes neuroendocriniens et neuro-humoraux

mettant en jeu l’axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-cortico-surrénalien) et le

système nerveux autonome (système nerveux sympathique et parasympathique) (Mayer

et Fanselow, 2003). Cependant, lorsqu’il y a un déséquilibre entre la capacité

d’adaptation et les exigences du milieu environnemental, la réaction de stress devient

pathologique, conduisant à l’apparition des troubles fonctionnels métaboliques, voire

lésionnels.

1.2. Physiopathologie du stress : "le syndrome d'adaptation"

Il existe trois phases successives constituant le « syndrome d'adaptation

générale » qui se traduit sur le plan biologique par des effets tels que l’hypertrophie du


73

cortex surrénalien, les ulcères gastro-intestinaux, l’atrophie du thymus et des ganglions

lymphatiques, retrouvés quelle que soit la cause de stress. Ces trois phases sont :

• une phase d'alarme : celle de la perturbation; il s'agit de la première réaction

de défense de l'organisme avec stimulation du système neuro-endocrinien (axe

corticotrope). En effet, l'organisme déclenche une mise en garde générale caractérisée

par des modifications des paramètres biologiques (augmentation du débit cardiaque, de

la pression artérielle et de la résistance vasculaire, vasodilatation du système

musculaire, modification du métabolisme lipidique, modification de l'homéostasie,

augmentation de la vigilance)

• une phase d'adaptation ou de résistance : celle de la réaction. Les

mécanismes mis en jeu lors de la première phase se compensent ou s'inversent en

maintenant l'équilibre entre le système nerveux sympathique et parasympathique.

• une phase de décompensation ou d'épuisement : où la phase d'adaptation est

mise en échec. Le stress s'installe de façon durable, dramatisant la situation jusqu'à la

pathologie psychique ou somatique.

Figure 23 : Vue d'ensemble de la régulation neuroendocrinienne et neuro-humorale impliquée dans

la réponse au stress (Söderholm et Perdue, 2006). Le stress entraîne une activation de l'axe hypothalamo-

hypophyso-surrénalien (HPA) et des noyaux pontomédullaires (PMN), générant une réponse du système

nerveux autonome. La réponse au stress est modulée par un rétrocontrôle négatif des glandes surrénales

(cortisol) et des projections ascendantes monoaminergiques Le stress se traduit également par une

libération de cytokines en périphérie qui, à leur tour, peuvent agir comme agents stressants intéroceptifs.

Ach, acetylcholine; ACTH, adreno-corticotropic hormone; CRH, corticotropin-releasing hormone; NE,

norepinephrine; SGPA, substance grise périaqueducale; PVN, noyau paraventriculaire

Cortex Réponse comportementale

Amygdale

PVN SGPA

hypophyse PMN

Réponse autonomique NE, CRH, ACh

Réponse de l’axe HPA cortisol

Pathophysiologie viscerale

cytokines

CRH

ACTH - -

Adrenaline


74

1.2.1. L'axe corticotrope

L’hypothalamus, l’hypophyse antérieure et le cortex surrénalien

représentent les structures engagées au cours de l’activation de l’axe corticotrope. La

composante centrale primaire de ce système se situe au niveau du noyau

paraventriculaire (PNV) de l’hypothalamus, à l’origine de la sécrétion de CRF

(Corticotropin Releasing Factor) et d’AVP (Arginine Vasopressine). Ces deux facteurs

hypothalamiques sont synthétisés au niveau parvocellulaire du PNV et libérés par les

terminaisons axoniques pour gagner la circulation sanguine porte hypothalamo-

hypophysaire. A ce niveau, le CRF stimule la synthèse et la sécrétion d’ACTH

(Adrenocorticotropin Hormone). L’ACTH ainsi libérée au niveau des cellules de

l’hypophyse antérieure induit la sécrétion de glucocorticoïdes, principalement le cortisol

ou la corticostérone en agissant sur la cortico-surrénale.

a) Les facteurs hypophysaires

Le CRF, peptide de 41 acides aminés initialement isolé et caractérisé par Vale et

al. (1981), joue un rôle majeur dans l’activation de l’axe corticotrope en réponse au

stress. Ce neurotransmetteur est principalement localisé dans la région centrale, au

niveau du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), mais il est également

décrit au sein de structures centrales extra hypothalamiques telles que le noyau central

de l’amygdale, le locus coeruleus et le noyau parabrachial (De Souza et al., 1987;

Swanson et al., 1983). Les techniques d’hybridation in situ ont confirmé la présence

d’ARNm du CRF dans les cellules de ces structures (Sawchenko, 1987).

Le stress, dans ses différentes modalités (stress physique ou psychologique)

affecte les quantités de CRF libérées au niveau de ces différentes régions. Ainsi, un

stimulus stressant induit une libération immédiate de CRF dans la circulation porte

hypothalamo-hypophysaire et une augmentation de la synthèse de CRF au niveau du

PNV, se traduisant par une augmentation des taux d’ARNm (Chappell et al., 1986).

Paradoxalement, une augmentation ou une diminution de la synthèse de CRF dans

certaines régions extra hypothalamiques est décrite, par exemple, au niveau du locus

coeruleus ou du bulbe olfactif, selon la nature et la durée du stress appliqué (Imaki et

al., 1991; Valentino et Wehby, 1988). Cependant, la plupart des régions centrales extra

hypothalamiques, où des neurones à CRF ont été visualisés en situation basale, ne


75

présentent pas d’altérations de la concentration en CRF après un stress (Chappell et al.,

1986). Ces différentes données suggèrent une différence dans la régulation du CRF par

le stress selon les régions.

Au niveau des tissus périphériques, le gène codant pour le CRF est largement

exprimé, mais dans des quantités inférieures comparées aux structures hypothalamiques.

L’expression de ce gène a été détectée au niveau des organes reproducteurs (endomètre,

placenta, utérus, ovaires, testicules) (Asakura et al., 1997; Di Blasio et al., 1997; Dufau

et al., 1993; Petraglia et al., 1993), du système digestif (rate, pancréas, foie, estomac,

intestin grêle et côlon) (Kawahito et al., 1995), des surrénales, la glande thyroïde et la

peau (Orth, 1992; Owens and Nemeroff, 1991), ainsi que des cellules immunitaires

telles que les lymphocytes (Kravchenco et Furalev, 1994). La production de CRF à la

périphérie semble être régulée par différents facteurs tels que les prostaglandines, le

NO, la progestérone, et certains facteurs de croissance (epidermal growth factor, platelet

growth factor) (Roe et al., 1996; Zoumakis et al., 1997).

D’une façon générale, les récepteurs au CRF sont largement distribués au niveau

périphérique (tissus reproducteurs, appareil digestif, cellules immunitaires, muscle

squelettique…) (Aguilera et al., 2001; Asakura et al., 1997; Chalmers et al., 1996;

Kishimoto et al., 1995); mais également dans le système nerveux central. A ce niveau,

la distribution des récepteurs au CRF est hétérogène et les concentrations les plus fortes

sont rencontrées dans les régions impliquées dans la fonction cognitive (cortex cérébral)

et dans les aires limbiques impliquées dans la réponse au stress et aux émotions

(amygdale, nucleus accumbens, hippocampe), dans les bulbes olfactifs ainsi que dans

les régions régulant les fonctions autonomes (locus coeruleus, noyau du tractus

solitaire) (De Souza et al., 1985). De plus, des récepteurs au CRF ont été observés en

forte concentration au niveau de la substance gélatineuse de la corne dorsale de la

moelle épinière (Bell et De Souza, 1988). Le profil de distribution des récepteurs au

CRF au niveau central est représentatif du rôle clef de ce neuropeptide dans

l’intégration des réponses comportementales, endocriniennes et autonomes au stress.

b) les facteurs hypophysaires

Le gène POMC (pro-opiomelanocortin), exprimé de façon prédominante au

niveau de l’hypophyse antérieure (Pawelek, 1993) représente le précurseur de nombreux

composés tels que l’ACTH, les endorphines, la melanotropine (MSH) et les lipotropines


76

(LPH) (Bertagna, 1994). Ces neuropeptides biologiquement actifs sont générés à la suite

de modifications de nature post-traductionnelle (Bateman et al., 1990). Un système de

régulation secondaire au niveau du lobe intermédiaire permet la transformation de ces

peptides, conduisant par clivage à l’expression de nombreuses unités peptidiques (α,δ,γ

MSH, β endorphines, CLIP).

La production et la sécrétion des peptides issus du précurseur POMC au niveau

du lobe antérieur de l’hypophyse est sous la dépendance d’un contrôle hormonal dont

l’un des principaux facteurs est le CRF (Autelitano et al., 1989). A ce niveau,

l’activation par le CRF des récepteurs de type CRF-R1, présents sur les cellules

hypophysaires, stimule la sécrétion d’ACTH via une augmentation de la concentration

de calcium cytosolique (Aguilera et al., 2001). La fixation de CRF sur ces récepteurs

active l’adenylate cyclase (Labrie et al., 1982), induisant une augmentation

intracellulaire d’AMPc et de l’activité des protéines kinases AMP dépendantes. D'autres

hormones telles que les catécholamines via les récepteurs β ou α1 adrénergiques, le VIP

ou l’AVP peuvent également stimuler la libération d’ACTH (Lundblad et Roberts,

1988). Ces différents agonistes se fixant sur la cellule hypophysaire entraînent

l’activation de différents récepteurs et la mise en jeu de nombreuses voies intra-

cellulaires et médiateurs secondaires. La sécrétion d’ACTH est également décrite au

niveau de nombreux tissus tels que les organes reproducteurs, le tractus gastro-

intestinal, le pancréas et la glande thyroïde (Bertagna, 1994).

L’ACTH ainsi libérée gagne la circulation sanguine et active la sécrétion de

glucocorticoïdes à partir des cellules de la corticosurrénale. Les effets de l’ACTH sur

ces cellules sont médiés via l’activation de récepteurs membranaires liés à une protéine

G, appartenant à la famille récepteurs de la mélanocortine (MC) (Eberle, 1988). Les

récepteurs de type MC2 semblent être majoritairement impliqués dans les effets de

l’ACTH, compte tenu de leur grande sélectivité pour ce peptide (Cone et al., 1996).

Cependant il existe une seconde classe de récepteurs, les MC5, présentant une forte

affinité pour l’ACTH (Van Der Kraan et al., 1998). L’interaction de l’ACTH avec ces

récepteurs membranaires produit l’activation de l’adénylate cyclase et une augmentation

de la concentration intracellulaire d’AMPc. D’autre part, cette réaction induit une

mobilisation du calcium intracellulaire et la production de métabolites de l’acide

arachidonique (Yamazaki et al., 1998).


77

c) Les glucocorticoïdes

Les glucocorticoïdes sont synthétisés par la partie corticale des glandes

surrénales. Les deux hormones glucocorticoïdes principales, le cortisol et la

corticostérone, sont représentées en proportion variable selon les espèces avec une

prédominance du cortisol chez l’homme et de la corticostérone chez le rat.

Les glucocorticoïdes représentent le produit final de l’activation de l’axe

corticotrope et sont les molécules effectrices primaires de ce système neuro-

endocrinien. Ces hormones présentent un large spectre d’activité caractérisé

principalement par :

• une stimulation de la néo-glycogénèse

• une action modulatrice sur le système immunitaire

• un rôle régulateur de l’activation des structures impliquées au cours du stress

Le rôle modulateur des glucocorticoïdes sur la fonction immunitaire a fait l’objet

de nombreuses études. L’action de ces hormones sur les cellules immunitaires se fait

par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques cytoplasmique et/ou nucléaire, exprimés

par différentes populations cellulaires telles que les monocytes, les neutrophiles et les

lymphocytes (Miller et al., 1993). Au niveau tissulaire, une forte expression de

récepteurs aux glucocorticoïdes a été décrite dans le thymus et la rate (Miller et al.,

1990). Il existe également au niveau circulant, une protéine dite « corticosteroid binding

protein » (CBP) dont la distribution et la quantité exprimée semblent avoir un rôle

modulateur dans l’activation des récepteurs intracellulaires par les glucocorticoïdes

(Rosner, 1990). En général, l’effet des glucocorticoïdes se révèle être de nature

immunosuppressive et anti-inflammatoire.

La localisation des récepteurs aux glucocorticoïdes a été mise en évidence par des

techniques immuno-cytochimiques au niveau central chez le rat. Une concentration

importante a été précisément localisée au niveau du noyau para-ventriculaire, le noyau

de l’amygdale, les aires CA1 et CA2 de l’hippocampe et les lames 4 et 5 du cortex. Les

cellules de l’hypophyse antérieure et postérieure présentent également des récepteurs

aux glucocorticoïdes (Mcgimsey et al., 1991). Cette large distribution dans le système


78

nerveux central est le support anatomique de très nombreuses actions des

glucocorticoïdes sur les fonctions cérébrales

d) Régulation de l’axe corticotrope

Différentes structures centrales telles que l’amygdale et l’hippocampe sont

impliquées dans la régulation de l’axe corticotrope. L’amygdale possède un rôle

facilitateur dans les effets du stress (Allen et Allen, 1974; Ishihara et al., 1964). En

effet, une stimulation de l’amygdale provoque une augmentation de la libération de

glucocorticoïdes par le cortex des glandes surrénales (Slusher et Hyde, 1961) et sa

destruction bilatérale modifie les concentrations plasmatiques de corticostérone chez le

rat (Knigge et Hays, 1963). En revanche, l’hippocampe semble jouer un rôle inhibiteur

sur l’activité de l’axe HPA (Jacobson et Sapolsky, 1991). Une lésion au niveau de cette

structure induit une augmentation des taux plasmatiques de corticostéroïdes et d’ACTH

(Wilson et al., 1980). La présence de récepteurs aux glucocorticoïdes au niveau de cette

structure participe à l'efficacité de ces mécanismes de rétrocontrôle négatif (Sapolsky et

al., 1984).

Ce circuit central est soumis à un rétrocontrôle via les projections sérotoninergiques à

partir du noyau raphé et noradrénergiques à partir du locus coeruleus, qui exercent une

action stimulatrice dans la réponse au stress (Sternberg et al., 1992). Au contraire, une

régulation négative est exercée par les systèmes GABAergiques et opioïdes centraux. Le

GABA et les opioïdes exercent un effet inhibiteur sur l’activation de l’axe HPA et

réduisent la libération de différents médiateurs en réponse à des stimuli stressants (Jones

et al., 1984).

e) Neurotransmetteurs et contrôle de l’axe HPA

Les neurones à CRF et les neurones noradrénergiques sont en étroite connexion

au niveau du système nerveux central. Le CRF est capable de stimuler la sécrétion de

noradrénaline, elle même capable de stimuler la libération de CRF par l’intermédiaire

des récepteurs α1-adrénergiques (Saper et al., 1976). Une composante β-adrénergique

se révèle être de nature inhibitrice. En fait, la réponse de l’axe HPA à une stimulation

stressante est relativement lente comparée à l’activation du système nerveux

sympathique qui est activé dans un délai très court (quelques secondes) suite au


79

stimulus. Ceci est clairement mis en évidence par l’apparition rapide de catécholamines

au niveau sanguin (Kvetnansky et al., 1993).

Dans le cas d’une exposition prolongée des cellules de l’hypophyse antérieure au

CRF, on observe une désensibilisation des récepteurs au CRF (Aguilera et al., 2001;

Catt et al., 1979). Cet effet reflète une diminution de la capacité du CRF à induire la

libération d’ACTH, conséquence d’une régulation négative sur les récepteurs au CRF

induite par les glucocorticoïdes.

Il existe également une modulation de la sécrétion d’ACTH au niveau

hypophysaire, impliquant différents mécanismes. Les glucocorticoïdes peuvent être à

l’origine d’un rétrocontrôle négatif sur la libération d’ACTH soit en agissant au niveau

post-transcriptionnel, soit en inhibant l’activité phospholipase A2 impliquée dans les

mécanismes intracellulaires de sécrétion (Hirata et al., 1980). La libération d’ACTH

peut aussi être stimulée par les catécholamines via une action directe sur les cellules de

l’hypophyse antérieure. Par un mécanisme indirect, les catécholamines peuvent agir en

synergie avec l’AVP et le CRF pour favoriser la sécrétion d’ACTH (Giguere et Labrie,

1983).

1.2.2. L'axe catecholaminergique

Au cours du stress, on observe une rapide augmentation de l’activité du système

nerveux sympathique, mais aussi de la zone médullaire des glandes surrénales. Cette

activité conduit à la libération de catécholamines (adrénaline et noradrénaline) dans la

circulation sanguine. La synthèse et la libération d’adrénaline résultent principalement

de la mise en jeu de la zone médullaire des surrénales, suite à une modulation du

système enzymatique, lui-même régulé par l’ACTH ou les glucocorticoïdes. La

libération de noradrénaline est majoritairement issue de la stimulation des nerfs

sympathiques.

Les effets des catécholamines sont dirigés vers les organes cibles impliqués dans

la défense de l’organisme, permettant une mobilisation et une augmentation des réserves

énergétiques. Ainsi, les catécholamines provoquent une augmentation de la pression

artérielle, une redistribution de l’irrigation sanguine en faveur des organes de défense

(muscles, cerveau…), par le jeu de vaso-dilatation ou constriction, et une augmentation

du rythme respiratoire (Mills et al., 1990; Nakamura et al., 1990). Les effets


80

métaboliques impliquent une augmentation de la dégradation du glycogène en glucose

au niveau musculaire, et une augmentation de la lipolyse, un rétro-contrôle favorisant la

synthèse de catécholamines et réduisant leur catabolisme (Yamada et al., 1993).

1.3. La protéine c-Fos activée cours du stress

L’une des approches la plus couramment utilisées pour caractériser les

différentes régions du système nerveux centrale (SNC) activées au cours d’un stress est

la mise en évidence de la protéine c-Fos, un marqueur d’activité neuronale (voir revue

pour Semba et al., 1997).

La protéine c-Fos intervient comme facteur de transcription nucléaire dans

l’expression de certains gènes impliqués dans la réponse adaptative à différents stimuli

(Morgan and Curran, 1990). En effet, une expression importante d’ARNm c-fos retrouvé

dans les neurones est le résultat de l’action de neurotransmetteurs induisant la

dépolarisation et/ou l’activation synaptique des neurones (Hugues et Dragunow, 1995).

L’induction de l’expression de la protéine c-Fos est alors utilisée dans de nombreuses

études pour cartographier les régions du SNC mises en jeu au cours de différents stimuli

tels que le stress (Crane et al., 2005; Herrera et Robertson, 1996; Kovacs, 1998). Ainsi,

la protéine c-Fos n’est pas seulement un marqueur indirect de l’activité neuronale, mais

également un reflet des modifications à long terme que peut provoquer une stimulation

(Zimmerman et al., 1994).

Plusieurs études ont montré un profil spécifique de l’expression de la protéine c-

Fos au niveau de différentes régions du SNC selon le modèle de stress tels que stress de

contrainte ou stress par immobilisation (Stone and Zhang, 1995), la nage forcée

(Duncan et al., 1993), la stimulation douloureuse (Bullitt, 1990), une inflammation

périphérique (Ericsson et al., 1994) ou un stress hyperosmotique (Ceccatelli et al.,

1989) (Figure 24).


81

Figure 24 : Distribution cérébrale de la protéine c-Fos induite par différents stimuli. LS, Septum lateral ; BST, strie terminale ; PVN pv, division parvocellulaire du noyau hypothalamique paraventriculaire ; PVN mg, division magnocellulaire du noyau hypothalamique paraventriculaire ; SON dors, partie dorsale du noyau supraoptique ; Thal PV, noyau thalamique paraventriculaire ; AMe noyau amygdale médian ; ACe, noyau amygdale central (Senba et Ueyama, 1997).

Le modèle de stress de contrainte ou PRS (partial restraint stress) présente à la

fois une composante physique et une composante psychologique. L’étude de l’influence

de différents types de stress sur le transit intestinal chez le rat a révélé un effet plus

important du stress de contrainte comparé à un stress strictement physique (nage forcée)

ou psychologique (exposition à un prédateur). De plus, ce modèle de stress est associé à

une hypersensibilité viscérale en réponse à un stimulus douloureux (Gue et al., 1997).

Le stress de contrainte, contrairement à d’autres modèles de stress physique (nage

forcée) ne conduit pas à la formation d’ulcères.

L’hyperalgésie viscérale induite par le stress est généralement associée à une

analgésie somatique. En effet, un stress de contrainte aigu chez le rat entraîne une

diminution de la sensibilité somatique, évaluée par le modèle de « tail flick » (Gamaro

et al., 1998 ; Appelbaum et Holtzman, 1985). Ce type de réponse est également observé

dans des modèles de stress environnemental ou de choc électrique au niveau de la patte

Exposition à Immobilisation douleur Il-1β Histamine stress prédateur hyperosmotique

+ + + + + +

-

- - + + + +

- - - +/- + +

- - - +/- + +

- - + + + +

LS

BST

PVN pv

PVN mg

SON dors

SON

Thal PV

AMe

ACe

+ + + + + +

+ + + + +

+ + + + + +

+ + + + + +


82

(Jakoubek, 1984). Ce phénomène d’analgésie somatique induite par le stress correspond

à l’activation des voies descendantes inhibitrices de la douleur, impliquant les systèmes

opioïdes, glutaminergiques et sérotoninergiques. Néanmoins, cette réaction est

dépendante de la chronicité du stress pouvant conduire au développement d’une

hyperalgésie somatique (Gamaro et al., 1998, Metz et al., 2001).

2. Stress et altérations des fonctions digestives : les Troubles Fonctionnels

Intestinaux

2.1 Généralités

Dés 1902, Cannon décrivait chez le chat exposé à la présence d’un chien

agressif, l’existence d’altérations de la motricité gastro-intestinale. Chez l’homme,

l’application de stress expérimentaux provoque des modifications immédiates de la

motricité gastro-intestinale (Stanghellini et al., 1983). Différents modèles de stress chez

le rongeur ont permis de confirmer l’induction de troubles de la motricité et du transit

intestinal par le stress. Plus récemment, les effets du stress sur la fonction digestive ont

été associés à des modifications de la sensibilité douloureuse mais aussi de la réponse

inflammatoire. Les troubles fonctionnels intestinaux (TFI) sont le reflet clinique d’une

influence des facteurs psychosociaux et du stress sur la fonction digestive.

L’hétérogénéité de la symptomatologie clinique au cours des TFI a nécessité la

mise en place de critères diagnostiques basés principalement sur les signes cliniques

évoqués à l’interrogatoire. Les critères de Manning (Manning et al., 1978) ont permis

une première standardisation dans la sélection des patients, suivie d’une seconde

classification selon les critères de ROME I (Drossman et al., 1990). Cette dernière a fait

l’objet d’une révision tenant compte des données scientifiques aboutissant aux critères

de ROME II (Drossman, 2000) et plus récemment aux critères de Rome III (Drossman,

2006).

Les TFD (les troubles fonctionnels digestifs) constituent un ensemble de

pathologies incluant la dyspepsie non ulcéreuse, la douleur thoracique non angineuse et

les troubles fonctionnels intestinaux encore appelés syndrome de l'intestin irritable (SII).

Ce syndrome est caractérisé par l'existence de douleurs abdominales, associées à un

trouble du transit intestinal en l'absence de pathologie organique. Chez les patients


83

souffrant de SII, la relation entre stress et sévérité des symptômes est très bien décrite,

montrant une réponse anormale au stress du système nerveux autonome, de l'axe HPA

et de la perception de la douleur viscérale (Mayer, 2000). Cependant, l’origine de cette

hypersensibilité viscérale dans le SII paraît de plus en plus être la conséquence d’un état

inflammatoire. Les patients SII peuvent être classés en trois groupes : les patients SII à

prédominance diarrhée (SII-D), constipation (SII-C), ou alternance des deux (SII-A).

Un autre sous groupe de patients présente des symptômes de SII à la suite d’une gastro-

entérite infectieuse: SII post-infectieux ou SII-PI.

2.2. Stress et sensibilité viscérale

2.2.1. Nature des effets

Parmi les symptômes de SII, les douleurs abdominales constituent l’élément

principal qui définit le syndrome. L’abaissement du seuil douloureux digestif à

différents stimuli, notamment mécaniques comme la distension luminale amène les

patients SII à percevoir de façon pénible ou douloureuse des stimuli qui, habituellement,

sont soit non perçus, soit ressentis de façon non désagréable par des volontaires sains

(Bradette et al., 1994; Trimble et al., 1995). Des épisodes de stress sévères (abus

physique ou sexuel) dans l’enfance ou l’adolescence représentent un facteur de risque

particulièrement important de développement de troubles fonctionnels intestinaux

durant la vie adulte (Drossman, 1997). D’autres types de stress apparaissant au cours de

la vie (séparation, situation financière critique…) lorsqu’ils sont perçus comme une

menace, sont associés à l’apparition transitoire des symptômes, ou leur exacerbation

(Creed, 1999).

Chez l’animal, un stress de contrainte ou un stress par immobilisation induit un

abaissement d’environ 30 à 40 % du seuil de la sensibilité viscérale sans modification

du tonus musculaire (Barone et al., 1990; Gue et al., 1997; Williams et al., 1988). De

plus une hypersensibilité viscérale a été observée chez les rats Wistar-Kyoto,

caractérisée par une forte anxiété (Gunter et al., 2000). Un stress chimique appliqué au

niveau du côlon chez les nouveaux nés entraîne une hypersensibilité viscérale chronique

en absence d’inflammation (Al-Chaer et al., 2000). Des évènements stressants au cours

de la période néonatale peuvent également altérer la sensibilité viscérale. En effet, une

séparation maternelle des rats prédispose l’animal à développer à l’âge adulte une


84

hyperalgésie viscérale en réponse à un stress psychologique (Barreau et al., 2004;

Coutinho et al., 2000; Rosztoczy et al., 2003).

2.2.2. Mécanismes impliqués

Les mécanismes décrits dans les altérations de la sensibilité viscérale par le

stress sont à la fois périphériques et centraux. Comme pour les troubles moteurs, le CRF

est impliquée dans l’hypersensibilité viscérale via un effet central puisque l’effet d’un

stress de contrainte sur la sensibilité colique est bloqué par l’administration d’un

antagoniste des récepteurs au CRF (α-hélical CRF9-41) (Gue et al., 1997).

L’hypersensibilité paraît avoir également une origine périphérique, impliquant les

mastocytes au niveau du côlon. En effet, il a été observé une étroite corrélation entre le

nombre de mastocytes ou leur degré de dégranulation et la sévérité des symptômes

(Barbara et al., 2004). La substance P, via une activation des récepteurs NK1 entraîne la

dégranulation des mastocytes libérant ainsi des médiateurs tels que l’histamine, les

cytokines, la tryptase ou le NGF (nerve growth factor) capable d’agir sur les

terminaisons des neurones afférentes primaires digestifs (Bradesi et al., 2002). Ceux-ci,

par un réflexe d’axone, libéreraient alors différents neurotransmetteurs à l’origine d’une

boucle d’amplification favorisant une sensibilisation des terminaisons sensitives et

l’apparition d’un état d’hypersensibilité (Bueno et al., 2000) (Figure 25).


85

Figure 25 : Mécanismes par lequel le stress favorise le développement d’une

hypersensibilité viscérale (Bradesi et al., 2002).

Le rôle de l’activité sympathique dans la sensibilité a été confirmé par une étude

montrant une augmentation de la sensibilité duodénale à la distension consécutive à une

activation sympathique chez l’homme (Iovino et al., 1995).

Différentes études sur des modèles animaux ont permis d’emettre l’hypothèse du

rôle probable du locus coeruleus (Elam et al., 1986), qui reçoit les informations des

fibres afférentes viscérales. Cette région participe à l’activation du système nerveux

autonome et est impliquée dans les mécanismes de contrôle endogène de la douleur.

L’activation de cette région centrale au cours du stress suppose son implication dans les

altérations de la sensibilité viscérale chez les patients SII.

2.3. Stress et immunité

2.3.1. La composante inflammatoire

L’implication de l’axe neuro-immun dans la physiopathologie du SII est

désormais prise en compte et la composante inflammatoire semble jouer un rôle

important dans l’émergence du SII ainsi que dans sa persistance.


86

En effet, il existe chez les patients SII post-infectieux (SII-PI) une étroite

corrélation entre le maintien de la réaction inflammatoire et les symptômes

d’hypersensibilité. La persistance du processus inflammatoire au niveau de l’épithélium

colique a été associée à une augmentation des cellules entérochromaffines et de

lymphocytes intraépithéliaux (Dunlop et al., 2003; Spiller et al., 2000). Plus récemment,

des études sur le taux des cytokines dans le sang périphérique et le sérum ont décrit un

état inflammatoire chez les SII (Dinan et al., 2006). La présence d’une infection peut

aussi expliquer l’augmentation des mastocytes au niveau iléal et colique souvent décrit

chez les patients SII (Barbara et al., 2004; Dunlop et al., 2003; O'sullivan et al., 2000;

Wang et al., 2004). Cependant, chez certains patients SII ne présentant pas

d’antécédents infectieux, une augmentation des cellules CD25+ dans la lamina propria

est observée (Chadwick et al., 2002). En revanche, chez les patients souffrant de forts

symptômes, un faible degré d’infiltration des lymphocytes est alors décrit au niveau du

plexus myentérique (Tornblom et al., 2002). Par ailleurs, le risque de développer un SII-

PI est plus élevé lorsque le facteur stressant (Gwee et al., 1999) ou un fort degré

d’anxiété, la dépression, la somatisation interviennent après un épisode d’infection

gastro-intestinale.

2.3.2. Mécanismes impliqués dans l’activation du système

immunitaire par le stress

L’influence du stress sur l’activité du système immunitaire fait intervenir le

système sympathique et hypothalamo-hypophyso-surrénalien impliqués dans la réponse

au stress. Plus généralement, le stress aggrave les mécanismes inflammatoires où les

cellules immunitaires reconnaissent et répondent aux hormones et neuropeptides

impliqués dans la réponse au stress

L’ensemble des organes lymphoïdes (thymus, rate, ganglions) est innervé

essentiellement par le système sympathique (Felten et al., 1991). La distribution des

fibres nerveuses noradrénergiques au niveau de ces organes est le support anatomique

d’une interaction fonctionnelle entre les cellules effectrices du système immunitaire et

cette innervation (Felten et al., 1987). L’hypothèse d’un effet direct des catécholamines

sur les cellules immunitaires est soutenue par la présence de récepteurs adrénergiques

exprimés sur les lymphocytes T et B, les macrophages, les polynucléaires neutrophiles


87

et les cellules NK (natural killer) (Fuchs et al., 1988 ; Loveland et al., 1981 ; Motulsky

et al., 1982). De nombreuses études in vivo et in vitro ont montré un rôle modulateur

des catécholamines sur la migration et la prolifération lymphocytaire, sur la sécrétion

d’anticorps, l’activité cytotoxique et l’activation des macrophages (Koff et al., 1985 ;

Melmon et al., 1974).

Le rôle des glucocorticoïdes dans la modulation du système immunitaire a fait

l’objet de nombreuses études dont les conclusions dégagent, en général, un effet

immunosuppresseur de ces hormones stéroïdes. Les effets des glucocorticoïdes sur les

acteurs de la réponse immunitaire peuvent être médiés par une action directe par

l’intermédiaire de récepteurs spécifiques. Ainsi, les glucocorticoïdes inhibent

l’expression des protéines d’adhésion cellulaire, la migration lymphocytaire, l’activation

des macrophages, le processus de présentation des antigènes en inhibant l’expression du

complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II); ils inhibent également

l’activation, la prolifération et la cytotoxicité des lymphocytes T, et la production

d’anticorps par les lymphocytes B. A ces effets immunosuppresseurs s’ajoute un rôle

immunomodulateur des glucocorticoïdes, caractérisé par la stimulation de la production

de cytokines anti-inflammatoires (IL4 et IL10) et l’inhibition de la production d’IL2 et

d’interféron gamma (IFNγ) à tendance pro-inflammatoire (Elenkov et al., 1999 ;

Ashwell et al., 2000). Dans le cas de situation de stress sévère ou chronique, ces

modifications du profil immunitaire peuvent être à l’origine d’une susceptibilité

exacerbée des sujets stressés aux pathologies infectieuses. D’autres médiateurs de l’axe

corticotrope, tels que le CRF ou l’ACTH sont également des candidats pouvant moduler

la fonction immunitaire. En effet, des récepteurs au CRF et à l’ACTH ont été décrits au

niveau de différentes cellules effectrices (Webster et al., 1991 ; Bost et al., 1987).

2.4. Stress et perméabilité épithéliale

2.4.1. Effet du stress sur la perméabilité épithéliale intestinale

L’hypothèse selon laquelle une augmentation de la perméabilité de l’épithélium

est à l’origine des symptômes en particulier de la douleur viscérale est de plus en plus

prise en compte. Le stress rend la muqueuse intestinale plus vulnérable au stimulus

inflammatoire entraînant ainsi une augmentation de la perméabilité intestinale (Collins,


88

2001). La présence d’une infiltration lymphocytaire dans la muqueuse intestinale

associée à une augmentation de la perméabilité suggère donc l’importance de

l’inflammation dans la génèse des SII-PI (Spiller et Campbell, 2006).

Chez l’homme, cette hypothèse n’a pas reçu de confirmation. Cependant,

certains travaux vont dans ce sens. Ainsi, chez les sujets SII diarrhéiques, post-

infectieux ou non, des modifications de la perméabilité paracellulaire intestinale et

colique ont été observées (Spiller et al., 2000; Marshall et al., 2004). Il a été également

montré chez les volontaires sains qu’un stress psychologique influence l’absorption

intestinale entraînant des altérations de la perméabilité intestinale. Ces effets sont abolis

par l’atropine suggérant l’implication des voies parasympathiques cholinergiques

(Barclay et Turnberg, 1987).

Chez l’animal les données sont plus éloquentes et de nombreux travaux ont

étudié les effets du stress sur la perméabilité paracellulaire et transcellulaire. Cette

perméabilité transcellulaire est dépendante d’une bonne continuité des couches

épithéliales interconnectées par les jonctions serrées (Chapitre 2, paragraphe 2.3).

Sauders et al. (1994) ont montré une augmentation de la conductance épithéliale, ainsi

que le passage paracellulaire de sondes inertes telles que le mannitol et le Cr-EDTA

chez les rats stressés, bien que la structure de la muqueuse observée en microscopie

semble normale. Kiliaan et al. (1998) ont aussi observé, chez les rats ayant subi un

stress de 24h, une augmentation du flux transépithélial de la « horsehadish peroxydase »

caractérisé par la présence de cette molécule au niveau des endosomes entérocytaires.

Parallèlement, à ces altérations de la perméabilité transcellulaire et paracellulaire,

l’application d’un stress aigu est également décrite pour altérer la résistance de

l’épithélium digestif et, les échanges ioniques entérocytaires associés à un phénomène

de translocation bactérienne (Santos et al., 1999). Chez le rat, ce phénomène de

translocation bactérienne a été récemment étudié et les résultats ainsi obtenus ont

montré que cette dernière était principalement localisée au niveau des plaques de Peyer

(Velin et al., 2004). Une étude clinique suggère que les répercussions d’un stress

chronique sont beaucoup importantes que celles d’un stress aigu et que ce stress

chronique pourrait augmenter le risque d’exacerbation d’une recto-colique

hémorragique (Levenstein et al., 2000). Ainsi, sur un modèle de stress chronique où les

rats adultes sont immergés dans l’eau 1 heure par jour pendant plusieurs jours, Santos et


89

al. (2000) ont montré une augmentation de la perméabilité transcellulaire (flux

d’horsehadish peroxydase) et de la conductance épithéliale chez des rats stressés. Chez

la souris, une session de stress répétées (ultrasons et contrainte) entraîne une

augmentation de la perméabilité paracellulaire par un mécanisme mettant en jeu les

lymphocytes CD4+, également associé à une translocation bactérienne au niveau du foie

(Ferrier et al., 2003). Un stress chronique peut aussi stimuler l’adhésion des bactéries

aux niveaux des cellules épithéliales via un mécanisme dépendant des mastocytes

(Soderholm et al., 2002).

Actuellement, certaines études suggèrent que les altérations chroniques de la

flore entérique peuvent jouer un rôle dans le développement des SII. Ainsi, une

différence significative est observée dans le nombre de bactéries endogènes (Madden

and Hunter, 2002; Malinen et al., 2005) et leur activité fermentaire (King et al., 1998)

au niveau de la microflore entérique entre les patients SII et les contrôles. Ces

changements qualitatifs de la flore colique peuvent entraîner la prolifération d’espèces

favorisant la production de gaz (King et al., 1998) et d’acides gras à chaîne courte, qui à

leur tour modifient le transport d’électrolyte et d’eau dans le côlon et affectent la

motricité et/ou la sensibilité colique. Plus récemment, une augmentation de la

colonisation bactérienne au niveau de l’intestin a été décrite chez les patients SII,

associée à une fréquence anormale du complexe moteur migrant (Pimentel et al., 2003).

L’utilisation d’antibiotiques chez les patients SII, détruisant provisoirement la flore

entérique normale, facilite le passage de bactéries pathogènes, de toxines et d’antigènes

(Maxwell et al., 2002). Ceux-ci peuvent être à l’origine de réponses inflammatoires

locales associées à une présence accrue d’immunocytes et surtout de médiateurs de

l’inflammation.

2.4.2. Mécanismes impliqués dans les altérations de la

perméabilité

Parmi les médiateurs impliqués dans l’augmentation de la perméabilité induite

par un stress aigu ou chronique, l’implication du système cholinergique de l’axe

corticotrope (CRF et glucocorticoïdes) et des mastocytes ont largement été étudiés.

Les médiateurs de l’axe corticotrope, tels que le CRF et les glucocorticoïdes,

sont connus pour participer au développement des altérations digestives (Santos et al.,


90

1999; Saunders et al., 2002). En effet, l’administration périphérique de corticolibérine

reproduit les effets du stress sur la perméabilité colique (Santos et al., 1999) en activant

les mastocytes. En revanche, les effets du stress sur la muqueuse colique sont abolis

après un traitement au doxantrazole (stabilisateur mastocytaire) ou après administration

d’un antagoniste non sélectif des récepteurs au CRF (α-helical CRF9-41). La

participation des mastocytes, leur dégranulation et leur prolifération est bien décrite

dans les altérations de la perméabilité intestinale en réponse à un stress. Meddings et al.,

ont caractérisé l’implication d’un autre médiateur, la corticostérone, dans les altérations

de la perméabilité induite par un stress. Ainsi, ces auteurs ont montré qu’une

adrenalectomie ou un blocage pharmacologique des récepteurs à la corticostérone par le

RU 486, prévient l’augmentation de la perméabilité intestinale (Meddings and Swain,

2000).

Plus généralement, les mastocytes ainsi que les médiateurs de l’axe corticotrope

(corticolibérine et corticostérone) jouent un rôle primordial dans les dysfonctionnements

de la barrière épithéliale induits par un stress, et démontre également les interactions

entre corticolibérine et mastocytes dans la régulation de la perméabilité intestinale lors

d’un stimulus stressant.

L’ensemble de ces données montre que l’interface entre la lumière intestinale et

les voies nerveuses endocrines et immunitaires est sous le contrôle de système nerveux

autonome (Figure 26). Des altérations de celle-ci, dans le cas d’un déséquilibre de

l’allostasie, sont donc susceptibles d’induire des variations des secrétions, de la

motricité, de l’inflammation, et de la sensibilité de l’intestin lors du SII.


91

Figure 26 : Mécanismes physiopathologiques du SII (Kellow et al., 2006).

3. Probiotiques et Troubles Fonctionnels Intestinaux

Face à l’absence de traitement efficace du SII à l’heure actuelle, les traitements

probiotiques ont commencé à être évalués en tant qu’agents thérapeutiques dans cette

pathologie. En effet, les probiotiques sont connus pour leur action potentielle sur la

flore, mais également pour leurs propriétés anti-inflammatoires intestinales et leur

pouvoir immunomodulateur. Concernant les bases rationnelles pour l’utilisation des

probiotiques dans le SII en tant qu’outil thérapeutique, trois arguments peuvent être

avancés :

3.1. Normalisation de la microflore, effets métaboliques

Certains patients SII qui présentent des modifications quantitatives de leur flore

au niveau de l’intestin grêle, on parle encore de patients SIBO pour « small intestinal

bacterial overgrowth » (Lin, 2004; Lee et Pimentel, 2006), présentent également une

anomalie des fonctions motrices (Pimentel et al., 2003). Des changements qualitatifs de

la flore colique entraînent la prolifération d’espèces favorisant la production de gaz et

d’acides gras à chaîne courte, modifiant ainsi la perméabilité colique (King et al., 1998).

D’ailleurs, une récente étude a montré que la normalisation de la flore par la Neomycine

Predisposing factors

Psycho-physiological factors

Concurrent modifiers

CNS-ENS dysregulation

Clinical manifestations

Genetic

Early life

Environmental

Chronic life stress and effortful coping

Enteric infection and inflammation

Stress response neuromodulation

Gender, personality,

mood, autonomic dysfunction

Live event stress? Diatery components? Altered enteric flora

Mucosal immune activation

CNS

ENS

Cortical arrousal

Visceral hypersensitivity

Altered Epithelial

permeability

Dysmotility

IBS

EI Symptoms

GI Symptoms


92

réduit la sévérité de la constipation et soulage les symptômes (douleur abdominale, …)

chez les patients SII-C (Pimentel et al., 2006).

Une repopulation de la flore à l’aide de l’administration de probiotique peut être

utilisée dans la restauration de la microflore commensale. Ainsi, l’efficacité de ces

probiotiques peut s’expliquer, soit par des changements qualitatifs et quantitatifs de la

flore colique, soit par la suppression du SIBO. Zareie et al. (2006) ont récemment

montré que les probiotiques diminuaient la translocation bactérienne aux cellules

épithéliales et prévenait ainsi de l’activation du système immunitaire. Une autre étude a

montré des modifications de l’activité métabolique et la composition de la microflore

fécale humaine après administration de probiotiques chez les patients SII (Brigidi et al.,

2001). En effet, l’une des principales propriétés des probiotiques est leur activité

antibactérienne et antivirale. Leur activité antimicrobienne est médié par la sécrétion

directe de bactériocines (Cotter et al., 2005), la production de protéases (Castagliuolo et

al., 1999) dirigées contre les toxines bactériennes, ou encore par leur capacité à adhérer

aux cellules épithéliales et aussi à exclure les pathogènes. Ces propriétés expliquent

sans doute les effets positifs observés chez les patients SII-PI où l’activité

antibactérienne des probiotiques pourrait bien jouer un rôle dans la prévention de 5 % à

10 % de SII susceptibles de développer un épisode de gastro-entérite (Spiller, 2003).

3.2. Effets immunomodulateurs et propriétés anti-inflammatoires

De nombreux travaux ont démontré une relation directe entre le SII et

l’activation du système immunitaire. Des biopsies de côlon ont montré dans certains cas

la présence d’une inflammation et dans d’autres cas l’activation des cellules

immunitaires (Chadwick et al., 2002). Plus récemment, une étude sur le taux de

cytokines présent dans le sang périphérique et le sérum a montré la présence d’un état

inflammatoire chez les patients SII (Dinan et al., 2006). De plus, chez les patients SII-

PI, une persistance du processus inflammatoire au niveau de l’épithélium colique a été

observée et corrélée avec une augmentation des cellules entérochromaffines et de

lymphocytes intraépithéliaux (Dunlop et al., 2003; Spiller et al., 2000).

Dans un modèle expérimental d’inflammation colique, l’administration de différents

probiotiques et de cocktail de probiotiques ont démontré des propriétés anti-

inflammatoires supprimant ainsi l’inflammation au niveau de la muqueuse colique et


93

restaurant la balance des cytokines vers un statut anti-inflammatoire (Rachmilewitz et

al., 2004). Chez l’homme, le cocktail de probiotiques VSL#3, composé de

Streptococcus thermophilus et différentes espèces de lactobacilles et de bifidobactéries,

a montré une stimulation de cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et une diminution de

la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12. Dans la même étude, une

évaluation détaillée de différents micro-organismes de ce cocktail a montré que

l’activité immunomodulatrice la plus importante était médié par l’espèce bifidobactéries

(Hart et al., 2004). De la même façon, l’administration de Bifidobacterium infantis

35624 diminue les symptômes chez les SII avec un retour à un niveau de base du

rapport de cytokines IL-10/IL-12 (O'mahony et al., 2005). Les probiotiques possèdent

également un potentiel certain dans la modulation de la motricité et l’infestation

intestinale (Verdu et al., 2004). Dans des modèles expérimentaux, une administration

orale de probiotiques a montré une régression de l’état inflammatoire au niveau de site

éloigné de l’intestin comme le foie (Li et al., 2003) ou les articulations présentant une

arthrite (Sheil et al., 2004). Ces probiotiques peuvent aussi être efficaces sur des sites

extra-intestinaux.

Par conséquent, les probiotiques peuvent, en théorie, reverser plusieurs des

processus impliqués dans l’initiation et la perturbation de l’hypersensibilité viscérale

par une activation du système immunitaire.

3.3. Effet neuro-immunomodulateur

Depuis longtemps, les anomalies de la motricité et de l’hypersensibilité viscérale

ont été considérées comme des facteurs dominants dans la physiopathologie du SII. A

présent, l’hypersensibilité viscérale est décrite comme un phénomène ubiquitaire dans le

SII, avec une anomalie de la motricité non-spécifique, ou un épiphénomène (Quigley,

2005). On ne peut pas nier le rôle de l’altération de la motricité dans la

symptomatologie du SII qui semble être secondaire par rapport à d’autres facteurs

étiologiques primaires. L’un des facteurs primaires les plus souvent admis dans la

littérature comme responsables d’un dysfonctionnement moteur, est l’activation du

système immunitaire qui entraîne ainsi une augmentation de l’activité des voies

sensitives au niveau de l’intestin (Collins, 2002). D’ailleurs, Barbara et al. (2004) ont

montré qu’il existait une étroite corrélation entre la proximité des cellules mastocytaires


94

aux éléments nerveux et la sévérité de la douleur. L’existence d’un lien entre le système

nerveux central et le système immunitaire a été récemment décrite chez les patients SII.

En effet, Dinan et al. (2006) ont observé des niveaux élevés de cytokine IL-6 pro-

inflammatoire, dans le plasma chez presque tous les patients SII, corrélé avec une

réponse exagérée en ACTH et cortisol en réponse à une administration de CRF. Des

études expérimentales chez l’animal ont également montré la capacité des cytokines

pro-inflammatoires et du TNFα, en particulier, à influencer l’axe HPA (Beishuizen et

Thijs, 2003).

Actuellement, très peu d’études ont mis en évidence une influence directe des

probiotiques sur le système nerveux central. Néanmoins, l’hypothèse que les

probiotiques influencent les neurotransmetteurs au niveau du système nerveux entérique

ne peut être exclue. D’ailleurs, seule une étude rapporte les modifications de localisation

des neurotransmetteurs au niveau du système nerveux myentérique du jéjunum de porc

traité par un probiotique (Kamm et al., 2004).

3.4. Quelques essais thérapeutiques et préventifs

Depuis une dizaine d’années, un petit nombre d’études cliniques contrôlées en

double aveugle, montrant l’efficacité des probiotiques chez les patients SII, a été publié.

Les résultats entre ces différentes études sont difficiles à comparer notamment à cause

du protocole, des doses et du type de souches utilisés. Plusieurs essais randomisés ont

suggéré l’efficacité positive de certaines souches probiotiques, d’autres ont été négatifs.

Cependant, le niveau de preuve est insuffisant pour des recommandations cliniques

mais il existe un intérêt considérable des cliniciens et industriels dans ce domaine.

La première étude a été réalisée avec Lactobacillus acidophilus LB détruit par la

chaleur (Lacteol fort®) et son milieu de culture utilisé comme placebo (Halpern et al.,

1996). Même si seulement 18 patients ont participé à cette étude, l’administration de L.

acidophilus LB pendant 6 semaines s’est révélée être plus efficace que le placebo pour

soulager les symptômes de l’intestin irritable chez 50 % des patients. King et al. (1998)

ont décrit qu’une partie de la population atteintes du SII présentait une fermentation

colique anormale. D’ailleurs, une étude clinique réalisée avec Lactobacillus plantarum

299V a montré une réduction du symptôme de flatulence et par conséquent une

diminution de la douleur abdominale (Nobaek et al., 2000). Cependant, une autre étude


95

utilisant la même préparation de Lactobacillus plantarum 299V a montré que ce

probiotique était incapable de modifier la fermentation colique ou de confirmer les

effets bénéfiques observés dans les études cliniques (Sen et al., 2002). Une suspension

de Lactobacillus plantarum 299V a été utilisée dans une autre étude où 95 % des

patients vs. 15 % du groupe placebo présentaient un net soulagement de leurs

symptômes (Niedzielin et al., 2001). Des essais conduits avec Lactobacillus rhamnosus

GG tué par la chaleur n’ont pas montré une diminution de la douleur chez les patients

SII, mais il semblerait que ce probiotique ait un effet positif sur les patients SII à

tendance diarrhéique (O’Sullivan et al., 2000). Cela encourage donc la réalisation de

travaux chez des malades constipés ou diarrhéiques. Récemment, un essai mené chez 20

malades a suggéré un effet bénéfique du mélange de probiotiques VSL#3 pour soulager

les ballonnements, mais les autres symptômes tels que la douleur abdominale ou la

production de gaz n’ont pas été modifiés (Kim et al., 2003). Cependant, ce même

cocktail de probiotiques aurait un effet sur la modification de la composition de la

microflore fécale. Une autre étude récente a évalué les effets de Lactobacillus salivarus

UCC4331 et de Bifidobacterium infantis 35624 sur une sous-population de patients SII

et seul B. infantis 35624 est capable de soulager les symptômes chez les patients

souffrant de SII (O’Mahony et al., 2005). Ce résultat est associé une normalisation de la

balance de cytokines pro- et anti inflammatoires (rapport IL-10/IL-12), suggérant ainsi

un rôle immunomodulateur de B. infantis. Cette étude montre bien que les effets

observés sont souche dépendants. De façon intéressante, par l’utilisation de modèle SII-

post infectieux et de différents probiotiques, il a été montré qu’une restauration normale

de la contractilité intestinale était dépendante de la souche utilisée. Parmi tous ces

probiotiques, Lactobacillus paracasei NCC2461 prouve la meilleure efficacité dans la

diminution de la contractilité induite par une infection (Verdu et al., 2004).

Ces données suggèrent donc que certains probiotiques pourraient devenir des

thérapies efficaces chez les patients souffrant du SII (Tableau 4).


96

Tableau 4: Etudes cliniques récentes testant les effets des préparations probiotiques

sur les patients SII.

à la dose de 108 CFU

Whorwell et al., 2006 soulagement des symptomes Bifidobacterium infantis 35624

mais diminue la sensibilité à une distension

pas d’effet sur la douleur abdominale Bausserman et al., 2005 IBS chez l’enfant : Lactobacillus GG

constipation et la flatulence Niv et al., 2005 tends à soulager de la Lactobacillus reuterii

Kajander et al., 2005 soulagements à 6 mois 4 probiotiques : Lactobacillus rhamnosus GG et LC705

Bifidobacterium breve, Propionibacterium freudenreichii

des ballonements

chez les patients SII avec

Kim et al., 2005 diminution de la flatulence

chez les patients SII diarrhéiques

Kim et al., 2003 diminution des ballonnements

Sen et al., 2002 pas d'effet Lactobacillus plantarum

O'Sullivan et al., 2000 pas d'effet Lactobacillus casei GG

diminution de la douleur Lactobacillus plantarum

abdominales et flatulence

Nobaek et al., 2000 diminution des douleurs Lactobacillus plantarum

Gade and Thorm, 1989 soulagement douleur abdominales Streptococcus faecium

REFERENCES EFFETS BIOLOGIQUES PROBIOTIQUES

Niedzielin et al., 2001

Bifidobacterium infantis 35624 soulagement des symptomes

normalise la balance des cytokines anti/pro-inflammatoire

O’mahony et al., 2005

VSL#3

VSL#3 (Bifidobacterium breve, longum, infantis

Lactobacillus acidophilus, plantarum, casei,

bulgaricus

Streptococcus thermophilus)

97

PARTIE 2

OBJECTIFS

OBJECTIFS

98

Au cours des six dernières années, un ensemble de travaux ont été menés au

laboratoire visan,t dans un premier temps, l’évaluation des effets d’un traitement

probiotique sur l’inflammation colique. Le choix de la souche bactérienne

(Lactobacillus farciminis) a été motivé par sa capacité à produire du monoxyde d’azote

(NO), médiateur connu pour ses propriétés anti-inflammatoires lorsqu’il est apporté de

façon exogène. Ainsi, L. farciminis a été utilisé en tant que vecteur biologique de NO

dans la lumière colique. Ces travaux ont montré que le traitement par L. farciminis

diminue la sévérité d’une colite expérimentale et atténue la douleur en réponse à une

distension colorectale qui lui est associée, par un mécanisme d’action impliquant le NO

libéré dans la lumière par cette souche. Cependant, au cours de ces travaux il a

également été montré que L. farciminis exerçait un effet protecteur par des mécanismes

d’action partagés par la plupart des probiotiques comme la normalisation de la flore

endogène, la modulation du profil cytokinique et le renforcement de la barrière

épithéliale intestinale, soulignant la complexité des mécanismes d’action des

probiotiques. Ces travaux ont montré que L. farciminis possède des potentialités

thérapeutiques pouvant s’inscrire dans le traitement de certaines pathologies digestives

impliquant un dysfonctionnement des réponses immunes et des altérations de la flore,

telles que les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Ce travail de thèse se situe dans la continuité des travaux précédents visant à

élargir l’exploration des potentialités thérapeutiques de L. farciminis dans le traitement

des pathologies digestives à caractère non inflammatoire ou « micro-inflammatoire »

tels que les troubles fonctionnels intestinaux (TFI) et plus particulièrement le syndrome

de l’intestin irritable (SII), dont l’étiologie reste mal connue et les traitements décevants.

Compte tenu de l’hypersensiblité viscérale en tant que dénominateur commun de ces

troubles et de l’augmentation de la perméabilité intestinale reflétant les altérations de la

barrière intestinales chez les patients atteints du SII (Spiller et al., 2000 ; Marshall et al.

2004), l’objectif de ce travail était d’évaluer à l’aide d’un modèle animal approprié, le

stress de contrainte chez le rat induisant une hypersensibilité viscérale en réponse à une

distension colorectale, les effets d’un traitement par L. farciminis ainsi que les

mécanismes d’action impliqués dans l’hyperalgésie viscérale chez le rat stressé.

OBJECTIFS

99

L’objectif de la première partie a été d’évaluer si un stress de contrainte induit

des altérations de la barrière épithéliale colique et s’il existe une relation de cause à effet

entre ces altérations et l’hyperalgésie induite par ce stress. Dans un deuxième temps

nous nous sommes intéressés à l’évaluation des effets d’un traitement par L. farciminis

sur l’hyperalgésie viscérale induite par le stress. Nous avons exploré deux pistes

concernant les mécanismes d’action impliqués dans un effet antinociceptif par ce

traitement : le rôle du NO et l’incidence sur les altérations de la barrière épithéliale

induites par le stress. Enfin, dans une dernière partie nous nous sommes attachés à

déterminer les voies nerveuses au niveau spinal et supraspinal qui sont activées lors

d’un stress de contrainte suivi d’une distension colorectale età l’évaluer l’influence du

traitement par L. farciminis sur l’activation de ces voies.

100

PARTIE 3

RESULTATS EXPERIMENTAUX


101

RESULTATS 1

L’hypersensibilité viscérale induite par un stress en réponse à une distension

colorectale dépend de l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique :

rôle de la kinase de la chaîne légère de la myosine

Acute stress-induced hypersensitivity to colonic distension depends upon increase in

paracellular permeability: role of myosin light chain kinase.

Ait-Belgnaoui A., Bradesi S., Fioramonti J., Theodorou V., Bueno L.

Pain 2005;113:141-7.

Résumé

Le but de cette étude a été de déterminer chez le rat i) si l’inhibition des altérations de la

perméabilité paracellulaire colique induite au cours d’un stress pouvait réduire

l’hypersensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale; ii) le rôle de la

contraction du cytosquelette des cellules épithéliales dans les effets délétères du stress.

Méthodes: Les animaux ont été répartis en deux groupes recevant : une administration

de ML-7, un inhibiteur spécifique de la kinase des chaines légères de myosine (MLCK;

3 x 1 mg/kg i.p ; 12 h d’intervalle d’injection entre chaque injection) ou du TAP, un

bloqueur des jonctions serrées (2,4,6-triaminopyrimidine, 100mM ; perfusion

intracolique 1 h avant et pendant le stress). Les animaux ont été soumis soit à un stress

de contrainte de type aigu (une session de 2 heures) ou soit à la procédure de stress

fictif. Vingt minutes après la session de stress aigu ou de stress fictif, la sensibilité

viscérale en réponse à une distension et la perméabilité paracellulaire colique ont été

évaluées.


102

Résultats: Les rats stressés présentent une augmentation de la réponse abdominale à

tous les volumes de distension, ainsi qu’une augmentation de la perméabilité

paracellulaire colique, comparée aux rats soumis à un stress fictif. Les effets du stress

sont supprimés après un traitement par le TAP ou le ML-7.

Conclusion: Les résultats nous montrent que les changements de la perméabilité

paracellulaire colique étaient responsables de l’hypersensibilité viscérale induite par un

stress,et que ces changements résultaient de la contraction du cytosquelette des cellules

épithéliales par l’activation de la MCLK. L’hypothèse de l’existence d’une relation de

cause à effet entre la perméabilité et la sensibilité intestinale est alors confirmée.

Acute stress-induced hypersensitivity to colonic distension depends upon

increase in paracellular permeability: role of myosin light chain kinase

Afifa Ait-Belgnaouia, Sylvie Bradesib, Jean Fioramontia, Vassilia Theodoroua, Lionel Buenoa,*

aNeuro-Gastroenterology and Nutrition Unit, INRA, 180, chemin de Tournefeuille BP 03, 31931 Toulouse cedex 9, FrancebDivision of Digestive Diseases, Digestive Diseases Research Center, UCLA, Los Angeles, CA, USA

Received 21 July 2004; received in revised form 24 September 2004; accepted 30 September 2004

Abstract

Hypersensitivity to rectal or colonic distension characterizes most patients with IBS and increased gut permeability has been described in

post-dysenteric IBS patients. However, no link has been established between these two events. The aim of this study was to determine (i)

whether chemical blockade of stress-induced increase of colonic paracellular permeability by 2,4,6 triaminopyrimidine (TAP) affects the

concomitant hypersensitivity to colonic distension, (ii) the role of epithelial cell contraction in the stress-induced increased permeability and

hyperalgesia, using a myosin light chain kinase inhibitor (ML-7). The effect of acute partial restraint stress (PRS) on visceral sensitivity to

colorectal distension (RD) was assessed by abdominal muscle electromyography. Colonic paracellular permeability was determined by

measuring percentage of urinary 51Cr-EDTA recovery after intracolonic infusion. The effect of stress on both parameters was evaluated after

TAP, ML-7 or vehicle pretreated animals. PRS significantly increased colonic paracellular permeability and the number of spike bursts for all

volumes of RD applied compared to sham. TAP suppressed the stress-induced increase of colonic paracellular permeability and sensitivity to

colonic distension. Similarly, ML-7 blocked the stress-induced increase of colonic paracellular permeability and sensitivity. Neither ML-7

nor TAP had any effect on both permeability and sensitivity in absence of stress. The increase of colonic permeability induced by PRS results

from epithelial cell cytoskeleton contraction through myosin light chain kinase activation and this increase is responsible for stress-induced

rectal hypersensitivity.

q 2004 International Association for the Study of Pain. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Visceral pain; Stress; Colonic paracellular permeability; MLCK

1. Introduction

Irritable bowel syndrome (IBS) is characterized by

abdominal pain, colonic motor disturbances and altered

bowel habits (Naliboff et al., 2000; Thompson et al., 1999).

Further, patients often have increased levels of anxiety or

psychological distress and stressful life events have been

associated with the onset or exacerbation of IBS symptoms

(Collins et al., 1999; Drossman et al., 1999). In rats and

mice, stress increases intestinal and colonic paracellular

permeability (Ferrier et al., 2003; Santos and Perdue, 2000),

leading to an excessive uptake of luminal antigens and

0304-3959/$20.00 q 2004 International Association for the Study of Pain. Publi

doi:10.1016/j.pain.2004.10.002

* Corresponding author. Tel.: C33 561 285 143; fax: C33 561 285 397

E-mail address: [email protected] (L. Bueno).

bacterial products initiating or modulating an inflammatory

response. It has been recently shown that increased gut

paracellular permeability is an accurate change observed in

post-infective (PI-IBS) and in diarrheic non-PI-IBS patients

(Neal et al., 2002; Spiller et al., 2000). Epithelial

paracellular permeability is regulated mainly by intercel-

lular tight junctions (TJ). Proteins that constitute the TJ

complex, include transmembrane proteins such as occludin,

claudin, junction adhesion molecules and intracytoplasmic

proteins (Fanning et al., 1999; Liu et al., 2000; Tsukita and

Furuse, 2000). However, the barrier integrity is critically

dependent on the actomyosin-driven contraction, an event

that involves the phosphorylation of the regulatory myosin

light chain (MLC) (Sellers and Adelstein, 1985). This

process is initiated by MLC kinase-mediated MLC

phosphorylation, which is tightly linked to actin filament

Pain 113 (2005) 141–147

www.elsevier.com/locate/pain

shed by Elsevier B.V. All rights reserved.

http://www.elsevier.com/locate/pain

A. Ait-Belgnaoui et al. / Pain 113 (2005) 141–147142

reorganisation. MLC kinase (MLCK) is activated through

different intracellular pathways including Ca2C–calmodulin

complex depending on the epithelial cell (EC) (Goeckeler

and Wysolmerski, 1995). Considerable amount of phos-

phorylated MLC was observed in stressed animals associ-

ated with disruption of epithelial barrier (Ferrier et al.,

2003). In addition in mice, increased paracellular per-

meability linked to activation of PAR-2 receptor results

from the activation of MLCK from epithelial cells (Cenac

et al., 2003). This increase in permeability is inhibited by

ML-7, an ATP-competitive, cell-permeable inhibitor of

MLCK (Saitoh et al., 1987). These data suggest an

important role of MLCK in the regulation of intestinal

paracellular permeability.

IBS patients also exhibit an enhanced sensitivity to rectal

distension evidenced by lower threshold of pain perception

(Ritchie, 1973; Whitehead et al., 1990). Moreover in

humans, stress affects pain sensation induced by colonic

and rectal distension (Ford et al., 1995) and in rats, acute

restraint stress induces hypersensitivity to rectal distension

(Gue et al., 1997). However, the relationship between the

effect of stress on visceral hypersensitivity in response to

colorectal distension and on intestinal paracellular per-

meability, is not yet established.

Consequently, the aim of this study was (i) to determine

whether blockade of stress-induced increase in colonic

paracellular permeability by the tight junction chemical

blocker, TAP, infused intracolonically is able to prevent the

concomitant hypersensitivity to colonic distension (ii) to

evaluate the role of MLCK activation catalysing EC

cytoskeleton contractions in stress-induced colonic increase

of permeability and subsequent hypersensitivity.

2. Material and methods

Female Wistar rats (Janvier SA, Le Genest St Isle, France)

weighing 225–250 g were used and housed individually in a

temperature-controlled room (21G1 8C). They were allowed free

access to water and fed standard pellets (UAR pellets, Epinay,

France). The Local Committee for animal use and care had

approved all experimental protocols described in this study.

2.1. Animal preparation

Under general anesthesia induced by intraperitoneal (i.p.),

administration of 0.6 mg kgK1 acepromazine (Calvimet; Vetoqui-

nol, Lure, France) and 120 mg kgK1 ketamine (Imalgene 1000;

Rhone-Merieux, Lyon, France), animals were equipped with a

polyethylene catheter (ODZ0.7 mm, IDZ0.3 mm, lengthZ60 cm) inserted in the proximal colon at 1 cm from the cecocolonic

junction. Rats were also equipped with three groups of three NiCr

wire electrodes (60 cm in length, 80 mm in diameter) implanted

into the abdominal external oblique muscle, 2 cm superior to

the inguinal ligament (Morteau et al., 1994). Catheter and

electrodes were exteriorized on the back of the neck and protected

by a glass tube attached to the skin. The myoelectrical activity was

recorded on an electromyograph (EMG) (Mini VIII; Alvar, Paris,

France) using a short time constant (0.03 s) to remove low-

frequency signals (!3 Hz) and with a paper speed of 3.6 cm minK1.

2.2. Partial restraint stress

All stress sessions were performed at the same period of the day

(between 10:00 a.m. and 12:00 noon) to minimize any influence of

circadian rhythms. Stress effects were studied using the wrap

partial restraint stress (PRS) model (Williams et al., 1987). Thus,

animals were lightly anesthetized with ethyl-ether, and their fore

shoulders, upper forelimbs and thoracic trunk were wrapped in a

confining harness of paper tape to restrict, but not to prevent, body

movements. Then, rats were placed in their home cage for 2 h. Rats

recovered from ethyl-ether within 2–3 min and immediately

moved around in their cage, although the restricted mobility of

their forelimb prevented grooming behaviour. Sham-stress rats

(sham-PRS) considered as controls were anesthetized as above, but

were not wrapped and were allowed to move freely in their cages.

The PRS at room temperature used in the present study, is a mild

and non-ulcerogenic stressor.

2.3. Colorectal distension

Electromyography recordings began 5 days after surgery. Rats

were placed in polypropylene tunnels (6 cm diameter, 25 cm

length). In order to minimize stress reaction during experiments and

to prevent recording artifacts due to movements during distension,

rats were acclimated, 3 days before distension, to stay in the plastic

tunnel. A balloon consisting of an arterial embolectomy catheter

(Fogarty, Edwards Laboratories, Inc., Santa Anna, USA) was

introduced into the colorectum at 1 cm from the anus and fixed at the

base of the tail. The balloon (2 mm diameter; 2 cm length) was

progressively inflated by steps of 0.4 ml, from 0 to 1.2 ml, each step

of inflation lasting for 5 min. Pressure applied to colonic wall

corresponding to 0.4, 0.8 and 1.2 ml to balloon inflation were 12.5,

24.8 and 39.5 mmHg, respectively, as defined previously (Morteau

et al., 1994). The balloon was filled with tepid water to avoid

temperature contrast. To detect possible leakage, the volume of

water introduced into the balloon was checked by complete removal

with a syringe at the end of the distension period.

2.4. Colonic paracellular permeability

Evaluation of colonic paracellular permeability was performed

using 51Cr-ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA; Perkin–

Elmer Life Sciences, Paris, France) as a marker of paracellular

permeation of tight junction (Bjarnason et al., 1995). 51Cr-EDTA

(0.7 mCi.), diluted in 250 ml of saline was injected through the

intracolonic (IC) catheter 20 min after PRS or sham-PRS. Then,

the animals were placed in metabolic cages, and feces and urine

were collected separately during 24 h. The radioactivity in urines

was measured on a gamma counter (Cobra II, Packard Meriden,

CT, USA). Permeability to 51Cr-EDTA was expressed as the

percentage of the total radioactivity administered.

2.5. Experimental protocol

In the first series of experiments, eight groups of eight rats were

continuously infused intracolonically with a solution containing

2,4,6 triaminopyrimidine (TAP), a tight junction blocker (100 mM;

A. Ait-Belgnaoui et al. / Pain 113 (2005) 141–147 143

0.5 ml hK1; groups 3, 4, 7 and 8) or its vehicle (Tris–HCl 0.1 M;

pHZ6.7; groups 1, 2, 5 and 6), for 1 h before and during PRS

(groups 2, 4, 6 and 8) or sham-PRS (groups 1, 3, 5 and 7)

In the second series of experiments, eight groups of eight rats

were treated with a specific inhibitor of MLCK, ML-7 (1 mg kgK1;

groups 3, 4, 7 and 8) or its vehicle (10% ethanol; groups 2, 4, 6 and

8) injected i.p. three times at 12 h intervals before PRS (groups 2,

3, 5 and 6) or sham-PRS (groups 1, 3, 5 and 6).

In these two series, groups 1–4 received intracolonically51Cr-EDTA (250 ml) 20 min after PRS or sham-PRS and colonic

paracellular permeability was assessed by 24 h post-stress urine

collection. Groups 5–8 were submitted to a progressive color-

ectal distension (CRD) performed 20 min after PRS or sham-

PRS and the number of spike bursts was recorded for 5 min for

each volume of distension.

2.6. Statistical analysis

All values are expressed as meanGSEM. Statistical analysis of

the number of spike bursts for each 5 min period during CRD was

performed by one-way ANOVA followed by parametric Student’s

unpaired t-test. Data on permeability were compared by using

Student’s unpaired t-test after one-way analysis of variance.

Differences were considered significant for P!0.05.

3. Results

3.1. Effect of stress on colonic paracellular permeability

and on colorectal distension

Stressed rats receiving vehicle, exhibited an increased

colonic paracellular permeability compared with sham-

stressedCvehicle animals (2.19G0.19 vs. 1.35G0.19%)

(Fig. 1A and B).

Colorectal distension applied in sham-stressedCvehicle

rats, significantly and gradually increased the number of

Fig. 1. (A) Influence of intracolonic infusion of TAP (100 mM, 0.5 ml hK1), a tight

i.p. administrations of ML-7 (3!1 mg kgK1), a specific inhibitor of MLCK on

assessed by 24 h post-stress urine collection and measurement of 51Cr-EDTA rec

stress-induced increase of colonic permeability. Neither TAP nor ML-7 or th

permeability. *P!0.01 significantly different from sham-stressCvehicle and †P!

spike bursts in a volume dependent manner and this increase

became significant when the volume of distension reached

0.8 ml. Compared to sham-stressCvehicle, PRS for 2 h,

increased significantly the number of spike bursts for all

volumes of distension (Fig. 2A and B).

3.2. Influence of colonic tight junction blockade

In control (sham-PRSCvehicle), IC infusion of TAP

(100 mM, 0.5 ml hK1) did not affect per se both colonic

paracellular permeability (Fig. 1A) and increased number

of spike bursts for all distending volumes (Fig. 2A).

TAP (100 mM, 0.5 ml hK1) infused intracolonically for

1 h before and during PRS, suppressed the stress-induced

increase in colonic paracellular permeability (0.81G0.10

vs. 2.19G0.19%; P!0.01; Fig. 1A). Similarly, TAP

infusion also prevented the stress-induced enhancement of

spike bursts in response to rectal distension for all volumes

of distension (Fig. 2A). Vehicle of TAP (Tris–HCl, 0.1 M)

had no effect on stress-induced increase in paracellular

permeability (Fig. 1A) and in abdominal response to RD

(Fig. 2A).

3.3. Role of MLCK in stress-induced increase in colonic

permeability and sensitivity

In sham-stressed animals, ML-7 (3!1 mg kgK1 i.p.) did

not affect either colonic paracellular permeability (Fig. 1B)

nor sensitivity to RD (Fig. 2B). Stress-induced increase in51Cr-EDTA permeability was reduced in animals previously

treated with ML-7 (3!1 mg kgK1) (1.18G0.18 vs. 2.19G0.198%; P!0.01; Fig. 1B). ML-7 pretreatment also

suppressed PRS-induced hypersensitivity to RD for all

volumes of distension (Fig. 2B).

junction blocker on colonic paracellular permeability. (B) Effect of repeated

colonic paracellular permeability. Colonic paracellular permeability was

overy in urines. Note that both TAP and ML-7 treatments suppressed the

eir vehicles had any effect on basal (sham-stress) colonic paracellular

0.01 significantly different from stressCvehicle.

Fig. 2. (A) Effect of TAP, a tight junction blocker infused IC (100 mM, 0.5 ml hK1) on stress-induced hypersensitivity. (B) Effect of repeated i.p.

administrations of ML-7 (3!1 mg kgK1), a specific inhibitor of MLCK, on the number of spike bursts in response to increasing volumes of colorectal

distension. Note that both TAP and ML-7 treatments suppressed the stress-induced hypersensitivity to colorectal distension. No difference in the number of

spike bursts in response to increased volumes of colorectal distension were observed in sham-stressed rats treated by either TAP or ML-7 or their vehicles. †

and *P!0.05, respectively, significantly different from sham-stressCvehicle and stressCvehicle values.


4. Discussion

The present study shows that the increase in colonic

permeability induced by acute stress is responsible for the

concomitant rectal hypersensitivity to distension, since a

non-absorbed chemical blocker for tight junctions prevents

the occurrence of colorectal hypersensitivity. Furthermore,

we demonstrate that stress influences the permeability and

subsequently the visceral sensitivity by inducing epithelial

cell cytoskeleton contraction. The cytoskeleton contraction

depends upon MLCK, and MLC phosphorylation induces

actinomyosin contraction leading to tight junction opening.

In this study, we confirm in rats that stress activates MLCK

of epithelial cells, since a specific inhibitor of this enzyme,

ML-7, prevents stress-induced increase in permeability

(Ferrier et al., 2003) and we demonstrate that this effect is

enough to prevent visceral hypersensitivity.

The majority of IBS patients presents a lower threshold

for perception of gut distension (Kellow et al., 1991; Mertz

et al., 1995). Although, the pathophysiology of IBS is not

well understood, it seems that IBS severity may be

influenced by stressful life events and psychological status

contributing to the development of visceral hypersensitivity,

often associated with a high degree of anxiety (Drossman

et al., 1988; Ford et al., 1987; Whitehead et al., 1988).

Recent studies have also shown an increase of intestinal

permeability in post-infectious and other diarrheic IBS

patients (Neal et al., 1997, 2002; Spiller et al., 2000).

Interestingly, stressful events before infection also increase

risk of post-infective IBS. In animals, acute restraint stress

is known to enhance abdominal response to rectal disten-

sion, particularly in females as we observed in our study.

Previous studies have shown that this effect of stress

depends upon the central release of CRF (Gue et al., 1997)

and the presence of estradiol (Bradesi et al., 2002) but is also

linked to mast cell degranulation (Gue et al., 1997).

In rats, restraint stress also triggers alterations of the

intestinal barrier characterized by an increased permeability

to macromolecules. This effect of stress on paracellular

permeability also involves mast cells, since this colonic

epithelial response to stress is not observed in mast cell

deficient rats (Santos et al., 2001). More recently, it has been

shown that peripheral CRF-related mechanisms also

contribute to stress-induced changes in intestinal mucosal

function, as reflected by an increase of mucosal per-

meability to macromolecules induced by intraperitoneally

administered CRF and prevention of acute stress-induced

mucosal permeability changes by CRF antagonists given

peripherally (Tache and Perdue, 2004). A pivotal role of

mast cells has been proposed in the pathogenesis of

intestinal inflammation and visceral hyperalgesia. Increased

colonic permeability favours the entry of pathogens and

toxins, which in turn activate the local immune system.

Consequently, a variety of stimuli, including neuromedia-

tors and endogenous compounds like cytokines, leads to the

release of substances such as histamine, tryptase, prosta-

glandin or serotonin able to activate directly the mechan-

oreceptors of the gut (Bueno et al., 2000).

In our study, stress increases both colonic paracellular

permeability and visceral sensitivity. To investigate a

possible cause effect relationship between these two

phenomena, we used TAP, a tight junction chemical blocker.

This substance has been used for a long time to block TJs

cation-selective permeability in gallbladder and other

leaky epithelia in Ussing chambers (Moreno, 1974, 1975).

In an in vivo study in dogs, TAP blocks the tight junction

movement of NaC across the ileal epithelium, since it

reduces NaC diffusion and the related changes in


transepithelial potential difference, normally generated

when the ileal mucosa is exposed to a NaC free mannitol

solution (Krejs et al., 1977). Moreover, it has been

demonstrated in rats that intestinal permeability is regulated

by NaC transport (Turner and Madara, 1995) and the

epithelial cell cytoskeleton is modified during physiological

regulation of TJ permeability. In this study, TAP prevents

both stress-induced increase in paracellular permeability and

visceral sensitivity.

Therefore, the increase in intestinal permeability may

lead to an excessive uptake of luminal microbial antigens,

and bacterial products that activate the submucosal immune

system, releasing substances sensitizing terminals of

sensory nerves. Such sensitization is similar to that

occurring in response to local inflammation in experimental

models of rectal or colonic hypersensitivity (Morteau et al.,

1994; Ness and Gebhart, 2001) and may be considered as an

alert signal of altered epithelial functioning. Indeed in post-

dysenteric IBS patients, immune changes such as the

Fig. 3. Putative mechanisms involved in stress-induced increase in visceral sensi

activate immunocytes such as T lymphocytes to produce increased permeability. T

role to mediate T cell-induced MLC phosphorylation and subsequent contraction

intraluminal bacterial products activating the submucosal immune cells then sens

increase in the number of enteroendocrine cells, T

lymphocytes and intraepithelial lymphocytes, which can

persist for more than 1 year, as well as increased gut

permeability have been described (Spiller et al., 2000).

Immune changes occurring in the intestine of IBS patients

are not limited to the post-dysenteric population. Indeed, an

increased density of mast cells in the intestinal and colonic

mucosa of different IBS sub-types patients, has been

described (Barbara et al., 2004; O’Sullivan et al., 2000;

Park et al., 2003; Tornblom et al., 2002). In addition, a

positive correlation has been established, the number of

mast cells, close to nerves and abdominal pain in IBS

patients (Barbara et al., 2004). Furthermore, abnormalities

in lymphocytes distribution in myenteric plexus has been

observed using biopsies from constipated and diarrhoeic

IBS patients (Tornblom et al., 2002).

Disturbances of intestinal barrier is suggested as an

etiologic factor in several intestinal diseases associated with

abdominal pain. Indeed using different tracers, abnormal

tivity to colonic distension. Stress sensitize mast cell to degranulate and to

he resulting activation and release of mediators such as INF-g plays a major

s of the epithelial cell cytoskeleton. This opening of TJ favours uptake of

itizing sensory terminals to mechanical stimuli.


intestinal or colonic permeability has been shown in

Crohn’s disease (Soderholm et al., 1999), gluten-sensitive

enteropathy (Cobden et al., 1980), alcoholism (Bjarnason

et al., 1984), acute gastroenteritis (Zuckerman et al., 1993)

and ulcerative colitis (Gitter et al., 2001). All these

situations lead to an excessive antigen load of immunocytes

of the lamina propria and bacterial translocation. Indeed, in

alcoholic patients, as well as in animal models, it has been

shown that ethanol, by affecting colonic tight junction

permeability is responsible for liver bacterial translocation

and injury (Ma et al., 1999; Keshavarzian et al., 2001).

Moreover, it has been shown in vitro that ethanol at low and

non-cytotoxic doses causes a functional and structural

opening of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier,

by activating MLCK (Ma et al., 1999). Herein, we show that

stress-mediated modifications of permeability and sensi-

tivity involve activation of MLCK since ML-7, a MLCK

inhibitor, prevents the epithelial cells cytoskeleton contrac-

tion and subsequently the increase in colonic permeability.

These results confirm in rats previous data showing that in

mice, acute stress increases colonic permeability through an

activation of epithelial cell MLCK and that INF-g is the

main mediator of this effect (Ferrier et al., 2003). Here

again, blockade of stress-induced increase in permeability

prevents rectal hypersensitivity reinforcing the cause–effect

relationship between permeability and sensitivity in the gut.

However, the mechanism by which stress activates MLCK

from epithelial cell, even if it involves at least lymphocytes

CD4C and INF-g (Ferrier et al., 2003), remains partly

unknown. Taking together all the results in agreement with

our study, we suggest a close relationship between the

alterations in colonic mucosal barrier and visceral hyper-

sensitivity (Fig. 3).

Finally, we demonstrate for the first time in this study

that changes in colonic paracellular permeability are

responsible for visceral hyperalgesia induced by stress,

and that these changes result from stress-induced epithelial

cell cytoskeleton contraction through activation of MLCK.

Therefore, taking into account the place of stress in the

genesis of functional bowel disorders, we can speculate that

specific blockers of MLCK such as ML-7 are promising

therapeutic drugs for the treatment digestive pathologies

such as IBS.

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110

RESULTATS 2

Lactobacillus farciminis diminue l’hyperalgésie viscérale induite par un stress chez

le rat en inhibant la contraction MLCK-dépendante du cytosquelette des

colonocytes

Lactobacillus farciminis treatment suppresses stress induced visceral hypersentivity: a

possible action thought interaction with epithelial cell cytoskeleton contraction

Ait-Belgnaoui A., Han W., Lamine F., Eutamene H., Theodorou V., Bueno L.

Gut 2006; 55:1090-1094.

Résumé

L’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique observée lors d’un stress

résulte de la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales via l’activation de la

kinase de la chaîne légère de la myosine (MLCK). Cette augmentation de la

perméabilité est à l’origine de l’hypersensibilité viscérale à la distension colorectale

observée chez le rat stressé. L’objectif de cette étude a été d’évaluer les variations de

l’expression de la MLCK, de la chaîne légère de la myosine (MLC) et de sa forme

phosphorylée (p-MLC), responsable de la contraction du cytosquelette, au cours d’un

stress de contrainte et l’influence d’un traitement par L. farciminis sur ces

modifications.

Méthodes : Les rats femelles ont reçu un traitement oral de Lactobacillus farciminis

(1011UFC/ml/jour) pendant 15 jours ou du NaCl avant la session de stress ou de stress

fictif. La sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale et la perméabilité

paracellulaire colique ont été évaluées après la session de stress ou de stress fictif. Ces

rats ont reçu en parallèle de l’hémoglobine, un piégeur de NO. L’expression des


111

protéines MLCK, MLC, p-MLC est déterminée au niveau de la muqueuse colique de

rats traités ou non par L. farciminis après une session de stress aigu ou fictif.

Résultats : Le stress entraîne une augmentation de la perméabilité paracellulaire colique

ainsi qu’une hyperalgésie en réponse à une distension colorectale. Un traitement par L.

farciminis prévient l’ensemble de ces effets délétères du stress, tandis que

l’hémoglobine réverse les effets protecteurs de L. farciminis. Concernant la cinétique

d’expression de la protéine p-MLC, un maximum d’expression de la protéine a été

observé après 45 minutes de stress. En revanche, un traitement par L. farciminis

prévient de cette augmentation.

Conclusion : Cette étude monte qu’un traitement de deux semaines par L. farciminis

prévient des effets délétères du stress sur la sensibilité viscérale et la perméabilité

paracellulaire colique. Le NO libéré par L. farciminis, semble agir de façon directe ou

indirecte sur ces deux paramètres. Finalement, les effets antinociceptifs observés à la

suite d’un traitement par L. farciminis se traduisent par une action de ce probiotique

essentiellement sur la barrière épithéliale colique. A ce niveau, l’inhibition de la

phosphorylation de la MLC par L. farciminis empêche donc la contraction du

cytosquelette des cellules épithéliales et l’ouverture des jonctions serrées qui en résulte.

NEUROGASTROENTEROLOGY

Lactobacillus farciminis treatment suppresses stressinduced visceral hypersensitivity: a possible actionthrough interaction with epithelial cell cytoskeletoncontractionA Ait-Belgnaoui, W Han, F Lamine, H Eutamene, J Fioramonti, L Bueno, V Theodorou. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

See end of article forauthors’ affiliations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Correspondence to:Dr V Theodorou, UMR1054, INRA/ESAP,Neuro-Gastroenterologyand Nutrition Unit, 180chemin de Tournefeuille,BP 3, 31931 Toulousecedex 9, France;[email protected]

Revised version received26 December 2005Accepted for publication31 December 2005Published online first28 February 2006. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Gut 2006;55:1090–1094. doi: 10.1136/gut.2005.084194

Background: Stress induced increase in colonic paracellular permeability results from epithelial cellcytoskeleton contraction and is responsible for stress induced hypersensitivity to colorectal distension(CRD). The probiotic Lactobacillus farciminis releases spontaneously nitric oxide (NO) in the colonic lumenin vivo and exerts anti-inflammatory effects. This study aimed: (i) to evaluate the effects of L farciminis onstress induced hypersensitivity to CRD and increase in colonic paracellular permeability; and (ii) toascertain whether these effects are NO mediated and related to changes in colonocyte myosin light chainphosphorylation (p-MLC).Methods: Female Wistar rats received either 1011 CFU/day of L farciminis or saline orally over 15 daysbefore partial restraint stress (PRS) or sham-PRS application. Visceral sensitivity to CRD and colonicparacellular permeability was assessed after PRS or sham-PRS. Haemoglobin was used as an NOscavenger. Western blotting for MLC kinase, MLC, and p-MLC were performed in colonic mucosa from Lfarciminis treated and control rats after PRS or sham-PRS.Results: PRS significantly increased the number of spike bursts for CRD pressures of 30–60 mm Hg as wellas colonic paracellular permeability. L farciminis treatment prevented both effects, while haemoglobinreversed the protective effects of L farciminis. p-MLC expression increased significantly from 15 to45 minutes after PRS, and L farciminis treatment prevented this increase.Conclusion: L farciminis treatment prevents stress induced hypersensitivity, increase in colonic paracellularpermeability, and colonocyte MLC phosphorylation. This antinociceptive effect occurs via inhibition ofcontraction of colonic epithelial cell cytoskeleton and the subsequent tight junction opening, and may alsoinvolve direct or indirect effects of NO produced by this probiotic.

Probiotics have been defined as living organisms in foodand dietary supplements which improve the health of thehost beyond inherent basic nutrition.1 Preventive and

curative efficacy of probiotic treatments has been described inseveral gastrointestinal pathologies and in the past decadeencouraging results have been obtained in inflammatory boweldisease using different strains.2 3 Similarly, treatment withseveral lactobacilli strains has been found to reduce the severityof experimental colitis in animals.4 5 Based on a recent approachusing bacteria as a carrier of anti-inflammatory compoundsdelivered into the colonic lumen,6 we have previously shownthat Lactobacillus farciminis given orally for 15 days can releasespontaneously nitric oxide (NO) into the colonic lumen andreduce the severity of trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS)induced colitis in rats.7 Among the targets which have benefitedfrom probiotics, studies have reported enhancement of intest-inal barrier function8–10 by strengthening tight junctionsbetween enterocytes11–13 and thereby preventing an increase inparacellular permeability and subsequent bacterial transloca-tion. L farciminis shares these properties as it prevents bacterialtranslocation and the increase in colonic paracellular perme-ability in TNBS induced colitis in rats.5

On the other hand, irritable bowel syndrome is agastrointestinal disease with unknown aetiology, frequentlyassociated with psychological distress, and characterised byabdominal pain.14 15 An increase in intestinal permeabilityhas recently been described in post-dysenteric16 and otherirritable bowel syndrome patients.17 Manifestations such asincreased gut permeability and visceral hypersensitivity are

similar to those initiated by various stressful stimuli in ratsand mice.18–21 In rats, partial restraint stress induces colonichypersensitivity to distension triggered by an increase in gutparacellular permeability.21 Moreover, this stress inducedincrease in gut permeability results from epithelial cellcytoskeleton contraction.19 21 In contrast, despite controver-sies in the literature concerning the role of NO in paintransmission and mucosal barrier protection, an antinocicep-tive action of NO in visceral or peritoneal pain22–24 as well asimprovement in mucosal barrier function by NO donors25

have already been described.Based on this background, the aim of our study was to

evaluate: (i) whether L farciminis treatment prevents stressinduced visceral hypersensitivity to colorectal distension(CRD) and increases colonic paracellular permeability; (ii)the involvement of NO in these effects; and (iii) the effect ofL farciminis treatment on stress induced changes in colono-cyte phosphorylated myosin light chain (p-MLC) expression,reflecting contraction of the cytoskeleton.

MATERIALS AND METHODSAnimalsFemale Wistar rats (Janvier SA, Le Genest St Isle, France)weighing 200–225 g and housed individually in a temperature

Abbreviations: CRD, colorectal distension; EDTA,ethylenediaminetetraacetic acid; MLC, myosin light chain; MLCK, myosinlight chain kinase; p-MLC, phosphorylated myosin light chain; NO, nitricoxide; PRS, partial restraint stress; TNBS, trinitrobenzene sulphonic acid

1090

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controlled room (21¡1 C) were used. They were allowed freeaccess to water and fed standard pellets (UAR pellets; Epinay,France). The local committee for animal use and care approvedall experimental protocols described in this study.

Bacteria preparationL farciminis (CIP 103136; Institut Pasteur Collection, Paris,France) was grown at 37 C in MRS broth (VWRInternational, Fontenay-sous-Bois, France). After 17 hoursof incubation, cultures were harvested by centrifugation at4500 g for 10 minutes. Strain extract was resuspended in0.9% NaCl and conserved at 220 C. Bacterial suspension wasprepared daily in order to administer orally 1011 CFU/day/rat.

Animal preparationUnder general anaesthesia induced by intraperitoneal admin-istration of 0.6 mg/kg acepromazine (Calvimet; Vetoquinol,Lure, France) and 120 mg/kg ketamine (Imalgene 1000;Rhone-Merieux, Lyon, France), animals were equipped witha polyethylene catheter (OD 0.7 mm, ID 0.3 mm, length60 cm) inserted into the proximal colon at 1 cm from thecaecocolonic junction. Rats were also equipped with threegroups of three NiCr wire electrodes (60 cm in length, 80 mmin diameter) implanted into the abdominal external obliquemuscle, 2 cm superior to the inguinal ligament.26 Catheterand electrodes were exteriorised on the back of the neck andprotected by a glass tube attached to the skin. Myoelectricalactivity was recorded on an electromyograph (Mini VIII;Alvar, Paris, France) using a short time constant (0.03 sec-onds) to remove low frequency signals (,3 Hz) and with apaper speed of 3.6 cm/min.

Partial restraint stressAll stress sessions were performed at the same time of day(between 10am and 12 noon) to minimise any influence ofcircadian rhythms. Stress effects were studied using the wrappartial restraint stress (PRS) model which is a mild non-ulcerogenic stressor.27 Thus animals were lightly anaesthe-tised with ethyl-ether and their fore shoulders, upperforelimbs, and thoracic trunk were wrapped in a confiningharness of paper tape to restrict, but not to prevent, bodymovements. Then, rats were placed in their home cage fortwo hours. Rats recovered from ethyl-ether within 2–3 minutes and immediately moved around in their cage,although the restricted mobility of their forelimb preventedgrooming behaviour. Sham-PRS rats, considered as controls,were anaesthetised as above but were not wrapped and wereallowed to move freely in their cages.

Colorectal distensionRats were accustomed to being in polypropylene tunnels(diameter 7 cm; length 20 cm) for several days before CRD in

order to minimise recording artefacts. A 4 cm long latexballoon fixed on a rigid catheter was used. CRD wasperformed by insertion of the balloon into the rectum 1 cmfrom the anus. Isobaric distensions of the colon wereperformed by connecting the balloon to a computerisedbarostat. Colonic pressure and balloon volume were con-tinuously monitored on a potentiometric recorder (L6514;Linseis, Selb, Germany). Isobaric distensions were performedfrom 0 to 60 mm Hg, each distension step lasting fiveminutes. The first distension was performed at a pressureof 15 mm Hg and an increment of 15 mm Hg was added ateach following step until a maximal pressure of 60 mmHg.

Colonic paracellular permeabilityColonic paracellular permeability was evaluated using 51Cr-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Perkin Elmer LifeSciences, Paris, France) as a marker of paracellular permeationof tight junctions.28 51Cr-EDTA (0.7 mCi), diluted in 250 ml ofsaline, was injected through the intracolonic catheter 20 min-utes after PRS or sham-PRS. Then, animals were placed inmetabolic cages, and faeces and urine were collected separatelyover 24 hours. Radioactivity in urine was measured on agamma counter (Cobra II; Packard, Meriden, Connecticut,USA). Permeability to 51Cr-EDTA was expressed as percentageof administered radioactivity recovered in urine.

Western blot analysis for myosin light chain kinase(MLCK), myosin light chain (MLC), and p-MLCAfter sacrifice, a 2 cm segment of proximal colon wasremoved, washed with saline, and the colonic mucosa was

*

**

*

* *

A B

1500

20

40

60

0

20

40

60

30 45 60

† †

Pressure (mm Hg)150 30 45 60

Pressure (mm Hg)

No

of s

pike

bur

sts/

5 m

inut

es

No

of s

pike

bur

sts/

5 m

inut

es

Sham PRSPRS

PRS + L farciminisPRS + L farciminis Hb

Figure 1 (A) Effect of Lactobacillus farciminis (1011 CFU/day) treatment on stress induced hypersensitivity in rats. *p,0.05, significantly differentfrom sham-PRS; �p,0.05, significantly different from partial restraint stress (PRS). (B) Reversion by haemoglobin (200 mg/kg/day) of the effect of Lfarciminis treatment (1011 CFU/day) on hyperalgesia induced by PRS. *p,0.05 significantly different from PRS+L farciminis.

0

2

1

%51Cr-EDTA

recoveryin

24hurines

*

�

�

PRSSham PRS+ saline +saline +L farciminis +L farciminis

+ Hb

Figure 2 Effect of Lactobacillus farciminis (1011 CFU/ml/day)treatment on the increase in colonic paracellular permeability induced bypartial restraint stress (PRS) and its reversion by haemoglobin (Hb200 mg/kg/day). *p,0.05, significantly different from sham-PRS;�p,0.05 significantly different from PRS; `p,0.05 significantlydifferent from PRS+L farciminis. EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid.

Lactobacillus farciminis treatment and visceral hypersensitivity 1091

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scraped off. Proteins were extracted in RIPA buffer andprotein concentrations assessed using the BC Assay kit(Interchim, Montlucon, France). Equal amounts of eachextract were subjected to 10% sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and then electrotrans-ferred onto PVDF membrane. Membranes were blockedovernight at 4 C with Tris buffered saline /bovine serumalbumin 3%, before incubation with primary antibodies.Immunoblotting was performed using specific anti-MLC,anti-MLCK (Sigma, Saint Quentin Fallavier, France), andanti-phospho-MLC (Clinisciences, Montrouge, France) anti-bodies at the following dilutions: 1:500, 1:500, and 1:10 000,respectively. After washing, horseradish peroxidase conju-gated secondary antibody was used (Upstate, Charlottesville,Virginia, USA). Bands were identified by ECL detectionreagents (Amersham Biosciences Europe GmbH, Orsay,France). Band intensities were quantified by densitometryand expressed as mean area density using Quantify one 4.1.1software.

Experimental protocolIn the first series of experiments, 10 groups of eight rats wereused. Over 15 days, animals received orally either saline(groups 1, 2, 4, 5, 7, and 9) or 1011CFU/day L farciminis(groups 3, 6, 8, and 10). Animals were equipped with NiCrelectrodes implanted in the abdominal striated muscles(groups 1, 2, 3, 7, and 8) or an intracolonic catheter (groups4, 5, 6, 9, and 10).

Rats were subjected to PRS (groups 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, and10) or sham-PRS (groups 1 and 4). Stepwise CRD wereperformed in groups 1, 2, 3, 7, and 8, 20 minutes after PRS orsham-PRS. Groups 4, 5, 6, 9, and 10 received 51Cr-EDTAintracolonically at the end of PRS or sham-PRS session, andcolonic paracellular permeability was assessed by 24 hourspost-PRS urine collection. Groups 7–10 were continuouslyinfused with haemoglobin, an NO scavenger (0.25 ml/h;200 mg/kg/day) through the intracolonic catheter over48 hours before PRS until the end of the CRD session(groups 7 and 8) or until the end of the urine collectionperiod (groups 9 and 10).

In a second series of experiments, 12 groups of four ratswere used for the kinetics of MLCK, MLC, and p-MLC proteinexpression of stress exposure by western immunoblotting.Groups 1–6 and groups 7–12 were subjected to sham-PRSand PRS, respectively. After 15, 30, 45, 60, 75, and 90 minutesof sham-PRS or PRS application, the corresponding groupwas sacrificed and colonic segments were removed forwestern blot assays.

In the last series of experiments and according to theresults obtained concerning the effect after 45 minutes ofPRS application on MLC phosphorylation, four groups of fourrats were used in order to evaluate the influence of Lfarciminis treatment on these stress induced changes. Saline(groups 1 and 2) or 1011 CFU/ml L farciminis were given orally

over 15 days before sham-PRS or PRS, respectively. Allgroups were sacrificed at 45 minutes after sham-PRS orPRS application and colonic segments were removed forp-MLC protein level determination by western blotting.

Statistical analysisAll values are expressed as mean (SEM). Statistical analysisof the number of spike bursts for each five minute periodduring CRD and colonic paracellular permeability wereperformed using one way analysis of variance. Differenceswere considered significant when post hoc test p,0.05.

RESULTSL farciminis and stress induced visceralhypersensitivityPRS significantly (p,0.05) increased the number of spikebursts for CRD pressures of 30–60 mm Hg compared withsham-PRS (50 (5) v 29 (3) spike bursts/5 min at 45 mm Hg)(fig 1A). L farciminis treatment prevented the increase in thenumber of spike bursts induced by PRS, whatever thepressure of CRD (fig 1A). The beneficial effect of L farciministreatment on stress induced visceral hyperalgesia wasabolished when animals received haemoglobin infusion (54(3) v 28 (2) spike bursts/5 min at 45 mm Hg) (fig 1B).Haemoglobin infusion had no effect per se on PRS inducedincrease in the number of spike bursts (data not shown).

L farciminis and stress induced increase in colonicparacellular permeabilityPRS significantly (p,0.05) increased colonic paracellularpermeability (2.07 (0.24) v 1.20 (0.20)%) compared withsham-PRS (fig 2). L farciminis treatment prevented theincrease in colonic paracellular permeability induced byPRS (0.95 (0.09) v 2.07 (0.24)%) (fig 2). Haemoglobininfusion reversed the effect of L farciminis on the increase incolonic paracellular permeability induced by PRS (1.78 (0.18)v 2.07 (0.24) %) (fig 2). Haemoglobin infusion did not affectthe increase in colonic paracellular permeability induced byPRS (data not shown).

Time dependent changes in MLC and p-MLC proteinlevels after stress exposureMLCK protein levels were not affected by exposure to stress(table 1). Conversely, significantly (p,0.05) higher levels ofp-MLC were observed from 15 to 45 minutes after thebeginning of stress application, with a maximal effect at45 minutes (fig 3). Then, p-MLC levels decreased andreturned to basal values at 75 minutes after the beginningof stress application (fig 3). MLC protein levels were similarto those observed in sham stressed rats during the earlystages of stress application but they increased significantly(p,0.05) after 60 minutes from the beginning of the stresssession (table 1).

Table 1 Kinetics of myosin light chain kinase (MLCK) and myosin light chain (MLC)protein level determination after sham-partial restraint stress (PRS) and PRS exposure*

Times of sham-PRS or PRS exposure (minutes)

15 30 45 60 75 90

MLCK Sham-PRS 0.49 (0.01) 0.47 (0.02) 0.45 (0.03) 0.48 (0.02) 0.50 (0.01) 0.47 (0.02)PRS 0.48 (0.01) 0.52 (0.02) 0.54 (0.03) 0.54 (0.03) 0.48 (0.01) 0.49 (0.01)

MLC Sham-PRS 0.49 (0.01) 0.47 (0.02) 0.45 (0.03) 0.48 (0.02) 0.50 (0.01) 0.48 (0.02)PRS 0.44 (0.05) 0.53 (0.01) 0.56 (0.03) 0.83 (0.03)� 0.82 (0.03)� 0.68 (0.04)�

Data are represented as mean (SEM) area density.*By western blot band density.�p,0.05 versus sham-PRS.

1092 Ait-Belgnaoui, Han, Lamine, et al

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L farciminis treatment effect on changes in p-MLCprotein levels induced by stressIn sham treated animals, L farciminis did not change p-MLClevels. Conversely, after 45 minutes of stress exposure, Lfarciminis treatment significantly (p,0.05) decreased p-MLCprotein levels (fig 4).

DISCUSSIONThe present study shows that oral L farciminis treatmentprevents stress induced visceral hypersensitivity to colorectal

distension and the increase in colonic paracellular perme-ability. Delivery of exogenous NO by this strain into thecolonic lumen is involved in these protective effects as theyare both reversed by intracolonic infusion of haemoglobin, anNO scavenger. Moreover, L farciminis treatment suppressesstress induced colonocyte MLC phosphorylation, reflectingtheir cytoskeleton contraction.

In animals, acute restraint stress enhances abdominalresponses to rectal distension18 21 29 and we have recentlyestablished that this hypersensitivity to distension resultsfrom increased gut permeability.21 In a previous study, weshowed that L farciminis, given orally for 15 days, releasesspontaneously NO into the colonic lumen.7 We can hypothe-sise that NO released luminally by L farciminis may act oncolonic permeability. A protective effect of NO on mucosalbarrier permeability has been described. Indeed, alterationsin mucosal barrier permeability after ischaemic injury arealso reduced in rats pretreated with molsidomine, an NOdonor.25 Furthermore, it has been shown that administrationof NO synthase inhibitors elicits large increases in themucosal permeability of the feline intestine, independent ofalterations in intestinal blood flow or adhesion of leucocytesto vascular endothelium.30 This effect of NO synthaseinhibitors is reversed by simultaneous administration of NOdonor or L-arginine, underlying a modulatory role of NOproduced in the gut mucosa on paracellular permeability.30 31

Increased colonic paracellular permeability resulting fromstress depends on epithelial cell cytoskeleton contractionthrough MLCK activation, inducing MLC phosphorylation, asa specific MLCK inhibitor (ML-7) prevents the stress inducedincrease in permeability in mice19 and rats.21 In this study, weshowed that acute stress induced MLC phosphorylation atearly stages of stress application, and L farciminis treatmentsuppressed this effect. Interestingly, in a recent study, NOwas found to be involved in the modulation of intestinalpermeability by preventing MLC phosphorylation in vitro.32 Incontrast, the role of NO in pain transmission is controversial.NO has been proposed as being involved in inflammatoryhyperalgesia33 but it is also considered a mediator of opiateanalgesia.34 Only a few studies have investigated the role ofNO on visceral or peritoneal pain models and they indicate anantinociceptive action of NO.22 23 24 Taken together, these datasuggest that the antinociceptive effect of L farciminis on stressinduced hyperalgesia is probably due to a primary regulatoryaction of NO on colonic permeability rather than a directaction of NO on nociceptive fibres.

The hypothesis of NO involvement in the protective effectsof L farciminis on both colonic paracellular permeability andvisceral sensitivity is based on reversal of these effects byintracolonic infusion of haemoglobin. NO is known to formdinitrosyl complexes with iron and to bind easily andstrongly with proteins that contain the haem group, suchas haemoglobin.35 Consequently, haemoglobin has been usedas an appropriate NO scavenger in several experimentalstudies.36 37 However, we cannot exclude the fact thathaemoglobin infusion in the rat colon may impact on thecolonic microecology in terms of specific bacterial metabolicactivity and/or population composition changes, suggestingthat observations obtained in animals undergoing haemoglo-bin infusion may result from a direct action of haemoglobinon colonic microbiota. Haemoglobin or other haemoproteinsreaching the colonic lumen are metabolised by bacteria to arange of haem derived porphyrins lacking iron.38 In aprevious work we have shown that L farciminis significantlyincreased colonic NO concentrations and haemoglobininfusion reduced these concentrations to basal levels, similarto saline treated rats, suggesting that there are no significantchanges concerning the ability of the microflora to degradehaemoglobin as this haemoprotein remains able to scavenge

** ****

15A

B

30 45 60 75

150.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

30 45 60 75 90

90 minutes

Sham PRS

PRS

p-MLC

p-MLC

Time exposure (minutes)

Sham PRS

PRS

Meanareadensity(DO/m

in2)

Figure 3 Western blot for evaluation of phosphorylated myosin lightchain (p-MLC) protein levels on colonic mucosa after partial restraintstress (PRS) application for different time periods. (A) Westernimmunoblotting for p-MLC. (B) Relative mean (SEM) area density.Significant increases in p-MLC protein levels were observed from 15 to45 minutes after the beginning of stress application. **p,0.01significantly different from sham-PRS.

Vehicle

Vehicle(sham PRS)

Lf

(sham PRS)Vehicle(PRS)

Lf

(PRS)

Sham PRS(45 minutes)

PRS(45 minutes)

Lf Vehicle LfA

B

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

�

p-MLC

Meanareadensity(DO/m

in2) *

Figure 4 Western blot for phosphorylated myosin light chain (p-MLC)protein levels on colonic mucosa after Lactobacillus farciminis treatment.(A) Western immunoblotting for p-MLC. (B) Relative mean (SEM) areadensity. L farciminis treatment reduced phosphorylation of MLC inducedby 45 minutes of stress exposure. Significantly different (p,0.05) from*sham-PRS and �PRS, respectively.

Lactobacillus farciminis treatment and visceral hypersensitivity 1093

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NO. However, further investigations are needed to confirmthe involvement of NO by using alternative NO scavengers,and also to exclude the possibility that the effect ofhaemoglobin is due to another mechanism, such as alterationof the microflora.

The protective effect of L farciminis treatment on mucosalbarrier integrity is in agreement with previous data showingthat in vitro live probiotic strains interact with intestinalepithelial cells to protect them from the deleterious effects ofenteroinvasive Escherichia coli by blocking the fall in trans-epithelial resistance and acting on tight junction proteins.12

Similarly, supernatant of Lactobacillus thermophilus cultureprevents aspirin induced inhibition of ZO-1 expression.13 Wetherefore speculate that blockade of tight junction opening byL farciminis during stress may in turn prevent excessiveuptake of luminal microbial antigens and bacterial productsable to activate the submucosal immune system, which maysensitise terminals or sensory nerves through release ofmediators. According to the literature, the most attractivepotential use of probiotics seems to be colonisation of the gutand subsequent improvement of the intestinal microflorabalance and fight against pathogens. We have previouslyshown that L farciminis given orally for two weeks can adhereto the mucosa of the proximal colon and modulate theimmunity of the inflamed colon in rats.5 Thus we cannotexclude the fact that the ability to colonise and interact withthe microflora could be involved in the beneficial effects of Lfarciminis treatment observed in this study. Furthermore, arecent study by Verdu et al showed that perturbations in thegut flora and inflammatory cell activity enhanced visceralsensitivity and this effect was prevented by Lactobacillusparacasei administration.39 Also, a preliminary report from ourgroup showed that disturbances of the commensal floraresulting from oral antibiotic administration in micedecreased the effects of acute stress induced changes oncolonic permeability, underlying the role of the flora in theresponsiveness of epithelial cells.40

In conclusion, in this study we showed that probiotictreatment prevented the acute stress induced hypersensitivityto distension and the increase in colonic paracellular perme-ability. It is possible that NO released by L farciminis may affectdirectly or indirectly colonic paracellular permeability andsubsequent colonic hypersensitivity but further investigationsare needed to confirm this action. Finally, L farciminis exert aprimary action on the colonic epithelial barrier and the effect atthis level results from inhibition of MLC phosphorylation andcytoskeleton contraction. All of these data suggest that Lfarciminis may be of interest in the treatment of visceralhyperalgesia, particularly irritable bowel syndrome.

Authors’ affiliations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

A Ait-Belgnaoui, W Han, F Lamine, H Eutamene, J Fioramonti, L Bueno,V Theodorou, Neuro-Gastroenterology and Nutrition Unit, UMR 1054INRA/ESAP, Toulouse, France

Conflict of interest: None declared.

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1094 Ait-Belgnaoui, Han, Lamine, et al

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117

RESULTATS 3

Un traitement par Lactobacillus farciminis diminue la surexpression spinale et

supraspinale de la protéine c-Fos induite par un stress aigu précédant une

distension colorectale chez le rat

Lactobacillus farciminis treatment decreases stress-induced overexpression of c-Fos in

spinal and supra spinal level after coorectal distension

Ait-Belgnaoui A., Eutamene H., Houdeau E., Bueno L., Fioramonti J., Theodorou V.

Manuscrit en préparation

Introduction

Dans la deuxième patie de notre travial nous avons montré qu’un traitement par L.

farciminis diminue l’hyperalgésie viscérale en réponse à une distension colorectale

induite par le stress en prévenant la contraction du cytosquellette des colonocytes et

l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique qui en résulte. De plus, cet effet

antinociceptif met en jeu une action directe ou indirecte du NO. Bien que quelques

études cliniques relatent l’éfficacité de certains traitements aux probiotiques vis-à-vis

des symptomes du syndrome de l’intestin irritable (ballonnement, flatulence,…), leur

effet et leur mécanisme d’action dans les anomalies sensitives viscérales n’ont pas été

clairement élucidés. De plus, de façon plus générale, l’influence des probiotiques sur les

voies nerveuses impliquées en réponse à des stimuli douloureux d’origine viscérale a

fait l’objet d’un très faible nombre d’études. Ainsi, Kamiya et al. (2006) ont récemment

montré qu’un traitement par Lactobacillus reuteri inhibe la autonomique réponse

cardiaque à une distension colorectale en agissant sur le système nerveux entérique. Une

autre étude raporte qu’un traitement par une levure à caractère probiotique

(Saccharomyces boulardii) module le profil d’expression de certains neurotransmetteurs

au niveau des neurones myenteriques (Kamm et al., 2004).


118

L’objectif de cette partie était de caractériser dans un premier temps les voies

nociceptives spinales et supraspinales activées dans l’hyperalgésie en réponse à une

distension colorectale induite par un stress et d’évaluer ensuite l’effet de L. farciminis

sur cette activation.

Nous nous sommes principalement intéressés aux différentes structures du système

nerveux central participant au processus de nociception, telles que les régions situées :

• au niveau spinal : section S1-S2 de la moelle épinière qui reçoivent

principalement les projections des neurones afférents provenant du côlon.

• au niveau supraspinal : les noyaux parvocellulaires de hypothalamus et médials

de l’amygdale.

Méthodologie

1. Animaux

Pour la réalisation de cette étude des rats femelles Wistar (200-250 g) ont été utilisés.

Les animaux ont été logés individuellement, dans des pièces à température et lumière

contrôlée (21°C ; 12h de lumière) et avaient accès à l’eau et à la nourriture ad libitum

(UAR pellets, Epinay, France).

2. Préparation bactérienne

Lactobacillus farciminis (CIP 103136, Collection de l’Institut Pasteur) a été cultivé à 37

°C dans un bouillon MRS (VWR internationnal, Fontenay-sous-Bois, France). Après 17

h d’incubation, les cultures sont lavées dans du PBS par centrifugation à 4500 x g

pendant 10 minutes. Le culot cellulaire a été resuspendu dans du NaCl 0.9 % et

conservé à -20°C. Les suspensions bactériennes ont été préparées quotidiennement de

façon à administrer 1011 CFU/ml/rat oralement.

3. Modèle de stress de contrainte

Le modèle de stress appliqué était un modèle de stress de contrainte. Ce stress est non

ulcérogène et caractérisé par une stimulation de la motricité colique et une augmentation

du taux plasmatique d’ACTH et de cortisol (Williams et al., 1987) reproduisant ainsi les

symptômes digestifs liés au stress chez l’homme. Le stress de contrainte consiste en une


119

immobilisation des pattes antérieures de l’animal pendant une durée de 2h sous

anesthésie légère à l’éther. Les animaux témoins seront soumis à une session de stress

fictif. La session de stress fictif consiste en une anesthésie légère à l’éther sans

immobilisation les pattes antérieures de l’animal. Les sessions de stress ont toujours eu

lieu sur la même plage horaire (12:00-14:00) afin d’éviter l’influence du rythme

circadien.

4. Modèle expérimental de douleur viscérale

La distension mécanique des différentes parties du tube digestif est le stimulus le plus

souvent utilisé dans les modèles mis en œuvre pour étudier la douleur viscérale. Chez le

rat, la distension colorectale induit des contractions des muscles abdominaux

considérées comme réaction somatique à la douleur viscérale (Morteau et al., 1994).La

session de distension colorectale a été réalisée après la session de stress ou de stress

fictif à l’aide d’un ballonnet introduit à 1 cm de la marge anale et connecté à un

barostat. Le ballonnet sera gonflé par pallier de pression de 15 mm Hg allant de 0 à 60

mm Hg.

5. Immunohistochimie de la protéine c-Fos

Sous anesthésie générale (uréthane 2 g/kg par voie intrapéritonéale), les animaux ont été

perfusés par voie transcardiaque avec 100-150 ml de NaCl 0.9% suivi de 400-500 ml de

paraformaldehyde. Après fixation, les sections sacrées de la moelle épinière (section S1-

S2), ainsi que le cerveau ont été disséquées et postfixés à 4°C dans 4% de

paraformaldhyde tamponné pendant quatre heures. Les échantillons ont été ensuite

incubés dans une solution de saccharose à 30% toute la nuit à 4°C. Des coupes d’une

épaisseur de 35 µm ont été réalisées à l’aide d’un cryostat, collectées et hydratées dans

du PBS. Après saturation avec une solution de blocage (2 % sérum normal de chèvre,

0.25 % Triton X-100, PBS), les coupes ont été incubées avec l’anticorps anti c-Fos

(1/10000 ; Ab-5, AbCys) pendant 24 h à 4°C. Les coupes rincées 2 fois ont été incubées

avec l’anticorps secondaire biotinylé anti-lapin (1/2000 ; ABC Vecstatain) suivi du

complexe avidine-biotine (Vecstatain Elite kit, Vector Laboratories, Paris, France).

L’activité peroxidase a été révélée en utilisant en diaminobenzidine comme chromogène


120

(DAB substrat kit, Vector Laboratories, France). Les coupes sont collées, séchées et

montées dans la résine DePex. L’immunoréactivité de la protéine c-Fos est caractérisée

par la présence d’une coloration marron foncée, localisée au niveau des noyaux et

détectée au microscope (90i Nikon, Nikon France, Champigny-sur-Marne, France).

6. Protocole expérimental

Les rats répartis en huit groupes de quatre individus ont reçu une administration orale

journalière de NaCl (groupes 1, 2, 3, 5, 6) ou de Lactobacillus farciminis à la dose 1011

UFC (unité formant des colonies) (groupes 2, 4, 7 et 8) pendant 15 jours. Les rats sont

soumis à un stress de contrainte (groupes 5 à 8) ou un stress fictif (pas de stress ;

groupes 1 à 4). Après ce stress aigu ou fictif, les groupes 1,4, 7 et 8 ont été soumis à une

distension colorectale progressive pendant 20 minutes. Une heure après la DCR et sous

anesthésie, les animaux ont été perfusés par voie intracardiaque avec du

paraformaldehyde 4% et des coupes de la section S1-S2 de la moelle épinière ainsi que

des régions du cerveau (PVN, MeA) ont été réalisées et traitées pour la détection de la

protéine c-Fos par immunohistochimie de l’expression de la protéine c-Fos (Figure 29).


121

Figure 27 : Protocole expérimental relatif à l’expression de la protéine c-Fos.

7. Comptage et Analyses statistiques

Les différentes régions ont été localisées à l’aide de l’atlas de Paxinos et Wastson

(1986). Le noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) et la région médiale de

l’amygdale (MeA) ont été repérés respectivement au niveau du bregma -1,80 à -2,12 et -

1,80 à -2,56. La section sacrée de la moelle épinière a été prélevée au niveau du

segment S1-S2 de la moelle épinière. Le nombre de neurones positifs au c-Fos a été

déterminé à l’aide du logiciel Lucia G4.8 sur 4 coupes pour le PVN et MeA et 16

coupes pour la section S1-S2.

Les valeurs ont été exprimées en moyenne ± l’erreur standard à la moyenne (ESM) et

représentent la moyenne du nombre de neurones c-Fos positifs par coupes pour chaque

animal. Les données ont été traitées statisquement après un test t. Les différences ont été

considérées significatives pour les valeurs de P<0,05.

Traitement par voie orale L. farciminis (1011CFU/ml/j)

ou NaCl (0,9%)

Immunoréactivité de la protéine c-Fos au niveau:

• de la section S1-S2 de la moelle épinière

• du tronc cérébral et cerveau

1’

stress de contrainte ou fictif

6600 mmmmHHgg

1155

44553300

CRD

15’

2h

1h

J-15 J0


122

Résultats

1. Effet du stress sur l’expression de la protéine c-Fos en réponse à une distension

colorectale au niveau de la moelle épinière sacrée, du PVN et du MeA.

Quelque soit le type de stimulus appliqué, la distension colorectale, le stress de

contrainte ou les deux, l’expression de la protéine c-Fos est induite au niveau des

régions suivantes : la section S1-S2 de la corne dorsale de la moelle épinière, le noyau

paraventriculaire hypothalamique (PVN) et le noyau médial de l’amygdale (MeA) par

rapport au contrôle correspondant aux rats naïfs (sans stimuli) où le marquage est quasi

inexistant. Cependant, l’application de l’association de stimuli (stress de contrainte et

DCR) entraîne une surexpression de la protéine c-Fos au niveau des noyaux de la corne

dorsale (section S1-S2 de la moelle épinière), du PVN et du MeA. En effet, une

augmentation significative du nombre des cellules c-Fos positives de 50%, 44%, et 54%

est observée respectivement à ces régions (Figure 1A, 1B, 1C). L’augmentatoin de

l’activité neuronale est principalement localisée au niveau de la couche superficielle I-II

et autour du canal central (aire X) de la corne dorsale (section S1-S2) (Figure 2, C1).

Dans le PVN, la surexpression de la protéine c-Fos est principalement localisée dans la

région parvocellulaire (Figure 2, C2). Concernant l’amygdale, l’augmentation de la

protéine c-Fos est également observée au niveau de la région médiale (Figure 2, C3).

2. Effet d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur l’activation neuronale induite

par un stress

Un prétraitement de 15 jours par L. farciminis (1011 UFC/ml/jour) n’a aucun effet sur

l’expression de la protéine c-Fos induite par une DCR ou un stress seul au niveau spinal

(S1-S2) (Figure 3A et C) et supraspinal : PVN (Figure 3D et F) et MeA (Figure 3G et I).

En revanche, ce traitement semble diminuer de façon significative l’expression de la

protéine c-Fos induite par une DCR en absence de stress dans la région médiale du

noyau amygdalien (Figure 3G). De plus, L. farciminis diminue significativement le

nombre de noyaux c-Fos positifs après un stress suivi d’une DCR au niveau de la corne

dorsale de la moelle épinière S1-S2 (1,5 fois ; Figure 3A), du PVN (2 fois ; Figure 3D)

et du MeA (3,5 fois ; Figure 3G).


123

Discussion

Dans cette étude, nous avons montré qu’une session de stress aigu entraine une

surexpression de la protéine c-Fos à différentes régions du système nerveux central

(SNC) en réponse à une distension colorectale (DCR). L’activité neuronale a

principalement été détectée au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière sacrée

(S1-S2), et dans certaines régions du cerveau telles que les noyaux paraventriculaires de

l’hypothalamus (PVN) et la région médiale de l’amygdale (MeA) où une augmentation

significative du nombre de cellules c-Fos positives a été observée chez les rats stressés

soumis à une DCR comparés aux rats contrôles (absence de stress + DCR). Un

traitement par L. farciminis réduit la surexpression de la protéine c-Fos induite par le

stress après une DCR dans les régions spinales (section S1-S2) et supraspinales (PVN et

MeA), excepté au niveau du NTS. Les résultats obtenus après traitement par L.

farciminis sont résumés dans le tableau suivant :

Tableau 5 : Variations du nombre de cellules c-Fos positives activées lors d’un stress en réponse à

une distension colorectale après un traitement par L. faricminis à différents niveaux spinaux et

supraspinaux. DCR, distension colorectale; MeA, noyau median de l’amygdale; NTS, noyau du tractus

solitaire; PVN, noyau paraventriculaire.

Des études antérieures ont montré que l’hyperalgésie induite par un stress se

traduisent par des modifications de l’expression de la protéine c-Fos au niveau de

différents sites de la moelle épinière impliqués dans la transmission sensorielle (Light,

1992; Quintero et al., 2003). Dans notre étude, la surexpression de la protéine c-Fos

induite par un stress en réponse à une DCR est principalement localisée au niveau de la

MeA

PVN

Section S1-S2

+ DCR - DCR

+ DCR - DCR

Régions spinales et supraspinales

STRESS de CONTRAINTE + L. farciminis

STRESS FICTIF + L. farciminis


124

couche superficielle I-II de la corne dorsale (section S1-S2 de la moelle épinière) et de

la couche X formant la région épendymaire où se projettent les fibres afférentes

primaires. Ainsi, l’activation des fibres afférentes nociceptives Aδ et C induit

l’expression spinale de la protéine c-Fos (Munglani and Hunt, 1995). Quintero et al.

(2003) ont également montré qu’un stress répété chez le rat entraîne une surexpression

de la protéine c-Fos induite par un stimulus douloureux (test au formalin) résultant

d’une augmentation de recrutement des fibres afférentes. Par conséquent, nos résultats

suggèrent qu’une pré-activation ou sensibilisation des neurones sensitifs par le stress est

nécessaire pour l’apparition d’une hypersensibilité viscérale en réponse à une distension

colorectale.

De la même façon, une augmentation du nombre de cellules c-Fos positives est induite

par un stress suivi d’une DRC au niveau du PVN et plus particulièrement dans les

noyaux parvocellulaires médians. Bien que l’expression de la protéine c-Fos au niveau

du PVN ne permet pas d’identifier spécifiquement le type de neurones activés, il est

admis que les neurones parvocellulaires médians secrètent du CRH (Sawchenko, 1987)

et se projettent vers le tronc cérébral et la moelle épinière exerçant un contrôle du

système nerveux autonome. De plus, l’induction de l’expression de la protéine c-Fos au

niveau du PVN est considérée comme un index de l’activation de l’axe hypothalamo-

hypophysaire surrénalien dans la réponse au stress (Imaki et al., 1992). Le PVN

participe donc à la régulation du système nerveux autonome et de l’axe HPA (Chen et

Herbert, 1995).

Dans notre étude, nous avons également montré une augmentation de l’expression de la

protéine c-Fos induite par un stress en réponse à une distension colorectale au niveau de

plusieurs régions du noyau amygdalien. Seule la zone médiale du noyau amygdalien

(MeA) présente une différence significative de l’expression de la protéine c-Fos chez le

rat stressé soumis à une DRC par rapport aux rats contrôles (absence de stress + DRC).

L’induction de la protéine c-Fos a également été observée 30 à 60 minutes après un

stress d’immobilisation au niveau des noyaux amygdaliens centraux et médiaux chez les

rats Sprague-Dawley contrairement aux rats Wistar-Kyoto qui présentent une faible

anxiété à un stress aigu (Ma et Morilak, 2004). Les noyaux amygdaliens médians sont

impliqués dans l’activation du système nerveux autonome noradrénergique (Dayas et


125

Day, 2002) et régulent l’activation de l’axe HPA (Dayas et al., 1999) en réponse à un

stress.

Actuellement aucune étude n’a décrit une influence des probiotiques sur le système

nerveux extrasèque. Hooper et al. (2001) suggère une communication directe entre la

microflore commensale et le système nerveux entérique (Hooper et Gordon, 2001). Ces

auteurs montrent ainsi une différence d’expression de gènes codant pour certains

neurotransmetteurs chez la souris colonisée par rapport à la souris axénique. Par

ailleurs, d’autres études ont montré que des bactéries pathogènes pouvaient induire

l’expression de la substance P (médiateur nociceptif) au niveau du tissu endommagés

(Gonkowski et al., 2003; Piedimonte et al., 1999). Par conséquent, nous ne pouvons pas

exclure l’hypothèse que L. farciminis pourrait influencer la libération de

neurotransmetteurs des neurones intrinsèques et extrinsèques impliqués dans la

perception et la transmission des messages nociceptifs.

Les résultats de cette étude montrent qu’un stress suivi d’une DCR active les afférences

au niveau du côlon, se traduisant par une surexpression de la protéine c-Fos au niveau

spinal et supraspinal. Cette activité neuronale est abolie après un traitement par L.

farciminis. Les effets antinociceptifs de ce probiotique résultent d’une diminution de

l’activation et/ou la sensibilisation des neurones sensitifs au niveau spinal et supraspinal

qui avaient induites par le stress.


126

Figure 1

A

0

15

30

45

60

75

90

105

Nombre de cellules Fos positives (moyenne/section)

*

stress fictif stress

*

+

+

S1

- DRC + DRC

B

0

50

100

150

200

250

300

350

*


PVN

+ +


0

50

100

150

200

250

300

C


AMe

*

* +

+


Figure 1 Nombre de cellules c-Fos positives quantifié au niveau (A) de la moëlle épinière

sacrée (S1-S2), (B) noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) et (C) région médiale du

noyau de l’amygdale (MeA) chez le rat après une session de stress aigu ou fictif en réponse à

une distension colorectale (DCR) (noir) ou non (blanc). Chaque barre représente la moyenne ±

E. S M. * p<0.05 significativement différent vs. le groupe contrôle correspondant; + p<0.05

significativement différent vs le groupe stress fictif.


127

v

Figure 2: Observation microscopique représentant l’expression de la protéine c-Fos au niveau de la

moëlle épinière sacrée, du PVN et du MeA. Photo A, animaux controles (absence de DCR et de stress).

Photo B, animaux soumis à une DCR an absence de stress. Photo C, animaux soumis à un DCR après un

stress.

corne dorsale

III-IV

V-VII

III

dp pm

mp pv

I-II

X

contrôle

PVN

S1

MeA

Figure 2

DRC

B1

stress + DRC + NaCl

C1

III

B2

MeA

A3 B2

III

C2

C3

III-IV

V-VII

C

A1

A2


128

15

30

45

60

75

90

105

sham-stress stress

0 L. f.

*

A

L. f. L. f. L. f. NaCl NaCl NaCl NaCl

S1

Nombre de cellules c-Fos positives (moyenne/section)

C

stress + DRC + L.f.

B

Figure 3 stress + DRC + NaCl


129

0

50

100

150

200 250

300

350 *

D

Stress fictif stress

L. f. L. f. L. f. L. f. NaCl NaCl NaCl NaCl

PVN


III

E

III

0

50

100

150

200

250

300


L. f. L. f. L. f. L. f. NaCl NaCl NaCl NaCl

MeA

*

*

G


stress + DRC + NaCl

stress + DRC + NaCl

stress + DRC + L. f

stress + DRC + L.f

F

H

I


130

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133

PARTIE 4

DISCUSSION GENERALE

CONCLUSION

DISCUSSION GENERALE

134

L’évaluation des potentialités thérapeutiques des probiotiques dans les

pathologies gastro-intestinales a fait l’objet de plusieurs études chez l’animal mais

également d’essais cliniques chez l’homme ces vingt dernières années. L’intérêt

croissant pour l’utilisation des probiotiques en tant qu’agents thérapeutiques, renforcé

par l’efficacité des traitements par certaines souches chez l’homme, a été motivé

également par l’augmentation d’apparition d’antibiorésistances des bactéries pathogènes

en particulier en milieu hospitalier et par la demande croissante des consommateurs

pour des substituts naturels aux agents pharmacologiques classiques.

Ainsi parmi les pathologies ciblées par les traitements probiotiques figurent des

pathologies digestives aiguës ou chroniques (infection, inflammation, troubles

fonctionnels intestinaux, cancers colo-rectaux) mais également extra digestives (allergie

cutanée, respiratoire, asthme). La littérature des dix dernières années souligne un effort

particulier pour la mise en évidence des mécanismes d’action impliqués dans les effets

exercés par ces agents microbiens mais ce domaine reste encore incomplètement

exploré.

Ce travail se situe dans la continuité des travaux précédents du laboratoire qui

ont montré qu’un traitement par L. farciminis diminue la sévérité d’une colite

expérimentale et la douleur viscérale associée chez le rat, par un mécanisme impliquant

le monoxyde d’azote libéré dans la lumière intestinale par cette souche . Ces travaux ont

également montré que le traitement par L. farciminis exerce des propriétés anti-

inflammatoires par des mécanismes d’action généralement partagés par les probiotiques

comme la modulation de la microflore endogène, la réduction de la translocation

bactérienne et la modulation du profil cytokinique, soulignant la complexité des

interactions entre hôte et probiotiques.

Notre travail se situe dans une perspective d’élargissement des potentialités

thérapeutiques de L. farciminis vers des pathologies digestives à caractère non

inflammatoire ou micro-inflammatoire comme les troubles fonctionnels digestifs et plus

particulièrement le syndrome de l’intestin irritable (SII). Le SII souvent associé avec

des épisodes de vie stressants est caractérisé par une hypersensibilité viscérale à la

distension de la paroi intestinale, mais aussi selon des études plus récentes par une

augmentation de la perméabilité intestinale, des altérations de la réponse immunitaire et

des changements de la microflore intestinale. Quelques études cliniques rapportent une

DISCUSSION GENERALE

135

efficacité de certains traitements probiotiques vis-à-vis des symptômes du SII. Toutefois

les effets et les mécanismes d’action des probiotiques, impliqués en particulier dans les

anomalies sensitives viscérales de cette pathologie, restent très peu étudiés. Ainsi notre

objectif était d’évaluer les effets et les mécanismes d’action d’un traitement par L.

farciminis sur l’hyperalgésie viscérale induite par un stress aigu, le stress de contrainte,

chez le rat.

Ce travail s’est déroulé en trois temps. Dans un premier temps nous avons étudié

la relation entre l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique et

l’hyperalgésie viscérale induites par le stress. Ensuite après avoir mis en évidence une

relation de cause à effet entre ces deux paramètres altérés par le stress, nous avons

déterminé les effets d’un traitement par L farciminis sur ces paramètres. Nous avons

plus particulièrement évalué le rôle du NO et de la barrière épithéliale colique dans les

effets du L farciminis vis-à-vis de l’hypersensibilité viscérale et de l’augmentation de la

perméabilité paracellulaire colique induite par le stress. Enfin nous nous sommes

attachés à l’évaluation de l’activation des zones spinales et supraspinales suite au stress

de contrainte suivi d’une distension colorectale, et les effets de L. farciminis sur cette

activation.

1. Aspects méthodologiques

1.1. Le traitement probiotique utilisé

Suite aux travaux précédents de l’équipe ayant validé le statut probiotique de L.

farciminis et mis en évidence ses propriétés anti-inflammatoires à l’aide d’un modèle de

colite expérimentale, nous avons utilisé pour nos études L farciminis comme souche

probiotique dans le but d’évaluer les propriétés de cet agent microbien sur la douleur

viscérale à l’aide d’un modèle de type non inflammatoire, en l’occurrence un stress

aigu.

Ce probiotique disponible dans la collection de l’Institut Pasteur (CIP 103136), a

été initialement choisi pour sa capacité à produire du NO en tant que métabolite

bactérien et utilisé comme vecteur biologique de NO dans la lumière intestinale.

Plusieurs souches bactériennes sont décrites dans la littérature comme productrices de

DISCUSSION GENERALE

136

NO in vitro à partir de la réduction des nitrates en nitrites par une nitrate réductase et

des nitrites en NO par une nitrate réductase dénitrifiante (Avice et al., 1999; Xu et al.,

2001). L. farciminis figure parmi ces souches (Wolf et al., 1990). De plus, les travaux

précédents ont montré que L farciminis était également capable de libérer du NO dans

des conditions in vivo (Lamine et al., 2004a). Etant donné notre objectif d’évaluer le

rôle du NO dans les effets de L farciminis vis-à-vis de la douleur viscérale induite par le

stress nous avons poursuivi avec cette souche. De plus sa présence naturelle dans les

denrées alimentaires (Reuter, 1970) et son utilisation actuelle dans l’industrie agro-

alimentaires (Bioacarna®), fournissant des indices d’innocuité pour des applications

thérapeutiques futures ont renforcé notre choix pour ce lactobacille.

Concernant la durée du traitement, nous avons opté pour un traitement préventif

de 15 jours avant l’application du stress par analogie avec les études précédentes. De

plus, même si cette durée a été choisie initialement de façon arbitraire, elle s’est avérée

appropriée puisque L farciminis, n’appartenant pas à la flore commensale du rat, a été

détecté dans les matières fécales ce qui suggère une survie de ce lactobacille au cours du

passage gastro-intestinal et une bonne adaptation dans un biotope inconnu.

Enfin, la dose journalière administrée a été de 1011 UFC/ml par analogie avec les

travaux précédents. Toutefois dans la littérature des doses plus faibles sont

generalement utilisées pour l’évaluation des effets de souches probiotiques en

conditions inflammatoires (Kuisma et al., 2003; Kruis et al., 1997) ou non

inflammatoires (O’mahony et al., 2005; Whorwell et al., 2006). Plus particulièrement

les doses utilisées chez l’homme lors des essais cliniques dans le cadre du SII sont de

l’ordre de 1010 UFC (O’mahony et al., 2005). Ainsi nous avons récemment évalué

l’effet de L. farciminis administré à la dose journalière de 109 UFC/ml sur la douleur

viscérale induite par le stress de contrainte qui s’est avérée efficace. Cette donnée est

importante pour la valorisation de L farciminis dans les applications thérapeutiques

futures envisagées.

1.2. Modèle de stress de contrainte

L’influence du stress sur la fonction intestinale dépend en majeure partie des

modalités utilisées (stress physique, psychologique, durée, fréquence…). En effet, les

DISCUSSION GENERALE

137

réponses biochimiques et comportementales chez l’animal sont variables et

caractéristiques du type de stress utilisé (Odio et al., 1985).

Le modèle de stress de contrainte présente à la fois une composante physique et

une composante psychologique. L’étude de l’influence de différents types de stress sur

le transit intestinal chez le rat a révélé un effet plus important du stress de contrainte

comparé à des stress strictement physiques (nage forcée) ou psychologiques (exposition

à un prédateur) (Williams et al., 1989). Le stress de contrainte, contrairement à d’autres

modèles de stress physiques (nage forcée en eau froide), ne conduit pas à la formation

d’ulcères. Les modifications biochimiques induites par ce modèle correspondent à une

augmentation des taux plasmatiques d’ACTH et de corticostérone (Williams et al.,

1988).

Les modifications de la barrière épithéliale au niveau du côlon observées au

cours du stress chez le rat (voire revue pour Söderholm et Perdue, 2001) soulèvent un

intérêt particulier dans la genèse des dysfonctionnements intestinaux qui correspond aux

symptômes caractéristiques des troubles fonctionnels intestinaux, notamment du SII.

Ainsi, le stress de contrainte constitue un modèle approprié à l’étude des mécanismes

impliqués dans les altérations de la fonction digestive observées chez des patients

souffrant du SII.

1.3. Modèle de distension colorectale

Le protocole de distension colorectale chez le rat est classiquement utilisé dans

l’étude de la douleur viscérale à différent endroits du tube digestif (œsophage, estomac,

intestin, côlon et rectum) (Salet et al., 1998; Castroman et al., 2001). Cette procédure de

distension colorectale permet de reproduire les stimuli naturels à l’origine des douleurs

viscérales chez l’homme, caractérisés par une distension ou la contraction des organes

ou l’étirement du mésentère (Lewis, 1942). Le modèle de distension colorectale chez le

rat a été mise en lace par Ness et Gebhart (1988), celui de distension rectale a été

élaboré par Morteau et al. (1994). Un des intérêts du modèle de distension rectale ou

colorectale réside dans le caractère non invasif de la mise en place de ballon, inséré par

voie anale permettant de s’affranchir d’une étape chirurgicale.

DISCUSSION GENERALE

138

Chez le rat éveillé, la distension colorectale entraîne un réflexe recto-colique

inhibiteur (inhibition de la motricité caeco-colique) associé à une augmentation du

nombre de contractions des muscles striés de l’abdomen (Morteau et al, 1994). Cette

réponse, quantifiée par électromyographie, présente une bonne reproductibilité inter-

individuelle et son intensité est corrélée au volume de distension appliqué. L’activité

électrique et mécanique des cellules musculaires de la paroi abdominale, représentative

des contractions abdominales en réponse à la distension colorectale, est considérée

comme un index de la douleur viscérale. Ces contractions ont été associées à une

augmentation du rythme respiratoire et cardiaque et de la pression artérielle. Enfin, la

stimulation par paliers successifs permet une évaluation du seuil et de l’intensité de la

douleur viscérale, le seuil correspond au volume de distension nécessaire pour induire

une réponse viscéro-motrice significative.

2. Mécanismes impliqués dans les altérations de la sensibilité viscérale

lors d’un stress : rôle de la barrière épithéliale colique

Plusieurs études se sont intéressées aux effets du stress sur la sensibilité

viscérale mais également, plus récemment, sur la perméabilité intestinale ainsi qu’aux

mécanismes impliqués dans ces effets. En effet, chez l’animal, un stress aigu induit une

hyperalgésie viscérale en réponse à une distension colorectale impliquant une libération

centrale de corticolibérine (CRF) par activation de l’axe HPA, et la dégranulation des

mastocytes muqueux (Gue et al., 1997). Par ailleurs, un stress aigu ou chronique induit

chez le rat une augmentation de la perméabilité aux macromolécules (Tache et Perdue,

2004; Santos et al. 2001) traduisant des altérations de la barrière épithéliale. Cet effet du

stress sur la perméablité intestinale met également en jeu la dégranulation des

mastocytes, puisque chez les rats déficients en mastocytes l’augmentation de la

perméabilité intstinale en réponse au stress n’a pas été observée (Santos et al., 2001).

Plus récemment, il a été montré que l’administration intrapéritonéale de CRF reproduit

les modifications de la perméabilité intestinale induites par un stress aigue ou

chronique, suggérant l’implication des récepteurs au CRF périphériques dans cet effet

(Tache et al., 2004). Au vu de ces données, l’hypothèse d’un lien entre les altérations de

DISCUSSION GENERALE

139

la barrière épithéliale et la douleur viscérale induites par le stress a pu être formulée. En

effet, une augmentation de la perméabilité paracellulaire intestinale serait susceptible de

favoriser le passage d’agents indésirables présents dans la lumière intestinale à travers la

barrière épithéliale, lesquels à leur tour activeraient le système immunitaire, local

libérant ainsi des médiateurs capables d’activer et/ou sensibiliser les terminaisons

nerveuses sensitives. Une telle sensibilisation traduite par une hyperalgésie viscérale en

réponse à une distension colorectale, a été également décrite dans le cadre d’une

inflammation expérimentale intestinale, caractérisée par une rupture de la barrière

épithéliale et une activation immunitaire (Morteau et al., 1994; Ness et al., 2001). Ainsi,

la première partie de nos travaux a été centrée sur la validation de l’hypothèse de

l’existence d’une relation de cause à effet entre l’augmentation de la perméabilité

paracellulaire colique et l’hypersensibilité viscérale induites par le stress de contrainte.

Pour ce faire, nous avons eu recours à l’utilisation d’un outil pharmacologique,

un bloqueur chimique des jonctions serrés, le TAP (2,4,6 aminopyrimidine). Cette

substance a été traditionnellement utilisée en tant qu’inhibiteur de la perméabilité

sélective aux cations des jonctions serrées de la vésicule biliaire et d’autres tissus

endommagés, déterminée ex vivo par la technique de la chambre de Ussing (Moreno,

1974; Moreno, 1975). Une étude in vivo chez le chien a montré que le TAP bloque la

diffusion de Na+ à travers les cellules épithéliales de l’iléon et les changements de la

différence de potentiel transépithélial, généré par l’exposition de la muqueuse iléale à

une solution de mannitol dépourvue de Na+ (Krejs et al., 1977). De plus, il a été décrit

chez le rat, que le transport de Na+ à travers les cellules épithéliales intervient dans la

régulation de la perméabilité intestinale (Turner et al., 1995). Dans notre étude, la

perfusion intracolique continue du TAP, une heure avant et pendant de la session de

stress, supprime à la fois l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique et

l’hypersensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale induites par le stress,

montrant l’existence d’une relation de cause à effet entre ces deux paramètres.

Nous nous sommes attachés par la suite à la caractérisation des altérations de la

barrière épithéliale colique responsables des altérations de la sensibilité viscérale induite

par le stress.

La perméabilité paracellulaire intestinale est régulée principalement par les

jonctions serrées intercellulaires constituées d’un complexe de protéines

DISCUSSION GENERALE

140

transmembranaires et intracytoplasmiques (Fanning et al., 1999; Liu et al., 2000;

Tsukita et al., 2000). Des études menées à l’aide des lignées cellulaires épithéliales de

l’intestin ou de muqueuse isolées à partir de l’intestin humain ont montré que la

phosphorylation de la chaîne légère de la myosine (MLC) via l’activation de la kinase

de la MLC (MLCK), survenant au niveau de l’anneau péri-jonctionnel de l’actine et de

la myosine (Berglund et al., 2001), induit une contraction du cytosquelette entrainant

ainsi une ouverture des jonctions serrées (Turner et al., 1997; Berglund et al., 2001). A

partir de ces données, notre objectif était d’évaluer le rôle de la MLCK dans

l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique induite par le stress de

contrainte. Nous avons ainsi utilisé un inhibiteur sélectif de la MLCK, le ML-7 (1-(5-

Iodonaphtalene-1-sulfonyl)-1Hhexahydro-1,4-diazepine hydrochloride). Un

prétraitement des animaux stressés par administration intrapéritonéale de ML-7 inhibe

l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique induite par le stress, suggérant

l’implication de l’activation de la MLCK dans cet effet. Ces données confirment des

résultats antérieurs montrant qu’un stress répété chez la souris induit une augmentation

de la perméabilité paracellulaire colique dépendante de l’activation de la MLCK des

colonocytes et se traduisant par une augmentation des taux de la protéine MLC

phosphorylée détectés (Ferrier et al., 2003). (Figure 29).

DISCUSSION GENERALE

141

Figure 29 : Mécanismes impliqués dans l’hyperalgésie viscérale induite par un stress

de contrainte en réponse à une distension colorectale (Ait-Belgnaoui et al., 2005).

Plusieurs études ont décrit les cascades des événements biochimiques

intracellulaires conduisant à la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales et

l’ouverture des jonctions serrées qui en découle. Ainsi la MLCK se complexe à la

calmoduline pour catalyser la phosphorylation de la MLC en présence de l’activation

d’une ATPase-Mg3+ hydrolysant l’ATP, afin de générer une énergie mécanique

nécessaire à la contraction des filaments d’actine et de myosine (Madara et al., 1986;

Ma et al., 1995; Makhlouf, 2003; Somlyo et al., 2003). Toutefois le mécanisme par

lequel le stress active la MLCK des cellules épithéliales intestinales n’a pas été élucidé.

Ferrier et al. ont montré qu’un stress répété induit une augmentation de la

phosphorylation de la MLC sans affecter le niveau d’expression de la protéine MLCK.

Ces auteurs ont également montré que l’augmentation de la perméabilité paracellulaire

colique induite par le stress répété dépend de la présence des lymphocytes T CD4(+) et

de la surexpression d’IFN-γ au niveau colique. Ils concluent que l’IFN-γ pourrait

induire l’activation de la MLCK sans moduler son niveau d’expression. Par contre

Pathogènes Bacteries Toxines…

Hypersensibilité viscérale

MLCP

STRESS

Cytokines CRF…

IFNγ

Tryptase 5-HT…

médiateurs inflammatoires

Terminaison nerveuse

pôle basal

pôle apical

Augmentation de la perméabilité (via activation de la MLCK)

MLC

MLCK

MLCP OUVERTURE DES

JONCTIONS SERREES

Cellules épithéliales

Activation des mastocytes

Lymphocytes T

DISCUSSION GENERALE

142

l’augmentation du niveau de phosphorylation de la MLC dans les cellules épithéliales

est associée à la contraction du cytosquelette et, par conséquent, à l’augmentation de la

perméabilité paracellulaire colique (Ferrier et al., 2003; Petrache et al., 2001;

Zolotarevsky et al., 2002). Cependant, le processus de phosphorylation de la MLC est

décrit comme un phénomène réversible dépendant du complexe calmoduline-MLCK.

Ainsi nous nous sommes intéressés à la cinétique d’expression de la MLC phosphorylée

(p-MLC) à différents temps d’exposition au stress de contrainte (de 15 à 90 min). Nous

avons observé une augmentation de 30 % du niveau d’expression de la p-MLC entre 15

et 45 minutes d’exposition au stress, avec un pic d’expression à 45 minutes, suggérant

une apparition rapide des événements conduisant à la contraction du cytosquelette des

colonocytes. En revanche, quelque soit le temps d’exposition au stress, le niveau

d’expression de la protéine MLCK n’est pas modifié. Compte tenu que les effets du

stress sur la perméabilité paracellulaire colique et l’hyperalgésie viscérale ont été

observés dans nos études, bien au delà de la plage de surexpression de la p-MLC, nous

suggérons que des mécanismes dépendants d’autres cascades intracellulaires

régulatrices de l’ouverture des jonctions serrées prennent le relais aux stades plus

tardifs.

L’ensemble des résultats obtenus dans cette première partie valide l’hypothèse

de départ en montrant une relation de cause à effet entre l’augmentation de la

perméabilité paracellulaire colique et l’hyperalgésie viscérale induite par un stress

aigue, et souligne l’importance de l’intégrité de la barrière épithéliale dans ces effets.

Ainsi nous proposons les mécanismes d’action impliqués dans l’hyperalgésie viscérale

induite par un stress aigu dans la figure 29.

En tenant compte de la place du stress dans l’apparition et/ou l’exacerbation des

symptômes du SII, une pertinence physiopathologique de nos résultats pourrait

s’inscrire dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques de cette

pathologie. En effet, les patients souffrant du SII sont caractérisés par une augmentation

de la perméabilité intestinale (Marshall, 2004) et présentent une hypersensibilité

viscérale en réponse à la distension de la paroi intestinale (Bradette et al., 1994). De

plus ces patients sont caractérisés par des modifications immunitaires locales telles

qu’une augmentation du nombre de cellules neuroendocrines, des lymphocytes T et des

lymphocytes intraépithéliaux, et de la densité des mastocytes au niveau de la muqueuse

DISCUSSION GENERALE

143

du jéjunum et du côlon (Barbara et al., 2004; Dunop et al., 2003; O’sullivan et al.,

2000; Wang et al., 2004). Des altérations de la réponse immunitaire locale pourraient

être associées à un passage accru de facteurs endoluminaux indésirables activant le

système immunitaire local qui, par des médiateurs libérés, pourrait sensibiliser/activer

des terminaisons nerveuses sensitives. Des altérations de la barrière intestinale ont été

suggérées en tant que facteurs étiologiques dans différentes pathologies digestives

associées à une douleur abdominale. Ainsi une augmentation de la perméabilité

intestinale a été décrite dans la maladie de Crohn (Söderholm et al., 1999) et la

rectocolite hémorragique (Gitter et al., 2001), l’alcoolisme (Bjarnason et al., 1984) et la

gastroentérite aiguë (Zuckerman et al., 1993). Dans toutes ces situations pathologiques

une stimulation excessive du système immunitaire local ainsi qu’une translocation

bactérienne a été décrite.

3. Influence d’un traitement par Lactobacillus farciminis sur

l’hyperalgésie viscérale induite par un stress : maintien de l’intégrité

de la barrière épithéliale

Dans cette deuxième partie nous nous sommes attachés à l’évaluation des effets

d’un traitement par L. farciminis sur l’hyperalgésie viscérale induite par le stress ainsi

qu’aux mécanismes d’action impliqués. Nous avons exploré deux pistes concernant les

mécanismes d’action impliqués dans un effet antinociceptif par ce traitement : le rôle du

monoxyde d’azote (NO) et l’incidence sur les altérations de la barrière épithéliale

induites par le stress. Le rationnel de ces deux pistes découle des travaux précédents de

l’équipe ayant montré que L farciminis administré par voie orale chez le rat : (i) est

capable de produire du NO dans la lumière intestinale et de diminuer, via un mécanisme

impliquant l’apport de ce NO exogène, la sévérité d’une colite expérimentale chez le rat

et l’hyperalgésie viscérale associée à cette inflammation; (ii) diminue l’augmentation de

la perméabilité intestinale associée à la colite expérimentale.

Les résultats de cette partie montrent qu’un traitement oral de deux semaines par

L. farciminis prévient de l’hypersensibilité viscérale en réponse à une distension

DISCUSSION GENERALE

144

colorectale et l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique induites par le

stress de contrainte.

3.1. Rôle du monoxyde d’azote (NO)

Pour évaluer le rôle du NO dans les effets protecteurs de L. farciminis vis-à-vis

des effets du stress sur la douleur viscérale et la perméabilité intestinale, nous avons

opté pour une approche pharmacologique utilisant l’hémoglobine en tant que piégeur de

NO. La réaction entre l’hémoglobine et le NO est rapide et stœchiométrique (Doyle et

al., 1981). Le NO forme des complexes dinitrosylés avec le fer et se lie facilement et

fortement avec des protéines contenant un groupement hème comme l’hémoglobine. De

par sa taille, l’hémoglobine ne traverse pas les membranes cellulaires et piège

uniquement le NO généré dans l’espace extracellulaire ou interstitiel, et non le NO

synthétisé par les NOS (Feelish M. et al., 1996). Toutefois une critique peut être

adressée concernant l’utilisation de l’hémoglobine (perfusion inracolique) dans notre

étude, basée sur une possible interaction entre cette protéine et la microflore colique. En

effet, l’hémoglobine ainsi que d’aures hémoprotéines atteignant la lumière colique sont

métabolisées par des bactéries donnant naissance à des métabolites dépourvus de Fer

(Young et al., 1990). Cependant, Lamine et al. (2004a) ont montré précédemment que

L. farciminis induit une augmentation de la concentration du NO dans la lumière

colique et que la perfusion réduit cette concentration à un niveau basal, suggérant que

cette pefusion n’induit pas des altérations signficatives de la microflore tout au moins

concernant sa capacité à dégrader l’hémoglobine, puisque celle ci conserve son aptitude

de piégeur de NO.

La perfusion intracolique d’hémoglobine chez les rats stressés et traités par L.

farciminis a reversé les effets protecteurs de ce traitement vis-à-vis de l’hyperalgésie

viscérale et l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique induites par le

stress, suggérant l’implication du NO dans les effets de ce probiotique. Deux

hypothèses peuvent être envisagées concernant les voies d’implication du NO dans ces

effets : une action directe du NO sur la sensibilité viscérale ou une action de NO sur la

barrière épithéliale.

Un effet protecteur du NO d’origine exogène sur la barrière épithéliale a déjà été

décrit (Kanwar et al., 1994; Schleiffer et al., 1996). En effet, les altérations de la

DISCUSSION GENERALE

145

perméabilité intestinale observées suite à des lésions ischémiques sont prévenues chez

le rat recevant un traitement par un donneur chimique de NO, la molsidomine

(Schleiffer et al., 1996). De plus, l’administration des inhibiteurs de NO synthétases

chez le chat, provoque une forte augmentation de la perméabilité intestinale

indépendante des altérations sur le flux sanguin ou l’adhésion des leucocytes au niveau

de l’endothélium vasculaire (Kubes, 1992). Cet effet des inhibiteurs de NO synthétases

est reversé par l’administration concomitante de donneurs de NO ou de L-arginine,

soulignant que le NO produit au niveau du tractus gastro-intestinal joue un rôle dans la

régulation de la perméabilité paracellulaire intestinale. De plus, une étude récente

conduite in vitro, a montré que la contraction du cytosquelette des cellules endothéliales

provoquée par une stimulation par H2O2 est inhibé par le NO (Rivero-Vilches et al.,

2003). Les auteurs montrent que le NO participe à l’activation d’une phosphatase

responsable de la déphosphorylation de la MLC via un mécanisme intracellulaire

dépendant de la PKG/cGMP (Rivero-Vilches et al., 2003) entraînant une relaxation du

cytosquelette des cellules endothéliales. Toutefois, dans notre étude, nous n’avons pas

évalué le lien entre le NO exogène apporté indépendemment d’un vecteur bioogique sur

l’augmentation de la p-MLC induite par le stress.

La demi-vie du NO dans les systèmes biologiques est de l’ordre de quelques

secondes (Marletta, 1988), son apolarité lui facilite son passage à travers les membranes

biologiques et sa diffusion à travers les tissus. La distance de diffusion du NO sécrétée

par une cellule unique est de l’ordre de 150 à 300 µm en 4 à 15 secondes et encore

d’avantage lorsque les cellules sont regroupées (Lancaster, 1994; Lancaster, 1996).

Ainsi, par ses capacités de diffusion, l’activité du NO n’est pas restreinte à son site de

production. Le NO ne se fixe pas sur un recepteur mais interagit avec des cibles

moléculaires non spécifiques. Le NO peut également moduler les enzymes responsables

de sa synthèse par les cellules. En effet, un rétrocontrôle négatif du NO sur l’activité des

NO synthases constitutives (cNOS) et inductible a été décrit (iNOS) (Griscavage et al.,

1993; Rengasamy et al., 1993). Ainsi, certains donneurs de NO inhibent l’expression de

la iNOS dans les neutrophiles (Moilanen et al., 1993; Mariotto et al., 1995) en exerçant

un rétrocontrôle négatif direct sur l’expression de cette enzyme (Ravichandran et al.,

1995). De plus, dans un modèle de colite expérimentale, l’augmentation de l’activité

iNOS au niveau de la muqueuse colique provoquée par l’induction de l’inflammation a

DISCUSSION GENERALE

146

été fortement réduite lors de l’apport de NO dans la lumière colique suite à un

traitement par L. farciminis (Lamine et al., 2004a). Les auteurs avaient suggéré que le

NO exogène ainsi apporté, par un mécanisme de rétrocontrôle négatif, pourrait

empêcher l’induction de l’expression de la iNOS par les cellules épithéliales et

immunitaires. Dans ce travail, nous avons n’avons pas évalué l’activité des NO

synthases lors du stress de contrainte. Cependant, chez le rat, un stress de contrainte

associé à une immersion dans l’eau induit une forte augmentation de la iNOS et une

diminution de la cNOS dans la muqueuse gastrique (Nishida et al., 1997).

L’augmentation de la l’expression de la iNOS se traduit par une fote production de NO

d’origine endogène susceptible, de par sa réactivité, de former de composés radicaliares

délétères conduisant à des lésions de la muqueuse et une rupture de la barrière

épithéliale. Nous pouvons émettre l’hypothèse que le NO exogène apporté dans la

lumière par L. farciminis pourrait exercer un rétrocontôle négatif sur une éventuelle

induction de la iNOS par les cellules épithéliales et/ou immunitaires par le stess

contribuant ainsi au maitient de l’intégrité anatomo-fonctionnelle de la barrière

nestinale.

Le rôle du NO dans les voies de la transmission des messages douloureux est

très controversé. Ainsi, le NO a été décrit comme médiateur impliqué dans

l‘hyperalgésie d’origine inflammatoire (Aley et al., 1998) mais il a été également

proposé comme médiateur impliqué dans l’hyperalgésie induite par des antagonistes

opiacés (Nozaki-Toguchi et Yamamoto, 1998). Le rôle du NO dans la sensibilité

viscérale a fait l’objet de très peu d’études. Ainsi, l’administration d’un donneur du NO,

le SNP, reduit la réponse nociceptive à la distension gastrique chez le rat (Rouzade et

al., 1999) et exerce également un effet nociceptif dans le «writhng test» chez la souris

(Fidecka et Lalewicz, 1997) (Figure 30).

3.2. Effets sur la barrière épithéliale colique

Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que le stress de

contrainte induit une augmentation de la perméabilité paracellulaire colique par

activation de la MLCK, sans modification de son expression, et une augmentation

précoce du niveau d’expression de la p-MLC indusant une contraction du cytosquelette

des colonocytes et l’ouverture des jonctions serrées qui en découle. Le traitement par L.

DISCUSSION GENERALE

147

farciminis diminue l’augmentation de la perméabilité paracellulaire colique, et du

niveau d’expression de la p-MLC induite par le stress suggérant une action de ce

probiotique sur l’intégrité de la barrière épithéliale colique et plus particulièrement

l’ouverture des jonctions serrées. Cet effet protecteur du L. farciminis est en accord avec

le mécanisme d’action généralement évoqué concernant les probiotiques : le

renforcement de la barrière intestinale. De plus, cet effet est en accord avec des éudes

précédentes conduites in vitro montrant une action des probiotiques sur le complexe

protéique des jonctions serrées. Ainsi, L. acidophilus et S. streptococcus vivants,

bloquent la diminution de la résistance transépithéliale des cellules épithéliales en

culture, induites par des souches d’ E. coli enteroinvasives (EIEC) en agissant sur les

protéines du cytosquelette telles que ZO-1, actine, occludine (Resta-Lenert et al., 2003).

De la même façon le surnageant de culture de L. thermophilus prévient l’inhibition de

l’expression de ZO-1 induite par l’exposition à l’aspirine de cellules épithélailes en

culture (Montalto et al. 2004). La capacité de L. farciminis d’agir sur les protéines du

cytosquelette des colonocytes en empêchant l’ouverture des jonctions serrées, pendant

le stress, peut se traduire par une diminution du passage d’agents indésirables présents

dans la lumière, capables d’activer le système immunitaire sous muqueux et la

libération des médiateurs susceptibles de sensibiliser les afférences sensitives.

Un autre mécanisme d’action communément attribué aux probiotiques est leur

possibilité de coloniser l’intestin et de participer ainsi à la normalisation de la

microflore et à la lutte contre les bactéries pathogènes. L. farciminis administré par voie

orale pendant deux semaines est capable de coloniser l’intetin et d’adhérer à la

muqueuse comme indique sa détection dans les matières fécales et la muqueuse colique

d’animaux ainsi traités (Lamine et al., 2004a). Il est par conséquent également capable

de pallier les altérations de la microflore colique induites par une inflammation colique

(Lamine et al. 2004a). Par ailleurs, une étude récente montre que les pertubations de la

flore ainsi que l’activation des cellules immunitaires de la sous muqueuse induisent une

hypersensibiité viscérale et que cet effet est prevenu par l’administration de L.

paracasei (Verdu et al., 2006).

Le caractère aigu du stress utilisé dans notre travail ne nous a pas incités à

évaluer les effets du stress sur la microflore et l’éventuelle incidence de L. farciminis

dans ces altérations. Toutefois des données préliminaires de Santos et al. (2006)

DISCUSSION GENERALE

148

montrent qu’un stress aigu chez le volontaire sain entraîne des modifications du profil

bactérien caractérisé au niveau du jéjunum (Santos et al., 2006). De plus, la destruction

partielle de la flore commensale après administration orale d’antibiotiques chez la

souris, diminue les effets du stress sur le changement de la perméabilité colique

(Demaude et al., 2005). Plus récemment, Zareie et al. ont montré qu’un stress chronique

induit une augmentation de l’adhésion et de la pénétration des bactéries commensales au

niveau de la surface des cellules épithéliales ainsi que la translocation bactérienne chez

le rat. Ces effets ont été prévenus par un prétraitement par L. acidophilus et L.

rhamnosus (Zareie et al., 2006). Ainsi dans notre étude, nous ne pouvons pas exclure

que la capacité de colonisation de l’intestine par L. farciminis et son interaction avec les

bactéries commensales, participent dans ses effets protecteurs vis-à-vis des altérations

de la perméabilité paracelluaire colique et l’hyperalgésie viscérale induites par le stress

(Figure 30).

Figure 30 : Mécanisme d’action potentielle de Lactobacillus farciminis sur la barrière épithéliale

intestinale

Lactobacillus farciminis

activation/sensibilisation

des neurones sensitives

BALANCE CYTOKINE PRO ET ANTI-

INFLAMMATOIRE

compétition

exclusion

EQUILIBRE DE LA MICROFORE

NO

fibres nociceptives

HYPERALGESIE VISCERALE

+ PERMEABILITE

PARACELLULAIRE COLIQUE

Pathogènes

Bactérie

toxines

N

PHOSPHATASE relaxation

actinomyosine

MLC p-MLC

JONCTIONS SERREES FERMEES

?

?

+

?

+ NO

NO

NO

NO

pôle apicale

pôle basale

DISCUSSION GENERALE

149

4. Influence de Lactobacillus farciminis sur les voies nerveuses spinales

et supraspinales activées lors d’un stress aigu suivi d’une distension

colorectale

Après avoir montré qu’un stress aigu chez le rat se caractérise par une

augmentation de la réponse abdominale corrélée à une augmentation de la perméabilité

colique, nous avons décrit un rôle anti-nociceptif d’un traitement par L. farciminis via

un renforcement de la barrière épithéliale colique et une implication du NO généré dans

la lumière colique par cette souche probiotique. Dans cette dernière partie, nous nous

sommes attachés à caractériser les voies spinales et supraspiales activées lors d’un stress

suivi d’une distension colorectale et à évaluer l’influence de L. farciminis sur cette

activation.

L’expression de la protéine c-Fos est classiquement utilisée comme marqueur

d’activité neuronale. De plus, il existe une bonne corrélation entre l’expression de la

protéine c-Fos et l’activation des fibres nociceptives après une stimulation douloureuse

(Bullitt, 1990; Jasmin et al., 1994). La protéine c-Fos est rapidement exprimée en

réponse à des stimulations périphériques nociceptives (Birder et al., 2003; Ness et

Gebhart, 2001) et atteint un pic d’expression une heure après la stimulation.

L’expression de c-Fos est négligeable en absence de stimulations, ce qui permet une

quantification plus aisée de l’activité neuronale après application de différents stimuli.

Nous avons montré qu’une session de stress induit une surexpression de la

protéine c-Fos à différentes régions du système nerveux central en réponse à une

distension colorectale. L’activité neuronale a été principalement identifiée au niveau de

la corne dorsale de la moelle épinière sacrée (section S1-S2) et certaines régions

cérébrales. Les principales régions du cerveau détectées Fos positives sont le noyau

paraventriculaire hypothalamique (PVN) et les noyaux médians de l’amygdale (MeA).

Concernant l’activité neuronale au niveau de la corne dorsale de la moelle

épinière sacrée, la surexpression de la protéine c-Fos est principalement localisée au

niveau de la couche superficielle I-II de la corne dorsale et de la couche X. Les fibres

afférentes primaires nociceptives se projettent essentiellement au niveau de la couche

superficielle de la moelle épinière. Quintero et al. (2003) ont également montré qu’un

DISCUSSION GENERALE

150

stress répété chez le rat entraînait une augmentation de l’expression de la protéine c-Fos

(Quintero et al., 2003). Cette surexpression de la protéine c-Fos observée dans

l’hyperalgésie induite par un stress chez le rat peut être médiée soit par l’augmentation

de recrutement des fibres afférentes, soit par une sensibilisation des neurones sensoriels.

Les processus nociceptifs au niveau de la moelle épinière font intervenir des

neurotransmetteurs, tels que les acides aminés excitateurs et la substance P, pouvant

induire la dépolarisation et/ou l’activation synaptique des neurones de la corne dorsale

de la moelle épinière (Donnerer et al., 1993). La substance P agit préférentiellement sur

les récepteurs NK1 (Fleetwood-Walker et al., 1990) localisés essentiellement au niveau

de la couche superficielle de la moëlle épinière et joue ainsi le rôle de neuromodulateur

sur l’influx nociceptifs transmis par les fibres afférentes primaires.

De la même façon, une importante augmentation du nombre de cellule c-Fos

positive est induite par un stress suivi d’une DRC au niveau du PVN et plus

particulièrement dans les noyaux parvocellulaires. Bien que l’expression de la protéine

c-Fos au niveau du PVN ne permet pas d’identifier spécifiquement le type de neurones

stimulés, il est admis que cette région contient des neurones à CRF (Sawchenko, 1987).

En fait, l’induction de l’expression de la protéine c-Fos au niveau du PVN est

considérée comme un index de l’activation de l’axe HPA dans la réponse au stress

(Imaki et al., 1992).

Cette étude a également montré une augmentation de l’expression de la protéine

c-Fos induite par un stress en réponse à une distension colorectale au niveau de

plusieurs régions du noyau amygdalien. Toutefois, cette augmentation a été

significativement observée uniquement dans la région médiales du noyau amygdalien

(MeA). Des études ont montré que la région MeA était impliquée dans l’activation du

système nerveux autonome noradrénergique (Dayas et Day, 2002) et régule l’activation

de l’axe HPA en réponse à un stress (Dayas et al., 1999).

L’ensemble de ces résultats nous permettent de conclure que le stress exacerbe

la sensibilité viscérale à une distension colorectale et joue un rôle important dans le

développement de l’hypersensibilité colique.

Le traitement par L. farciminis a diminué la surexpressoin de la protéine c-Fos

induit par le stress suivi d’une DCR aussi bien au niveau de la section S1-S2 de la

DISCUSSION GENERALE

151

moelle épinière qu’au niveau du PVN et de MeA. Actuellement aucune étude n’a décrit

une influence des probiotiques sur le système nerveux extrasèque. Hooper et al. (2001)

suggère une communication directe entre la microflore commensale et le système

nerveux entérique (Hooper et Gordon, 2001). Ces auteurs montrent ainsi une différence

d’expression de gènes codant pour certains neurotransmetteurs chez la souris colonisée

par rapport aux souris axénique. Nous pouvons emettre l’hypothèse que les probiotiques

pourraient influencer directement l’expression de neurotransmetteurs au niveau du

système nerveux entérique.

L. farciminis en diminuant l’augmentation de la perméabilité paracellulaire

colique induite par le stress pourrait limiter le passage d’agents indésirables

intraluminaux et par cette voie être capable de stimuler le système immunitaire local et

de libérer des médiateurs pro-inflammatoires suceptibles d’activer des neurones

sensitifs intrasèques. Ainsi, la diminution de la surexpression de la protéine c-Fos

observée aux sites spinaux et supraspinaux chez les animaux traités par L. farciminis

peut être due à une diminution de l’activation des neurones sensitifs impliqués dans la

perception et la transmission des messages nociceptifs. Toutefois, des investigations

supplémentaires sont necessaires pour mieux caractériser le type de neurone et des

neurotransmetteurs mis en jeu au niveau du système nerveux entérique après l’action de

L. farciminis.

CONCLUSION

152

L’objectif de ce travail de thèse était d’élargir le spectre des potentialités

thérapeutiques de L. farciminis dans le domaine des troubles fonctionnels intestinaux et

plus particulièrement du SII, à l’aide d’évaluations précliniques de ses effets sur la

douleur viscérale et la fonctionnalité de la barrière. L’apport de nos travaux montrant

que les changements de la perméabilité intestinale par un stimulus non inflammatoire

tel que le stress soient responsables de l’hyperalgésie viscérale induite par ce stress a

permis de proposer un rationnel de départ permettant de proposer L. farciminis en tant

qu’agent probiotique prometteur dans ce type de pathologie. En effet, nous avons

montré que L. farciminis en renforçant la barrière intestinale par diminution de la

contraction du cytosquelette dans les cellules épithéliales par un mécanisme direct ou

indirect via le NO diminue l’hyperalgésie viscérale induite par le stress. De plus, ce

travail apporte des résultats dans un domaine peu exploré par la littérature, concernant

la caractérisation des effets des probiotiques en terme d’influence sur les voies

nerveuses impliquées dans la transmission de la douleur viscérale. L’ensemble des

résultats de ce travail contribue à la valorisation du brevet déposé par l’INRA

concernant « l’utilisation de Lactobacillus farciminis pour la prévention et le traitement

des pathologies digestives »

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