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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO COM ÁCIDO LIPOICO SOBRE O
METABOLISMO ÓSSEO E PERFIL ANTIOXIDANTE DE MULHERES
NA PERIMENOPAUSA
Aluno: Francisco Paulo Freire Neto
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria das Graças Almeida
Natal-RN 2010
Francisco Paulo Freire Neto
INFLUÊNCIA DO TRATAMENTO COM ÁCIDO LIPOICO SOBRE
METABOLISMO ÓSSEO E PERFIL ANTIOXIDANTE EM MULHERES
NA PERIMENOPAUSA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte na Área de Concentração Bioanálises
e Medicamentos
NATAL-RN 2010
DEDICATÓRIA
Á minha família
que sempre me apoiou em todos os momentos da minha vida sem nunca
pedir nada em troca. E graças a eles consegui cumprir mais essa etapa da
minha vida. A todos vocês avós, tios, primos, especialmente meus PAIS, pelo
amor, vida e educação, e minha IRMÃ. Com todo amor e carinho quero
agradecer por tudo que proporcionaram para que eu chegasse até aqui.
A minha namorada Ticiana, que tanto tem me apoiado em todos os passos que tenho trilhado. Você
apareceu na minha vida e me deu o companheirismo que eu precisava para
tornar essa etapa mais fácil. Queria apenas te dizer que te amo.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra.. Adriana Augusto de Rezende e Profa. Dra. Maria das Graças
Almeida que durante quase 10 anos tem me ajudado e orientado não só no âmbito
acadêmico, mas em todos os aspectos da vida.
À médica ginecologista Maria do Socorro Medeiros Morais que desde o inicio não
poupou esforços para que este trabalho fosse concluído.
À todos os professores colaboradores pela valiosa contribuição, que sem este apoio
jamais seria possível o desenvolvimento e conclusão deste trabalho:
Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão
Profa. Dina Maria de Araújo
Profa. Dra. Fernada Nervo Raffin
Prof. Dr. José Brandão Neto
Prof. Msc Júlio Fernandes Maia Neto
Profa. Dra. Lúcia de Fátima Pedrosa
Prof. Dr. Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosário Dominguez Crespo Hirata
Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Moura
À todos os amigo do Laboratório Multidisciplinar Álamo, Brunno, Clélio, Diana,
Felipe, Gustavo, Heglaine, Karine, Karla, Karol, Leandro, Leila, Luciana, Marcela,
Melina, Paula, Rand, Raul, Rodrigo, Tatiane, Yonara que ajudaram desde a fase mais
complexa até uma simples palavra e que assim conseguiram dar sua parcela de
contribuição nessa minha jornada e procuraram na amizade o termo comum de diálogo, o
meu sincero obrigado.
Aos funcionários da Faculdade de Farmácia-UFRN, Aureliana, Fábia, Selma e
Washington, bem como ao funcionário Fábio, UNp, pela ajuda, carinho e dedicação.
À todos do LABMAD que sempre estiveram dispostos a nos ajudar sempre que
recorremos a eles.
A todos os funcionários do LIATEC pela disponibilidade e contribuição.
As amigas e companheiras de trabalho Profa. Tereza Neuma de Sousa Brito,
Profa. Maria Goretti do Nascimento Santos e Profa. Telma Maria Araújo Moura Lemos
que souberam compreender as ausências quando precisava estar na pesquisa e pelas
palavras de incentivo nas horas difíceis.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 15
1.1 METABOLISMO ÓSSEO ........................................................................................ 15
1.1.1 CÉLULAS E SISTEMA IMUNOMODULADOR.................................................... 15
1.1.2 FATORES ASSOCIADOS A PERDA ÓSSEA..................................................... 18
1.2 MENOPAUSA ......................................................................................................... 23
1.2.1 TRANSIÇÃO MENOPAUSAL E EFEITO SOBRE O METABOLISMO ÓSSEO ... 23
1.2.2 TERAPIA CLÁSSICA E ALTERNATIVA COM ÁCIDO LIPOICO......................... 29
2 OBJETIVOS ................................................................................................................. 33
2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................ 33
2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................... 33
3 METODOLOGIA .......................................................................................................... 34
3.1 Aspectos Éticos do Projeto e Financiamento ..................................................... 34
3.2 Casuística .............................................................................................................. 34
3.3 Parâmetros Antropométricos ............................................................................... 36
3.3.1 ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA – IMC ............................................................ 36
3.3.2 CIRCUNFERÊNCIA CINTURA QUADRIL .......................................................... 37
3.4 Amostras Biológicas ............................................................................................. 38
3.5 Avaliação Laboratorial .......................................................................................... 39
3.6 Avaliação do Perfil Oxidante ................................................................................ 39
3.6.1 OBTENÇÃO DO CONCENTRADO DE HEMÁCIAS ........................................... 39
3.6.2 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) ...... 39
3.6.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA GLUTATIONA PEROXIDASE (GPX) ..... 40
3.6.4 DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SRAT EM PLASMA .............................. 40
3.6.5 DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE GSH EM SANGUE TOTAL .................. 41
3.7 Análise da Expressão Gênica ............................................................................... 41
3.7.1 EXTRAÇÃO E AVALIAÇÃO DO RNA TOTAL .................................................... 41
3.7.2 ANALISE DE EXPRESSÃO DE mRNA PELA QT-PCR EM TEMPO REAL ........ 42
3.8 Avaliação Estatística ............................................................................................. 45
4 RESULTADOS ............................................................................................................. 46
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 57
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 70
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 71
APÊNDICE A – Ficha Clínica de Triagem ....................................................................... 92
APÊNDICE B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ........................................ 94
APÊNDICE C – Ficha Clínica de Avaliação Ginecológica ............................................... 97
ANEXO 1 – Certificado final da avaliação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Universitário Onofre Lopes – CEP-HUOL ......................................................... 102
ANEXO 2 – Termo de Concessão e Aceitação de Apoio Financeiro à Projeto de Pesquisa
........................................................................................................................................ 103
ANEXO 3 – Resumos Apresentados em Congressos ..................................................... 104
ANEXO 4 – Valores de referência para as determinações
bioquímicas no sangue.................................................................................................... 106
ARTIGO .......................................................................................................................... 107
LISTA DE ABREVIATURAS
AL – Ácido Lipoico
ALT – Alanina Aminotransferase
AMR – Atividade Metabólica de Repouso
AST – Aspartato Aminotransferase
BMP-6 – Proteína óssea morfogênica
CC – Circunferência Cintura
CCPar – Centro Clínico de Especialidades Médicas de Parnamirim
DHL – Ácido dihidrolipoico
DNA – Ácido desoxirribonucléico
ERO’s – Espécies Reativas de Oxigênio
FAL – Fosfatase Alcalina
FSH – Hormônio Folículo Estimulante
GGT – Gama Glutamil Transferase
GH – Hormônio do crescimento
GPx – Glutationa Peroxidase
GSH – Glutationa Reduzida
HDL – Lipoproteína de alta densidade
HIV – Human immunodeficiency virus
IGF-I – Fator de crescimento semelhante a insulina tipo I
IL – Interleucina
IMC – Índice de Massa Corpórea
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
LH – Hormônio Luteinizante
M-CSF – Fator estimulador de colônia de macrófago
MDA – Malonildialdeído
mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro
NAMS – The North American Menopause Society
OMS – Organização Mundial de Saúde
OPG – Osteoprotegerina
PTH – Paratormônio
RANK – Receptor Ativador de NFκB
RANKL – Ligante do Receptor Ativador de NFκB
RCQ – Relação Cintura Quadril
SOD – Superóxido Dismutase
SRAT’s – Substâncias Reativas ao Ácido tiobarbitúrico
TCLE – Termo de Conscentimento Livre e Esclarecido
TFN-ɑ – Fator de necrose tumoral alfa
TGF-β – fator de crescimento beta de transformação
TRH – Terapia Hormonal
TRAP – Fosfatase Ácida Tartarato-Resistente
VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: Estado nutricional e antropométrico, de acordo com o IMC,
para adultos. 36
QUADRO 2: Valores de classificação para circunferência da cintura de
acordo com o gênero. 37
QUADRO 3: Valores de classificação para a RCQ, de acordo com o
gênero. 37
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Iniciadores e sondas marcadas utilizadas nas PCRs em
Tempo real 42
TABELA 2. Valores de inclinação da curva e eficiência da qT-PCR em
tempo real. 43
TABELA 3 – Características das mulheres na perimenopausa 44
TABELA 4 – Distribuição das características Antropométricas e
adiposidade das mulheres na perimenopausa 45
TABELA 5 – Perfil Lipídico das mulheres na perimenopausa. 48
TABELA 6 – Perfil de segurança quanto ao uso de Ácido Lipoico e
Placebo das mulheres estudadas 49
TABELA 7 - Avaliação do metabolismo mineral e ósseo das pacientes na
perimenopausa. 50
TABELA 8 – Avaliação do Perfil Oxidativo das pacientes na
perimenopausa 50
TABELA 9 – Avaliação da expressão de mRNA dos genes RANK,
RANKL, IL-6 e TNF-α 51
TABELA 10 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL,
IL-6 e TNF-ɑ em LTSP e parâmetros pró e antioxidantes, antes do
tratamento com Ácido Lipoico em mulheres na perimenopausa.
52
TABELA 11 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL,
IL-6 e TNF-ɑ em LTSP e os parâmetros bioquímicos, após do tratamento
com Ácido Lipoico em mulheres na perimenopausa.
53
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Resumo esquemático da diferenciação celular óssea. As
células mesenquimais que originam mioblastos, adipócitos, condrócitos
e células estromais, diferenciam-se em preosteoblastos e depois se
tornam osteoblastos na superfície óssea. Os osteoblastos também
podem se incorporar ao osso como osteócitos. Os precursores da
linhagem mielóide que originam macrófagos e células dendríticas, se
transformam em preosteoclastos, fundem-se e originam osteoclastos
multinucleados. Adaptado de: WALSH et al, 2006.
16
FIGURA 2 – Via de sinalização mostrando a interação entre o sistema
imune as células do tecido ósseo na osteoimunologia. Adaptado de
Takayanagi, 2005.
17
FIGURA 3. Mecanismo esquemático da via de regulação da massa
óssea pelo estrógeno. Adaptado de Imai et al 2009. 27
FIGURA 4 – Representação da ação do Ácido Lipoico sobre a produção
de ERO’s com possível ação sobre o metabolismo ósseo. 61
FIGURA 5 – Esquema mostrando alterações provocadas pela perimenopausa associada à possível ação do ácido lipoico sobre a produção de ERO’s.
63
RESUMO
O osso é um tecido dinâmico que está em constante processo de remodelação em resposta
ao estresse mecânico e mudanças hormonais. O presente trabalho teve por objetivo
entender a relação entre as alterações bioquímicas, oxidativas e moleculares em mulheres
em transição menopausal e a influência do uso do ácido lipoico (AL) nessas alterações. O
estudo do tipo duplo-cego, foi realizado com mulheres em perimenopausa submetidas à um
tratamento de 3 meses com 600 mg de AL administrados por via oral em duas doses diárias,
comparadas com um outro grupo que recebeu placebo durante o mesmo período. O
presente trabalho mostrou que as mulheres apresentaram uma circunferência de cintura
(CC) e um índice de massa corporal, em média, acima dos valores preconizados pela OMS
(CC ≥ 80 cm; IMC > 25kg/m2). Além disso, essas mulheres apresentaram aumento nas
concentrações de colesterol total e triglicerídeos, além de valores de LDL próximos do
limítrofe (Colesterol Total > 200mg/dL; Triglicerídeos > 150mg/dL; LDL >130mg/dL). Essas
alterações não sofreram influência do tratamento com AL. Não foram encontradas
alterações no perfil hepático (ALT, AST e GGT) e renal (Uréia, Creatinina, Proteínas Totais e
Albumina) das mulheres após o tratamento com AL, bem como no perfil mineral (Cálcio
Total, Cálcio Ionizado, Fósforo e Magnésio) e ósseo (Osteocalcina, Fosfatase Alcalina Total
e Fosfatase Ácida Tartarato Resistente). Os resultados do perfil oxidativo mostraram que o
tratamento com AL diminuiu a atividade da enzimática da Glutationa Peroxidase (GPx) (p <
0,01), enquanto para os parâmetros Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúricos
(SRAT’s), Glutationa Reduzida (GSH) e Superóxido Dismutase (SOD) não houve diferenças.
A SOD apesentou-se elevada no grupo placebo após os 3 meses de estudo (p<0,05). A
expressão do mRNA do RANKL em leucócitos totais mostrou-se diminuída (p < 0,05) e do
RANK aumentada (p<0,001), após o tratamento com AL, enquanto a expressão dos genes
IL-6 e TNF-ɑ não apresentou alteração. Podemos concluir que as mulheres em estágio de
perimenopausa, inicial de deficiência estrogênica, apresentam alteração no perfil lipídico e
composição corporal, e que essas alterações poderiam estar induzindo alterações no perfil
oxidativo e do metabolismo ósseo. Entretanto, o tratamento com AL se mostrou eficaz para
o perfil oxidativo, bem como ósseo já que marcadores precoces como a atividade da GPx e
a expressão do mRNA do RANKL, respectivamente, foram reduzidos associada a não
alteração na atividade da SOD. Estes resultados sugerem o efeito benéfico e protetor do AL,
indicando-o como uma alternativa para tratamento auxiliar nas complicações associadas à
deficiência estrogênica.
Palavras-chave: Perimenopausa, metabolismo ósseo, estresse oxidativo, ácido lipoico.
ABSTRACT
Bone is a dynamic tissue that is in constant process of remodeling in response to mechanical
stress and hormonal changes. This study aimed to understand the relationship between the
biochemical changes, which women in the menopausal transition are subject to, and how the
use of an alternative therapy with lipoic acid (LA) could influence these changes. The study
of double-blind, was carried out in perimenopausal women that underwent a three month
treatment with 600 mg of AL compared with another group that received placebo during the
same period. This study showed that women had a waist circunference and body mass index
above the values recommended by WHO (WC ≥ 80 cm; BMI > 25kg/m2). Associated with
this, these women had increased concentrations of total cholesterol and triglycerides, and
borderline LDL (Total Cholesterol > 200mg/dL; Triglycerides > 150mg/dL; LDL >130mg/dL).
These changes were not affected by treatment with AL. There were no shifts in liver profile
(ALT, AST and GGT), kidney profile (urea, creatinine, total protein and albumin), mineral
profile (Total Calcium, Ionized Calcium, Phosphorus and Magnesium) as well in bone
markers (osteocalcin, Total Alkaline Phosphatase and Tartrate Resistant Acid Phosphatase)
after treatment with LA. The results of the oxidative profile showed that treatment with LA
decreased GPx activity (p < 0,01), while for the TBARS, GSH and SOD activity there were no
differences. With regard to SOD, this enzyme will submit to be high in the placebo group
after 3 months of study (p<0,05). The expression of RANKL mRNA was reduced (p < 0,05)
and of RANK increased (p <0.001), after treatment with LA, while the expression of IL-6 and
TNF-ɑ genes were no changed. We conclude that women already in the perimenopause
stage have changes in lipid profile and body composition that could induce shifts in oxidative
and bone metabolism. However, LA treatment has provided an effective effect in the
oxidative and bone profile since the earliest markers such as GPx activity and mRNA
expression of RANKL, respectively, were reduced associated with no change in SOD activity.
These results suggest a beneficial and protective effect of LA, indicating it potential as an
alternative treatment to help the to prevent the complications associated with estrogen
deficiency.
Keywords: Perimenopause, bone metabolism, oxidative stress, lipoic acid.
15 1. INTRODUÇÃO
1.1 METABOLISMO ÓSSEO
1.1.1 CÉLULAS E SISTEMA IMUNOMODULADOR
O osso é um tecido dinâmico que está em constante processo de
remodelação em resposta ao estresse mecânico e mudanças hormonais. A
remodelagem óssea ocorre em discretas unidades no esqueleto, chamados
unidades de remodelagem óssea, e envolvem um equilíbrio dinâmico entre as
células de reabsorção óssea, osteoclastos, e as de formação óssea, osteoblastos.
(OZGOCMEN, 2007).
A matriz óssea é formada por material orgânico e inorgânico. A matriz
orgânica inclui uma camada de proteoglicano e colágeno tipo I, enquanto que a
matriz inorgânica apresenta uma camada de hidroxiapatita (cristais de fosfato de
cálcio) sendo o principal reservatório de cálcio. Nos adultos, 10% da massa óssea é
reconstruída todo ano através da ação das células ósseas de formação e
reabsorção (RHO et al, 2004; LI et al, 2006).
Os osteoblastos são células de origem mesenquimal (Figura 1), responsáveis
por secretar a matriz orgânica e induzir a calcificação através do processo de
formação óssea. Os osteoblastos são células cubóides que formam uma camada
continua localizada na superfície externa do tecido ósseo onde o novo osso é criado.
A atividade de formação óssea pelos osteoblastos é lenta e ocorre continuamente
em todos os ossos, dessa maneira o novo osso é constantemente formado. A
diferenciação e função destas células são reguladas por fatores de crescimento e
citocinas (WALSH et al, 2006).
Os osteoclastos são derivados das células hematopoiéticas da linhagem
monócito/macrófago (Figura 1). A sua principal função é destruir a superfície do
osso velho ou fraturado durante o processo de reconstrução. Estas células estão
localizadas na superfície do osso, apresentam um formato discóide que compreende
a borda ondulada (ruffled zone) e zona fechada (sealing zone). A borda ondulada
contém elementos que reabsorvem os componentes orgânicos e inorgânicos do
osso. Os osteoclastos através da borda ondulada secretam enzimas como a
fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) que ocasionam a descalcificação óssea
16 e a cathepsina K que digere a matriz protéica óssea (WALSH et al, 2006). A
ativação dos osteoclastos dissolve a matriz óssea, liberando cálcio ionizado no fluido
extracelular alterando a homeostase do cálcio (LI et al, 2006).
FIGURA 1. Resumo esquemático da diferenciação celular óssea. As células mesenquimais que originam mioblastos, adipócitos, condrócitos e células estromais, diferenciam-se em preosteoblastos e depois se tornam osteoblastos na superfície óssea. Os osteoblastos também podem se incorporar ao osso como osteócitos. Os precursores da linhagem mielóide que originam macrófagos e células dendríticas, se transformam em preosteoclastos, fundem-se e originam osteoclastos multinucleados. Adaptado de: WALSH et al, 2006.
Estudos têm mostrado que a homeostase óssea é influenciada por
componentes do sistema imune, através de efeitos diretos e indiretos dos linfócitos T
sobre os osteoclastos. Um campo emergente nesta área é a osteoimunologia, uma
vez que a reabsorção óssea patológica é observada em condições inflamatórias,
associada aos efeitos diretos e indiretos das células T nos osteoclastos (NANES,
2003; RHO et al., 2004; FOUQUE-AUBERT, CHAPULART, 2007). O papel das
células T na biologia óssea tem sido mais aceito desde a descoberta do sistema
RANK/RANKL/OPG (Receptor Ativador de NFκB/ Ligante do Receptor Ativador de
NFκB/Osteoprotegerina) em meados de 1997 e 1998, por estes serem membros da
família do TNF (Fator de necrose tumoral). O RANK, inicialmente identificado nas
células T, e em seguida em osteoclastos, é reconhecido como fator essencial para a
osteoclatogênese, o que reforça a interrelação entre os sistemas: ósseo e imune
(RHO et al., 2004, FOUQUE-AUBERT, CHAPULART 2007; BOYCE, XING, 2008).
Adipócito
Célula do estroma
Célula tronco mesenquimal
Precursor Mielóide Célula
Dendrítica
Pré-osteoblasto Pré-osteoclasto
Osteoclasto Osteoblasto
Osteócito Osso
Macrófago
17 As células T parecem promover a reabsorção óssea diretamente via expressão de
RANKL, e indiretamente via expressão de citocinas pró-inflamatórias que irão mediar
a expressão de RANKL em células não T, como osteoblastos. Já o seu receptor
RANK, é expresso pelos osteoclastos e progenitores hematopoiéticos. Esta
interação é necessária e, juntamente com Fator estimulador de colônia de
macrófago (M-CSF) suficiente para a formação de osteoclastos. A OPG por sua vez,
é produzida pelos osteoblastos, e atua como um receptor solúvel antagonista para o
ligante RANKL, impedindo que este último se ligue ao RANK presente nos
osteoclastos e ative a osteoclastogênese (Figura 2) (MACKIE, 2003; THEOLEYRE
et al, 2004; WADA et al. 2006; BLAIR; ZHENG; DUSTAN. 2007).
FIGURA 2 – Via de sinalização mostrando a interação entre o sistema imune as células do tecido
ósseo na osteoimunologia. Adaptado de Takayanagi, 2005.
A OPG é uma glicoproteína que pertence à superfamília de receptores dos
fatores de necrose tumoral (TNFRSF11B) (MORINGA et al, 1998). O gene humano
OPG está localizado no cromossomo 8 (8q24.1), tem 29 kb de tamanho e contém 5
exons que codificam uma proteína com 401 aminoácidos. É expresso em vários
tecidos, incluindo o sistema cardiovascular, pulmão, rins, intestino, osso
INFLAMAÇÃO Macrófagos
Células T
OSTEOBLASTOS
Fibroblastos
Autoamplificação do NFATc1
Imuno- receptores
Diferenciação Osteoclástica TRAP Receptor de calcitonina
Calcineurina
Sinalização pelo Ca2*
OSTEOCLASTOS
18 (osteoblastos), células hematopoiéticas e imunológicas (SCHOPPET et al, 2002;
WADA et al, 2006; KEARNS et al, 2008). A sua principal função no metabolismo
ósseo é inibir a atividade e a diferenciação dos osteoclastos. Estudos in vitro e in
vivo, demonstraram que a expressão aumentada de OPG estava relacionada com o
aumento da massa óssea em associação com o número diminuído de osteoclastos
(KEARNS et al, 2008).
O RANKL pertence à família dos ligantes dos fatores de necrose tumoral
(TNFSF11) (LACEY et al, 1998). O gene RANKL está localizado no cromossomo 13
(13q14), tem 58 kb de tamanho e contém 8 exons que codificam para uma proteína
com 316 aminoácidos. É expresso em células de linfonodos, timo, pulmão, baço,
medula óssea, sangue periférico e osteoblastos (SCHOPPET et al, 2002; WADA et
al, 2005; KEARNS et al, 2008). A sua principal função no metabolismo ósseo é a
estimulação da diferenciação e da atividade dos osteoclastos e inibição da apoptose
dos osteoclastos (KEARNS et al, 2008).
O RANK pertencente á família dos receptores dos fatores de necrose tumoral
(TNFRSF11A). O gene RANK tem 61 kb de tamanho está localizado no cromossomo
18 (18q22.1), contém 12 exons que codificam uma proteína de 616 aminoácidos
(ANDERSON et al, 1997). Este gene é expresso nas células dendríticas, endoteliais,
fibroblastos, linfócitos T e B e nos osteoclastos (SCHOPPET et al, 2002; WADA et
al, 2005; KEARNS et al, 2008).
Com a descoberta do sistema OPG/RANKL/RANK foi possível o melhor
entendimento da regulação dos osteoblastos e dos osteoclastos na
osteoclastogênese, favorecendo a compreensão de mecanismos fundamentais na
fisiologia óssea, identificando um novo grupo de fatores candidatos que podem estar
envolvidos na patogênese de várias doenças ósseas (KEARNS et al, 2008).
1.1.2 FATORES ASSOCIADOS À PERDA OSSEA
A taxa de reconstrução óssea e o número de sítios de reconstrução
aumentam em várias condições patológicas afetando o metabolismo ósseo, como
osteoporose pós-menopausal, hiperparatireoidismo, artrite reumatóide, Diabetes
mellitus entre outras, na qual alterações locais e sistêmicas em nível de hormônios
ou citocinas pró-inflamatórias estimulam a reabsorção óssea. Muito dos fatores que
induzem a reabsorção óssea atuam predominantemente por mecanismos indiretos
19 que envolvem a regulação positiva da expressão de RANKL pelos osteoblastos,
células T e outras células (BOYCE & XING, 2008).
A ligação entre RANK e RANKL fornece sinais que direcionam o
desenvolvimento dos osteoclastos nas células hematopoiéticas progenitoras e
ativação dos osteoclastos maduros (THEOLEYRE et al, 2004; KEARNS et al, 2008).
Essa ligação entre RANKL e RANK resulta no recrutamento de uma proteína
denominada de TRAF6 (receptor de TNF associado ao fator 6) aos sítios específicos
no domínio intracelular de RANK. O TRAF6 atua como um segundo mensageiro
ativando várias proteínas kinases assim como fatores de transcrição como fator
nuclear-κB (NF-κB). O NF-κB ativado transloca-se para o núcleo ocasionando a
regulação positiva de c-fos, o qual interage com o fator nuclear ativado de células T
(NFAT)-c1 que induz a transcrição dos genes osteoclastogênicos (KEARNS et al,
2008).
Poubelle et al. (2007) evidenciaram a expressão de OPG, RANK e RANKL
nos neutrófilos do fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóite, entretanto nos
neutrófilos do sangue periférico houve somente a expressão de RANKL. Os autores
sugeriram que os neutrófilos podem contribuir para a reconstrução óssea nos sítios
inflamatórios.
A ação inibitória da OPG sobre o RANKL não apresenta efeito na inflamação,
mas previne completamente a perda óssea e protege a cartilagem. Estes dados
foram confirmados em estudos realizados com camundongos deficientes em
RANKL, nos quais havia ausência de produção de osteoclastos, que era recuperada
com reposição de RANKL e M-CSF exógenos (GRIMAUD et al.,2003; MACKIE,
2003; UELAND, 2004). Estudos em camundongos transgênicos demonstraram que
a super expressão de OPG levou ao desenvolvimento de osteopetrose grave e
redução do número de osteoclastos. Ao contrário, camundongos knockout para OPG
apresentavam osteoporose (BUCAY et al., 1998). O efeito biológico da OPG nas
células ósseas inclui a inibição do estágio terminal da diferenciação de osteoclastos,
supressão da ativação de osteoclastos maduros e indução de apoptose (PIVONKA
et al. 2008).
A possibilidade de participação das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO’s)
na diferenciação dos osteoclastos foi levantada baseando-se na correlação entre a
produção de ERO’s e a formação dos osteoclastos nas superfícies ósseas in vivo, e
em cultura in vitro de células de medula óssea. O TNF-α (fator de necrose tumoral-
alfa) tem se mostrado como o principal candidato na indução da linhagem de células
20 osteoclásticas através de uma ação das ERO’s, uma vez que exerce fortes efeitos
na diferenciação dos osteoclastos e tem sido mostrado ser a causa da geração de
ERO’s em outros tipos celulares (KIM et al. 2006).
Tem sido mostrado que no osso, o H2O2 seria responsável pela oxidação das
proteínas envolvidas na diferenciação celular e modulação de sua atividade, através
tanto de sua estimulação quanto de sua inibição. Entre as vias de sinalização
sensíveis ao estado redox envolvidas na diferenciação óssea, a via do NF-kB tem
sido a mais estudada já que a interação RANKL/RANK induz a ativação do mesmo
com conseqüente diferenciação, maturação e ativação dos osteoclastos (BAI et al.
2005).
Em 1990, Garret et al. foram os primeiros a descrever uma relação entre
ERO’s, particularmente o ânion superóxido, e a formação e ativação de
osteoclastos. Esses achados foram confirmados por Lee et al. em 2005. Eles
demonstraram que a osteoclastogênese induzida pelo RANKL requer uma produção
de EROs, usando precursores celulares da medula óssea como modelo de
diferenciação de osteoclastos (LEE at al. 2005). Similarmente, a glutationa
peroxidase 1 (GPx1) é a enzima antioxidante mais expressa pelos osteoclastos e é
responsável pela degradação do peróxido de hidrogênio. Esta enzima tem mostrado
uma expressão elevada na linhagem celular osteoclástica RAW264.7 prevenindo a
osteoclastogênese induzida pelo RANKL (LEAN at al. 2005), sugerindo um papel
crucial do peróxido de hidrogênio na formação dos osteoclastos. Estes autores
demonstraram que o 17β-estradiol estimula a expressão de GPx1 em osteoclastos
derivados da medula óssea e que a deficiência de estrógeno foi o passo chave na
estimulação da expressão de TNF-α mediada pelas ERO’s, levando à
osteoclastogênese e conseqüente reabsorção óssea (LEAN et al 2003).
Na linhagem celular de osteoblastos humano MG63, células primárias
estromais de medula óssea de ratos e osteoblastos da região calvarial, o aumento
dos níveis de ERO’s intracelular (H2O2 ou ânions superóxidos gerados pelo sistema
xantina/xantina oxidase) tem mostrado uma estimulação de mRNA do RANKL e uma
expressão protéica. Esses dados suportam fortemente o envolvimento das ERO’s,
como H2O2 ou o ânion superóxido na perda óssea relacionada a doenças pela
estimulação e diferenciação dos osteoclastos e conseqüente reabsorção óssea (BAI
et al. 2005).
Em ratos ooforectomizados, o aumento na produção de TNF-α, uma citocina
que promove a diferenciação dos osteoclastos, foi observado em medula óssea em
21 resposta ao estresse oxidativo e ativação de células T. Este efeito contribui para o
entendimento do mecanismo de perda óssea durante a menopausa (GRASSI et al.
2007).
A perda óssea pode ser resultado, além de um aumento nos osteoclastos
com conseqüente reabsorção óssea, de uma diminuição na atividade dos
osteoblastos e assim diminuição na formação óssea. Ao invés da influência na
expressão do RANKL nos osteoblastos, recentes estudos sobre o papel do H2O2 na
atividade dos osteoblastos têm mostrado uma inibição na sua diferenciação celular.
Em 2004, Liu et al. mostraram que o peróxido de hidrogênio induziu o estado de
estresse oxidativo e suprimiu o processo de diferenciação osteblástica em células
primárias estromais de medula óssea de ratos. Esta inibição na diferenciação celular
foi caracterizada pela redução na atividade da fosfatase alcalina, uma enzima chave
na deposição mineral óssea. A presença de metalotioneína, um inibidor de ERO’s,
re-estabeleceu a diferenciação celular, sugerindo um papel crucial do estresse
oxidativo na inibição da diferenciação osteoblástica (LIU et al. 2004). Em outro
estudo, Bai et al. (2004) confirmaram que H2O2 induziu estresse oxidativo e suprimiu
a diferenciação osteoblástica em células primárias estromais de medula óssea de
coelhos. Nesse estudo osteoblastos tratados com H2O2 exibiram diminuição em
marcadores como fosfatase alcalina, colágeno tipo 1, unidade formadora de colônia
osteoprogenitora (CFU-O) e fosforilação nuclear do fator de transcrição Runx2.
Recentemente, a relação entre o sistema antioxidante e a formação óssea foi
examinada em células MC3T3-E1. Quando incubadas com H2O2, os níveis de
mineralização foram diminuídos juntamente com a expressão gênica de marcadores
osteogênicos Runx2, ALP e sialoproteína óssea (ARAI et al 2007).
Além de afetar o processo de diferenciação, as ERO’s também influenciam
sobre a meia-vida dos osteoblastos. A glutaredoxina 5 (Grx5) é uma enzima
altamente expressa no osso que tem um papel importante na proteção contra
ERO’s. Quando apresenta um aumento na sua expressão, a Grx5 previne a
produção de ERO’s e protege os osteoblastos do processo de apoptose induzido
pelas ERO’s, através de um mecanismo dependente da atividade da manganês
superóxido dismutase (MnSOD) (LINARES et al. 2009). Convencionalmente,
acredita-se que as ERO’s estão envolvidas na hipertrofia dos condrócitos, um passo
crucial para o crescimento longitudinal e desenvolvimento de ossos longos. Esta
hipótese é suportada por experimentos in vivo e in vitro, demonstrando que
tratamento com NAC aumentou os níveis de antioxidantes endógenos e protegeu as
22 células frente ao estresse oxidativo, dessa forma promovendo a proliferação dos
condrócitos assim inibindo a hipertrofia (MORITA et al. 2007). Dessa forma em
contraste com o que é observado com os osteoblastos, as ERO’s tem mostrado
estimular a diferenciação terminal dos condrócitos e promovem a ossificação
endoncondral.
Em conjunto, esses dados demonstram que as ERO’s não somente tem um
efeito direto promovendo a osteoclastogênese, mas também mostram que a perda
óssea pode ser induzida pela apoptose, diminuição na diferenciação e atividade dos
osteoblastos o qual estimula a formação de osteoclastos induzida pelo RANKL.
Os estudos de Jagger et al. (2005) e Almeida et al. (2007) confirmaram que a
deficiência de estrógeno levou uma diminuição nas defesas antioxidantes tióis no
tecido ósseo de roedores, levando a uma acelerada perda óssea com a idade. Esta
falha no sistema de defesas antioxidantes contra o aumento do estresse oxidativo,
tem mostrado induzir a perda óssea através da via de sinalização dependente do
TNF-α (JAGGER et al. 2005). Associado a isso, o nível plasmático e atividade da
Superóxido Dismutase (SOD), uma enzima que converte o anion superóxido em
peróxido de hidrogênio, foi negativamente associada com a densidade mineral
óssea em humanos (OZGOCMEN et al. 2007; JAGGER et al. 2005; SANCHEZ-
RODRIGUEZ et al. 2007).
Bashir et al. (2005) demonstraram relação entre a diminuição da expressão
dos genes OPG, RANK e RANKL em sangue periférico em mulheres em tratamento
com estrógeno e a diminuição das concentrações séricas de Propetídeo carboxil-
terminal do colágeno tipo 1 (serum c-terminal telopeptide) e de OPG e o aumento
da densidade mineral óssea. Os autores sugeriram que a expressão desses genes
estaria respondendo ao remodelamento ósseo associado ao tratamento com
estrógeno.
1.2 MENOPAUSA
1.2.1 TRANSIÇÃO MENOPAUSAL E EFEITO SOBRE O
METABOLISMO ÓSSEO
A Organização Mundial de Saúde (OMS) define a menopausa como a
permanente cessação da menstruação resultante da perda da atividade ovariana
folicular que é reconhecido como tendo ocorrido após 12 meses consecutivos de
23 amenorréia sem causa patológica. Mais do que um evento isolado, a diminuição nas
concentrações de estrógeno é um processo universal que toma parte de muitas
mudanças fisiológicas e metabólicas, não afetando apenas o sistema reprodutor,
mas também outros tecidos das mulheres. Além disso, a menopausa pode implicar
mudanças importantes nos aspectos sociais e psicológicos da vida das mulheres,
onde tem mostrado afetar cada mulher de forma exclusiva. Para algumas mulheres
o fim da fertilidade se apresenta também como o fim das preocupações com a
contracepção e os períodos menstruais, o que para elas traz uma sensação de
liberdade. Entretanto, para a grande maioria das mulheres, “enfrentar” a pós-
menopausa com crises emocionais e sociais, podem contribuir para sérios
problemas de saúde (WHO, 1996; MOHAMMAD et al. 2004; COSTA & GUARDA
2008; MORIYAMA et al., 2008).
No mundo ocidental, a menopausa ocorre em uma idade mediana de 51,4
anos, com uma distribuição gaussiana variando de 40 a 58 anos. Algumas mulheres
atingem a menopausa na terceira década de vida, e algumas aos 60 anos. Embora
tenha havido um aumento da expectativa de vida ao longo dos anos, a idade da
menopausa não mudou ao longo dos últimos séculos. Hoje, especialmente no
mundo desenvolvido, as mulheres gastam um terço a metade de suas vidas no
período de pós-menopausa. A menopausa precoce faz com que as mulheres
passem mais anos após a menopausa, o que certamente é uma conseqüência
adversa. (KOK et al. 2004; BLUMEL et al. 2006; SHUSTER et al. 2009)
Segundo o Council of Affiliated Menopause Societies – CAMS, menopausa
prematura é definida como a menopausa que ocorre em uma idade inferior a dois
desvios-padrão abaixo da média de idade estimada para a população de referência.
Na ausência de estimativas confiáveis da distribuição da idade da menopausa
natural da população dos países em desenvolvimento, a idade de 40 anos é
freqüentemente usada como um ponto arbitrário de corte, abaixo do qual a
menopausa é dita ser prematura (SHUSTER et al. 2009).
A menopausa é precedida pela chamada “transição menopausal”,
popularmente referida como perimenopausa, uma fase durante a qual mudanças
menstruais e sintomas menopausais são comumente relatados. Durante a
perimenopausa mudanças nas concentrações hormonais como, por exemplo, o
hormônio folículo estimulante (FSH) que apresenta um aumento gradual,
característico dessa fase da vida das mulheres. (BLAKE, 2006)
24
A perimenopausa é clinicamente definida como um intervalo antes da
menopausa, caracterizada por uma atividade periódica de irregularidades
menstruais ou um prolongado período de amenorréia < 12 meses. A mediana da
idade de início tem sido relatada como entre 45,5 e 47,5 anos com duração média
de 4 anos. É altamente recomendado que o termo perimenopausa seja utilizado
como indicado aqui e não aplicado às mulheres na faixa dos 40 e início dos anos 50
que continuam a ter ciclos menstruais regulares e não os sintomas da aproximação
da menopausa. Estudos das alterações hormonais durante a perimenopausa, foram
baseados em vários modelos experimentais e definições. O Massachusetts’
Women’s Health Study (MWHS), um estudo longitudinal de 5 anos iniciado em 1981
com 2570 mulheres do estado de Massachusetts, com idades entre 45 e 55 anos,
indicou que os melhores itens para indicar que as mulheres estariam no período de
perimenopausa seriam: amenorréia presente de 3 a 11 meses e aumento de
irregularidades menstruais para aquelas que não possuíam amenorréia, as mulheres
desse estudo apresentavam esses sintomas com uma idade média de 47,5 anos
com uma média de duração de 4 anos. Um outro estudo, Seattle Midlife Women’s
Health Project, realizado em 2000 na cidade de Seattle, relatou o tempo de duração
dos ciclos menstruais, bem como o fluxo desses ciclos, como predeterminantes para
que as mulheres sejam consideradas como em perimenopausa. (BRAMBBILLA et
al. 1994; MITCHELL et al. 2000; BASTIAN; SMITH; NANDA, 2003; HALE; BURGER,
2008).
A deficiência do estrógeno leva a repercussões nos órgãos-alvo de forma
sistêmica e profunda, em vista da ampla distribuição de seus receptores no
organismo (IMANOV et al., 2005; DEROO; KORACH, 2006). Este fenômeno
determina o aparecimento de um conjunto de sinais e sintomas que caracterizam o
climatério, denominada de “síndrome do climatério ou síndrome menopausal”
(ALMEIDA, 2004; SAMSIOE; DÖREN; LOBO, 2006). Outro fator que pode favorecer
esse quadro é o incremento dos processos oxidativos, que é típico na diminuição da
síntese de estrógeno como mostrado em alguns estudos (TREVISAN et al. 2001;
BEDNAREK-TUPIKOWASKA et al. 2004).
Na síndrome climatérica a paciente apresenta uma grande variedade de
queixas que vão desde sintomas vasomotores como fogachos, acompanhados de
sudorese, distúrbios do sono, palpitação, vertigem, diminuição da memória, atrofia
urogenital, dispareunia, vaginites e incontinência urinária de esforço (SWHARZ,
2007) até o desenvolvimento de doenças crônico degenerativas como diabetes
25 mellitus, hipertensão arterial sistêmica, doenças cardiovasculares (PICHÉ et al.
2005), depressão (LORENZI et al. 2005), Alzheimer, osteoporose (LORENZI et al.
2006; OLIVEIRA et al., 2007) dentre outras que comprometem muito a qualidade de
vida das mulheres (VAN DER SCHOUW; GROBBEE, 2005; ZOLI et al. 2006).
Vários estudos têm sido realizados nos diferentes períodos de vida das
mulheres, desde a pré-menopausa até a pós-menopausa (MAZZUOLI et al. 2000;
PELAYO et al. 2008; MORIYAMA et al. 2008; ROGERS et al. 2009). Entretanto
baixo número de estudos relacionados à perimenopausa (FINKELSTEIN et al.
2008), fase da vida da mulher que começam a surgir alterações hormonais
significativas que podem comprometer a qualidade de vida das mulheres.
(SANTORO, 2003, LORENZI et al. 2006; HALE & BURGER, 2008)
A base biológica da síndrome climatérica são mudanças que incidem na
estrutura e função do ovário. Nesse período, ocorre uma diminuição progressiva do
número de folículos ovarianos, ocasionando uma menor produção de estrogênio por
estes e interrompendo os mecanismos de feedback necessários à manutenção do
ciclo menstrual (BASTOS et al. 2006).
Esses mecanismos estão sob o controle de um sistema de retroalimentação,
em que o hipotálamo, através do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH),
regula a síntese e liberação das gonadotrofinas hipofisárias. Por sua vez, os
hormônios luteinizante (LH) e FSH regulam a produção ovariana de progesterona e
estrogênios, recebendo destes uma retroalimentação negativa. O FSH também é
influenciado pela inibina, um hormônio responsável por inibir sua síntese e secreção
por ação direta na hipófise (SOARES; ALMEIDA, 2000).
Com a transição menopausal, ocorre um desequilíbrio nesse sistema
hormonal, consequente à diminuição do número de folículos ovarianos e da síntese
da inibina ovariana, além da menor resposta ao LH e FSH. Dessa maneira, ocorrem
ciclos menstruais irregulares, devido ao desenvolvimento folicular errático
(FERNANDES et. al., 2003; HALE & BURGER, 2008).
Logo, há o encurtamento das fases folicular e lútea, além da queda do pico
de estrogênio, que acarretam a diminuição da concentração sérica deste hormônio.
Por conseguinte, há uma progressiva elevação nas concentrações séricas de FSH,
podendo estes chegar a ser de 10 a 15 vezes maiores do que no período
reprodutivo (HALE & BURGER, 2008). Essa elevação induz o crescimento rápido de
folículos ovarianos, podendo ser a causa do encurtamento dos ciclos e que podem
26 representar a primeira evidência clinica da aproximação da menopausa. Com esse
crescimento, há consequente secreção de estrogênio, aumentando as
concentrações circulantes. Dessa forma, apesar da diminuição global de folículos
ovarianos em pacientes na perimenopausa, o aumento de FSH nessa fase age de
modo a manter as concentrações de estrogênio normais no período que antecede a
menopausa (SHAABAN, 1996).
É somente após a depleção absoluta dos folículos ovarianos que esses não
conseguem responder ao aumento de FSH e dessa forma começa a haver uma
intensa diminuição do estrogênio (HALE & BURGER, 2008; LUND, 2008).
Esse hormônio é de grande importância para a saúde da mulher, sendo suas
ações envolvidas no controle da ovulação, regulação neuroendócrina, do sistema
cíclico reprodutor, na implantação do óvulo e na estimulação das características
sexuais secundárias, juntamente aos seus efeitos sistêmicos como o crescimento,
maturação dos ossos longos (GIESE, 2003) e a redução das concentrações séricas
de colesterol (MITCHELL; WOODS; MARIELLA, 2004).
Nas mulheres na pré-menopausa, com metabolismo normal, o estrogênio é
secretado em quantidades significativas pelos ovários, com utilização do colesterol
como precursor. Entretanto, o estrógeno pode ser sintetizado localmente, tal como
no fígado, tecido adiposo, cérebro e pelo córtex adrenal (TAPIERO; BA; TEW,
2002). Com a aproximação da menopausa, há uma progressiva diminuição da
concentração sérica desse hormônio, determinando alterações na função de
diversos órgãos-alvo. Em 70 a 80% das mulheres na perimenopausa essa
diminuição determina o aparecimento dos sinais e sintomas característicos da
transição menopausal. Assim, o hipoestrogenismo pode ser considerado como um
dos principais fatores causadores desses sinais e sintomas (BAKSU et al. 2005).
Em relação ao metabolismo ósseo, o estrógeno tem uma influência nos
osteoblastos e osteoclastos através de seus receptores no tecido ósseo. Nos
osteoblastos, o estrógeno estimula a síntese e diferenciação de fatores de
crescimento beta de transformação (TGF- β), proteína óssea morfogênica – 6 (BMP-
6), fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-I) e aumento na expressão dos
receptores da 1,25(OH)2 vitamina D3, hormônio do crescimento (GH) e
progesterona. O estrógeno age ainda, inibindo a síntese de citocinas pró-
reabsortivas como: interleucina (IL)-1α, IL-1β, IL-6, M-CSF, TNF- α, além de
aumentar a expressão gênica de OPG. Seus efeitos nos osteoclastos incluem
27 apoptose e inibição nos estágios de formação e estimulação dos osteoclastos, além
da inibição na atividade de enzimas lisossomais dessas células (Figura 3)
(STANOSZ et al., 2009).
FIGURA 3. Mecanismo esquemático da via de regulação da massa óssea pelo estrógeno. Adaptado de Imai et al 2009.
Além da ação sobre o sistema OPG/RANK/RANKL, o estrógeno, pode ainda
afetar a geração, a meia vida e a atividade dos osteoclastos e osteoblastos em nível
celular, agindo como supressor da produção de várias citocinas pró-inflamatórias,
como a IL-1 e a IL-6. Concentrações aumentadas destes mediadores, que ocorre na
deficiência de estrógeno observada na pós-menopausa, estão associados com o
aumento da osteoclastogênese e um balanço negativo de remodelação óssea
(UELAND, 2004; PACIFICI, 2007). Outras citocinas como o TNF-α e a IL-1β
também atuam no sentido de aumentar a reabsorção óssea, estimulando a atividade
e proliferação osteoclástica (VURAL; AKGUL; CANBAZ, 2006).
Diante destes dados, propusemos o presente estudo considerando-o de
extrema importância para que os estagios mais precoces de deficiência de
estrógeno, como a perimenopausa, sejam avaliados e uma vez identificadas as
Células Hematopoiéticas
Osteoclastos Morte Celular
Osteoclastogênese Osteoclasto Maduro
Osteoblasto Estrógeno
Estrógeno
Estrógeno
Ovário
Cérebro
Células Imunológicas
Estrógeno
28 alterações e fatores associados à perda óssea estes possam ser indicadores de
intervenção terapêutica preventiva.
1.2.2 TERAPIA CLÁSSICA E ALTERNATIVA COM ÁCIDO LIPOICO
A administração de estrógenos sintéticos associados ou não a progesterona,
conhecida como terapia de reposição hormonal (TRH), constitui um importante
recurso na diminuição dos sintomas do climatério segundo consenso publicado em
2007 pela Sociedade Norte-americana de menopausa (The North American
Menopause Society - NAMS), além de prevenir doenças em mulheres na peri e pós
menopausa (NAMS, 2007).
Estudo realizado por Ji et al. (2006), demonstrou que a similaridade estrutural
da classe estrogênica com a vitamina E seria responsável pela interrupção da
peroxidação lipídica, diminuindo a degradação de membranas biológicas, que seria
um indício na diminuição dos processos oxidativos. Os estrógenos também seriam
capazes de preservar a integridade do endotélio vascular via mecanismo
antioxidante. Alguns estudos mostram o estradiol como redutor da lipoperoxidação
em humanas (UNFER et al., 2006, ALTINDAG et al., 2008) e em modelos animais
de hipercolesteroleremia (KEANEY; SHWAERY; XU, 2004).
Estes efeitos benéficos da TRH na diminuição dos desconfortos e prevenção
de doenças teriam, entre outras atribuições, o aumento nas defesas antioxidantes
com conseqüente diminuição das ERO’s. Pode-se esperar uma ação antioxidante de
mesma natureza também no osteoclasto o qual, com a deficiência estrogênica,
tende a diminuir acarretando aumento da concentração de ERO´s provocando vários
danos nos constituintes celulares e afetando consideravelmente a sinalização de
proteínas. (GARCIA-SEGURA; AZCOITIA; DONCARLOS, 2001).
Ainda citando o consenso norte-americano (NAMS, 2007), o uso da TRH
abrangeria não só o período após o evento menopausa, mas também aponta seus
benefícios, quando em doses mínimas, na melhora da qualidade de vida de
mulheres perimenopausadas. Outras terapias hormonais eficazes na prevenção e
no tratamento da menopausa tem sido de interesse clínico como aquela instituída
com a tibolona, derivado do 19-nortestosterone, útil no alívio de sintomas
climatéricos e prevenção da osteoporose na pós-menopausa (NAMS, 2007; PENG-
HUI et al., 2007).
29
A TRH tem mostrado claramente benefícios na saúde óssea em mulheres
com osteoporose pós-menopausal. Experimentos in vitro têm indicado possíveis
mecanismos subjacentes. Um pré-tratamento de células da linhagem dos osteócitos
com 17β-estradiol resultou na inibição da apoptose induzida por H2O2 associada a
uma diminuição na produção de ERO’s intracelular (MANN et al. 2007). Em
mulheres em pós-menopausa, foi observada uma diminuição na atividade da
catalase após o tratamento com Raloxifeno, um modulador seletivo do receptor do
estrógeno (SERM), o qual mostrou uma redução no estado oxidativo (OZGOCMEN
et al. 2007), observado pela diminuição das concentrações de carbonil protéico no
soro (KORUCULOGLO et al. 2006). Entretanto, um aumento na prevalência de
eventos tromboembólicos, câncer uterino e de mama também tem sido relatada
após a TRH (VALVERDE et al. 2008).
Além da TRH, dentro da prevenção ou redução dos efeitos causados pelo
estresse oxidativo gerado pelo estado de pós-menopausa, ressalta-se o papel da
suplementação com substâncias como a vitamina E, vitamina C, β-caroteno e, mais
recentemente, o ácido lipoico (KRIS-ETHERTON et al. 2004; BILSKA; WłODEK,
2005). Na linha destas observações, a vitamina C tem mostrado efeitos benéficos na
densidade mineral crescente do osso nas mulheres e, mais recentemente, NAC e a
vitamina C inibiram a perda óssea induzida por ooforectomia em um modelo de
osteoporose experimental (MORTON; BARRETT-CONNOR; SCHNEIDER, 2001;
LEAN et al., 2003).
O ácido lipoico vem sendo apontado como uma substância promissora na
defesa antioxidante. O AL e sua forma oxidada tem sido denominados na literatura
como “antioxidante universal” devido as suas habilidades em inativar a ação e inibir
a produção de uma grande variedade de ERO´s, como também regenerar outros
antioxidantes (PACKER et al., 2000). Conseqüentemente, a administração dos
antioxidantes acima mencionados na dieta pode ter efeitos favoráveis na saúde e na
qualidade de vida das mulheres, especialmente daquelas que não podem sofrer
níveis elevados do estresse oxidativo.
O AL, que também é conhecido como ácido R(+)-α- lipoico é um cofator
natural importante no metabolismo energético mitocondrial (TEICHERT; HERMANN;
RUUS, 2003). Nas ultimas décadas, a dupla redox ácido α-lipoico/ácido
dihidrolipoico receberam considerável atenção pela sua variedade de efeitos. A
redução celular de ácido α- lipoico a ácido dihidrolipóico (DHL) foi descrita em vários
organismos mamíferos (HARAMAKI et a., 1997).
30
Embora exista uma quantidade muito pequena de AL livre no organismo
humano sem suplementação, o AL livre tem a habilidade de capturar radicais
superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxil e peroxinitrito. Além disso, ele
pode interagir com outros antioxidantes como ascorbato, vitamina E e GSH,
contribuindo para a sua regeneração (WOLLIN & JONES 2003). Devido à sua
atividade antioxidante, o uso do AL tem se mostrado benéfico em várias formas de
estresse oxidativo, e um interesse como agente terapêutico nos processos de
isquemia e reperfusão, complicações diabéticas, formação de catarata, infecção por
HIV (Human immunodeficiency vírus), doenças neurodegenerativas, e lesões
radiação. (ALLEVA et al., 2005).
A capacidade antioxidante do AL está localizada no grupamento tiol, que
reage diretamente com os radicais oxidantes. É considerado um importante
antioxidante que pode ser de valor terapêutico em patologias relacionadas à
superprodução de radicais livres (PEREZ & CASTANEDA, 2006).
Nutricionalmente, o AL é encontrado no germe de trigo, no levedo de cerveja
e na carne vermelha. Contudo, a dieta dos mamíferos não prevê quantidades
suficientes de AL para uma significativa ação antioxidante (MORIKAWA et al. 2001).
O AL apresenta uma alta tolerância à suplementação bem documentada em
muitos estudos in vivo, com modelos animais e em humanos (HERMANN et al.
1996; BIEWENGA et al. 1997; TEICHERT et al. 1998; MARANGON et al. 1999;
RELJANOVIC et al. 1999; RUHNAU et al. 1999; ZIEGLER et al. 1999).
Cremer et al. (2006) avaliaram a toxicidade e carcinogenicidade do AL em
ratos suplementados durante 2 anos com doses de 20 a 180 mg/Kg/dia. Mesmo no
grupo que ingeriu 180mg/Kg, o AL não apresentou potencial carcinogênico ou
toxicidade a algum dos órgãos avaliados, entre eles: coração, fígado, baço, rins,
tireóide e cérebro.
Mais de 93% de uma dose de AL, administrada oralmente, é absorvida pelo
epitélio intestinal; contudo, apenas 20-30% escapa da metabolização hepática. Após
a absorção, o AL é reduzido intracelularmente para formar a ácido dihidrolipóico
(DHLA) que pode subseqüentemente sofrer S-metilação. AL e DHLA também estão
sujeitos à β-oxidação. AL é excretado pela urina na forma de metabólitos como o
4,6-bismetilmercapto-hexanóico que é o composto predominante. Em ratos, e
excreção urinária é responsável por aproximadamente 80% da eliminação do AL
(CREMER et al 2006).
31
Este composto também mostrado melhora no balanço glicolítico em pacientes
com diabetes mellitus tipo 2 além de ter efeitos antiobesidade (KONRAD et al.,
1999; KIM et al., 2004). Recentemente, o interesse nas aplicações clínicas do AL em
muitas doenças crônicas tem sido extremamente elevada, talvez devido a sua
segurança clínica relativa e às propriedades antioxidantes potentes (SMITH et al.,
2004).
Em estudos desenvolvidos por Alleva et al. (2005) e Borcea et al. (1999) em
pacientes submetidos a condições de estresse oxidativo, seja por uso de terapia
hiperbárica ou por pelo Diabetes mellitus, respectivamente, o uso de 600mg ao dia
de AL, mostrou uma melhora no quadro de estresse oxidativo. Entretanto, o efeito
deste antioxidante na prevenção de perda óssea e em células ósseas não tem sido
muito investigado.
Em outros estudos, ratos com artrite induzida por colágeno mostrou estar
associada com um aumento na produção de ERO’s intracelular em linfócitos dos
linfonodos inguinais, juntamente com um aumento de citocinas pró-inflamatórias. O
tratamento com AL diminuiu a produção de ERO’s bem como as propriedades
inflamatórias, sugerindo um papel do AL como antioxidante preventivo nas doenças
inflamatórias das articulações (LEE et al. 2007).
Dessa forma o uso de AL representaria uma possível alternativa clínica no
desconforto climatérico e no entendimento dos mecanismos osteoimunológicos
associados à falência ovariana. Vale ressaltar a carência de estudos voltados para a
perimenopausa, já que a maioria dos trabalhos que abordam a suplementação
antioxidante na deficiência estrogênica são voltados para a pós-menopausa. Logo, o
estudo apoiado na responsabilidade e ética, possibilitaria maiores subsídios para a
melhora da qualidade de vida desta parcela da população.
32 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a influência do tratamento com ácido lipoico sobre o metabolismo
ósseo, através de marcadores bioquímicos e moleculares, bem como sobre o perfil
antioxidante, através de marcadores pró e antioxidantes, em mulheres na
perimenopausa.
2.2 Objetivos Específicos
o Avaliar os parâmetros antropométricos como IMC, CC e RCQ além do perfil
lipídico através da determinação da concentração sérica de colesterol total,
HDL, VLDL, LDL e triglicerídeos das mulheres na perimenpausa, e a
resposta a suplementação com ácido lipoico;
o Avaliar as mulheres na perimenopausa quanto ao perfil hepático e renal
através da determinação da atividade sérica das enzimas ALT, AST, GGT e
da concentração sérica de uréia, creatinina, proteínas totais e albumina,
usadas como perfil de segurança, afim de, verificarmos possíveis alterações
provocadas pela suplementação com ácido lipoico;
o Determinar a atividade da fosfatase alcalina total, fosfatase acida tartarato-
resistente e a concentração de osteocalcina, marcadores de formação
óssea, e a concentração sérica dos minerais: fósforo, magnésio, cálcio total
e ionizado, antes e após a suplementação com ácido lipoico;
o Determinar a concentração de GSH e SRAT’s (Substâncias Reativas ao
Ácido tiobarbitúrico) e a atividade das enzimas antioxidantes GPx, SOD,
antes e após a suplementação com ácido lipoico;
o Estudar a expressão do mRNA do genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em
leucócitos totais de sangue periférico, antes e após a suplementação com
ácido lipoico;
o Avaliar as alterações de todos os parâmetros estudados frente uma
suplementação com ácido lipoico, e verificar o possível efeito benéfico deste
potente antioxidante na saúde óssea das mulheres que estão na
perimenopausa, condições iniciais de deficiência de estrógeno.
33 3 MÉTODOS
O estudo realizado é do tipo ensaio clínico aleatorizado e controlado duplo
cego no qual foi avaliado o efeito da suplementação com ácido lipoico sobre a
condição de estresse oxidativo e metabolismo ósseo em mulheres na
perimenopausa, onde pesquisadores de áreas distintas estão trabalhando
conjuntamente com a perspectiva de uma visão multidisciplinar.
3.1 Aspectos Éticos do Projeto e Financiamento
O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Universitário Onofre Lopes - UFRN, obedecendo às diretrizes
regulamentadas da pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na
Resolução do CNS nº 196/96. A pesquisa foi aprovada sob parecer consubstanciado
nº 178/08 (anexo 1).
O presente projeto teve financiamento aprovado pelo Edital CNPq Universal
2007, Processo 481011/2007-2, onde recebeu financiamento para execução do
mesmo.
3.2 Casuística
As mulheres com idade entre 40 e 60 anos que procuraram as 10 Unidades
Básicas de Saúde (Parque das Orquídeas, Parque Industrial, Passagem de Areia,
Centro, Cohabinal, Rosa dos Ventos, Santos Reis, Monte Castelo, COOPHAB e
Emaús) da Rede Municipal de Saúde do Município de Parnamirim/RN, foram
convidadas a participar do estudo onde as mesmas foram entrevistadas conforme
Ficha Clínica de Triagem (Apêndice A).
Foram selecionadas 600 mulheres e encaminhadas para o Centro Clínico de
Especialidades Médicas de Parnamirim (CCPar) onde foram atendidas pela equipe
multidisciplinar e submetidas aos critérios de inclusão ou exclusão, conforme
listados a seguir. Desse total, para 50 mulheres que atenderam aos critérios de
inclusão e exclusão, foram agendadas consultas com a ginecologista do grupo de
pesquisa, Dra. Maria do Socorro Medeiros de Morais, para serem avaliadas
conforme Ficha Clínica de Avaliação Ginecológica (Apêndice C). Aquelas que
cumpriram os critérios clínicos de inclusão e exclusão e assinaram o Termo de
34 Conscentimento Livre e Esclarecido (TCLE) estiveram aptas a participar da
pesquisa.
As mulheres foram informadas a respeito de sua participação voluntária por
meio do TCLE (Apêndice B), constando dados sobre a pesquisa, assim como os
riscos e benefícios.
Este grupo de 50 mulheres foi dividido aleatoriamente em 02 grupos de
preferência quantitativamente iguais, conforme delineado abaixo, que foram
acompanhados ao mesmo tempo. Devido ao fato do estudo ser do tipo duplo cego,
os pesquisadores responsáveis não tiveram acesso à divisão dos grupos.
Grupo 1 - Grupo Placebo (n=25) que receberam placebo como estratégia de
estímulo de adesão ao tratamento;
Grupo 2 – Grupo Ácido Lipoico (n=25), que receberam suplementação oral
diária com ácido α-lipoico na dose de 600mg/dia dividas em duas doses de 300mg
cada, durante um período de 3 meses; a administração foi realizada 30 minutos
após as refeições para evitar o desconforto gástrico associado a natureza da droga.
As cápsulas usadas no estudo forma manufaturadas na Farmácia Escola da
Faculdade de Farmácia – UFRN, sob orientação da profa. Dina Maria de Araújo.
Essas cápsulas passaram por um controle de qualidade prévio, a fim de avaliar o
teor de ácido lipoico nas cápsulas e assim validar o processo de manufaturamento
das mesmas. Esse procedimento foi realizado no Laboratório de Controle de
Qualidade da Faculdade de Farmácia sob a supervisão do prof. Dr. Cícero Flávio
Soares Aragão. Durante o processo de manipulação das cápsulas o controle de
qualidade consistia na análise do peso médio das mesmas. Os frascos que
continham as cápsulas (frascos branco), quanto as casulas (cápsulas 00, cor vinho),
eram idênticos, para que não houvesse viés na analise dos resultados.
As mulheres incluídas no Projeto foram semanalmente visitadas pelos
agentes comunitários de saúde para garantir a permanência no estudo e evitar
desistências, supervisionar o uso adequado da medicação e o aparecimento de
alguma intercorrência ou efeito colateral, como desconforto gástrico, relacionada à
suplementação com ácido lipoico.
Do total de 50 mulheres incluídas no estudo ocorreram 11 perdas as quais
não seguiram de forma correta as orientações quanto ao uso do medicamento (3) ou
não compareceram na data marcada para a segunda coleta (8). Dessa forma
restaram 39 mulheres participantes do estudo, sendo 22 no Grupo Ácido Lipoico e
17 no Grupo Placebo.
35
Critérios de inclusão
A Inclusão no estudo segue os critérios clínicos e laboratoriais para
perimenopausa adotados pela North American Menopause Society (2007):
• História de Irregularidade nos últimos 6 meses e/ou amenorréia há no máximo
12 meses;
• Idade entre 40 e 60 anos;
• Presença de um ou mais sintomas como sintomas vasomotores (fogachos,
sudorese noturna), somáticos (fadiga, artralgia, mialgia e alterações da pele),
urogenitais (ressecamento vaginal, sangramento vaginal irregular, polaciúria,
nictúria, urgência miccional, vaginites atróficas e incontinência urinária de
esforço), afetivos (como irritabilidade, tensão, ansiedade e apatia) e sintomas
relacionados à atividade sexual (alterações de libido e dispareunia).
• Nível sérico do FSH igual ou superior a 25UI/L;
• Obter escore maior que 14 pontos no Índice Menopausal de Kupperman
(KUPPERMAN, 1959).
Critérios de exclusão
• Apresentam menopausa precoce (antes dos 40 anos) e/ou menopausa
cirúrgica;
• Estiverem utilizando de forma regular medicações hormonais (incluindo
estrogênios, progestagênio e anticoncepcionais);
• Mulheres com história de fumo e consumo de álcool;
• Doenças ou disfunções psiquiátricas que alterem as funções cognitivas;
• Portadora de doenças clínicas tireoideanas, hepáticas, renais e pancreáticas;
• Apresenta alguma contra-indicação a terapêutica de reposição hormonal
estrogênica, ou seja, antecedentes pessoais de neoplasia de mama e/ou
útero, cardiopatia grave, atual ou recente, tromboembolismo, e hepatopatia
grave;
• Presença de nódulo mamário, hiperplasia endometrial a esclarecer ou outras
condições ginecológicas que à critério clínico se julgue prudente não fazer
TH.
• Amenorréia a mais de 12 meses
• Condições clínicas não citadas, mas que podem interferir com o climatério;
36
• Medos, queixas reais ou esperadas para o tratamento que possa interferir
com os objetivos do estudo;
• Participação simultânea em outro ensaio clínico.
3.3 Parâmetros Antropométricos
3.3.1 Índice de Massa Corpórea – IMC
A avaliação antropométrica foi realizada por meio da mensuração do peso
corporal e estatura das pacientes, para cálculo do Índice de Massa Corpórea (IMC),
que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²),
recomendado pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 1998). Para mensuração
da massa corporal, foi utilizada balança digital Tanita®, modelo MEA-03140, com
capacidade para 150 kg e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços
e com o mínimo possível de roupa e adereços.
A estatura foi aferida uma vez em centímetros, com auxílio de estadiômetro,
da marca Sanny® com comprimento de 2,20m. As mulheres foram medidas
descalças em posição ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e
a parte posterior dos joelhos encostados à parede. O valor do IMC é dado pelo
quociente do peso, em kilogramas, pelo quadrado da altura, em cm (IMC = Peso
(Kg)/Altura (cm)2). O estado nutricional antropométrico das participantes do estudo
foi avaliado conforme Quadro 1.
QUADRO 1: Estado nutricional e antropométrico, de acordo com o IMC, para adultos.
Índice de Massa Corporal (IMC)
kg/m²
Diagnóstico do Estado Nutricional
Antropométrico
≥ 40,0 Obesidade grau III
35,0 – 39,9 Obesidade grau II
30,0 – 34,9 Obesidade grau I
25,0 – 29,9 Pré-obeso ou sobrepeso
18,5 – 24,9 Eutrofia
17,0 – 18,4 Magreza grau I
16,0 – 16,9 Magreza grau II
< 16,0 Magreza grau III
FONTE: WHO, 1998. (Traduzido)
37 3.3.2 Circunferência da Cintura e do Quadril
As circunferências da cintura e quadril foram aferidas com o auxílio de uma
fita métrica inelástica, com 150 cm de comprimento.
Para medida da circunferência da cintura foi solicitado à entrevistada para
que ela levante a blusa e deixe os braços estirados sobre o corpo e em seguida foi
aferida a circunferência da cintura na região mais estreita do abdômen (em alguns
casos se localiza dois dedos acima da cicatriz umbilical). A aferição foi realizada em
triplicata e o valor médio de ambas será considerado para efeito de análise.
Os valores obtidos na circunferência da cintura foram classificados de acordo
com o Quadro 2.
QUADRO 2: Valores de classificação para circunferência da cintura de acordo com o
gênero.
Risco de complicações metabólicas Circunferência cintura (cm)
Homens Mulheres
Aumentado ≥ 94 ≥ 80
Substancialmente aumentado ≥ 102 ≥ 88
FONTE: WHO, 2004 (Traduzido).
Na medida da circunferência do quadril o avaliador se posicionou na lateral
do entrevistado para facilitar a tomada da medida, a fita foi posicionada na região de
maior perímetro entre a cintura e a coxa (maior protuberância glútea).
A Relação Cintura Quadril (RCQ) identifica a distribuição da gordura corporal,
sendo o indicador mais freqüente utilizado para identificar o tipo de distribuição da
gordura (andróide ou ginóide), obtida pela razão entre circunferência da cintura e a
circunferência do quadril (CC/CQ). Os valores obtidos na RCQ foram classificados
de acordo com o Quadro 3.
QUADRO 3: Valores de classificação para a RCQ, de acordo com o gênero.
Gênero Risco de complicações metabólicas associadas à Obesidade
Masculino > 1,0
Feminino > 0,85
FONTE: WHO, 1998 (Traduzido)
38 3.4 Amostras Biológicas
Foram coletados cerca de 30 mL de sangue por punção venosa, utilizando-se
sistema de coleta a vácuo, após jejum de no mínimo 12 horas, de todas as mulheres
para a realização de determinações bioquímicas, hormonais e imunológicas, RNA
total e avaliação do perfil antioxidante. O sangue foi fracionado em três alíquotas,
sendo uma sem anticoagulante (dosagens bioquímicas), outra com heparina
(osteocalcina) e outra com EDTA (biologia molecular e perfil antioxidante).
3.5 Avaliação Laboratorial
A avaliação laboratorial consistiu de hemograma completo, determinações de
concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides, glicemia de jejum,
transaminases hepáticas (ALT e AST), gama-glutamil transferase (GGT), fosfatase
alcalina total, fosfatase ácida tartarato-resistente, fósforo, magnésio, creatinina,
uréia, proteínas totais, albumina. Esses parâmetros foram determinados no auto-
analisador Dimension AR® (Dade Behring, Newark, USA) utilizando-se kits de
reagentes e protocolos do fabricante, sendo realizados no Laboratório de Análises
Toxicológicas e Clínicas - LIATEC (Natal-RN). Também foram realizadas as
dosagens de hormônio folículo-estimulante (FSH) através da técnica de
quimioluminescencia, utilizando-se o Sistema Immullite (SIEMENS, Los Angels,
USA).
3.6 Avaliação do Perfil Oxidante
3.6.1 Obtenção do Concentrado de Hemácias
O sangue total coletado com EDTA foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos
a uma temperatura de 4ºC em centrífuga refrigerada Sigma 2k15 (Sigma
Laborzentrifugen, Germany) para a separação dos eritrócitos e dos demais
constituintes por processos de centrifugação e lavagem com solução tampão
fosfato/NaCl de pH 7,4. A concentração de glutationa foi determinada em amostras
de sangue total. O plasma foi utilizado para a determinação das substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico (SRAT). O concentrado de hemácias foi acondicionado em
39 microtubos e armazenados em freezer -80ºC para posterior determinação da
atividade de superóxido dismutase e glutationa peroxidase.
Os resultados da atividade das enzimas SOD e GPx são expressos em U/gHb,
dessa forma foi realizada a analisa da concentração de hemoglobina. Essa análise
foi realizada em sangue total em equipamento hematológico automatizado MICROS
60 OS (ABX, France)
3.6.2 Determinação da Atividade da Superóxido Dismutase (SOD) (E.C.
1.1.15.1.1)
A atividade da SOD foi determinada através de kit RANSOD (RANDOX
LABORATORIES, United Kingdom). Este método emprega xantina e xantina oxidase
(XOD) para gerar radicais superóxido os quais irão reagir com 2-(4-iodofenil)-3-(4
nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (I.N.T) para formar o composto vermelho de
formazan . A atividade do superóxido dismutase foi medida através do grau de
inibição desta reação determinado a 505 nm UV-1650 PC Spectrophotometer UV-
Visible (Shimadzu, Tokio, Japan). A atividade da enzima é expressa em U/gHb.
XOD
Xantina Ácido Úrico + O2-
O
2-
I.N.T. Corante Formazan ou
SOD O2
- + O2- + 2H- O2 + H2O2
3.6.3 Determinação da Atividade da Glutationa Peroxidase (GPX) (E.C.
1.6.4.2)
A atividade da GPx foi determinada utilizando kit RANSEL (RANDOX
LABORATORIES, United Kingdom). A Glutationa Peroxidase (GPX) catalisa a
oxidação da Glutationa (GSH) pelo Hidroperóxido de Cumeno. Na presença da
Glutationa Redutase (GR) e NADPH a Glutationa oxidase (GSSG) é imediatamente
convertida na forma reduzida como uma oxidação concomitante da NADPH a
NADP+. A diminuição na absorbância a 340nm foi determinada em
espectrofotômetro UV-1650 PC Spectrophotometer UV-Visible; (Shimadzu, Tokio,
Japan). A atividade da enzima é expressa em U/gHb.
40 3.6.4 Determinação da Produção de SRAT em Plasma
A técnica fundamenta-se na determinação colorimétrica do produto de
substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBA) em meio ácido à 95oC.
Uma dessas substâncias é o malonildialdeído (MDA) o qual é produzido durante a
quebra de peróxidos lipídicos (YAGI, 1982). A leitura espectofotométrica foi
realizada a 535 nm (UV-1650 PC Spectrophotometer UV-Visible; Shimadzu, Tokio,
Japan). A concentração foi expressa em µmol/mL.
3.6.5 Determinação do Conteúdo de Glutationa (GSH) em Sangue Total
A glutationa foi determinada em sangue total conforme o descrito por Beutler
et al. (1963). O método baseia-se na reação de redução do 5,5'ditiobis,ácido 2 –
nitrobenzóico (DTNB) com a glutationa (GSH) , gerando o ânion tiolato (TNB) de cor
amarela e estável sob refrigeração. A concentração de glutationa foi expressa em
mmol/L e calculada a partir da absorbância em 412 nm (UV-1650 PC
Spectrophotometer UV-Visible; Shimadzu, Tokio, Japan) utilizando o coeficiente de
extinção de 14,1.
3.7 Análise da Expressão Gênica
3.7.1 Extração e Análise do RNA Total
O RNA total foi obtido a partir de sangue total periférico, colhido com EDTA
utilizando o kit de extração QiAamp RNA Blood Mini® (Qiagen, Alemanha)
imediatamente após a colheita do sangue. Este método utiliza o sistema de colunas
associa as propriedades de ligação seletiva da membrana sílica gel com
propriedades de centrifugação. Esse sistema utiliza tampões concentrados,
permitindo que RNAs maiores que 200 bases se liguem a membrana. Durante o
procedimento de purificação do RNA no sangue, os eritrócitos foram seletivamente
lisados e os leucócitos foram recuperados pela centrifugação. Posteriormente os
leucócitos foram lisados através de condições altamente desnaturantes, que
imediatamente inativam RNases, permitindo o isolamento do RNA intacto. Após a
homogeneização do lisado, através de uma breve centrifugação, adicionou-se etanol
na coluna para ajustar as condições de ligação. Logo após, a amostra foi aplicada
em outra coluna. O RNA ligou-se na membrana sílica durante o passo de
centrifugação. Os contaminantes foram eliminados na lavagem e o RNA total foi
41 eluído em 30µL em água livre de RNases (QIAamp RNA Blood Mini Handbook). O
material obtido foi armazenado no freezer - 80°C até a sua análise.
O RNA total extraído foi quantificado por espectrofotometria através da
absorbância a 260nm e o grau de pureza do RNA foi determinado pela relação
A260nm/A280nm utilizando o espectrofotômetro CIRRUS MB 80 (FEMTO, São
Paulo, Brasil) (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).
3.7.2 Analise de Expressão de mRNA pela qT-PCR em Tempo Real
A medida quantitativa da expressão do mRNA em sangue total periférico foi
realizada pela RT-PCR em tempo real utilizando o sistema de amplificação
TaqMan® RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O sinal de
fluorescência emitido pelo fluoróforo da sonda TaqMan® foi detectado em tempo
real no equipamento ABI Prism 7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EUA). A análise da expressão gênica foi realizada por método de quantificação
relativa utilizando o gene GAPDH como controle endógeno.
Para a amplificação pela PCR em tempo real foram selecionados iniciadores
e sondas marcadas com fluoróforo para os genes RANK, RANKL, IL-6, TNF-ɑ e
GAPD. A escolha foi possível com o auxílio do programa Primer Express® (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base nas seqüências gênicas disponíveis no
banco de dados do NIH (www.ncbi.nlm.nih.gov) e estão descritos na Tabela 1.
42 TABELA 1. Iniciadores e sondas marcadas utilizadas nas PCRs em Tempo real
Genes QT-PCR Iniciadores Fragmento
RANK Tempo Real 5’ TTGCCTTGCAGGCTACTTCTC3’ 96 pb
5’TGATGTTCTACTCTCTTTCCAAGGAA3’
5’FAM TTCCTCCACGGACAAATGCAGACCC TAMRA3’
RANKL Tempo Real 5’GCCTTTTGCTCATCTCACTATTAATG3’ 78 pb
5’TGGTACCAAGAGGACAGACTCACTT3’
5’FAM CACCGACATCCCATCTGGTTCCCA TAMRA3’
IL-6 Tempo Real 5’CGGGAACGAAAGAGAAGCTCTA3’ 68 pb
5’GGCGCTTGTGGAGAAGGA3’
5’FAM CGCCTCCAGGAGCCCAGCTATGA TAMRA3’
TNF-ɑ Tempo Real 5’CCTGCCCCAATCCCTTTATT3’ 71 pb
5’CCAATTCTCTTTTTGAGCCAGAA3’
5’FAM CCCCCTCCTTCAGACACCCTCAACC TAMRA3’
GAPDH Tempo Real 5’GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA3’ 229 pb
5’CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC3’
5’VIC TCAGCCTTGAGGGTGC TAMRA3’
Nota: RANK: Receptor Ativador de NFκB; RANKL: Ligante do Receptor Ativador de NFκB; IL-6: Interleucina-6; TNF-ɑ: Fator de Necrose Tumoral – alfa; GAPDH: Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase
A síntese do cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems, de acordo com a
metologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em termociclador em
termociclador MyCycler (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA, USA). O cDNA obtido
foi armazenado a –20°C até a realização da PCR em tempo real.
Na etapa seguinte o cDNA foi amplificado pela PCR em tempo real,
utilizando-se iniciadores a 10 µM e sonda de detecção marcadas com FAM a 5 µM
para RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ. Para o GAPDH, utilizou-se a sonda de detecção
marcada com VIC a 5 µM e os iniciadores a 10 µM. Os demais reagentes foram
fornecidos em solução 2x concentrada denominada Master Mix contendo dNTPs
com dUTP, AmpErase® Uracil N-glicosilase (UNG), enzima AmpliTaq Gold® DNA
Polimerase, uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foi utilizado volume final de 10 µL por reação
em duplicata.
43
O programa da PCR em tempo real utilizado foi constituído de: (1) um ciclo
2min a 50ºC, (ativação da UNG); (2) um ciclo de 10min a 95ºC, (inativação da UNG);
(3) 40 ciclos de 15s a 95ºC (desnaturação) e 1min a 60ºC (hibridização e extensão).
Os sinais de fluorescência emitidos pelos fluoróforos das sondas TaqMan® foram
detectados pelo equipamento ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EUA). Os dados foram analisados utilizando-se o programa Sequence Detection
Software v1.2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA EUA) que gera curvas semi-
logarítmicas dos sinais de amplificação.
Esse programa fornece o parâmetro ciclo em que o sinal de fluorescência é
significativo, denominado cycle treshold (Ct) (BUSTIN, 2000; LIVAK &
SCHMITTGEN 2001). Para cada amostra, o Ct de cada gene é registrado e
comparado com o gene GAPDH que é utilizado com controle endógeno.
A quantidade de cDNA utilizada nos ensaios foi otimizada a partir de uma
curva-padrão, realizada com diferentes concentrações de amostra. A curva-padrão
permite avaliar a linearidade da amplificação bem como a eficiência da mesma. Para
essa finalidade foram utilizadas diluições seriadas de cDNA de amostras usadas
somente para a avaliação da PCR em tempo real. Com as diluições de cDNA e os
respectivos valores de Ct construiu-se um gráfico que permitiu verificar a relação
entre essas duas variáveis (Ct x log da diluição de cDNA).
A eficiência da reação foi calculada de acordo com a inclinação da curva
gerada pela seguinte fórmula: E =10-1/á -1 x 100, onde á é a inclinação da curva
(PFAFFL, 2001). Segundo Livak & Schmittgen (2001), para a PCR em tempo real ter
alta eficiência, a inclinação da curva-padrão deve ser próximo de -3,3.
Na Tabela 2, são apresentados os resultados de inclinações (slopes) das
curvas e as respectivas eficiências dos ensaios. Para os genes RANK, RANKL, IL-6,
TNF-ɑ e GAPDH os valores de eficiência mostraram-se adequados.
TABELA 2. Valores de inclinação da curva e eficiência da qT-PCR em tempo real.
Gene Inclinação da curva Eficiência
RANK -3,2 103%
RANKL -3,1 109%
IL-6 -2,79 128%
TNF-ɑ -2,83 125%
GAPDH -3,2 103%
44
Os valores de Ct obtidos nesses ensaios foram utilizados para o cálculo da
expressão relativa de mRNA de cada gene alvo em relação à do GAPDH (controle
endógeno). Essa relação é denominada Delta Ct (DCt) e é calculada pela fórmula:
∆Ct = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)
Com objetivo de avaliar a variação de expressão após o tratamento com
Ácido Lipoico ou com o Placebo, foi utilizado o parâmetro Delta Delta Ct (DDCt) que
é calculado pela fórmula:
∆∆Ct = (∆Ct amostra – ∆Ct calibrador)
Foi considerado como calibrador a média dos ∆Ct’s basais. Os dados de
∆∆Ct foram transformados em escala logarítmica (2-∆∆Ct) para comparar dados de
expressão entre as fases de tratamento farmacológico. A expressão é interpretada
pelo seu aumento ou diminuição após o tratamento.
3.8 Avaliação Estatística
Para o tratamento dos dados foi elaborado um banco de dados para devidas
analise e tabulação das variáveis, utilizando o programa Microsoft Excel for Windows
versão Vista e para a analise estatística, o programa GraphPaf Prism 5.
Primeiramente foi realizado o teste de Kolmogorov-Smirnov, afim de avaliar a
distribuição dos dados. Para as comparações de variáveis quantitativas, foram
utilizados os testes paramétricos teste-t pareado, para amostras paramétricas, e o
teste de Mann-Withney para amostras não paramétricas. Foi realizado também o
teste de correlação bivariada de Pearson ou de Sperman, entre algumas variáveis,
com uma regressão linear simples. Para estas analises foi estabelecido o nível de
significância de p<0,05.
45 4 RESULTADOS
O estudo foi constituído por uma amostra de 39 pacientes (um total de 50
previstos), as quais foram selecionadas a partir de entrevista estruturada e realizada
pela médica ginecologista do projeto, de acordo com a ficha clínica ginecológica
(Apêndice C). Essas pacientes foram selecionadas a partir de mulheres que
procuraram as Unidades Básicas de Saúde (UBS) do município de Parnamirim/RN.
As principais características dessas mulheres são mostradas na Tabela 3.
Os dados foram coletados do período de outubro de 2008 a maio de 2009 e
refletem o estado inicial das mulheres estudadas. É importante essa caracterização,
uma vez que fazia parte dos critérios de inclusão: a idade entre 40-60 anos, histórico
de irregularidades menstruais, glicemia menor do que 100mg/dL e concentração de
FSH acima 25mUI/mL. Esse histórico de irregularidades menstruais associada às
altas concentrações de FSH, o que caracteriza o estado de perimenopausa das
mulheres do nosso estudo. Como pode ser observado não houve diferenças
significativas entre os grupos estudados.
TABELA 3 – Características das mulheres na perimenopausa Variáveis Placebo (17) Ácido Lipoico (22) p valor
Idade (anos) 48,7 ± 3,4 47,5 ± 4,2 0,3437c
Menarca (anos) 13,5 ± 1,4 13 ± 1,3 0,2567c
Irregularidade Menstrual (meses) 15,3 ± 9,3 17,5 ± 17,6 0,6435c
Pressão Sistólica (mmHg) 128 ± 15 125 ± 11 0,4754c
Pressão Diastólica (mmHg) 78 ± 7 76 ± 11 0,5176c
Glicose (mg/dL) 88 ± 8 86,6 ± 5,7 0,527 c
FSH (mUI/mL) 61 ± 24,7 78,8 ± 29,5 0,0526c
Nota: Número de indivíduos em parênteses. FSH: hormônio folículos estimulante. Valores mostrados em média ± desvio padrão e comparados por Teste-tc. A Tabela 4 mostra os resultados referentes à avaliação antropométrica realizadas
nas pacientes participantes do estudo.
46 TABELA 4 – Distribuição das características Antropométricas das mulheres na
perimenopausa
Variáveis Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois p Valor Antes Depois p valor
Altura (cm) 1,53 ± 0,08 1,54 ± 0,06
Peso (kg) 61 ± 10 61 ± 9 0,6976ª 64 ± 9 64 ± 9 0,5682ª
CC (cm) 80 ± 8 79 ± 9 0,2234ª 83 ± 8 83 ± 8 0,6567ª
≥ 80 cm 35% 30% 0,7851c
45% 13% 0,0658c
≥ 88 cm 23% 18% 22% 41%
RCQ 0,81 ± 0,04 0,80 ± 0,06 0,3263ª 0,81 ± 0,04 0,81 ± 0,04 0,7245ª
≥ 0,85 12% 24% 0,3683c 27% 23% 0,7277c
IMC (kg/m2) 26,0 ± 3,8 25,9 ± 3,5 0,7445ª 26,8 ± 3,3 26,9 ± 3,4 0,5171ª
<25 kg/m2 41% 41%
0,8219c
32% 27%
0,9416c 25,0 – 29,9 kg/m2 47% 53% 50% 54%
≥ 30 kg/m2 12% 6% 18% 19%
Nota: Número de indivíduos em parênteses. CC: circunferência de cintura, CC ≥ 80cm = risco aumentado de complicações metabólicas; CC ≥ 88cm = risco substancialmente aumentado de complicações metabólicas; RCQ: relação cintura quadril, RCQ ≥ 0,85 risco de complicações metabólicas associadas à obesidade; IMC: índice de massa corporal, IMC <25 kg/m2 = eutrófico; IMC 25,0 – 29,9 kg/m2 =pré-obeso; IMC ≥ 30 kg/m2 = obeso. Valores mostrados em média ± desvio padrão ou porcentagem antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por teste t de studenta e teste qui-quadradoc.
De acordo com os resultados obtidos podemos observar que as pacientes
apresentaram, em média, valores de circunferência de cintura elevados quando
comparados a valores estabelecidos pela OMS (1998) e que não houve alteração ao
longo do período de estudo comparando tanto o grupo placebo, quanto o tratado
com ácido lipoico. Com relação ao IMC foram encontrados resultados que indicaram
que as mulheres na perimenopausa apresentaram resultados que indicam pré-
obesidade. Não houve diferenças significativas após o tratamento com ácido lipoico.
A relação cintura quadril não apresentou valores, em média, alterados em nenhum
dos grupos estudados embora algumas pacientes apresentassem valores de RCQ
elevados.
Para avaliar o perfil lipídico das pacientes em estudo foi determinada a
concentração sérica de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e
triglicerídeos. Os resultados obtidos, mostrados na Figura 1, revelam que as
mesmas apresentaram hipercolesterolemia (VR – desejável < 200 mg/dL), com
valores de colesterol LDL aproximando-se do limite superior aceitável (VR – limítrofe
alto 130 – 159 mg/dL), bem como uma concentração aumentada para os
47 triglicerídeos (VR – normal < 150 mg/dL). Com relação ao HDL não foram
encontradas alteração significativas (VR – baixo = 40 mg/dL).
Quando avaliados as pacientes após o tratamento por 3 meses com acido
lipoico, podemos notar que as mesmas não apresentaram alterações significativas
no perfil lipídico.
TABELA 5 – Perfil Lipídico das mulheres na perimenopausa
Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois p Valor Antes Depois p Valor
Colesterol Total
(mg/dL)
212,3 ± 44,2 217,8 ± 22,8 0,5328 209,7 ± 45,3 220,5 ± 44,7 0,2309
LDL (mg/dL) 139,7 ± 44,3 147,5 ± 19,24 0,4113 133,0 ± 35,8 141,2 ± 34,1 0,3445
Triglicerídeos
(mg/dL)
137,9 ± 39,8 135,2 ± 32,76 0,7918 170,3 ± 82,9 190,0 ± 111,8 0,5713
HDL (mg/dL) 44,8 ± 10,1 43,7 ± 7,7 0,4989 42,5 ± 8,6 40,8 ± 7,8 0,4270
VLDL (mg/dL) 27,1 ± 7,9 26,5 ± 6,7 0,7538 34,1 ± 16,6 38,0 ± 22,4 0,2483
Nota: Número de indivíduos em parênteses. Lipoproteína de baixa densidade (LDL), Lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), Lipoproteína de alta densidade (HDL) Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, comparados por teste t de student.
Considerando que o presente trabalho faz uso de uma suplementação com
ácido lipoico, a avaliação da função hepática, renal e metabolica foi realizada como
controle metabólico para avaliar a segurança no uso desse suplemento, para assim
verificar a possível presença de efeitos adversos, como por exemplo, eventos
epigástricos. A Tabela 6 mostra os resultados referentes à avaliação da função
hepática e renal, mostrando que as pacientes não apresentavam comprometimento
nesses órgãos durante o período do presente estudo.
48 TABELA 6 – Perfil de segurança quanto ao uso de Ácido Lipoico e Placebo das mulheres estudadas.
Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois P valor Antes Depois p Valor
TGO/AST (U/L) 24 ± 7,6 24 ± 4,8 0,9596 23 ± 5,7 28 ± 9 0,1426
TGP/ALT (U/L) 44 ± 15 44 ± 10 0,9418 44 ± 11 47 ± 13 0,5098
GGT (U/L) 32 ± 14 33 ± 21 0,5365 23 ± 7 25 ± 9 0,5961
Uréia (mg/dL) 24 ± 6 26 ± 4,4 0,3658 24 ± 5,8 27 ± 7,2 0,0551
Creatinina
(mg/dL)
0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,15 0,4113 0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,4879
Proteínas Totais (mg/dL)
7,3 ± 0,4 7,1 ± 0,4 0,1514 7,1 ± 0,5 7,2 ± 0,5 0,3270
Albumina
(mg/dL)
3,9 ± 0,2 4,0 ± 0,6 0,2988 3,8 ± 0,3 3,9 ± 0,45 0,2133
Nota: Número de indivíduos em parênteses. TGO/AST: transaminase glutâmica oxalacética/asparto amino transferase; TGP/ALT: transaminase glutâmico pirúvica/alanina amino transferase; GGT: gama glutamil transferase; VR: valores de referência. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, comparados por teste t de student.
Com finalidade de avaliar o metabolismo mineral e ósseo foi medidas as
concentrações séricas de osteocalcina e a atividade de fosfatase alcalina total, como
marcadores de formação óssea e atividade de fosfatase ácida tartarato-resistente
como marcador de reabsorção óssea. Foram ainda determinadas as concentrações
séricas de cálcio total e ionizado, fósforo e magnésio. Esses resultados são
mostrados na Tabela 7.
Como pode ser observado foram encontradas alterações com relação ao
fósforo sérico, que se elevou após os três meses de tratamento, tanto para o grupo
placebo quanto para o grupo suplementado com ácido lipoico. Para os demais
analitos não foram observadas alterações significativas.
49 TABELA 7 - Avaliação do metabolismo mineral e ósseo das pacientes na perimenopausa.
Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois p Valor Antes Depois p Valor
Osteocalcina
(ng/mL)
6,8 ± 6,4 8,6 ± 5,4 0,4138 6,7 ± 3,5 5,0 ± 1,7 0,2684
FAL (U/L) 82 ± 19,5 70 ± 19,7 0,0923 81 ± 22,6 85 ± 21,2 0,3504
TRAP (U/L) 0,25 ± 0,10 0,26 ± 0,09 0,2218 0,31 ± 0,09 0,30 ± 0,22 0,8166
Cálcio (mg/dL) 9,3 ± 0,60 9,1 ± 0,88 0,3144 9,3 ± 0,72 9,2 ± 0,91 0,7214
Cálcio Ionizado
(mmol/dL)
1,13 ± 0,07 1,10 ± 0,08 0,2700 1,09 ± 0,1 1,08 ± 0,08 0,3539
Fósforo (mg/dL) 3,41 ± 0,50 3,70 ± 0,74 0,0213 3,48 ± 0,50 4,01 ± 0,87 0,0152
Magnésio (mg/dL) 2,01 ± 0,31 2,04 ± 0,32 0,8448 1,96 ± 0,27 1,96 ± 0,26 0,9805
Nota: Número de indivíduos em parênteses. FAL: fosfatase alcalina; TRAP: fosfatase ácida tartarato-resistente. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por: teste t de student.
A avaliação do estresse oxidativo foi realizada através da avaliação da
atividade enzimática da SOD e da GPx, enzimas antioxidantes, e medidas das
concentrações de GSH, molécula antioxidante, e SRAT, marcador pró-oxidante.
Esses resultados são mostrados na.
Como pode ser observado a SOD mostrou-se elevada após os três meses de
estudo no grupo placebo, elevação essa que não foi demonstrada no grupo que foi
submetido à terapia com ácido lipoico. A enzima GPx mostrou-se diminuída
significativamente após a terapia com ácido lipoico. Para os demais parâmetros não
houve diferenças estatisticamente significativa.
TABELA 8 – Avaliação do Perfil Oxidativo das pacientes na perimenopausa
Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois p Valor Antes Depois p Valor
SOD U/g Hb 2,68 ± 1,17 3,24 ± 1,65 0,0336 3,28 ± 1,34 2,81 ± 1,39 0,1797
GPx U/g Hb 56,8 ± 10,37 50,4 ± 13,41 0,0813 51,3 ± 8,35 43,4 ± 11,87a 0,0041
GSH mmol/L 0,75 ± 0,175 0,76 ± 0,267 0,7754 0,76 ± 0,176 0,79 ± 0,148 0,3908
SRAT µmol/L 3,57 ± 1,16 2,73 ± 1,25 0,3921 3,66 ± 2,22 3,88 ± 1,15 0,9580
NOTA: Número de indivíduos em parênteses. SOD: superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; GSH: glutationa reduzida; SRAT: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por teste t de student.a: p< 0,01 vs ácido lipoico antes.
50
A expressão dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em leucócitos totais do
sangue periférico (LTSP) foram analisados em 22 mulheres do grupo que
concluíram o tratamento de 3 meses com ácido lipoico e 17 mulheres que
receberam o placebo.
A Tabela 9 mostra a variação de expressão do mRNA dos genes RANK,
RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em LTSP tanto para o grupo placebo bem como para o grupo
tratado com ácido lipoico. Essa avaliação da expressão do mRNA foi realizada tanto
no período basal, quanto após os 3 meses do estudo.
TABELA 9 – Avaliação da expressão de mRNA dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-α
Placebo (17) Ácido Lipoico (22)
Antes Depois p Valor Antes Depois p Valor
RANK 0,97 ± 0,28 1,12 ± 0,43 0,0947 0,82 ± 0,29 1,18 ± 0,25b P<0.0001
RANKL 1,04 ± 0,27 1,29 ± 0,57a 0,0427 0,85 ± 0,10 0,82 ± 0,11a 0,0241
IL-6 1,01 ± 0,29 0,73 ± 0,36a 0,0031 1,16 ± 0,54 1,00 ± 0,27 0,1074
TNF-ɑ 1,17 ± 0,76 0,79 ± 0,37 0,0675 1,01 ± 0,36 1,10 ± 0,27 0,4136
NOTA: Número de indivíduos em parênteses. RANK: Receptor Ativador de NF-κB; RANKL: Ligante do Receptor Ativador de NF-κB; IL-6: Interleucina-6; TNF- ɑ: Fator de Necrose Tumoral-alfa. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão antes e depois tanto para o grupo Placebo quanto para grupo tratado com Ácido Lipoico, e comparados por: t de student,a e teste Mann-Whitney. .
Ao avaliar a expressão do mRNA do RANK, observou-se um aumento
significativo da expressão após o tratamento com ácido lipoico no período de três
meses, aumento este não observado no grupo placebo. Com relação ao RANKL,
esse mostrou aumento após três meses no grupo placebo, em contra partida o
grupo que recebeu o tratamento com ácido lipoico mostrou diminuição na expressão
deste gene. Com relação à expressão das citocinas IL-6 e TNF-ɑ, houve diminuição
na expressão destas no grupo placebo, entretanto o tratamento com ácido lipoico
não modificou a expressão de mRNA das citocinas estudadas.
Houve correlações positivas na expressão de mRNA entre os genes RANK e
RANKL (rp=0,958; p=0,000), RANKL e IL-6 (rp=0,689; p=0,003), IL-6 e RANK
(rp=0,498; p=0,049), RANK e TNF-ɑ (rp=0,832; p=0,000), TNF-ɑ e RANKL
(rp=0,875; p=0,001), TNF-ɑ e IL-6 (rp=0,653; p=0,006) quando avaliadas as
expressão de mRNA das mulheres que receberam o placebo após o período de três
meses. Quando avaliada a correlação entre a expressão de mRNA nas mulheres em
perimenopausa que foram submetidas ao tratamento com ácido lipoico, encontrou-
51 se uma correlação positiva entre os gene RANK e RANKL (rp=0,851; p=0,000),
RANKL e IL-6 (rp=0,770; p=0,000), IL-6 e RANK (rp=0,874; p=0,000), RANK e TNF-
ɑ (rp=0,653; p=0,0013), TNF-ɑ e RANKL (rp=0,747; p=0,0001), TNF-ɑ e IL-6
(rp=0,702; p=0,0003).
A análise da correlação entre os parâmetros bioquímicos e os valores da
expressão de mRNA basal dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ no grupo ácido
lipoico estão representados na Tabela 10. Observou-se correlações positivas entre a
expressão gênica basal de RANK e RANKL e a atividade da SOD (rp 0,593; p=0,005
e rp 0,698; p<0,001, respectivamente) e entre a expressão gênica basal do TNF-ɑ e
a atividade da GPx (rp 0,505; p=0,020).
TABELA 10 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em
LTSP e parâmetros pró e antioxidantes, antes do tratamento com Ácido Lipoico em
mulheres na perimenopausa.
PARÂMETROS RANK (22) RANKL (22) IL6 (22) TNF-ɑ (22) SOD U/g Hb rp 0,593 rp 0,698 rp 0,017 rp 0,123
p 0,005 p 0,000 p 0,941 p 0,596
GSH (mmol/L) rp 0,103 rp 0,332 rp -0,233 rp -0,171 p 0,655 p 0,141 p 0,309 p 0,459
SRAT (µmol/L) rp -0,149 rp -0,371 rp -0,043 rp -0,092 p 0,275 p 0,097 p 0,854 p 0,691
GPx U/g Hb rp 0,312 rp -0,092 rp 0,403 rp 0,505 p 0,169 p 0,691 p 0,070 p 0,020
Nota: Número de indivíduos em parênteses. SOD: superóxido dismutase; GSH: glutationa reduzida; SRAT, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; GPx: glutationa peroxidase. A significância da correlação foi calculada por coeficiente de correlação de Pearson (rp).
A análise da correlação entre os parâmetros bioquímicos e os valores da
expressão de mRNA dos genes RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ após o tratamento com
ácido lipoico estão representados na Tabela 11. Observou-se uma correlação
positiva entre a expressão gênica de RANK, RANKL e IL-6 e a atividade da SOD (rp
0,694; p=0,000; rp 0,577; p=0,007; rp 0,552; p=0,007, respectivamente) e uma
correlação negativa entre a expressão gênica de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ e a
atividade da GPx (rp -0,476; p=0,029; rp -0,628; p=0,002; rp -0,513; p=0,002; rp -
0,689; p=0,001, respectivamente).
52 TABELA 11 – Análise da correlação entre expressão de RANK, RANKL, IL-6 e TNF-ɑ em
LTSP e os parâmetros bioquímicos, após do tratamento com Ácido Lipoico em mulheres na
perimenopausa.
PARÂMETROS RANK (22) RANKL (22) IL6 (22) TNF-ɑ (22) SOD U/g Hb
rp 0,694 rp 0,577 rp 0,552 rp 0,386 p 0,000 p 0,007 p 0,007 p 0,093
GSH (mmol/L) rp 0,093 rp 0,299 rp 0,084 rp 0,133 p 0,687 p 0,187 p 0,187 p 0,565
SRAT (µmol/L) rp 0,017 rp -0,021 rp -0,035 rp 0,009 p 0,945 p 0,934 p 0,934 p 0,970
GPx U/g Hb rp -0,476 rp -0,628 rp -0,513 rp -0,689
p 0,029 p 0,002 p 0,002 p 0,001 Nota: Número de indivíduos em parênteses. FSH: hormônio folículos estimulante; LDL: lipoproteína de baixa densidade; HDL: lipoproteína de alta densidade; VLDL: lipoproteína de muito baixa densidade; IMC: índice de massa corporal; CC: circunferência da cintura; RCQ: relação cintura quadril;TGP/ALT: transaminase glutâmico pirúvica/alanina amino transferase; TGO/AST: trasaminase glutâmico pirúvica/aspartato amino transferase; GGT: gama glutamil transferase; SOD: superóxido dismutase; GSH: glutationa reduzida; SRAT, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; GPx: glutationa peroxidase. A significância da correlação foi calculada por coeficiente de correlação de Pearson (rp).
53 5 DISCUSSÃO
No presente trabalho, foram avaliados inicialmente os fatores envolvidos no
ganho de peso corporal, considerando que as mulheres estão vulneráveis a um
rápido ganho de peso em todo o período da menopausa. Nossos resultados
indicaram que 60-70% das mulheres apresentaram uma média de circunferência de
cintura acima da meta preconizada pela OMS (1998), CC < 80cm, indicando um
risco aumentado às complicações metabólicas. Alem disso, de 30-40% das
mulheres apresentaram a CC ≥ 88cm, o que indica um risco substancialmente
aumentado às complicações metabólicas. No que consiste a RCQ, em média as
mulheres apresentaram valores adequados aos preconizados pela OMS, (RCQ <
0,85), embora de 20-40% das mulheres estivessem com valores superiores à meta
da OMS. Por outro lado IMC das mulheres estudadas indicou que em media estas
apresentaram sobrepeso, embora cerca de 60% das mulheres apresentaram IMC
eutrófico e cerca de 40% apresentaram valores de IMC que indicavem sobrepeso ou
obesidade. Não foi observada nenhum correlação entre os índices antroométricoas
apresentados e as outras variáveis do estudo. Considerando que as mulheres do
presente estudo revelaram que não realizam atividade física, estas alterações de
peso tornam-se mais preocupantes principalmente para os estágios mais avancados
da menopausa. Esse dados corroboram Donato et al (2006) cujos resultados para
mulheres na perimenopausa indicaram excesso de peso, (IMC = 27,97±5,89), e para
a circunferência de cintura (85,61±12,53 cm) e relação cintura/quadril (0,83±0,07) os
valores foram semelhante aos encontrados em nosso estudo.
No que diz respeito à distribuição de gordura corporal em mulheres, tem sido
relatado que, em particular os estrogênios, parecem promover diminuição no
acúmulo de gordura corporal (glúteo-femoral), enquanto andrógenos têm sido
associados com um máximo de distribuição de gordura corporal. Entretanto na
transição menopausal há uma mudança na relação de andrógenos a estrógenos, a
produção estrogênica ovariana diminui progressivamente enquanto a produção de
andrógenos pelas adrenais continua, o que pode estar relacionado às alterações na
distribuição de gordura que ocorre neste momento. Considerando-se que nos
estágios iniciais de transição menopausal ainda existe produção de estrógeno estes
efeitos ainda são de menor impacto. O mecanismo para este efeito foi proposto por
Rebuffé-Scrive, Eldh e Hafstrom (1986), que mostraram alterações na atividade
lipase lipoprotéica em diferentes depósitos de gordura de mulheres pré-
54 menopausadas quando comparadas com mulheres pós-menopausadas.
Especificamente, após a menopausa, há diminuição na atividade lipase lipoprotéica
nos adipócitos femurais combinada com uma diminuição da responsividade lipolítica
dos adipócitos abdominais e mamários observada em mulheres na pré-menopausa,
ambos predispondo para o acúmulo de gordura corporal central e abdominal
(LOVEJOY, 2003).
Neste sentido, estudos realizados em mulheres menopausadas tem mostrado
que a atividade física está diminuída e que estas têm uma ligeira diminuição da
atividade metabólica de repouso (AMR). Esta diminuição da AMR pode ser devido a
uma diminuição de massa magra e perda do gasto energético durante a fase lútea, o
que contribuiria para um balanço energético positivo e conseqüente ganho de peso
em mulheres menopáusicas (MILEWICZ; JEDRZEJUK, 2007). O comportamento
alimentar desempenha também um importante papel no desenvolvimento da
obesidade na menopausa. Em um estudo longitudinal, realizado com mulheres
desde a pré até a pós-menopausa, mostrou a ingestão alimentar foi aumentada
como resultado da menopausa (POEHLMAN; TOTH; GARDNER, 1995).
Em relação à mulheres na fase da perimenopausa, os resultados presentes já
demonstram um ganho de peso corporal sugerindo que é nessa fase inicial que os
cuidados já devem ser iniciados para que a mulher possa chegar aos estágios de
menopausa e pós-menopausa com uma melhor qualidade de vida e sem as
complicações associadas a deficiência de estrógeno, entre eles o de
desenvolvimento de doenças cardiovasculares.
Em nosso estudo, além das alterações no perfil antropométrico das mulheres
na perimenopausa, foram observadas alterações no que diz respeito ao perfil
lipídico. Observou-se aumentos no colesterol total, LDL-c e triglicerídeos, onde cerca
de 70% das mulheres, independentemente do grupo, apresentaram valores
superiores à 200mg/dL de colesterol total e cerca de 50% das mulheres
apresentaram valores de LDL-c e triglicerídeos superiores à 130mg/dL e 150mg/dL,
respectivamente, não havendo alterações com relação ao tratamento com AL as
quais essas mulheres foram submetidas.
Embora a suplementação com AL não tenha promovido redução no perfil
lipídico no período estudado, é importante considerar que a suplementação com
uma substância antioxidante, como o ácido lipoico, poderia minimizar os efeitos
advindos do aumento da lipoproteína LDL, podendo diminuir a probabilidade da
mesma ser oxidada e por conseguinte promover a formação da placa de ateroma.
55
Em um estudo realizado em animais experimentais submetidos à
hipercolesterolemia, Amom et al. (2008), encontraram diminuição na concentração
de colesterol total e LDL após tratamento com AL, sugerindo que em condições mais
extremas o AL apresenta um efeito protetor.
Recentemente Graff-Iversen, Thelle e Hammar (2008), estudaram mulheres
em transição menopausal e demonstraram aumento concentração de colesterol e
triglicerideos superior a mulheres em pré-menopausa. Fukami et. al. (1995)
mostraram, em um estudo longitudinal com 7 anos de acompanhamento de
mulheres, que as mesmas apresentaram uma mudança na concentração dos lípides
séricos e lipoproteínas em função da menopausa. Os seus resultados indicaram um
aumento na concentração de colesterol total e de colesterol LDL. Segundo Welty
(2001), a menopausa está associada à elevação significativa na concentração do
colesterol, aumentando três vezes o risco cardiovascular na mulher. Neste sentido,
vários autores justificam que a perda da proteção relativa às doenças coronárias nas
mulheres na pós-menopausa ocorre devido às modificações no perfil lipídico,
conseqüência da deficiência estrogênica (STEFÁNSKA, et al. 2005, MATURAMA et
al. 2008).
Portanto o aumento na concentração de colesterol pode estar relacionada
com a diminuição estrogênica e ainda com o aumento na deposição de gordura na
região abdominal. Segundo relatos de Piché (2008) adipócitos do tecido adiposo
visceral são mais sensíveis a atividade lipolítica e mais resistentes a supressão da
lipólise pela insulina do que os adipócitos da região femural/gluteal. Em
contrapartida o tecido adiposo femoral/gluteal tem um baixo turnover de ácidos
graxos. Por esse motivo a região das coxas armazenam mais facilmente ácidos
graxos livres da circulação, protegendo outros órgãos como fígado, tecido
esquelético e pâncreas, do excesso de ácidos graxos livres. Em adição, o tecido
adiposo produz muitos peptídeos como IL-6, TNF-α, ativador do inibidor de
plasminogêneo-I (PAI-I), leptina e adiponectina, que exercem ação sobre o
metabolismo. As diferenças nas regiões de secreção potencialmente desses
peptídeos poderiam explicar os efeitos diretos e opostos desses depósitos de tecido
adiposo sobre o perfil lipídico.
Um fator importante a ser considerado é que o aumento na concentração de
lipídeos circulantes pode contribuir para o desenvolvimento da osteoporose. Nesse
sentido, os lípides oxidados poderiam atuar como inibidores da atividade e
diferenciação dos osteoblastos, além de induzirem a expressão endotelial de fatores
56 quimiotáticos de monócitos e M-CSF, que são potentes indutores da diferenciação
de células da linhagem osteoclástica (TANKÓ et al., 2005). Dessa forma, o aumento
de colesterol e triglicerídeos, também observados em nossos resultados,
representam fatores de risco que poderiam estar associado à perda óssea através
da inibição da formação óssea e da ativação da reabsorção. Vale ressaltar que em
nosso estudo não encontramos correlação entre os lipídeos circulantes com os
marcadores ósseos, provavelmente pelo fato desses últimos não terem apresentado
alteração na sua concentração.
Em nosso estudo foram estudados alguns marcadores do perfil ósseo e
constatou-se que não houve variação nos grupos. O presente estudo é composto de
mulheres entre 40 e 60 anos em fase de perimenopausa, período este onde não
haveria um comprometimento total da função ovariana, e dessa forma não havendo
uma deficiência estrogênica total. Portanto, considerando-se que no estágio de
perimenopausa as mulheres podem apresentar estrógeno circulante, o qual oferece
um efeito protetor quanto à perda de massa óssea, provavelmente este efeito
protetor, mesmo que reduzido, estaria ainda sendo suficiente a ponto de não ser
detectado qualquer nível de perda óssea, e que pudesse ser indicada por
marcadores circulantes.
Estudos tem mostrado que mesmo com elevação do FSH, como apresentado
no nosso estudo, as mulheres em perimenopausa ainda apresentam concentrações
significativas de estradiol (EBERLING et al. 1996; LUKACS et al. 2000). Associado a
isso, o excesso de tecido adiposo pode servir como local de síntese de estradiol.
Dessa forma, o estradiol ainda presente na circulação pode servir como defesa
frente uma diminuição da massa óssea (FINKELSTEIN et al .2008). Além disso,
resultados de densitometria óssea de algumas das participantes do presente estudo
indicaram que as mesmas não apresentavam comprometimento da DMO (resultado
não mostrados). Considerando que os indicadores clínicos do metabolismo ósseo
tambem não estão alterados, é possível sugerir que nesta fase de perimenopausa
as mulheres não apresentam um processo de perda óssea avançado.
No presente trabalho a resposta de redução da atividade da GPx pela
suplementação com AL, bem como de manutenção da atividade da SOD, poderia
ser uma resposta antioxidante direta deste agente considerado potente e
provavelmente suficiente nos estágios iniciais da transição menopausal. Deve ser
lembrado que a atividade da SOD aumentou no grupo placebo.
57
Esta resposta envolveria uma ação antioxidante direta do AL na H2O2 que
uma vez destruída pelo AL não levaria ao aumento da atividade da GPx e da SOD,
que por sua vez tem a função de controlar a atividade osteoclastica. Alem disso,
como no estagio da perimenopausa ainda existe estrógeno circulante e a presença
de H2O2 ainda não é exarcebada, o AL atuaria de forma eficiente. Estudos
relacionados com a expressão de mRNA da GPx e da SOD, bem como dos demais
parâmetros antioxidantes, poderão esclarecer mais a etse respeito.
Resultados de vários estudos utilizando animais revelaram que a
diferenciação e função dos osteoclastos são estimuladas pelas ERO’s,
particularmente o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o anion superóxido (GARRETT et
al 1990; LEAN et al. 2003; LEAN et al. 2005; BAI et al. 2004; MUTHUSAMI et al.
2005). Os osteoclastos expressam NADPAH oxidase e geram uma grande
quantidade e ERO’s durante a reabsorção óssea (STEINBECK et al. 1994).
Muthusami et al. (2005) mostraram que os níveis de peroxidação lipídica e H2O2
estavam aumentados e as enzimas antioxidantes como SOD, GPx e glutationa S-
transferase estavam diminuídas em ratos ooforectomizados quando comparados
com ratos controle e assume que o H2O2 foi essencial na diferenciação
osteoclásticas. Similarmente, Lane et al. (2003) encontraram que a ooforectomia
causa diminuição nos níveis de glutationa e tioredoxin e atividade das enzimas
glutationa e tioredoxin redutase em roedores. Mais ainda, eles mostraram que esses
antioxidantes e suas enzimas regenerativas foi rapidamente normalizado por uma
simples dose de 17-β- estradiol e antioxidantres (NAC e ascorbato) os quais
preveniram a perda óssea pela deficiência estrogênica.
Em outro estudo recente, um grupo mostrou que a expressão de GPx, a
enzima responsável pela maior depleção de H2O2 intracelular, estava aumentada em
osteoclastos quando comparados com macrófagos e novamente a atividade
enzimática foi aumentada pela administração de 17-β-estradiol. A deficiência
estrogênica também tem sido associada com a diminuição das defesas
antioxidantes tióis em células ósseas e induz a expressão de TNF-ɑ, o qual tem um
papel importante na perda óssea (LEAN et al. 2005; JAGGER et al. 2005).
Associada a isso um recente estudo publicado promoveu evidências do papel das
ERO’s na diferenciação osteoclástica através da regulação pelo NF-κB (KIM et al
2006).
Apesar do grande de estudos realizados em animais ou em cultura de células,
estudos in vivo em humanos avaliando o papel do estresse oxidativo ou sistemas
58 antioxidantes na osteoporose são escassos. Melhus et al. (1999) investigaram o
papel das vitaminas antioxidantes no desenvolvimento de fraturas em fumantes.
Eles concluíram que uma diminuição na ingestão de vitaminas E e C aumenta o
risco relativo no desenvolvimento de fraturas em quase 5 vezes depois do ajuste
pela idade, peso e outros fatores de risco osteoporóticos e uma mais adequada
ingestão dessas vitaminas parece ter um efeito protetor efeitos adversos do fumo.
Maggio et al. (2003) investigaram a possível interação entre antioxidantes e DMO
em um grupo de 75 mulheres idosas osteoporóticas e comparando-as com controles
não osteoporóticas. Os autores investigaram níveis plasmáticos de vitaminas C, E e
A ácido úrico e MDA além da atividade eritrocitária e plasmática de SOD e a
plasmática de GPx. O grupo osteoporótico apresentou uma redução significativa nos
níveis das vitaminas, e atividade de SOD e GPx, entretanto não foi encontrada
nenhuma diferença nos níveis de MDA entre o grupo com osteoporose e o controle.
Eles também relataram que as vitaminas A e C e a atividade da GPx estavam
positivamente correlacionados com a DMO femural nas mulheres com osteoporose.
Wolf et al. (2005) mostraram que não houve nenhuma associação entre ingestão ou
concentração sérica antioxidante e a DMO em mulheres participantes de um grande
estudo transversal.
No presente trabalho foram encontradas concentrações de GSH em sangue
total que variaram de 0,75 a 0,79mmol/L, não havendo diferenças entre as mulheres
do grupo placebo e tratadas com AL. Com relação às SRAT’s foram encontrados
valores que variaram de 2,73 a 3,88µmol/L, os quais não apresentaram diferenças
entre os grupos estudados.
A glutationa reduzida tem sido amplamente reconhecida como uma
importante molécula antioxidante intracelular. Lang et al. (2002) observaram que
níveis de GSH em sangue total, estão relacionados com o bem estar físico,
independente da idade, e ainda ele detectou que o bem-estar de mulheres
saudáveis com 60 anos de idade pode ser previsto pela concentração de GSH.
Maggio et. al (2003) encontraram valores de malonildialdeído (MDA)
plasmático muito próximos aos encontrados no nosso estudo, onde em seu estudo
não houve diferença entre pacientes com osteoporose e seus respectivos controles.
Entretanto, os autores observaram uma diminuição das defesas antioxidantes,
através da redução da atividade da GPx e SOD em pacientes osteoporóticos quando
comparados com controles.
59
Resultados controversos têm sido encontrados na literatura, onde
Karolkiewicz et. al. (2008), estudando mulheres pós-menopausadas encontraram
valores de SRAT’s semelhantes aos mostrados no presente estudo. Entretanto
Unfer et. al (2006) encontraram valores superiores aos encontrados em nosso
estudo, estudando mulheres em pré e pós-menopausa, todavia, não existiram
diferenças entre os grupos estudados. Nossos resultados mostram que não houve
alterações no conteúdo de GSH, nas mulheres perimenopausadas quando as
mesmas foram submetidas à suplementação com AL. O fato de não haver essa
alteração pode ser devido ao AL ter sido consumido mantendo o GSH livre na
circulação.
Dessa forma quando analisados os dados de forma conjunta, podemos notar
que a não alteração nas concentrações de SRAT’s e GSH pode ter ocorrido pelo
fato das mulheres na perimenopausa ainda estarem produzindo estrógeno, mesmo
que em pequenas quantidades, e esse estrógeno estaria ainda atuando como
protetor antioxidante. Com relação a GPx e a SOD, marcadores de estresse mais
precoce e mais sensíveis, a manutenção de suas atividades e até mesmo a
diminuição, pelo AL sugere que este antioxidante poderá estar promovendo um
controle de possíveis ERO’s já presentes não sendo necessária a resposta de
aumento na atividade dessas enzimas. Este comportamento sugere que o controle
das ERO’s pelo AL estaria sendo determinante para o controle da diferenciação e
função dos osteoclastos, retardando assim o processo de perda óssea associada à
deficiência inicial de estrógeno (Figura 4). Consequentemente, estes resultados
suportam a ausência de mudança do perfil ósseo e da DMO das mulheres em
perimenopausa suplementadas com AL. Adicionalmente, alguns estudos tem
mostrado que o ácido lipoico, como um antioxidante potente, tem um potencial
terapêutico nas doenças ósseas erosivas (KIM et al. 2006).
60
FIGURA 4 Representação da ação do Ácido Lipoico sobre a produção de ERO’s com possível ação
sobre o metabolismo ósseo.
O aumento anormal na diferenciação osteoclástica é o principal fator
associado na erosão óssea patológica associada com a osteoporose e doença
inflamatória. Baseado em evidências sobre a produção de ERO’s em condições
inflamatórias e associação das ERO’s na osteoporose (MAGGIO et al. 2003; LEAN
et al. 2003), a diferenciação osteoclástica pode requerer a intermediação das ERO’s
e que a reabsorção óssea in vivo poderia ser controlada pelo uso de antioxidantes.
Tem sido relatado que agentes antioxidantes usados na clínica como AL tem um
potencial bloqueio na diferenciação osteoclástica induzida por RANKL (KOH et al.
2005). No nosso estudo encontramos diminuição na expressão de mRNA de RANKL
quando as mulheres foram suplementadas com ácido lipoico, o que mostra que
mesmo no quadro de perimenopausa, onde não se observa um comprometimento
acentuado do tecido ósseo, a suplementação antioxidante promoveu uma defesa
frente a um possível inicio na reabsorção óssea, o qual seria observado apenas em
quadros mais avançados de deficiência estrogênica. A redução da expressão de
RANKL associada à redução da atividade da GPx e manutenção do perfil ósseo,
sugere que o antioxidante AL estaria suportando um controle de possíveis ERO’s
presentes, não desencadeando assim nesta fase de perimenopausa uma ativação
de osteoclastos e o processo de perda óssea. Entretanto, considerando que o AL
revelou uma ação de proteção a perda óssea, a resposta do RANK poderia estar
relacionada não aos osteoclastos e sim as demais células que o expressam como
nas células dendríticas, endoteliais, fibroblastos, linfócitos T e B.
61
No estudo realizado in vitro, Kim et al. (2006) os autores mostraram que
células precursoras osteoclásticas, tratadas com RANKL, apresentaram um aumento
na produção ERO’s de maneira dependente de NADPH oxidase. Similarmente, as
ERO’s mediaram sinais de transdução intracelulares para o RANKL. E ainda eles
mostraram que o AL bloqueou a indução do RANKL pelas ERO’s e atenuaram a
ativação do NF-κB em precursores osteoclásticos. A associação das ERO’s na
sinalização do RANKL também tem sido associada com a ativação de osteoclastos
maduros diferenciados (HA et al. 2004). Isso demonstra que a participação das
ERO’s na ativação do NF-κB descrito para outros tipos celulares e outras condições
de estimulação (DROGE et al. 2002; SCHRECK et al. 1991) também é demonstrada
em células precursoras osteoclásticas em resposta ao estímulo osteoclastogênico.
Resultados anteriores mostraram que a presença NF-κB na diferenciação
osteoclástica (IOTSOVA et al. 1997) suporta a importância do papel das ERO’s na
ativação do NF-κB na osteoclastogênese.
Em outro estudo realizado com cultura de osteoclastos, Mendez-Dávila et al.
(2004), concluíram que o efeito do estrógeno sobre o metabolismo ósseo não seria
por ação sobre a IL-6, uma vez que não foi visto aumento na expressão de mRNA
dessa interleucina quando a cultura foi incubada com estrógeno. Outro estudo
realizado em animais, mostrou que um agonista estrogênico diminuiu a expressão
de mRNA de TNF-α, o que sugere uma ação protetora do estrógeno pelo bloqueio
da ativação do NF-κB (KANG et al. 2005). Um outro achado importante foi no
trabalho de Seck et al. (2002). onde não encontraram diferença na expressão de
mRNA de IL-6 em biopsias ósseas de mulheres em pré e pós-menopausa os
mesmos não encontraram correlação entre a expressão da citocina no tecido ósseo
e sua concentração sérica. O autor sugere que o aumento do receptor solúvel para
IL-6 teria um efeito protetor na menopausa, uma vez que o mesmo iria impedir que a
citocina se ligasse ao seu receptor no tecido ósseo.
Novamente, o fato das mulheres do nosso estudo estarem no período de
perimenopausa, fase essa que ainda se tem uma produção de estrógeno poderia
estar relacionado a ausência de alterações. Entretanto a redução na expressão de
mRNA de RANKL, principal fator desencadeador da diferenciação e ativação
osteoclásticas, torna-se representativa em um estagio menopausal considerado
inicial e de poucas alterações frente a reduções ainda menores de estrógeno.
Demonstra ainda que para estágios mais avançados da menopausa, cuja deficiência
de estrógeno já encontra-se instalada, o AL poderá ter efeito benéficos e
62 importantes para o combate a presença de ERO’s e consequentemente ao processo
de osteoporose. Entretanto, é importante ressaltar que a suplementação seja
realizada em estágios que antecedam os estágios iniciais da transição menopausal.
Em conclusão, as alterações significativas encontradas para o perfil lipídico e
antropométrico de mulheres na perimenopausa, parecem já ser um reflexo das
alterações hormonais iniciais neste estagio, sendo portanto as primeiras a serem
notadas. Entretanto, como discutido anteriormente, tanto as alterações no perfil
lipídico quanto na composição corporal podem refletir no metabolismo ósseo e no
perfil oxidativo, levando progressivamente a complicações precoces como
cardiovascular e óssea. Um outro ponto muito importante mostrado no presente
trabalho é o fato de que a suplementação com ácido lipoico revelou minimizar as
possíveis alterações nas mulheres em perimenopausa, uma vez que marcadores
precoces como a atividade da SOD não mostrou-se elevada como observado para
as mulheres que receberam placebo, e mesmo a atividade da GPx e da expressão
do mRNA do RANKL foram reduzidas (Figura 5).
FIGURA 5 – Esquema mostrando alterações provocadas pela perimenopausa associada à possível ação do ácido lipoico sobre a produção de ERO’s.
Finalmente, o tratamento com ácido lipoico, como terapia auxiliar, se mostra
como uma importante alternativa para mulheres que estão em transição
menopausal, e mesmo ainda em estágio de pós-menopausa, podendo representar
uma importante ferramenta em função do seu efeito protetor contra as doenças
associadas à deficiência de estrógeno.
63
6 CONCLUSÕES
- A elevação da concentração de FSH das pacientes, associada as irregularidades
menstruais, indica um início de falência ovariana, característico de um período de
transição menopausal;
- A associação dos parâmetros antropométricos com o perfil lipídico alterado indica
que alterações no metabolismo dos lipídeos já tem inicio na fase de perimenopausa,
se mostrando como a primeira alteração detectada;
- A redução na atividade enzimantica da GPx e da expressão gênica do RANKL
após o tratamento com ácido lipoico, sugere que este antioxidante apresentou um
efeito de controle sobre a presenca de EROs, e conseqüente efeito protetor sobre a
reabsorção óssea na fase de perimenopausa;
- O tratamento com ácido lipoico indicou que este antioxidante pode ser uma
alternativa auxiliar e benéfica para mulheres na perimenopausa, abrindo ainda
perspectivas para o tratamento em fases mais avançadas de deficiência estrogênica
como na pós-menopausa.
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85
APÊNDICE A – FICHA CLÍNICA DE TRIAGEM
Ficha Clínica de Triagem Nº _______ Data: __/__/__
PARTE I - IDENTIFICAÇÃO (a ser preenchida apenas na primeira consulta)
Nome:_________________________________________________Prontuário:_______
Endereço:______________________________________________________________
Ponto de Referência: _____________________________________________________
Telefone para contato_______________________ ACS da área: _________________
Data de Nascimento:___/___/19___ Idade: ___anos (40 a 55 anos)
Profissão: (0) do lar (1) trabalha fora_______________________________
Situação conjugal: (0) Casada ou União Estável; (1) Solteira, Separada ou Viúva
Você tem parceiro fixo? (0) Sim; (1) Não. Número atual de parceiros: _________
Tempo de vida conjugal com atual parceiro (meses ou anos):______________________
Escolaridade: ( ) Sem Escolaridade ( ) 1ºGrau incompleto ( ) 1ºGrau completo
( ) 2ºGrau incompleto ( ) 2ºGrau completo ( ) Nível superior
Anos de estudo completos: ______ anos
Renda familiar mensal: R$ _______ Número de pessoas da família: ______
PARTE II – DADOS RELEVANTES
2.1 – Menstruação: ( ) Normal ( ) Irregular – Há quanto tempo(meses)?_________
( ) Menopausa – Há quanto tempo(meses)? ___________________________________
2.2 – Fumante: ( ) S ( ) N – Nº de cigarros/dia:_______________________________
2.3 – Uso de Medicações Hormonais nas últimas 8 semanas: ( )S ( ) N – Qual?
_____________________________________________________________________
Índice Menopáusico de Blatt e Kupperman: SINTOMAS Peso Escore obtido Ondas de Calor 4 Parestesia 2 Insônia 2 Nervosismo 2 Depressão 1 Vertigens 1 Fadiga 1 Artralgia/Mialgia 1 Cefaléia 1 Palpitação 1 Zumbido 1
86 Índice Menopáusico ----- Escore dos sintomas: Ausentes( 0) Leves(1) Moderados(2) Intensos(3) Exame Físico Geral:
Peso: ___________ Altura: ________IMC:_______CA: _______PA:________________
OBS.:Critérios importantes para triagem: 1) Idade: entre 40 e 55 anos de idade; 2)
Irregularidade Menstrual nos últimos 06 meses e/ou parada da menstruação há até 12 meses;
3) Índice Menopáusico de Blatt e Kupperman maior ou igual a 14.
Consulta para avaliação com ginecologista do projeto marcada para ___/___/___ às ____ Local:
______________________________
Ficha de Investigação do Conhecimento sobre Climatério/Menopausa/TH
1 – Conhece o significado dos termos “Perimenopausa” e/ou “Climatério”?
( )Conhece bem ( ) Conhece parcialmente ( ) Não conhece
Tem interesse em conhecer? ( )S ( )N
2 – Conhece o significado do termo “ Menopausa”?
( )Conhece Bem ( ) Conhece parcialmente ( )Não Conhece
Tem interesse em conhecer? ( )S ( )N
3 – Conhece o significado do termo “TH”?
( ) Conhece bem ( )Conhece parcialmente ( ) Não conhece
Tem interesse em conhecer? ( )S ( )N
4 – As informações sobre Perimenopausa, Menopausa, TH foram obtidas com/no(a):
( ) Ginecologista ( ) Outros profissionais da saúde ( )TV ( )Rádios ( ) Internet
( )Publicações leigas ( )Publicações especializados
( )Outras fontes: ________________________________________
5 – Já utilizou TH para tratamento de sintomas climatéricos?
( )Nunca usou ( ) Sim – Tempo_______ Nome: _______________________________
Identifica benefícios: ( ) N( )S - Quais? _____________________________________
Parou o uso por: ( ) Decisão Médica ( ) Abandonou o tratamento
Motivo do abandono: ( ) Preço ( )Efeitos Indesejáveis_________________( ) Medo(
)Outros:_______________________________________________________
6 – Conhece Terapias Alternativas para Perimenopausa/Menopausa? ( )Não conhece
( )Conhece – Quais?___________________________________________________
7 – Já Utilizou alguma terapia alternativa para Perimenopausa/Menopausa? ( )N
( )S – Quais? ____________________________ Quem Prescreveu ou
Recomendou?_________________________________________________________
8 – Desejaria fazer algum tratamento para a Perimenopausa/Menopausa? ( ) N ( )S
Tem preferência por algum tratamento que já conhece? ( )N ( )S – Qual?__________
_____________________________________________________________________
87 APÊNDICE B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
ESCLARECIMENTOS Este é um convite para você participar da pesquisa “Suplementação com Ácido
Lipoico e Terapia Hormonal com Tibolona: Impacto sobre o estresse oxidativo e a
reabsorção óssea” que é coordenada pela professora doutora Maria das Graças Almeida e
conduzida clinicamente pela ginecologista Maria Socorro Medeiros de Morais.
Sua participação é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer
momento de continuar participando sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.
Esta pesquisa procura avaliar a influência de um medicamento (Tibolona), associada
ou não com um suplemento (Ácido Lipoico) para ajudar você melhorar sua qualidade de
vida.
Caso decida aceitar o convite, você será submetido(a) ao(s) seguinte(s)
procedimentos:
1- Exame ginecológico completo com colheita de preventivo, realização de
ultrassonografia transvaginal, avaliação da densidade mineral óssea, através da
densitometria óssea, exame de mamografia, além de responder um questionário sócio-
econômico e também uma ficha clínica ginecológica.
2- Em seguida será realizada uma coleta de 40mL de sangue por punção venosa à
vácuo para realização de vários exames para avaliação da saúde geral, além de alguns
exames específicos relacionados a pesquisa. O material genético também será obtido das
amostras de sangue e será armazenado no Laboratório de Biologia Molecular – LABIOMOL
do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Faculdade de Farmácia da
UFRN sob a responsabilidade da Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende, onde o RNA
será usado para avaliar a saúde do osso e o DNA será guardado para posteriores estudos.
Caso haja interesse de realizarmos futuras pesquisas entraremos em contato com você, e
somente com sua autorização e aprovação dos novos projetos no Comitê de Ética em
Pesquisa realizaremos os estudos.
As análises do seu RNA que podem estar relacionados a ocorrência de problemas
ósseos será realizada no Laboratório de Biologia Molecular Aplicado ao Diagnóstico –
LABMAD da Faculdade de Farmácia da USP em São Paulo sob responsabilidade do Porf
Tit. Mario Hiroyuki Hirata. As amostras de RNA serão enviadas ao responsável do estudo
para São Paulo para realização das análises genéticas relacionados ao projeto, sendo que a
mesma retornará ao local de armazenamento inicial na UFRN, ficando armazenada na USP
somente durante a realização das análises. Durante o período de permanência das
amostras em São Paulo a relização do procesamento, análise e armazenamento das
88 mesmas ficarão sob a responsabilidade do Prof Tit. Mario Hiroyuki Hirata. O transporte da
mesma será realizado por via aérea em condições ótimas de transporte para esse tipo de
amostra biológica, devidamente identificada.
3- Em seguida você será submetida a uma suplementação (ácido lipóico 600mg)
e/ou uso do medicamento (Tibolona 2,5 mg) durante 3 meses. Você poderá estar inserida
em um dos grupos seguintes: pacientes que receberão substância sem nenhum efeito,
pacientes que receberão comprimidos contendo medicamento, pacientes que receberão
cápsulas contendo suplemento alimentar ou pacientes que receberão cápsulas contendo
suplemento alimentar e o medicamento. Você só será informada sobre o que foi
administrado ao final da pesquisa. Após esse período, será realizada nova coleta de sangue
para a realização dos mesmos exames, repetido a Ultrassonografia Transvaginal, bem como
uma nova avaliação ginecológica através da ficha Clínica de Avaliação Ginecológica.
O risco a saúde será mínimo, por causa da coleta de sangue que pode formar uma
mancha roxa (hematoma) no local da picada da agulha além do risco do aparecimento de
reações adversas devido ao uso do medicamento e/ou suplementação. Riscos esses que
serão minimizados através de procedimentos de coleta cuidadosos, além do
acompanhamento das pacientes para que as reações adversas possam ser avaliadas e, se
necessário, a suspensão do uso do medicamento. Você responderá a algumas perguntas
sobre doenças existentes nas pessoas de sua família, hábitos alimentares e uso de
medicamentos. Além de você outras mulheres também participarão do estudo.
Ao participar dessa pesquisa você realizará uma avaliação da saúde geral e
ginecológica, e também fará exames que não são feitos pelo Sistema Único de Saúde
(SUS) e terá a oportunidade de participar de reuniões de educação em saúde.
Caso seja de seu interesse, entregarei todos os resultados dos exames laboratoriais
necessários sem qualquer custo, que são: hemograma completo, determinações de
concentrações séricas de colesterol total e frações, triglicérides, glicemia de jejum,
transaminases hepáticas (ALT e AST), gama-glutamil transferase (GGT), fosfatase alcalina,
fosfatase ácida tartarato-resistente, fósforo, magnésio, ferro, creatinina, uréia, proteínas
totais, albumina e proteína C-reativa, estradiol, osteocalcina, IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α.
Também disponibilizarei os resultados da análise dos demais exames da pesquisa. Você
não receberá qualquer pagamento por sua participação.
Em qualquer momento, se você tiver algum problema de saúde decorrente da
pesquisa, será garantido atendimento médico na instituição.
Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em
nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos
resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito
desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para Dra. Maria das Graças Almeida, no
89 endereço General Cordeiro de Faria, S/N; Petrópolis, Natal/RN ou pelo telefone 32154377.
Você também poderá tirar dúvidas com os demais pesquisadores envolvidos na pesquisa:
Adriana Augusto de Resende (Professora – tel: 88746161) Socorro de Medeiros Morais
(médica ginecologista – tel: 99816134) ou Francisco Paulo Freire Neto (bioquímico – tel:
94012147).
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os
riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa
“Suplementação com Ácido Lipoico e Terapia Hormonal com Tibolona: Impacto sobre
o estresse oxidativo e a reabsorção óssea”.
Foram garantidos esclarecimentos sobre a pesquisa e o direito de desistir da
participação dela em qualquer momento, sem que essa desistência implique em qualquer
prejuízo a minha pessoa ou de minha família, além do anonimato e o sigilo dos dados
referentes à minha identificação.
Participante da pesquisa: ___________________________________________
Assinatura:_______________________________________________________
COMPROMISSO DO INVESTIGADOR
Eu discuti as questões acima apresentadas com os responsáveis dos participantes.
É de minha opinião que o indivíduo entende os riscos, benefícios e obrigações relacionadas
a este projeto.
Pesquisador Responsável
90
APÊNDICE C – FICHA CLÍNICA DE AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA
Parte 1 - IDENTIFICAÇÃO: Data: ____/____/_____ Ficha Triagem nº: _________ Nome: ______________________________________________Data Nasc:____/___/___ PARTE 2 - INVENTÁRIO GINECOLÓGICO/OBSTÉTRICO Menarca : ____ anos Gesta:______ Para:______ Abortos______ Ciclos menstruais: ____/____ ( )Normal ( )Irregular, há________ DUM:___/___/___ (há menos de 12 meses?) Método Anticoncepcional: _______________________(se pílula e há menos de 8 semanas, excluída) Já fez TH? ( ) Nunca; ( ) Estou usando atualmente(Excluída); ( )Já usei há mais de 8 semanas PARTE 3 – DOENÇAS ASSOCIADAS • Hipertensão arterial: (0 ) Não; ( 1 ) Sim – Qual medicamento? __________________ • Diabetes tipo 2: ( 0 ) Não; (1 ) Sim – Qual medicamento? ______________________ • Dislipidemia: (0 ) Não; (1 ) Sim – Medicamento? ____________________________ • Osteoporose: (0) Não; (1) Sim – Medicamento? _____________________________ Critérios de exclusão (*se presente qualquer um desses estiver presente, circule e exclua a paciente): distúrbios tromboembólicos, IAM, AVC, neoplasia estrógeno-dependente, tireopatia, sangramento genital, doença hepática, má absorção, IRC, hepatopatia, distúrbios da coagulação, uso de drogas que sabidamente interfiram na avaliação do sistema hemostático (antiinflamatórios, etc) uso de drogas que interferem com densidade mineral óssea
PARTE 4 – HÁBITOS DE VIDA Tabagismo: (0) Nunca fumou (1 ) Fumante atual – Quantos cig/dia?____ (2) Ex-fumante OBS: Fumantes são pessoas que fizeram uso de mais de três cigarros por dia por mais de seis meses até o momento da pesquisa, e ex-fumantes são aqueles que não fumam mais, porém já fumaram em algum momento da vida por um período > seis meses
Você ingere bebida alcoólica? (0 ) Não (1 ) Sim Freqüência por mês:_______vezes Você pratica exercícios físicos regularmente ? (0 ) Não (1) Sim Qual ____________ Freqüência por semana: ______ vezes OBS: atividade física regular é caracterizada como três ou mais vezes por semana (40 minutos/vez)
PARTE 5 – Exames de rastreamento • Citologia cérvico-vaginal:
- Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim - Atualizada (<1 ano)? (0) Não (1) Sim – Resultado________________ (Se NÃO, agendar ou encaminhar para realização de preventivo)
• Mamografia: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim Atualizada (< 1 a 2 anos)? (0) Não (1) Sim - Resultado(Birads) ________________________ (se houver lesão – EXCLUÍDA)
• Ultra-sonografia transvaginal: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim - Atualizada (< 1 a 2 anos)? (0) Não (1) Sim Espessura endometrial_______________
• Densitometria óssea: - Já realizou alguma vez na vida: (0) Não (1) Sim Atualizada (últimos 2 anos)?
(0) Não (1) Sim, resultado
91
DADOS ANTROPOMÉTRICOS
DADOS ANTROPOMÉTRICOS – Triagem (____/____/_____)
Peso: _____Kg; Estatura: ______ m;
PA: 1a Medição _____ x _____ mmHg 2a Medição: _____x_____mmHg
Circunferência da cintura: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
Circunferência do quadril: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
OBS: Para medir o perímetro da cintura, a fita métrica deve ser posicionada na menor curvatura localizada entre as costelas e a crista ilíaca. Para aferição do perímetro do quadril, a fita métrica deve ser posicionada na área de maior protuberância glútea.
Circunferência muscular do braço (CMB): _____ cm
DADOS ANTROPOMÉTRICOS – 4 semanas (____/____/_____)
Peso: _____Kg; Estatura: ______ m;
PA: 1a Medição _____ x _____ mmHg 2a Medição: _____x_____mmHg
Circunferência da cintura: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
Circunferência do quadril: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
OBS: Para medir o perímetro da cintura, a fita métrica deve ser posicionada na menor curvatura localizada entre as costelas e a crista ilíaca. Para aferição do perímetro do quadril, a fita métrica deve ser posicionada na área de maior protuberância glútea.
Circunferência muscular do braço (CMB): _____ cm
DADOS ANTROPOMÉTRICOS – 8 semanas (____/____/_____)
Peso: _____Kg; Estatura: ______ m;
PA: 1a Medição _____ x _____ mmHg 2a Medição: _____x_____mmHg
Circunferência da cintura: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
Circunferência do quadril: 1a medição= _____ cm; 2a medição= _____ cm
OBS: Para medir o perímetro da cintura, a fita métrica deve ser posicionada na menor curvatura localizada entre as costelas e a crista ilíaca. Para aferição do perímetro do quadril, a fita métrica deve ser posicionada na área de maior protuberância glútea.
Circunferência muscular do braço (CMB): _____ cm
92 AVALIAÇÃO DOS SINAIS E SINTOMAS DA MENOPAUSA A – Inventário de sintomas relacionados ao climatério -Apresenta ondas de calor?
(0 ) Não (1 ) Sim, mas que não interferem em minha qualidade de vida (2 ) Sim, e que atrapalham significativamente minha qualidade de vida # Como você classifica a intensidade de seus sintomas, de acordo com a seguinte escala de intensidade?
0 ausência de
sintomas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 intensidade
máxima
-Apresenta secura vaginal?
(0 ) Não (1 ) Sim, mas que não interferem em minha qualidade de vida (2 ) Sim, e que atrapalham significativamente minha qualidade de vida # Como você classifica a intensidade de seus sintomas, de acordo com a seguinte escala de intensidade?
0 ausência de
sintomas
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 intensidade
máxima
B – Índice menopausal de Kupperman e Blatt.
SINTOMAS
ESCORES
AUSENTE
(0)
LEVES
(1)
MODERADOS
(2)
INTENSOS
(3)
PESOS RESULTADO
PARCIAL
Ondas de calor 4
Parestesia 2
Insônia 2
Nervosismo 2
Depressão 1
Vertigens 1
Fadiga 1
Artralgia/mialgia 1
Cefaléia 1
Palpitações 1
Zumbido 1
Total
Índice menopáusico:
93 AVALIAÇÃO DOS SINAIS E SINTOMAS DA MENOPAUSA – Escala climatérica de Greene.
SINTOMAS
ESCORE
NUNCA
(0)
LEVE
(1)
MODERADO
(2)
INTENSO
(3)
ESCORE
(0 - 3)
1. Coração batendo rápido ou fortemente
2. Sentindo tensão ou nervosismo
3. Dificuldade para dormir
4. Excitabilidade
5. Ataques de pânico
6. Dificuldade de concentração
7. Sentindo cansaço ou falta de energia
8. Perda de interesse em muitas coisas
9. Sentindo-se infeliz ou deprimida
10. Crises de choro
11. Irritabilidade
12. Sentindo tonturas
13. Pressão ou peso na cabeça ou corpo
14. Formigamento em partes do corpo
15. Dores de cabeça
16. Dores nos músculos e juntas
17. Perda de sensibilidade nas mãos ou
pés
18. Dificuldade para respirar
19. Ondas de calor
20. Suores noturnos
21. Perda de interesse sexual
Psicológicos (1-11) = Ansiedade (1- 6) = Depressão (7-11) = Somáticos (12-18) = Vasomotores (19-20) = Sexual (21) =
94 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE VIDA A - Utian QOL - Menopausa
Utian Quality of Life – Menopausa
Por gentileza, avalie o grau com que você concorda com as seguintes afirmações, conforme elas se aplicam a você no último mês. Circule sua resposta usando a tabela abaixo:
1 2 3 4 5
Muito Falso Falso Moderadamente verdadeiro Verdadeiro Muito verdadeiro
Por favor responda todas as questões:
1 Sou capaz de controlar coisas na minha vida que são importantes para mim.
1 2 3 4 5
2 Eu me sinto motivada pelo meu trabalho. 1 2 3 4 5
3 Acredito que meu trabalho traz benefícios para a sociedade. 1 2 3 4 5
4 Eu não estou satisfeita com minha vida sexual. 5 4 3 2 5
5 Eu estou satisfeita com minha vida amorosa. 1 2 3 4 5
6 Tenho recebido reconhecimento pessoal na minha comunidade ou no meu trabalho.
1 2 3 4 5
7 Estou infeliz com minha aparência (física e estética). 5 4 3 2 1
8 A minha dieta não está equilibrada nutricionalmente. 5 4 3 2 1
9 Tenho controle sobre meus hábitos alimentares. 1 2 3 4 5
10 Eu pratico atividade física três ou mais vezes na semana,
rotineiramente. 1 2 3 4 5
11 Eu geralmente estou depressiva. 5 4 3 2 1
12 Eu tenho ansiedade freqüentemente. 5 4 3 2 1
13 Sinto que a maioria das coisas que acontecem comigo estão fora do meu controle.
5 4 3 2 1
14 Estou satisfeita com a freqüência de minhas relações sexuais. 1 2 3 4 5
15 Atualmente, eu sinto desconforto físico ou dor durante a relação sexual.
5 4 3 2 1
16 Acredito que não tenho controle sobre minha saúde física e corporal. 5 4 3 2 1
17 Tenho orgulho das minhas realizações profissionais 1 2 3 4 5
18 Considero minha vida estimulante. 1 2 3 4 5
19 Continuo a estabelecer novos objetivos pessoais para minha vida. 1 2 3 4 5
20 Tenho esperança de que coisas boas acontecerão na minha vida. 1 2 3 4 5
21 Eu me sinto fisicamente bem (saudável). 1 2 3 4 5
22 Eu me sinto em boa forma física. 1 2 3 4 5
23 Continuo a estabelecer novos objetivos profissionais para mim. 1 2 3 4 5
95 ANEXO 1 – CERTIFICADO FINAL DA AVALIAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ
DE ÉTICA EM PESQUISA DO HOSPITAL UNIVERSITÁRIO ONOFRE LOPES –
CEP-HUOL
97
ANEXO 3 – RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
RESUMOS SUBMETIDOS AO I SIMPÓSIO NACIONAL EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS BÁSICAS E APLICADAS: FRONTEIRAS DO CONHECIMENTO E
POLÍTICAS DE INOVAÇÃO
99
ANEXO 4 – VALORES DE REFERÊNCIA PARA AS DETERMINAÇÕES
BIOQUÍMICAS NO SANGUE
PARÂMETROS
VALOR DE REFERÊNCIA
Alanina aminotransferase (ALT) 30 –65U/L
Albumina 3,5 – 5,2 g/dL
Aspartato aminotransferase (AST) 15 –37U/L
Cálcio Ionizado (CaI) 4,6 – 5,3 mg/dL
Cálcio Total 8,6 – 10,2 mg/dL
Colesterol Desejável < 200 mg/dL
Limítrofe Alto – 200 – 239 mg/dL
Alto > 239 mg/dL
Creatinina Mulher – 0,6 - 1,1 mg/dL
Fosfatase alcalina Mulher 20-50 anos – 42 - 98 U/L
Fósforo 2,5 a 4,5 mg/dL
Gama Glutamil Transferase 05 –55U/L
Glicose 74 – 100 mg/dL
Hormônio Folículo Estimulante (FSH) Mulher
Fase Folicular – 1,4 – 9,9 mUI/dL
Pico no meio do ciclo – 0,2 – 17,2 mUI/mL
Fase Lútea – 1,1 – 9,2 mUI/mL
Pós-menopausa – 19,3 – 100,6 mUl/mL
LDL-c Ótimo < 100 mg/dL
Próximo/acima do ótimo – 100 - 129 mg/dL
Limítrofe alto – 130 – 159 mg/dL
Alto – 160 – 189 mg/dL
Muito Alto > 189 mg/dL
Magnésio 1,6 – 2,1 mg/dL
Proteínas totais 6,4 – 8,3 g/dL
Triglicerídeos Normal < 150 mg/dL
Alto – 150 – 199 mg/dL
Hitrigliceridemia - 200 – 499 mg/dL
Muito Alto > 499 mg/dL
Uréia 15 – 40 mg/dL
FONTE: BURTIS, 2008.