INFOKME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

NOMBRE TELEFONO 5797380 MATRICULA 90339687 LICENCIATURA m E N I E R I A DE LOS ALIMENTOS, UNIDAD

IZTAPALAPA, CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.

TRIMESTRE LECTIVO 94-P HORAS SEMANALES 20

P e - INFLUENCIA DE ALGUNOS FACTORES AMBIENTALES QUE

ENDOPOLIGALACTURONAS A DE Kliiyveromyces murxiuiiiis ". INTERVIENEN EN LA P R O D U C C I ~ N DE

ASESORES

M. en C. LORENA GOMEZ-RUIZ Profesor Titular A, Tiempo completo

ING. ALMA ELIZABETH CRUZ GUERRERO Profesor Asistente A, Tienipo coinpleto

LUGAR DE REALIZACION

FECHA DE INICIO 20 OCTUBRE 1993 FECHA TERMINO 20 ABRIL 1994 CLAVE IA.51 93 NOMBRE DEL PROYECTO

PLANTA 1'll.OTO DE CARNES Etlif "PP2" [JAM-I DIVISION C I3 S

OBTENCION DE ENZIMAS DE KIr~y~~crr~niyc~s ninrrinriris

ALUMNA

E L g A I&S GARCIA PEÑA

ASESORES

M.C. LORENA GOMEZ-RIJIZ ING ALMA E CRUZ GUERRERO

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA- IZTAPALAPA

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA México D.F. a 1 de Septiembre de 1994

'1

M. en C. Rosaura Grether González Directora de la División de C.B.S., U.A.M. lztapalapa Presente :

Por este conducto , nos permitimos comunicarle que la alumna ELVIA INES GARCIA PENA matrícula 90339687 de la Licenciatura Ingenieria de los Alimentos , cuyo trabajo de Servicio Social intitulado:

"Factores ambientales que intervienen en la producción de endopoligalacturonasa de Kltiywrotnyce~ ntarxiarrtis"

Debió postergar la fecha de entrega de su informe final de Servicio Social debido a que para cumplir con los objetivos de dicho proyecto se precisa del fkriiientador New Ilriiiiswick. I3ioflo Ilc, cl ciinl rcqttiriii dc compostura y inanteiiiniiento. Asimisiiio, durante el periodo de la huelga no fue posible la utilización de dicho equipo.

Agradeciendo su comprensión, nos suscribimos a sus ordenes y aprovechamos la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

ATENTAMENTE 4 Iny. Alma '. Cruz Guerrero

'4 686 03 2 2 IELEFAX IS) 686 89 99 TELEX UAMME 176498

Casa aberta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA México D.F. a 2 de Septiempre de 1994

M. en C. Rosaura Gretlier González Directora de la División de C.B.S., U.A.M. Iztapalapa Presente :

I '1,

Por medio de la presente, nos permitimos comunicarle que la alumna ELVIA INES GARCIA PENA matrícula 90339687 de la Licenciatura Ingeniena de los Alimentos , finalizó su trabajo de Servicio Social intitulado:

"Factores ambientales que intervienen en la producción de endopoligalacturonasa de Khyveroniyces rnarxiutrrts"

Anexamos el informe fina# del trabajo, Departamento de Biotechología, con el cual estamos completamente de acuerdo.

realizado en la Planta Piloto de Carnes del

Sin más por el momento nos suscribimos a sus ordenes y aprovecharnos la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

ATENTAMENTE

en C. Lorena Gómez-Ruiz

UNIOAO IZTAPALAPA Av Michoacaii y La Piiiisiiiia. Col Viceniiiia. Iziapalapa. U F C ,

/ Ing. Alda E. Cniz Guerrero

36-03-22 TELLFAX: 151 686-89-99 TELEX: UAMME 178496

\ TITIJLO.

INFLUENCIA DE ALGUNOS FACTORES AMBIENTALES QUE INTERVIENEN EN LA PRODUCCION DE ENDOPOLIGALACrURONASA

DE Klr~yi~erornyces ntarwiarrirs

JUSTIFICACION -

En este trabajo se pretende evaluar la influencia del oxígeno disuelto a diferentes Nveles as¡ como la influencia de la temperatura en la producción de endoyoligalacturonasa, debido a que en investigaciones previas se vió que estos son dos de los factores de regulación importantes Además resulta interesante llevar a cabo fermentaciones en las que se prueben estos factores en un fernientador con control riguroso de las condiciones, pues las pruebas de estos factores reyulatorios se Ilevaion a cabo en niatraces

Eii cuanto al nivel de oxígeno disuelto en el medio (U O ) Winboriie y Rickard reportaron en 1978 que se reprime la producción de la enzima a 60% de saturación, nias tarde se realizaróii (Garcia Garibay et al 1987) numerosos experimentos deterniinandose que la producción se inliibe en condiciones de 60% de saturación de oxígeno disuelto, sin embargo si se agrega pectina al medio la enzima se sintetiza en dichas condiciones, de esta Forma la cantidad de enzima producida se incrementa al disminuir la oxigenación del medio, mientras la bioinasa disminuye al disminuir la cantidad de oxígeno disuelto

Referente a la temperatura se tienen antecedentes de que hay un incremento en la producción de la enzima al elevar la temperatura, sin embargo debe comprobarse que ese incremento se deba a la temperatura y no a variaciones en la forma de disolución del oxígeno, ya que a mayor temperatura en el medio menor es la disolución del oxígeno en el mismo

INTRODUCCION:

'I

Las sustancias pécticas son un grupo de polisacándos complejos que provienen de organismos vegetales y contienen una alta proporción de unidades de ácido anhidrogalacturónico. Las enzimas pectinolíticas son clasificadas con base en el modo de ataque y su preferencia por la pectina o el pectato como sustrato .

La habilidad de degradar sustancias pécticas no es tan común en especies de levaduras como lo es en bacterias y hongos (Winborne y Rickard 1978). En 1951 Luh y Pliaff reportaron que Khyiwonryces nicrrximrris era capaz de producir endopoligalacturonasa, la enzima fue caracterizada como extracelular y constitutiva. Trabajos posteriores llevados a cabo por Winborne y Rickard 19'78 refieren la actividiid pectiiiolitica de In enzima como actividad p«ligiilacturoiiiisa (1%) de acuerdo it la clasilicacibn de Liili y I'liaIf(1,uli y 1'Ii:iIY 195 i ) y muestran que lii actividad es sólo pat-cialiiiente constitutiva, siendo SLI

coiiccntracihn por unidad celular al)roxiiiiad;iiiieiite el doble con la adición de pectiiia e11 el iiiedio como inductor y que adeiiias su produccióii se ve reprimida a altas concentraciones de oxígeno disuelto en el medio, es decir condiciones de aerobiosis; cuando el oxígeno disuelto en el medio fue de 60% de saturación no fue detectable la actividad. de poligalacturonasa en el sobrenadante obtenido de la centrifugación de la biomasa celular , En su trabajo Winborne y Rickard realizaron varias fermentaciones en medio gliicosado al 2% con una cepa de Klrryieronyce.~ niorxi~nrr.~ , a 30 "C, probandose la producción de la enzima I'ü a 60% de saturación de oxígeno disuelto (D.O.) en el medio y a O% de saturación de D.O., para obtener este último valor de saturación se reemplazo el aire existente en el medio por Nz y COI. Los resultados mostraron que cuando existe un nivel de 60% de D.O., la producción es repriniida pero no dcfinieroii a que concentración entre O y 60 % permanece la represión en la producción de la enzima, también se observó que al reemplazar el oxígeno por NI o COI se anulo el efecto de represión de la actividad pectinolítica lo cual revela que el oxígeno disuelto en el niedio es un paránietro significativo (Winborne y Kickard 1978).

Khyveronyces murxrmrr.~, organismo GKAS (Generally Recognized As safe for human consunition) ha sido utilizado para la producción de lactosa y de proteína unicelular a partir de suero Garcia Garibay et al 1987 deniostro que la levadura es capaz de sintetizar simultanemente endopoligalacturonasa, tal como lo reportaron Lull y Phaff ( 1 95 1,1954a y 1954b), haciendo niás atractivo el proceso de producción de proteína unicelular La endopoligalacturonasa puede ser recuperada del sobrenadante obtenido de la centrifugación de la biomasa celular, la enzima no requiere condiciones extrictas de purificación y puede ser usada para numerosas aplicaciones en alimentos como se pudo constatar en los experimentos donde se uso la enzima para la clarificación de jugo de manzana (Gómez Ruiz et al 1988) Esta misma enzima se ha empleado también en la

2

' I maceración de tejidos vegetales (Kobayashi y Matsuo 1979; Lim et al 1980; Voragen et al 1980) y en la estabilización de la turbidez del jugo de naranja (Krop y Pilnik 1974).

Posteriormente (Garcia Garibay et al 1987) se llevaron a cabo experimentos con la cepa CDBB-L-278, haciendola crecer en matraces a tres diferentes niveles de aereación (microaerobiosis, anaerobiosis y aerobiosis) para probar el efecto de la oxigenación en la sintesis de la enzima, de esta forma se corroboró que la actividad enzimatica es iniperceptible a niveles altos de aereación como lo reportaron Winborne y Rickard; obteniendo la maxima producción para niveles de aereación más pectina. En dicho trabajo se decidió comparar los parámetros de producción de la enzinia en el fernientador a condiciones extremas de aereacióii debido a que la rapidez de crecimiento de los microorganismos a gran escala en fernieiitadores esta limitada normalmente por la velocidad de transferencia de oxígeno, para este propósito se usaron condiciones de cultivo aerobias y anaerobias . No fué posible detectar actividad enziiiiática en la fermentación aeróbica y se pudo ver que la velocidad de crecimiento fue tres veces mayor en la fermentación aerobia que en la anaerobia y que la concentración celular fue siete veces mayor en la fermentación aerobia. Para estudiar el efecto de la pectina como inductor se adiciono 1% ,de pectina al medio, en condiciones aeróbicas la enzima fue claramente inducida por la pectina a pesar de las condiciones de alta aereación. La niáxima producción de la enzima se di6 en condiciones de aerobiosis en el medio adicionado con pectina, obteiiiéndose,un valor de 38 uPGllt-hr para dichas condiciones contra 10 uPG/It- Iir en condiciones de anaerobiosis sin adición de pectina; en cuanto a la producción de masa celular los resultados fueron comparables en la fermentación aeróbica con y sin pectina (Garcia Garibay 1987).

A lo largo de los estudios realizados por Espinosa et al 1992 se evaluaron cinco cepas de Kluyveroniyces marxianus para la producción simultánea de lactasa y pectinasa, inulinasa, la cepa NRRL-Y-1109 mostró una actividad lactasa superior, pero la cepa CDBB-L-278 produjo actividades de pectinasa e inulinasa notableiiiente altas en comparación con el resto de las cepas evaluadas. La cepa CDBB-L-278 fue seleccionada como la mejor para la producción siniultánea de las dos enziiiias (Espinosa et al 1992)

Recientemente se han realizado fermentaciones en matraces (Vivar et al 1991) para determinar las condiciones adecuadas en la producción de la enzima , se midieron rangos de pll y temperatura definiendo los valores nias favorables en cada caso ; para evaluar el efecto del pH inicial en el medio de cultivo se probó un rango de 3.5 a 6.5 , determinando que a pH 5 se obtenía la mayor actividad específica (actividad enzimáticd g biornasa). Con respecto a la temperatura se realizaron pruebas con un rango entre 30 y 45 "C obteniendo la mayor producción a 40 "C. El aumento en la producción de la enzima ,que se pudo observar al aumentar la temperatura podria deberse al cambio en la solubilidad del oxígeno como efecto de incrementar la temperatura.

3

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OBJETIVOS.-

Objetivo general:

Evaluar la influencia del oxígeno disuelto en el medio y de la temperatura en la sintesis de la endopoligalacturonasa de Khyiwniyces murxiutiics en un fermentador con control riguroso de dichos parámetros , ya que estos paránietros se definieron a través de varios estudios y experimentos realizados, como algunos de los mas significativos en la producción de la enzima.

Objetivos especificas.-

a , ) Evaluar el efecto del oxígeno disuelto en la producción de la enzima endopoligalacturoriasa de K/uyirro/ityce.s ttxirximus.

b.) endopoligalacturonasa.

Estudiar la capacidad inductora de algunas sustancias pécticas en la producción de

c.) Evaluar la influencia de la temperatura en la producción de pectinasa

4

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.

METODOLOG1A.-

' I

Microorganismo

El microorganismo usado fue Kiuyveroinyces rnutxiuiirrs cepa CDBB-L -278, de la colección del Departamento de Biotecnologia y Bioingenieria del CINVESTAV-IPN. El cual se conservó en medio sólido de papa dextrosa para su utilización posterior.

Medio de cultivo.

Se utilizó un medio de cultivo base, el cual estaba constituido por 0.1% de sulfato de ainonio (NH4)zSOa , 0.5% de fosfato dibásico de potasio KHIPO.~, 0.05% de sulfato de iiiagnesio (Mg)2SO4 , as¡ como de 0.2% de glucosa y extracto de lavadura 0.2%.

El pH del niedio se ajustó con ácido acético, hasta alcanzar un valor de 5. Para estudiar el efecto inductor de la pectina, ésta se adicionó al medio de cultivo en concentración de I%. Posteriormente el medio de cultivo se esterilizó a 121 "C, durante I5 min.

Condiciones de cultivo

Las fermentaciones se realizaron en u n ferinentador New Brunswick, Bioflo Ilc. El volume,n de trabajo file de un litro, la temperatura se mantuvo constante a 30 "C cuando se cvaluó el efecto del oxígcno disuelto en el medio y cuando se pi'obó el efecto de la temperatura se mantuvo constante el nivel de saturación de oxigeno disuelto en 60%, usando el medio cuya composición ya se describió y con un pH de 5 .

Efecto de 1 nivel de oxígeno disuelto en el medio

Para evaluar el efecto del oxígeno disuelto en el medio se probaron tres niveles de saturación 20%, 40% y 60%. en medio con glucosa y en medio con glucosa más pectina, manteniendo una temperatura de 30 "C en los tres casos, la fermentación tuvo una duración de 24 horas tomando muestras del niedio de cultivo cada dos horas.

Se llevaron a cabo dos fermentaciones para cada nivel de oxígeno mencionado y los análisis de cada una de las fermentaciones fueron realizados por duplicado, tanto para la actividad enzimática como para la bioiiiasa celular.

5

Efecto de la temperatura.

Para determinar la influencia de la temperatura en la producción de la enzima se llevaron a cabo fermentaciones por duplicado en el medio ya mencionado con glucosa y con glucosa más pectina, probando la producción tanto enumática como celular a 30,35,40 y 45 "C, todas las fermentaciones que conciernen a temperatura se realizaron a 60% de saturación de oxígeno disuelto en el medio. Por medio de la evaluación de todos los niveles de oxígeno disuelto y temperatura con y sin pectina, se pudo evaluar el efecto inductor de

' I ésta última .

Concentración celular.

La biomasa se midió por turbiedad, cuyos valores se obtuvieron en un espectofotómetro Sliimatzuu V IGOA a 650 nni. los valores de absorbancia se compararon con una curva pairbit de bioiiiasn scca cxpresadn eii gramos de bioniasa seca / iid.

Actividad enzitnatica

La actividad pectinolítica se midió de manera cuantitativa mediante el incremento de los grupos reductores por el método de Nelson-Somogyi.

- A tubo con 9.9 ml de acid0 poligalacturónico al 1% en solución amortiguadora de aceiatos O. I h i pN 5, se le agregó O. 1 mi de la solución de la enzima . El tubo con la r-; . .

) ' ' . --zix 55 TYZ-.: E ir 5~5: z ~mmatm mRR&nte de 39 "C

. . . . . . . . . . . . .t' . . . . . _,e.:-'. - . , - ..,. . *-,e. .~ . . ~ . . .. . .

ACTIVIDADES REALIZADAS.-

- Análisis de la literatura existente.

- Entrenamiento en las técnicas analíticas a utilizar.

- Cinéticas de fermentación. Se realizaron las fermentaunes en las condiciones establecidas en la metodología tomando muestras cada dos horas a lo largo de 24 horas. Determinando la concentración celular y la actividad enzimática por duplicado en cada muestra.

- Cálculo de los datos numéricos y determinación los valores a graficar expresados como actividad especifica y actividad global.

- Análisis cstndístico de los tI;itos iiiiiii6ricos incdiantc u11 Análisis listiidislico de variniiza (ANDEVA)

- LilalIol-aciOii tlcl illfollllc lillal dc cstudio lcalizado

Los objetivos forniulados al inicio del presente trabajo se culininaron casi por completo debido a que se esperaba también probar el efecto del glicerol como fuente de carbono pero la definición de la técnica a usar seria motivo de un nuevo trabajo.

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RESULT OS \eD i '-

Efecto del oxigeno disuelto en el medio (D O.)

Para evaluar el efecto de este parámetro se reportan y se grafican tanto los valores de actividad enzimática total como los valores de actividad especifica (actividad enzimáticd biomasa)

En la grafica I se puede ver que a 60% de oxígeno disuelto, 30 "C y en medio sin pectina no fue posible detectar actividad enzimática; entre los valores de 20 % y 40% de D.O. el nivel de producción de enzima fue significativamente mayor a 20% de D.O., según análisis estadistico En la gráfica 2 también se comparan los diferentes niveles de oxígeno ya mencionados pero esta vez en un medio adicionado con pectina; pudiendo ver que a 60% de D.O. condición inhibitoria si se pudo ver producción enzimatica a partir de la octava hora de fermentación ; mediante un ADEVA se determinó que existe una diferencia significativa entre la producciún de enzima a 20% y a 40% de D O. y a 40% de D.O. entre las 2 y 10 horas de la fermentación se nota una mayor producción enzimática. En estas dos primeras gráficas se reporta actividad enzimática total .

En las gráficas 3 y 4 se expresa la actividad enzimática en cuanto a cada unidad de bioniasa, es decir, actividad especifica (UPG I g) a 40% de D.O. se ve una actividad enzimática mayor que a 20% de D.O. y nuevamente lo mas importante es el hecho de que a 60% de D.O. en medio con pectina si se detecta producción de la enzima.

En cuanto a los medios adicionados con pectina como inductor para lo tres niveles de oxigeno disuelto en el medio evaluados, la producción enziniática se increinentó, lo cual se puede aseverar estadisticarnente con una confianza de 99.99% sin embargo este aspecto se discutira posteriormente.

10

GRAFICA 1

Influencia D.O. sin pectina

O .4

- 0.2 'o cp 'o

c ." " ¿ - " - - - 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

tiempo (hr)

' I 1 ' -60% D.O. +20% D.O. *40% D.0

GRAFICA 3

Influencia D.O. actividad esp-ecíf ica

0.7

O .6 E 5 0.5 IL 3 0.4 a a 0.3 '(3

o a

h

Y

.- 2 c, 0.2

0.1

U 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

tiempo (hr)

I -60% D.O. +20% D.O. *40% D.O.

' t

Efecto de la temperatura.

En lo que se refiere a la temperatura, nuevamente lo observado se expresa en actividad enzimática total y en actividad enzimática especifica. Lo obtenido en este caso es sumamente interesante ya que a pesar de que todas las fermentaciones se realizaron a 60% de D.O. ( condición en la cual no era detectable actividad enzimática en medio sin adición de pectina ) al ir incrementando la temperatura se fueron obteniendo valores de producción enzimática parecidos a los obtenidos en condiciones de 20 y 40% de saturación de oxigeno e incluso mayores en medio adicionado con pectina ya que la actividad enzimática fue significativamente mayor a 45 "C.

En la gráfica 5 se compara la actividad enzimática en medio sin adición de pectina y se puede notar que en cuanto va aumentando la temperatura de la fermentación se incrementa la producción de la enzima; a 30 "C no hubo actividad enzimática; a 35 "C se obtieiicri valor'es por encima de 0.2 uPG/iiiI; a 40 "C la producción decrece para increiiieiitnrse iioial>leiiientc a 45 "C, la actividad eiiziiiiática file significativaniente mayor ii 45 "C. la grálica 6 muestra la iictividnd ciid«poligaliicttii-oiiiicii en iiicdio adicionado coii

pcct iii;i+iitiicii<iosc ver' tin coiiioort:iiiiiciili) similar al que se tiene en el medio sin pectinii cxccpio por el Iieclio de que a 45 "<: se obtienen los iiiiiyores valores de pioduccibii enziiiiiitica de todo este exlierimento y además a 30 "C se logra detectar actividad eiiziiiiática. que coiilo se expuso en el anterior npai-tado se da en condiciones completamente inhibitorias de la misma (30 "C y 60% de D.O.).

~. .~..

Como en el caso del oxígeno disuelto, para la evaluación de la temperatura se expresa la actividad enziniática también en actividad especifica como se puede ver en las gráficas 7 y 8. El efecto de la temperatura es muy iniportante ya que se obtuvieron a 45 "C los valores inas altos de producción y además a 35, 40 "C (60% de oxigeno disuelto en el medio) se obtienen niveles de producción parecidos a los que se tiene a valores de 20 y 40% de D.O.. Sin embargo no se sabe si la temperatura tiene un efecto inductor por si misma o es que el aumento en la actividad enzimática se debe al efecto de la diferente disolución del oxigeno en el medio debido a la temperatura.

Mediante el Análisis Ectadistico se puede aseverar con 99.99% de confianza que la producción enzimática fue la mayor a 45 "C, seguida por la actividad enzimática a 35T, que a su vez mayor que la que se obtuvo a 40 y finalmente la menor fue a 30 "C.

GRAFICA 5

lnfl uencia temperatura sin pectina

0.3

4.25 E 5 0.2 CL 3

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 tiempo (hr)

-30 *C +35 OC *40 OC *45 *C

G RAFI CA- 6

Influencia temperatura

,

con pectina

./ / \

0.7 i

0.6 I = I 5 E 0.5 I j

a l Y 3 0.4 ~

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 tiempo (hr)

20 22 24

GRAFICA 7

Influencia T sin ped. act i vi d ad es p ecif i ca

o O 2 4 6 8 10 12 14 16 18

tiempo (hr)

20 22 24

c O 0

S

a o o a, a. cn a, 73 a 73 > o a

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O 1

o O LD d- + o O d-

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+ o O Lc) m t o O

O c9

4

Efecto de 'i a adición de pectina como inductor.

Para todos y cada uno de los niveles de oxígeno disuelto y temperatura evaluados se usaron tanto medios con glucosa como medios con glucosa mas pectina , lo cual permitió probar también el efecto de ésta última como inductor en la producción enzimática. En todos los casos la producción de endopohgalacturonasa fue mayor en presencia de pectina.

En las tablas 9 a 14 se reporta la actividad enzimática como actividad especifica con y sin la adición de pectina en el medio , Es importante hacer notar que en las gráficas en las que se dan valores de actividad enzimática específica se puede ver un pico a las dos horas de iniciada la fermentación, el cual se tiene porque al obtener la relación de la cantidad de enzima producida entre la biomasa celular resulta un coeficiente alto, ya que en ese momento la biomasa celular es escasa mientras que la producción de la enzima ya es notable.

Con el propósito de ilustrar el efecto inductor de la pectina en la actividad enzimática especifica a los diferentes niveles de oxígeno disuelto evaluados se realizaron las gráficas 9, I O y 1 1 . El efecto más notable fué el que en condiciones que se reportan en trabajos anteriores (Wiiiborne y Rickard 1978 , Garcia-Garibay et al 1987) como totalmente inhibitorias (60% de oxígeno disuelto) , en medio adicionado con pectina se obtuvo actividad enzimática a partir de la octava hora de fermentación (gráfica 9) . El aumento de actividad enziiiiática para 60% de oxígeno disuelto fue de aproximadamente O. 1 de unidad enziniática (uPG/g) ; para 40% de oxigeno disuelto (gráfica 10) el aumento en la actividad enzimática fue significativamente mayor (ANDEVA) y se puede ver que a las dos horas de fermentación la diferencia fue de 0.6 uPG/g , sin embargo como esto se ve solamente en el pico de las 2 horas no se puede generalizar para toda la fermentación. En la gráfica 1 1 , a 20% de D.O. vemos que la mayor producción enzimática debida a la pectina se da a partir de la octava hora de fermentación y se hace más notable a las 24 horas.

En las gráficas 12 , 13 , 14 se puede ver el efecto de la pectina como inductor , adicionada al medio de cultivo en cada uno de los niveles de temperatura evaluados. La primera temperatura evaluada fue 30 "C y como para determinar el efecto de la temperatura se llevaron a cabo las fermentaciones a 60% de D.O. la gráfica que muestra este efecto coincide con la de 60% de D.O., es decir la gráfica 9 , en la cual el efecto inductor de la pectina es muy importante y se acaba de discutir.

En la gráfica 12 se compara también la actividad especifica con y sin pectina pero cabe resaltar que estos valores de producción se obtuvieron a 60% de saturación de D . 0 y

12

lil'cc~o dc la íidiciOii <IC pcctiiin c«mo iticliicíor.

Para todos y cada uno de los niveles de oxigeno disuelto y temperatura evaluados se usaron tanto medios con glucosa como medios con glucosa mas pectina , lo cual permitió probar también el efecto de ésta última como inductor en la producción enzimática. En todos los casos la producción de endopoligalacturonasa fue mayor en presencia de pectina.

+ i En las tablas 9 a 14 se reporta la actividad enzimática como actividad especifica con y sin la adición de pectina en el medio , Es importante hacer notar que en las gráficas en las que se dan valores de actividad enzimática especifica se puede ver un pico a las dos horas de inicia a la fermentación, el cual se tiene porque al obtener la relación de la cantidad de enzima 1 p oducida entre la biomasa celular resulta un coeficiente alto, ya que en ese momento la biomasa celular es escasa mientras que la producción de la enzinia ya es notable.

Con el propósito de ilustrar el efecto inductor de la pectina en la actividad enzimática especifica a los diferentes niveles de oxígeno disuelto evaluados se realizaron las gráficas 9, 10 y 1 1 . El efecto más notable fué el que en condiciones que se reportan en trabajos anteriores (Winborne y Rickard 1978 , Garcia-Garibay et al 1987) como totalmente inliibitorias (60% de oxigeno disuelto) , en medio adicionado con pectina se obtuvo actividad enzimática a partir de la octava hora de fermentación (gráfica 9 ) . El aumento de actividad enzimática para 60% de oxígeno disuelto fue de aproximadamente O. I de unidad enzimática (uPü/g) ; para 40% de oxigeno disuelto (gráfica IO) el aumento en la actividad enzimiitica fue significativamente mayor (ANDEVA) y se puede ver que a las dos horas de fermentación la diferencia h e de 0.6 uPG/g , sin embargo como esto se ve solamente en el pico de las 2 horas no se puede generalizar para toda la fermentación. En la gráfica 1 I , a 20% de D.O. vemos que la mayor producción enzimática debida a la pectina se da a partir de la octava hora de fermentación y se hace más notable a las 24 horas.

En las gráficas 12 , 13 , 14 se puede ver el efecto de la pectina como inductor , adicionada al medio de cultivo en cada uno de los niveles de temperatura evaluados. La primera temperatura evaluada fue 30 "C y como para determinar el efecto de la temperatura se llevaron a cabo las fermentaciones a 60% de D.O. la gráfica que muestra este efecto coincide con la de 60% de D.O., es decir la gráfica 9 , en la cual el efecto inductor de la pectina es muy importante y se acaba de discutir.

En la gráfica 12 se compara también la actividad especifica con y sin pectina pero cabe ',,\ resaltar que estos valores de producción se obtuvieron a 60% de saturación de D.O. y

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35 "C obteniendosé desde la hora 4 de fermentación una mayor producción en el medio adicionado de pectina Para 40 "C el aumento en la producción enzimática en el medio adicionado con pectina se nota a lo largo de casi toda la fermentación excepto a las dos horas (gráfica 13) Finalniente en la gráfica 14 se comparan los datos resultantes de la adición de pectina a 45OC y al igual que en los otros niveles evaluados hay una mayor producción enzimática en el medio con glucosa mas pectina que en el medio con glucosa

obtuvo la mayor producción enzimática.

Para todos los casos con 99.99% de confianza (ANDEVA) la actividad enzimática fue mayor en los medios adicionados con pectina

solamente , es importante el hecho de que en medio adicionado con pectina y a 45 "C se

Biomasa celular

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I ''

En uti medio sin adición de pectina (gráfica 15) la biomasa celular fue significativamente mayor, con 99.99% de confianza, a GO% de D.O. que a 20 y 40% de D.O. y entre estos dos valores fue mayor a 40% de D.O.; para el medio adicionado de pectina (gráfica 16) nuevatiiciite a 60% de D.0. la bioniasa lile mayor que a 40% y que a 20% de D.O., esto c«iiicidc con la litcniturti ya qiic se sabe que en condiciones de aerobiosis (GO% de saturación de oxígeno (lisiielto) sc ve Iiivorccido el crcciiiiicnto del iiiicroorgariisiiio. l;.ntrc 20% y 40% de D . 0 . iiiicvaiiiciile a 40% fiic iiiayor.

El crecimiento celular en las fermentaciones donde se evaluó la temperatura se muestra en las graficas 17 y 18 la primera en medio sin pectina y la segunda en medio adicionado con pectina como inductor del análisis estadístico se puede aseverar que la mayor producción de biomasa fue a 35 "C, a 45 "C el crecimiento celular fue el menor y la producción enzimática la mayor.

No hubo diferencia significativa entre los valores de biomasa obtenidos en medios con glucosa y medios con glucosa más pectina, aparentemente no hay un efecto de la pectina sobre la bioinasa celular.

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/,"

GRAFICA 9 O 6 0 h D.O.

actividad específica

O .3 h m 5 0.25 a W = 0.2 u (0 0.15 'CJ > o (0

.- - 0.1 0.05

O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

tiempo (hr)

+sin pect. +con pect.

GRAFICA 10 O 40h D.O.

act ¡vi dad específica _c

1.4

1.2

W 0.8

3 0.6

5 0.4

U > a

.-

.-

0.2

o 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

tiempo (hr)

-sin pect. +con pect.

CONCLUSIONES.-

- En cuanto a los niveles de oxigeno evaluados si hay diferencia significativa con 99.99% de confianza (se realizó un Análisis Estadistico de Varianza ANDEVA) en la cantidad de enzima que se produce a 20 y 40% de D.O. siendo mayor a 40% de D.O.; a (30% de oxigeno disuelto ( D.O.), 30 "C y sin adición de pectina en el medio no fue posible detectar actividad enzimática sin embargo con la adición de pectina se obtuvo a partir de la sexta hora de fermentación valores de actividad enziniática comparables a los obtenidos a 20 y 40% de D.O.

- El aumento de la temperatura tuvo un efecto regulador muy importante ya que al ir incrementando la temperatura se empezó detectar actividad enzimática aún a GO% de D.O..

- A 45 "C en medio adicionado con pectina se obtuvo la mayor producción enzimática.

- Con la adición de la pectina se pudo ver que la cantidad de enzima producida fue mayor para todos los niveles de oxigeno y temperatura evaluados.

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RECOMENDACIONES:

- Resultaría muy interesante determinar la influencia de la temperatura en la disolución del oxígeno en el medio, ya que se sabe que al aumentar la temperatura disminuye la disolución del oxigeno; para probar si realmente la temperatura tiene un efecto inductor en la producción de la enzima se debe poder determinar la concentración de oxígeno disuelto a las diferentes temperaturas evaluadas.

- Asimismo, resulta de particular interés determinar si los factores que promueven la producción de la enzima pueden ser aditivos, es decir, que si se puede aseverar que el efecto inductor de la pectina aumenta al sumarle el efecto de la temperatura, debido a que a 45 "C en medio adicionado con pectina se obtuvo la mayor producción enzimática de todo el experimento.

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