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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

FACULTAD DE INGENIERIA

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INFORME N°003-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCJ-2015-EAPIA-UNAMBA

PARA: Ing. Saúl moreano carrasco

DE: Sincé Peralta, Edith

Camacho Batállanos, Daniel

Saavedra Román, Katherine

Vera Gutiérrez, Juan Carlos

Chumbe Cahui, Judith

ASUNTO: CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO AMBIENTE

Fecha de ejecución de la práctica: 10/06/15

Fecha de entrega de la práctica: 19/06/15

Grupo: miércoles de 4:00 a 6:00 pm

I.- RESUMEN

Temas nuevos o de importancia creciente, como son el control de calidad del medio ambiente, las medidas de seguridad y salud de los personas y las que aseguran una relación armónica con el medio ambiente.se realiza con el objetivo de cuantificar los microorganismos en el aire del medio ambiente elegido, dado con el método de sedimentación por gravedad. Y los insumos utilizados en esta práctica fue dos medios de cultivo como son el caso de Agar plate count y Agar OGY respectivamente. Como resultado del proceso de evaluación y conteo de colonias, la mayor cantidad de población

microbiana fue en el laboratorio de microbiología mientras de menor cantidad era en el laboratorio de química. Esto lleva a la necesidad de diseñar acciones que tengan en cuenta esta realidad.

II.- INTRODUCCIÓN

El control ambiental es un proceso que permite determinar el grado de asepsia que tiene un recinto o un laboratorio, el proceso evaluara la limpieza e indicara si esta deberá ser reforzada. En un laboratorio de microbiología es imprescindible mantener un ambiente aséptico por las actividades que allí se realizan y para ello es necesario llevar un control de calidad del medio ambiente. En esta práctica se observara los pasos necesarios para mantener un control de calidad del medio ambiente también se determina el grado asepsia del mismo.Se puede defender el concepto “calidad ambiental” como el conjunto de características del ambiente, en función a la disponibilidad y facilidad de acceso a los recursos naturales y a la ausencia o presencia de agentes nocivos. Todo esto necesario para el mantenimiento y crecimiento de la calidad de vida de los seres humanos.

III.- MARCO TEORICO

CONTROL DE CALIDAD DEL MEDIO AMBIENTE

Control del medio ambiente

Un control adecuado de la temperatura, la humedad y el polvo es importante para el bienestar del personal, el funcionamiento de los instrumentos y la seguridad en el trabajo (por ejemplo, con disolventes inflamables). Los instrumentos ópticos suelen requerir unas condiciones de temperatura estables para funcionar debidamente. Es posible que el equipo electrónico precise unos niveles determinados de temperatura y humedad ambiental. Los ordenadores han de protegerse de campos magnéticos intensos provenientes de otros aparatos; los empleados o visitantes con marcapasos deberán evitar tales campos. Puede que sea necesario un sistema de agua fría de la red de abastecimiento o de refrigeración localizada para que ciertos aparatos funcionen debidamente. Los materiales

de ensayo, reactivos y patrones habrán de almacenarse en condiciones reguladas. Algunas sustancias deben protegerse de la luz del sol o de las lámparas fluorescentes que las afectan. Las balanzas e instrumentos ópticos delicados necesitan protección contra las vibraciones (por ejemplo de los mezcladores, tambores y centrífugas) o incluso un soporte estabilizador. Todas estas necesidades han de identificarse y documentarse de manera que en el sistema de garantía de la calidad puedan incluirse procedimientos adecuados para regularlas y tomar las medidas oportunas.(Weatherwax, J. y Martín, P.G. (1986))

Serán necesarios registros en los que conste que:

- las muestras se reciben, almacenan, manejan y analizada en condiciones ambientales que no afectan negativamente a los análisis;

- los controles de la temperatura, la humedad y la luz en las zonas sensibles son adecuados para proteger las muestras, sus extractos, el personal y el equipo;

- se lleva un registro de los resultados del muestreo ambiental en los locales del laboratorio, en el que se anota también la velocidad de las corrientes de aire que pasan a través de las aberturas.

Es cada vez más frecuente que dentro de las normativas de control de calidad se incluya un control microbiológico ambiental y de superficies y se hace prácticamente imprescindible en actividades relacionadas con productos destinados a sanidad o alimentación. Para llevar a cabo este análisis debemos establecer previamente: • El método de muestreo que se va a utilizar • Los microorganismos que se desean aislar y cuantificar • Los lugares de muestreo • La posición del muestreador • Número de muestras en cada punto • Frecuencia de los muestreos

Todos estos puntos dependen de las características específicas del ambiente que se pretende

Asociados a este concepto, se encuentran los términos “estándar de calidad ambiental” y “límite máximo permisible”, instrumentos de gestión ambiental que buscan regular y proteger la salud pública y la calidad ambiental, permitiéndole a la autoridad ambiental desarrollar acciones de control, seguimiento y fiscalización de los efectos causados por las actividades humanas.Un Estándar de Calidad Ambiental (ECA) es la medida que establece el nivel de contracción o del grado de elementos, sustancias o parámetros físicos, químicos o biológicos, presentes en el aire, agua o suelo, en su condición de cuerpo receptor, que no representa significativo para la salud de las personas ni al ambiente(Copyright Ministerio del Ambiente –MINAM)

Control de la limpieza

Como en lo que concierne a cualquier otro aspecto de las actividades del laboratorio, la responsabilidad de las operaciones de limpieza deberá definirse claramente. Tanto el personal de la limpieza como el del laboratorio deberán tener instrucciones precisas sobre sus obligaciones respectivas en relación con:( Weatherwax, J. y Martín, P.G. (1986))

- la limpieza de los suelos, superficies verticales (por ejemplo, armarios, paredes, ventanas y puertas), superficies horizontales (por ejemplo superficies de trabajo, estanterías), equipo, interior de refrigeradores, congeladores, almacenes de temperatura regulada;

- control del contenido de refrigeradores, congeladores, almacenes de temperatura regulada;

- comprobación del funcionamiento del equipo de acondicionamiento de aire y extracción de polvo.

TÉCNICAS DE MUESTREO AMBIENTE:

A) SEDIMENTACIÓN:

Es el método más rudimentario de medición de microorganismos en el ambiente. Consiste en la exposición de placas de Petri al ambiente durante un cierto tiempo.

Este método tiene la ventaja de que se puede realizar en todas las condiciones habituales de trabajo y en tiempo real, es el más económico y requiere muy poco tiempo de dedicación.

El resultado ha de expresarse como: u.f.c (unidades formadoras de colonias) /cm2/hora (no puede referirse a un volumen de aire, por lo que los resultados no pueden ser cuantitativos/volumen de aire, pero si comparativos).

Los tiempos de exposición no deben ser extremadamente largos para evitar que se reseque la superficie de la placa.

Se utilizan placas de Petri estándares de 90 mm de diámetro y los medios más utilizados son:

Agar de Triptona y Soja (T.S.A) para el recuento de aerobios (ref. 064-PA0031, para placas preparadas y ref. 1-200 para el medio deshidratado).

Agar Rosa de Bengala o Agar de Sabouraud cloranfenicol para el recuento de hongos (Ref. 064-PA0038 o 064-PA0026, para placas preparadas y ref. 1-301 o 1-166 para el medio deshidratado).

En el caso de control de salas blancas recomendamos utilizar placas preparadas e irradiadas, de esta forma evitamos introducir contaminación en la sala y los recuentos son fi ables. • Ref. 064PA0031I, placas de 90 mm de diámetro de T.S.A irradiadas.

Ref. 064PA0026I, placas de 90 mm de diámetro de Agar Sabouraud Cloranfenicol irradiadas.

El Agar Rosa de Bengala es un medio selectivo para la detección de hongos que, además de los requerimientos nutritivos para el desarrollo de los mismos, incorpora el indicador de Rosa de Bengala que, además de teñir las levaduras de color rosado, facilitando su contaje, impide el crecimiento masivo de mohos tales como Rhizopus y Neurospora permitiendo así detectar otros.

Cuál es el fundamento del agar OGY?

El agar OGY (Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura) Es un agar selectivo para la demostración y numeración de mohos y levaduras en de material de investigación (alimentos, material clínico, etc.) El agar-oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura ha sido recomendado comomedio de rutina para la investigación de mantequilla.Esta compuesto por extracto de levadura, D-glucosa, Agar-agar,Oxitetraciclina 0,1 o Gentamicina 0,05.

III.- OBJETIVOS

Cuantificar los microorganismos presentes en el aire ,determinar la diversidad microbiana del ambiente elegido

IV.- MATERIALES Y INSUMOS:

MATERIALES:

Placas Petri esterilizadas. Probeta. Matraz Erlen Meyer. Espátula. Balanza analítica. Equipo cuenta colonias. Incubadora regulada 20°C. Plumón indeleble.

INSUMOS:

Agua destilada. Agar pate count Agar OGY

V.- PROCEDIMIENTO:

Elegir 3 o más puntos de la muestra en el ambiente de microbiología. Abrir las placas de agar Plate Count y OGY y exponer durante 15

minutos Las placas con agar Plate Count incubar a 35°C / 3 días y las placas con

agar OGY 35°C / 4 días. Obtener resultados entre 3 días y 4 días de incubación y contar las

colonias y expresar como Ufc/ 15 minutos.

CALCULOS REALIZADOS EN LA PRÁCTICA:

Cálculos para el Agar Plate Count (para 2 placas)

17,5 gr 1000 ml

X 40 ml

X = 0,7 gr de agar plate count

Cálculos para el Agar OGY (para 2 placas)

18,5 gr 500 ml

X 40 ml

X = 1,48 gr de agar OGY

Diagrama: protocolo de procesamiento del control de calidad del medio ambiente

Elegir 3 puntos en el laboratorio de microbiología

Colocar en las zonas de muestra 3 placas de agar Plate Count y

Agar OGY

Exponer las placas abiertas durante 15 minutos

Incubar Plate Count a 35°C/ 3 días y OGY a 20-24°C a 4 días

Contar las colonias y expresar como ufc/ 15 minutos de exposición

VI.- RESULTADO:

Cuadro N°01 Resultados que se obtuvo en el control de calidad del medio ambiente

Medio de cultivo

zona demuestreo

placas color periodo de incubación

# total de colonias

Agar plate count

Laboratorio microbiología

Blanco cremoso y blanco amarillento

3 DIAS 100 ufc/15min

Agar plate count

Laboratorio química. Blanco

cremoso 4 DIAS 81ufc/15min

Agar OGY

Laboratorio microbiología

Blanco cremoso y blanco amarillento

3 DIAS 222 ufc/15min

Agar OGY

Laboratorio química.

Blanco cremoso y verde oscuro

4 DIAS 14 ufc/15min

FORMULA UTILIZADO PARA CONTAR LOS MICROORGANISMOS:

4.

1: N = ∑ XFd∗Vm

= 100 ufc/15min laboratorio de microbiología (Agar Plate

Count)

2: N = ∑ XFd∗Vm

= 81 ufc/15min laboratorio de química (Agar Plate Count)

3: N = ∑ XFd∗Vm

= 222 ufc/15min laboratorio de microbiología (Agar OGY)

4: N = ∑ XFd∗Vm

= 14 ufc/15min laboratorio de química (Agar OGY)

VII.- DISCUSIONES.

Se sabe que la mayor cantidad de colonias presentes en el aire, está en laboratorio de microbiología, esto nos indica que estamos expuestos a contaminarnos. Por tal motivo se requiere el ingreso al laboratorio con todo el implemento necesario en un laboratorio de microbiología, o en otros laboratorios.

En la práctica realiza solo tomo dos puntos de muestreo por motivos de materiales no estériles ,según el procedimiento debería tomarse más de dos puntos respectivamente,

Entre éstas, son las normas previas y simultáneas con los procesos de certificación de calidad (ISO 9000), medioambiental (ISO 14000) y con la introducción de medidas de seguridad y salud laboral, ocupan un lugar imprescindible.

VIII.- CONCLUSIONES:

Se logró la cuantificación de microorganismos en el aire, con los diferentes medios cultivos especialmente para microorganismos presentes en medio ambiente, para esto se tomó dos puntos el laboratorio de química y microbiología. Llegamos a un resultado de recuento de colonias y de cada zona de muestra. La más poblada de microorganismos fue de laboratorio de microbiología con un número de 222 ufc/15min y en el otro punto fue de 81 ufc/15min, son de los medios cultivos con mayor cantidad de colonias que los otros

medios, como se muestra en cuadro N°01. En conclusión si se logró los objetivos de cuantificación de microorganismos presentes en el aire.



ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE


INFORME N°003-IA 504-SPE-CBD-SRK-VGJC-CCY-2015-EAPIA-UNAMBA

PARA: Ing. Saúl Moreano carrasco

DE: Edith Sincé Peralta

Daniel Camacho Batállanos

Katherine Saavedra Román

Juan Carlos Vera Gutiérrez

Yudy Chumbe Cahui

ASUNTO: EVALUACION MICROBIOLOGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES:


Fecha de entrega de la práctica: 22/07/15

Grupo: miércoles 4:00 a 6:00 pm

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I.- RESUMEN

Los microorganismos de superficies vivas e inertes relacionado con la función de los riesgos sanitarios, con diferentes etapas de cadena alimentaria, siendo con el objetivo de Evaluar la cantidad microbiológica de superficies inertes (tabla de picar). Y la calidad microbiológica de manos de manipuladores de alimentos. Sea por métodos rápidos o convencionales, se realiza utilizando métodos normalizados por

organismos internacionales para la estandarización ISO ,dado el más utilizado es el incorporación ,utilizando el medio cultivo de Agar Plate Count y peptona, obteniendo un resultado en manos de manipulador de 3.4x104 ufc/ml y en superficies de1.4x104 ufc/100cm2 Respectivamente.

I.- INTRODUCCION

Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser por el manipulador quien lo contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una gran carga microbiana en la piel, pero nunca deberán deslizarse de ellas bacterias patógenas. Por lo tanto resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga una perfecta condición de higiene durante el procesado de los alimentos.

La técnica de carga microbiana depende de la naturaleza del sitio, grado de concentración y de información microbiológica que se pretende obtener.

Existen dos categorías de muestreo que habitualmente se toman del entorno donde se fabrican alimentos en superficies y ambientes.

Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el suelo, superficies de los objetos e incluso sobre muestro piel.

II.- OBJETIVOS

Evaluar la cantidad microbiológica de superficies inertes (tabla de picar).

Evaluar la calidad microbiológica de manos de manipuladores de alimentos.

III.- MARCO TEORICO

Evaluación de riesgo microbiológico en superficies inertes y vivas deManipuladores en áreas de producción

Uno de los factores que en mayor medida afectan a la Salud Pública es la higiene de los alimentos, especialmente en los grandes centros de venta, ya que cada vez es mayor el porcentaje de personas que adquieren o consumen alimentos fuera del hogar.

La higiene de las superficies, equipos y utensilios, es uno de los pilares donde se asientan las buenas prácticas de manufactura y si se considera que entre el 6 y 15 % de los alimentos producidos poseen algún tipo de contaminación, cifra que podría dispararse de manera imprevisible en un mercado de producción a escala macro como lo hacen las industrias alimenticias en la actualidad, la respuesta a estos grados de contaminación son varias, pero una de ellas se basa en la comprobación de que existen microorganismos capaces de resistir los tratamientos habituales de limpieza (Forte, L.M.y Rebagliati, J.E.,2000).

Los microorganismos patógenos pueden pasar de un alimento a otro por contacto directo o bien a través de quienes los manipulan, de las superficies de contacto o del aire (CAC/RCP 1, 1997).

Una correcta higiene de los alimentos está determinada por una multitud de factores: condiciones de obtención de los mismos, características de los medios empleados para su transporte, temperaturas y condiciones de conservación,Estructura de los locales donde se manipulan, destacando entre todos ellos la higiene de las prácticas de los manipuladores de alimentos. (Pérez Silva García, M.; Belmonte Cortés, S. y Martínez Corral, J.; 1998).

Entre los agentes etiológicos productores de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) predominan los biológicos.(Gomez, D.; Cotella, O.; Fernandez Pascua, C. y Ameztoy, A.M., 1997); entre los cuales se destaca el géneroSalmonella. En la industria de los alimentos Escherichia coli es un organismo de particular importancia por su impacto en salud, y se considera que, conociéndose el papel de los reservorios, la prevalencia del organismo en las plantas procesadoras y en los alimentos producidos, (Rodríguez; H.R. 1995),También se deberían conocer cuáles serían las operaciones o procedimientos en las etapas de producción y en las posteriores de procesamiento que facilitan o producen contaminación microbiana, la investigación sobre estos organismos aportaría la información científica necesaria para sustentar programas de control de estos emergentes. Asimismo, la intoxicación estafilocóccica es una de las ETA más frecuentes, con especial preponderancia en la región latinoamericana, y su presentación ocurre por las enterotoxinas producidas por numerosas cepas de Staphylococus aureus que proliferan en los alimentos, los estafilococos abundan en el medio y el origen de la contaminación por lo regular está relacionada con heridas de la piel, la nariz, la boca o la garganta de los manipuladores, cuando se procesan aun estando ya cocidos y calientes (INPPAZ / OPS / OMS, 1997).

La contaminación cruzada entre materias primas crudas o entre productos crudos y los ya cocidos a través de manos, equipos o utensilios, es otra forma frecuente de contaminación que origina toxiinfecciones.Al no existir en nuestra región un estudio microbiológico con las características planteadas, nos ha llevado a trazar esta línea de investigación.

Muestreo de superficies

Debe estar en función de los riesgos sanitarios relacionados a las etapas de la cadena alimentaria.

a) superficies inertes.

Se seleccionan aquellas que están o tendrán contacto directo con los alimentos, que no serán sometidos a un proceso térmico y que están destinados al consumo directo como: utensilios, vajillas, superficies de corte, menaje, equipos, etc.

b) Superficies vivas

Se selecciona a los manipuladores de alimentos, con o sin guantes, que estén en el contacto directo con los alimentos que no serán sometidos a un proceso térmico o pasterización u otro tratamiento que disminuya la carga microbiana.

Cuadro Nª01 selección del método del muestreo

MÉTODO DE MUESTREO SUPERFICIES A MUESTREAR

MÉTODO DEL HISOPO

Se utiliza superficies inertes e irregulares tales como: tabla de picar, bandejas, mesas de trabajo, utencillos, cuchillas de equipo, cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras, mezcladoras, pisos, paredes y otros.

MÉTODO DE LA ESPONJA El método de la esponja se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor área.

MÉTODO DEL ENJUAGUE Se utiliza para superficies vivas (manos) y para objetos pequeños o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plástico, etc.

Fuente: elaboración propia.

PARAMETROS PERMISIBLEAS:

Cuadro Nª02 limites microbiológicos permisibles

SUPERFICIESMWETODO DE ENJUAGUE SUPERFICIES VIVAS SUPERFICIES INERTES

ensayoLímite de detección método

Limite permisible

Límite de detección método

Limite permisible

Coliformes totales

<100 ufc/manos

<100 ufc/manos

<25 ufc/ super.muestra

<25 ufc/ super.muestra

Staphylococcus aureus

<100 ufc/manos

<100 ufc/manos

------ -------

patógenos Ausencia de manos

Ausencia de manos

ausencia ausencia

Fuente: dirección general de salud ambiental-DIGESA

VI.- MATERIALES E INSUMOS

Hisopo de algodón u otro material equivalente de largo aproximada 12 cm. Plantilla estéril con un área abierta en el centro de 10 cm x 10 cm. Frasco con tapa rosca de 250 ml con 100 ml de solución diluyente. Pinzas estériles Bolsas de polietileno de primer uso. Tubo de ensayo con tapa hermética de 10 ml. Guantes descartables de primer uso. Tabla de picar. Pipetas. Mechero bunsen.

INSUMOS

Agar Plate Count Agar agua peptona

V.- METODOLOGIA

a.- para método de hisopo

Colocar la plantilla de 10x10 cm sobre la superficie a muestrear. Humedecer el hisopo, en la solución diluyente y presionar ligeramente en la

pared del tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de soluciones.

Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30° frotar 4 veces la superficie determinada por la plantilla.

Para superficies irregulares en el caso de utensilios, se repetirá la operación 3 utensilios más, en total 4 como máximo.

b.- para método de enjuague para manos de manipuladores.

el método consiste en realizar un enjuague (botellas, frascos, utensilios) o inmersión (manos, objetos pequeños) en una solución diluyente.

Vaciar el diluyente del frasco 100 ml en una bolsa plástica de primer uso. Introducir las manos a muestrear hasta la altura de la muñeca. Solicitar al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente

alrededor de los uñas y la palma de los manos. Luego retirar las manos se regresa el líquido al frasco o se anuda la bolsa y

este se coloca en otra bolsa para que quede segura.

Cálculos realizados:

Para Agar Plate Count (para 6 placas)

17,5 gr-------------------1000 ml

X -------------------- 100 ml

X = 1’75 gr de Plate Count

Para agua peptonada (para 2 frascos de 90 ml y 4 tubos de 9ml)

1 gr -----------------1000 ml

X------------------ 220 ml

X = 0,22 gr de peptona

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra liquida)PARA EVALUACION MICROBIOLOGICA DE SUPERFICIES VIVAS E INERTES

(Para los dos métodos realizados)

1 ml 1 ml

Diluyente

H2Op 9 ml 9ml

10−2 10−3

10−1

Inocular 1ml de

Cada dilución en

Placas Petri por

Duplicado.

Siembra por incorporación

Invertir las placas e incubar a 37°C y reporte de resultado

Fuente: protocolo de DIGESA

90 ml

1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1ml

VI.- RESULTADOS

Cuadro Nª03 evaluación microbiológica de superficies vivas e inertes:

Dilución Cuadrantes Color Colonias en ufc/ml

Manos de manipuladores

Dilución 10−2Amarrillo lechoso 3.4x104 ufc/ml

Superficies (tabla de picar)

Dilución 10−2

Sin determinar1.4x104ufc/100 cm2

Fuente: elaboración propia.

Para manos del manipulador

Ufc/ml = ∑ xfd∗v

= 13+7+6+810−2∗0.1

= 34000=3.4x104

Para superficies (tabla de picar)

Ufc/100 cm2 = ∑ xfd∗v

= 7+1+2+410−2∗0.1

= 14000=1.4x104

13 7

6 8

7 1

2 4

VII.- DISCUSIONES

Según en cuadro Nª02 de limites microbiológicos permisibles, lo que se

encontró en la mano y en superficies supera a la norma dada. Esto nos indica

que la mano del estudia esté contaminada de microorganismos patógenos y

de igual manera en la tabla de picar encontrando de 1.4x104 Ufc/100 cm2 y de

3.4x104 ufc/ml.y se halló gran cantidad de S.aureus.

Para obtener o garantizar de que un producto no este contaminado por estos

microorganismos mencionados tenemos que tener más higiene aséptica en

todos los procesos de manipulación de alimentos de consumo directo.

VIII.- CONCLUCIONES

Se concluye que en la mano del estudiante se determinó 3.4x104 unidades

formadoras de colonia /ml, mientras en la tabla de picar 1.4x104 unidades

formadoras de colonias/ 100 cm2 , en el medio agar plate count, esto indica que

no puede manipular un alimento por tener la alta carga microbiana.

por lo general encontramos S.aureus, salmonella basillus cereus y oros que

pueden ser patógenos como coliformes totales que estas nos pueden causar

la muerte.










Juan Carlos Vera Gutiérrez

Yudy Chumbe Cahui

ASUNTO: NUMERACION DE MICROORGANISMO MESOFILOS AEROBIOS VIABLES EN ALIMENTOS NO FERMENTABLES.


Fecha de entrega de la práctica: 08 /07/15


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I.- RESUMEN

Se trata de conocer el número total de microorganismos viables, que se encuentran en los alimentos, no fermentables. Con el objetivo de alcanzar el flujo de operaciones para el numeración de microrganismos mesofilos aerobios viables, que pretendemos encontrar en el alimento utilizando (HotDog). Aislando con el método de la técnica de siembra por incorporación y utilizando solo el medio cultivo del Agar Plate Count para mesofilos aerobios viables no fermentativos. Obteniendo un resultado de colonias encontrados en un dilución sucesiva de 5,238x x102ufc/ml.

I.- INTRODUCCION

El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos aerobios mesofilos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Según La presente norma sanitaria se establece en el marco del Reglamento sobre Vigilancia y Control Sanitario de Alimentos y Bebidas (NTS N° 071-MINSA/DIGESA-V-01), aprobado por Decreto Supremo N° 007.98 SA, establecen que el número de microorganismos aerobios mesofilos y facultativos deben ser hasta un máximo de 500000 = 5x105 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la población. Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios mesofilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie o por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo dela cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973)

La presencia de microorganismos aerobios mesofilos en los alimentos puede ser relacionada directamente con la manipulación, el estado de frescura o de descomposición del producto y la temperatura de conservación del producto. Un número relativamente bajo de estas bacterias no es sinónimo de buena calidad bacteriológica del alimento, ya que puede contener microorganismos que producen entero toxinas o son patógenos. (Venegas y col., 1990).

II.- OBJETIVOS

Realice el flujo de operaciones para la numeración de microorganismos mesofilos aerobios viables.

Realice la técnica de siembra por incorporación en el medio Plate Count en la muestra de alimento.

Realice los cálculos y reporte de resultado para rechazar o aceptar el Producto.

III.- MARCO TEORICO

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos nos pueden considerarse como totales ya que solo se pueden contar aquellos microorganismos que crecen en condiciones establecidas.

En nuestro caso se incluyen microorganismos mesofilos, que son aquellos que crecen entre 20 – 30°C, con una temperatura de crecimientos optima entre los 30 – 40°C. Aquí se encuentran todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30°C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.

Existen 2 requisitos principales que deben tener los alimentos para ser considerados de buena calidad:

1. Que estén libres de microorganismos patógenos, o sea que posean buena calidad sanitaria.

2. Que posean un bajo número de microorganismos alterantes, o sea que sean frescos.

Esterilidad Comercial: Condición de un alimento procesado térmicamente obtenida por: (i) Aplicación de calor que hace que el alimento esté libre de: (a) Microorganismos capaces de reproducirse en el alimento bajo condiciones normales de almacenamiento y distribución no refrigeradas; y (b) Microorganismos viables (incluyendo esporas) de importancia para la salud pública; o (ii) Control de la actividad de agua y la aplicación de calor, que hace que el alimento esté libre de microorganismos capaces de reproducirse en el mismo, bajo condiciones normales (no refrigeradas) de almacenamiento y distribución. (Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos RM N° 615-2003 SA/DM)

Numeración de microorganismos aerobios mesofilos viables:

Método: recuento estándar en placa o pour plate o recuento en placa por siembra en profundidad.

Este método se recomienda para productos lácteos (standard methods for the examination of dairy products, 1972) y para alimentos congelados, enfriados, pre cocidos o preparados (ADAC .1975).

Realizar los recuentos:

- Seleccionar para hacer el recuento aquella dilución donde haya crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias, Utilice él cuenta colonias

- Cuente las colonias y el numero encontrado deberá multiplicarlo por el reciproco de la dilución que utilizo para hacerlo

- Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En la hoja siguiente usted encontrara las diferentes posibilidades y que hacer en cada caso. Lo importante es saber que cuando se puedan encontrar diluciones que contengan entre 30 y 300 colonias si el recuento es preciso, se informa como recuento Estándar.

Recuento estimado del standard.

Este cálculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilución que contenga menos de 300 colonias. Para hacer recuentos se puede dividir la caja en 2, 4 o aun 8 porciones y contar las colonias. Este número de colonias se multiplica por el factor apropiado (2,4 u 8) y además por el reciproco de la dilución, que en este caso sería la más alta.

Cuando hay más de 200 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja hay más de 1600 (200x8). El recuento total deberá ser mayor de 1600 multiplicado por el reciproco de la dilución más alta. Si no hubiese colonias en la caja de dilución menor (10−1) se reporta como menos de 10 colonias puesto que el mínimo número de colonias puesto que el mínimo número de colonias que se puede obtener es de 1 y al multiplicarlo por el reciproco de la dilución dará 10.

Expresión de los resultados.

El recuento bacteriano se debe expresar con 2 dígitos y el resto en potencias de 10.

Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por ejemplo 10-20- 50-80-300 etc., es necesario aplicar algunas correcciones con la finalidad de convertir el número hallado en uno con 2 dígitos.

Si el recuentos se realizó en la dilución 10−3 y fue de 138 colonias, el tercer digito por ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2º o sea que el recuento seria 140.000 = 14x104.

Si el recuento fue de 124 por ser el 3er. Digito menor que 5 se anula y se expresa 120.000 = 12x104.

Cuando el recuento de mesofilos aerobios se utiliza para determinar la aceptación o rechazo de un alimento, únicamente se considerara el recuento standard y nunca el estimado.

VI.-MATERIALES E INSUMOS

Placas Petri 250 ml Pipetas 10 ml Tubos de ensayo Matraz

INSUMOS

Agar Plate Count Agar peptona

V.- METODOLOGIA

Preparar el medio de cultivo según las indicaciones del frasco. Prepara la muestra de 10 gr en 90 ml de agua peptonada y tubos de 9 ml cada

uno. Siembra por duplicado 1 ml de volumen del inoculo de cada dilución en el

medio Plate Count Siembra por incorporación Invertir las placas e incubar a 37°C por 48 h

Recuento en placas

N=∑ C

V (n1+0,1n2 )d

Donde:∑C=es la suma de colonias contadas de todas las placas, de dos diluciones sucesivas.V =es el volumen de inoculo aplicado en cada uno de las placas, en mililitros.n1 = es el número de placas leídas de la primera dilución.

n2 = es el número de placas leídas de la segunda dilución.d = es el factor de dilución correspondiente de la primera dilución leída.

DIGRAMA DE OPERACIONES: numeración de microorganismo mesofilos aerobios viables en alimentos no fermentables.

Tomar 10 gr de hot dog

Diluir en 90 ml de agua peptonada estéril

Por otro lado tenemos placas estériles

Seguidamente después de ser diluido el hot dog, seguir las diluciones 10−1 hasta

10−3

Hacer una siembra por incorporación por duplicado de

cada una de las diluciones

Finalmente incubar las placas con estas diluciones a 37°C

durante 24 – 48 horas

DIAGRAMA DE FUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra solida)

10 gr de muestra de Hot dog

1 ml 1 ml

H2Op 9 ml 9ml

10−2 10−3

10−1

Inocular 1 ml

De cada dilución

Incorporar 15 ml de medio Agar Plate Count homogenizar y que solidifique.

Invertir las placas e incubar a 37°C por 48 h y reportar los resultados

90 ml

1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1ml

Siembra por incorporación

Fuente: ver apéndice de operaciones, ISO 4833:2003-DIGESA

CALCULOS REALIZADOS

Para agar Plate Count (para 6 placas)

17,5 gr -------------------1000 ml

X --------------------- 100 ml

X = 1,75 gr de Plate Count

Para agar peptona (para 2 tubos)

110 ml ------------------ 100 ml

X ---------------------- 1 %


VI.- RESULTADOS

Cuadro N°01: resultados de numeración de microorganismo mesofilos aerobios viables en la muestra (hot dog)

Factor de dilución

Agar Colonias contadas

10−1ml Plate Count 53

10−1ml Plate Count 57

Total 110 colonias = 11x10 ufc/ml

Fuente: elaboración propia

Cuadro N°02: expresión de resultado según el ISO 7218:1996

formula Calculo Total de colonias en UFC/g o ml

N=∑ C

V (n1+0,1n2 )dN= 53+57

1¿¿5,238x102ufc/ml

Fuente: elaboración propia

VII.-DISCUSIONES

Según La presente norma sanitaria se establece en el marco del Reglamento sobre Vigilancia y Control Sanitario de Alimentos y Bebidas (NTS N° 071-MINSA/DIGESA-V-01), aprobado por Decreto Supremo N° 007.98 SA, establecen que el número de microorganismos aerobios mesofilos y facultativos deben ser hasta un máximo de 500000 = 5x105 ufc/ g o ml, para que puedan ser consumidos por la población.

Según el cuadro N°01 nos indica que el número de colonias contadas de las dilución ( 10−1) fue de un total de 110 colonias dando un equivalencia de 11x10 ufc. Sin embargo en los de más diluciones sucesivas, se encontró bacterias que presentaban menores a 30 colonias.

16 13

14 14

Según el cuadro N°02 muestra que la cantidad calculada (de la muestra Hot dog) es de 5,238x102 ufc/ ml, esto nos indica grado de importancia en relación con la utilidad y riesgo sanitario. Patógenos de riesgo moderado directo, de diseminación limitada. Sin cambio de peligrosidad.

VIII.- CONCLUSIONES

Logramos un flujo de operaciones para la numeración de microorganismos mesofilos aerobios viables, y para así hacer el procedimiento que requiere este practica realizada. Que nos indica los parámetros de utilización respectivamente.

Se utilizó la técnica de siembra por incorporación para el medio Plate Count, siendo uno de los medio indicado para su desarrollo de los microorganismos mesofilos aerobios, dando en conclusión si se logró el crecimiento de mesofilos aerobios no fermentativos de un total de 110 colonias.

Dando los cálculos y reporte de resultado de numeración de microorganismos mesofilos aerobios. de colonias contadas (cuadro N°01) y total de colonias en ufc/ml (cuadro N°02) en conclusión se determinó 5,238x102ufc/ml y es menos a 5x105 ufc/ml que esta dado en la norma (DIGESA/MINSA) y es el máximo permisible de (5x105) ,para alimentos con tratamiento térmico y refrigeración como el caso de hot dog. Este nos indica que si es aceptable su consumo del alimento, en un rango permisible 5,238x102 < 5x105ufc/ml










Juan Carlos Vera Gutiérrez (no aporto en el informe)

Yudy Chumbe Cahui

ASUNTO: INVESTIGACIÓN Y NUMERACIÓN DE Bacillus cereus




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I.- RESUMEN

Bacillus cereus es una bacteria Gram positiva, habitante frecuente de un amplio número de ambientes. Esta bacteria es la responsable del síndrome emético y del diarreico, y además se ha identificado vinculada a otras enfermedades. Identificación realizándose la búsqueda e investigación en aquellos alimentos que por su naturaleza y por los datos clínicos ante una contaminación de arroz cocido pudieran guiar a la posible presencia de este microorganismo. Aislando con un método practico de diseminación en placas, con los medios de agar Bacillus cereus +yema de huevo y las pruebas de coloración Gram, así dando unos resultados de Bacillus cereus Gram positivo. Con un crecimientos de colonias de 4.9 x 104 ufc/g encontrados en el arroz cocido y contaminado.

I.- INTRODUCCION

Bacillus cereus es una bacteria ubicua formadora de esporas que ha sido vinculada con algunos aspectos beneficiosos y nocivos para la actividad económica de la sociedad. Esta bacteria es frecuentemente encontrada como saprofita en el suelo, agua, vegetación y aire, desde los cuales se transfiere muy fácilmente a los alimentos. La colonización de diferentes nichos ecológicos es posible debido a su buena adaptabilidad y resistencia a variadas influencias. B. cereus produce endosporas que sobreviven a la pasteurización y son resistentes a varios desinfectantes. Además produce enzimas como lipasas, proteasas, xilanasas y otras. En la leche y productos lácteos descompone la caseína a péptidos y aminoácidos y la grasa de la leche a ácidos grasos libres, los cuales descomponen la leche y acortan su vida útil. Es propósito de este artículo, revisar información sobre las toxinas producidas por B. cereus y cuáles y cómo están relacionadas con las intoxicaciones alimentarias, así como abordar otros factores responsables de la virulencia de esta bacteria.

II.- OBJETIVOS

Realizar la identificación y numeración de Bacillus cereus a partir de alimentos de panadería.

Conocer los medios de cultivo y la técnica de aislamiento de Bacillus cereus.

II.- MARCO TEORICO

Bacillus cereus:

Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su hábitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entre otros alimentos.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas por alimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios más difundidos en la actualidad

Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados o contaminados por este microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que son perfectamente evitables; la primera descripción de un brote de gastroenteritis data de principios de 1900

En nuestro país casos de brotes de ETA denunciados y confirmados, por este tipo de microorganismos han sido esporádicos, 3 brotes en los últimos 9 años.

B. cereus puede producir dos enterotoxinas: la toxina diarreica y la toxina emética. Los síntomas de la toxiinfección tienen dos formas de presentación con presencia de diarrea, dolores abdominales y vómitos.

Su período de incubación varía de 4 a 16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.

Los Laboratorios de Microbiología Alimentaria de los Municipios con infraestructura y capacidad analítica han realizado un seguimiento preventivo de este tipo de microorganismos en los alimentos que por su naturaleza pueden representar un vehículo de contaminación. La resistencia térmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicación, si las medidas higiénico sanitarias y de elaboración no son las adecuadas.

Taxonomía.

La familia Bacillaceae contiene una diversidad de bacterias formadoras de esporas incluyendo desde aerobios estrictos hasta anaerobios obligados, cocos y bacilos, tanto psicrófilos como termófilos

Es un microorganismo Gram positivo en los cultivos jóvenes y a medida que envejece puede verse como Gram variable o Gram negativo. Las esporas aparecen claras en la tinción de Gram y verdes con la tinción de esporas estas pueden estar dentro de la pared bacteriana o puede deformar la pared.

Las temperaturas de crecimiento: mínima están entre 15ºC a 20ºC y la máxima es entre 40ºC a 45ºC con un óptimo de 37ºC.

Tiene una morfología celular similar a la del B.anthracis pero a diferencia de éste, en general es móvil y no es susceptible a la penicilina o al fago gamma. La producción de esporas en presencia de oxígeno es un rasgo que define el género, así como su morfología. Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo tipo, y puede ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto tiene considerable oportunidad para estar presente en o sobre los alimentos. Las esporas fácilmente sobreviven la distribución en polvos y aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros habitas. Los alimentos secos como condimentos, leche en polvo y harinas pueden estar contaminadas con esporas.

Intoxicación alimentaria:

Nos referiremos esencialmente al papel del Bacillus cereus en la intoxicación alimentaria dejando de lado las actividades purulenta y necrotizante cutáneas que pueden verse. Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a través de la ingesta de alimentos contaminados. En general se admite que, debido a la levedad del cuadro y a que la detección microbiológica de esta bacteria no se realiza rutinariamente en pacientes diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada. Mas si tenemos en cuenta, que el cuadro clínico se confunde a menudo con los producidos por Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens, dependiendo de qué toxina esté involucrada.

La intoxicación alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidos sin la adecuada refrigeración durante horas antes de ser servidos. El consumo de alimentos que contienen 105 B.cereus/g o más puede provocarla. Los alimentos vinculados a brotes han sido carne y verduras cocidas, arroz frito o hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes de vegetales crudos.

Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la toxina diarreica y la toxina emética que dan lugar a dos formas clínicas distintas de intoxicación alimentaria.

El síndrome emético está producido por una toxina preformada y termoestable, al igual que la de S.aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado, tiene un período de incubación corto, habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los síntomas gastrointestinales altos manifestados por náuseas y vómitos. Este hecho ha llevado a confundir la intoxicación por B.cereus y atribuirla a S.aureus.

El síndrome diarreico por el contrario, está producido por la ingestión de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulación del organismo in vivo y de la producción de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada y termolábil tiene un período de incubación más largo que promedia entre 10 y 12 horas y las manifestaciones se relacionan con la afectación gastrointestinal baja similar a la intoxicación por Clostridiun perfringens . Los síntomas son dolor abdominal, diarrea acuosa profusa, tenesmo y nauseas que generalmente duran 12-24 hrs. y en algunos pacientes pueden durar más tiempo, de 2 a 10 días.

El aislamiento de Bacillus cereus de las heces de los pacientes no es documentación suficiente del brote, a menos que se obtengan cultivos negativos de materia fecal de un adecuado grupo control. Se puede realizar tipificación serológica para estudios epidemiológicos de disponer de los antisueros.

La intoxicación alimentaria por Bacillus cereus es auto limitada y no requiere tratamiento antimicrobiano, el tratamiento es sintomático y ocasionalmente es necesario rehidratación.

VI.-MATERIALES E INSUMOS

Placas Petri Pipetas Tubos de ensayo Matraz Microscopio a 10x a 100x Microscopio Mechero bunsen

INSUMOS

Agar peptona Agar Bacillus cereus

V.- METODOLOGIA

Procedimiento:

Se prepara el medio cultivo según la indicaciones del frasco

Preparar las diluciones con 10 g de muestra en 90 ml de agua peptonada y tubos de 9 ml cada uno. Diluir el alimento hasta 10-3

Sembrar por duplicado 0.1 ml de volumen el inoculo de cada dilución en el medio MYP y sembrar por diseminación con una espátula de drigalsky

Dejar incubar a 48 h por 30ºC Seleccionar las colonias sospechosas grandes ,irregulares, rosadas lisas Escoger de cada placa 5 colonias y realice la prueba bioquímica Realizar la confirmación bioquímica, pre calculo y reporte en ufc/g de alimento.

Diagrama de coloración Gram

Extendido y fijación

Lavar por 1min

Lavar por 1min

Lavar por 1min

lavar por 1 min

Observar a 10x y 100x

*color azul indica (+) y rosada y rojizo (-)

CALCULOS REALIZADOS

Para agar Bacillus cereus (para 6 placas)

20,5gr -------------------475 ml

Cristal violeta

Lugol

Alcohol acetona

Safranina

X --------------------- 100 ml

X = 4.3 gr

Para agar peptona (para 2 tubos y 90ml de frasco)

10 gr------------------ 100 ml

X ---------------- 120 ml


DIAGRAMA DE FUJO DEL PROCEDIMIENTO (muestra solida)

10 gr de muestra de arroz cocido

1 ml 1 ml

H2Op 9 ml 9ml

10−2 10−3

10−1

Inocular 0.1 ml

De cada dilución

Siembra por desimanación 15 ml de medio Agar Bacillus cereus + yema de huevo y homogenizar con espátula de drigalski

Incubar por 48 ha 30C°

90 ml

Hacer la coloración Gram

VI.- RESULTADOS

Cuadro Nª01 resultados obtenidos de Bacillus cereus en muestra de arroz cocido

medios Diluciones recuento Tinción Gram

Agar Bacillus cereus

10−2 4 .9x 104 ufc/g

Gram positivo

De color violeta (característico de Bacillus cereus)

10−32 x103 ufc/g

LIA10−2

Características

No hubo cambio

10−3Cambio a color amarillo: hay degradación de glucosa

TSI10−2

Cambio a amarillo claro

10−3Cambio a amarillo claro

Simons10−2 No cambio nada

10−3 No cambio nada

VII.-DISCUSIONES

Para obtener buenos resultados debemos homogenizar bien el alimento, por

otro lado tenemos que trabajar en condiciones asépticas para no contaminar

con otros microorganismos.

Una mal dilución o diseminación no nos saldrá bien buenos resultados

perjudicándonos en el conteo de los microorganismos en ufc/ml o gr de

alimento analizado.

VIII.- CONCLUSIONES

en la primera practica no se logró realizar una buena siembra ,dando a esto,

a hacer otro practica y obteniendo buenos resultados y de una carga

microbiana en el arroz cocido o cocinado,

logrando una carga microbiana de 4.9 x 104 ufc/g en una dilución de 10−2

superando los límites permisibles de la norma establecida.

Los causa que causan este microorganismo son la emética y diarreica

produciendo dolores abdominales y del estómago cuando es ingerido estés

microorganismos por alimentos contaminados.






PARA: Ing. Saúl Moreano Carrasco




Juan Carlos Vera Gutiérrez (no aporto nada en el informe)

Yudy Chumbe Cahui

ASUNTO: INVESTIGACION YNUMERACION DE Staphylococcus aureus COAGULASA POSITIVA




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I.- RESUMEN

Staphylococcus aureus es un especie bacteriana integrada por formas cocaceas .es una especie muy sensibles a la acción del calor y de los desinfectante. En esta práctica se realizó con una finalidad de determinar la numeración de S.aureus en alimentos y las características de colonias representativas. Aisladas en un medio de cultivo agar Baird Parker más yema de huevo como emulsionante, efectuando con un método de diseminación en placas. Dando que en las pruebas de confirmó se dio negativo en el acidez del manitol, mientras en las otras pruebas no se logró la confirmación, por motivos de inoperatividad del microscopio óptico o falta de un mantenimiento de limpieza en su lente óptico respectivamente.

I. INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 mm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son Gram positivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes.

Más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación.

Además algunas cepas de S.aureus son patógenas para el hombre porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suficiente de enterotoxinas para producir la enfermedad en el consumidor.

Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxinas estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.

El método de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 S. aureus por gramo.

II. OBJETIVOS:

Determinar la numeración de staphylococcus aureus en alimentos.

Evalúa las características de las colonias y las células bacterianas al

microscopio óptico.

III. MARCO TEORICO

DESCRIPCIÓN DE LA BACTERIA:

Staphylococcus es un género de bacterias anaerobias Gram-positivas productoras de enterotoxinas termoestables ampliamente distribuida en el medio ambiente y presente en las mucosas de los animales y personas, transmitiéndose al ser humano a través de alimentos contaminados, generándole una toxiinfección alimentaria.

LAS TRES CONDICIONES NECESARIAS PARA SU ÓPTIMO DESARROLLO SON:

o PH cercano a la neutralidado Temperatura alrededor de 30ºC o Ausencia de microorganismos competitivos.

Este último punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos.

Condiciones de crecimiento de las toxinas producidas por Staphylococcus aureus

Mínimo Óptimo Máximo

Temperatura 10 40-45 48

pH 4 7-8 9,6

Actividad del agua

0,85 0,98 0,99

Staphylococcus se puede encontrar

a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual

b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lácteos, también se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sería el jamón; otro factor importante en los alimentos es el pH, así tenemos en el caso de la mayonesa, ésta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxigénico. c) también se puede localizar en personas y animales.

Estos últimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos.

En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma específica en el tracto nasofaríngeo, cabello y piel del 50% o más de los individuos, sin causar daño aparente (portadores asintomáticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patógena dentro del género Staphylococcus y está comúnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumonía y en algunos casos puede llegar a ocasionar pérdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las más importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.

COMO SE PRODUCE LA CONTAMINACION EN LOS ALIMENTOS:

o los alimentos son susceptibles a una contaminación post proceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de conservación inapropiadas; este problema se acentúa por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo

o El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre.

Como se mencionó con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la “A” la más nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicación, es de 100 UFC/g de alimento, de acuerdo con la Norma

o perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no están contaminados con este microorganismo, por esta razón el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto.

o Los alimentos sometidos a intensa manipulación durante su preparación y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2° C y por debajo de 60°

Enterotoxinas de S. aureusEnterotoxina ConceptoEnterotoxina A Asociada a la mayoría de las intoxicaciones alimentarias.Enterotoxina B Produce colitis pseudo-membranosa y se encuentra con

Regularidad en infecciones intra-hospitalarias.Enterotoxina C Se atribuye a productos lácteos contaminados.Enterotoxina D También se asocia a un gran número de intoxicaciones

Y se atribuye a productos lácteos contaminados.

ALIMENTOS MÁS INVOLUCRADOS EN LA INTOXICACIÓN ESTAFILOCÓCCICA.

Los alimentos perecederos tales como:

o carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sándwiches y papas, son los más comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocóccicas.

SINTOMAS DE UNA INTOXICACION ALIMENTARIA:

El establecimiento de los síntomas de la intoxicación, por lo general se presentan rápidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de:

https://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%A1cteo

https://es.wikipedia.org/wiki/Colitis_pseudomembranosa

https://es.wikipedia.org/wiki/Intoxicaci%C3%B3n_alimentaria

o la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo.

Los síntomas más comunes de intoxicación consisten en:

o náusea, vómito, dolor o espasmos abdominales y postración. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos síntomas asociados a la enfermedad.

o En casos más severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares así como cambios intermitentes en la presión sanguínea y pulso. La recuperación parcial se alcanza a los 2 días, sin embargo la recuperación completa puede durar más días en casos muy severos.

COAGULASA-POSITIVO:

El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del huésped.

Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones.

Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico. Demostrar la contaminación pos proceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitadas.

Cultivo

Los estafilococos crecen rápidamente en casi todos los medios bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofílicas.

Tiempo de cultivo en Sal-manitol

24 h Recomendado para los cultivos de muestras no contaminadas

24-48 hUsado en cultivos mixtos/contaminados.Recomendado para conseguir colonias de tamaño adecuado paramicroscopio y pruebas.

72 h Puede ser necesaria para aumentar la sensibilidad de las pruebas.

Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio: manitol-salino o Chapman y el medio Baird-Parker. Estos medios comerciales verifican la presencia de α-glucosidasa durante

el desarrollo (las colonias de S.aureus coagulasa negativos crecen en color azul, blanco o beige).

Su temperatura óptima de crecimiento va de 35 a 40 °C y el pH óptimo oscila entre 7,0 y 7,5 aunque soportan pH mucho más extremos. Soportan tasas elevadas de cloruro sódico, hasta un 15%.

Medidas de control y prevención

En la cadena alimentaria

o En las explotaciones y durante el sacrificio es importante aplicar las buenas prácticas agrícolas (BPA) y las buenas prácticas higiénicas (BPH) que con-tribuyen a reducir el número de Staphylococcus.

o Durante la transformación de los alimentos, hay que evitar el uso de materias primas que puedan ser contaminadas con S. aureus (aunque se elimine la bacteria por tratamiento térmico, las enterotoxinas pueden estar presentes y su eliminación es muy difícil).

Por tanto, es importante cumplir con los criterios microbiológicos de las materias primas y los sistemas de autocontrol basados en el Análisis de Peli-gros y Puntos de Control Crítico (APPCC).

Tratamientos de inactivación

Los fabricantes de alimentos envasados deben someter a sus productos a una temperatura elevada durante un periodo de tiempo determinado para garantizar que no se formen las enterotoxinas estafilocócicas.

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Medio_manitol-salino&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Medio_manitol-salino&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/wiki/Medio_diferencial

o El tratamiento principal de inactivación de Staphylococcus aureus consiste en aplicar calor por encima de 45ºC, pero si las toxinas ya se han formado previa-mente, la destrucción de las células viables de la bacteria no inactiva la actividad biológica de las enterotoxinas estafilocócicas formadas. Asimismo, es necesario mantener la cadena de frío durante el transporte, almacenamiento y distribución de los alimentos crudos susceptibles de ser contaminados con Staphylococcus.

En usos diarios

Muchos de los brotes de intoxicación de enterotoxinas estafilocócicas se producen en el hogar por un inadecuado cocinado (<45ºC) y mala conservación de los alimentos (>10ºC), por lo que es recomendable seguir ciertas buenas prácticas de higiene y manipulación en la preparación de los alimentos, especialmente en alimentos que vayan a consumirse crudos o con tratamientos leves de conservación.

• Limpieza de las manos antes de manipular cualquier alimento. • Desinfección de los utensilios, tablas, superficies. • No consumir embutidos de procedencia no garantizada. • Cocinar bien los huevos, las carnes (vacuno, ternera, cordero, aves), los pescados, y los productos elaborados con ellas y mantenerlos calientes hasta su consumo. Tras su consumo, refrigerar los excedentes lo antes posible (5ºC). • No descongelar los alimentos a temperatura ambiente, sino en la parte baja del frigorífico. • Evitar la contaminación cruzada de alimentos crudos con cocinados. • Lavar bien las frutas y hortalizas con agua corriente cuando vayan a ser consumidos en crudo. • Mantener la cadena de frío durante el transporte de los alimentos crudos susceptibles de ser contaminados con S. aureus. • Mantener los alimentos elaborados con huevo crudo como mayonesa, salsas, helados, cremas, masas de pastelería a temperaturas seguras (calientes por encima de 60ºC o refrigerados en la nevera) hasta su consumo.

Cuadro N°01 límites permisibles

Alimento Límite micro-biológico máximo permitido

Fase en la que se aplica el criterio

Acción en caso de resultados insatisfactorios

Quesos a base de leche cruda

104 105 ufc/g

En el momento del proceso de fabricación en el que se prevea que el número de estafilococos será el máximo

Mejoras en la higiene de la producción y selección de las materias primas. Si se detectan valores > 105ufc/g, el lote de queso deberá ser sometido a pruebas para enterotoxinas estafilocócicas

Quesos hechos a base de leche sometida a un tratamiento térmico inferior a la pasteurización (7) y quesos madurados a base de leche o suero sometidos a pasteurización o tratamiento térmico más fuerte (7)

100 1000 ufc/g

Quesos blandos no madurados (quesos frescos) a base de leche o suero sometido a pasteurización o un tratamiento térmico más fuerte (7)

10 100 ufc/gFinal del proceso de fabricación

Mejoras en la higiene de la producción. Si se detectan valores > 105ufc/g, el lote de queso deberá ser sometido a pruebas para enterotoxinas estafilocócicas

Leche en polvo y suero en polvo (4) 10 100 ufc/g

Final del proceso de fabricación

Mejoras en la higiene de la producción. Si se detectan valores > 105ufc/g, el lote de queso deberá ser sometido a pruebas para enterotoxinas estafilocócicas

(4) El criterio no se aplica a los productos destinados a una transformación posterior en la industria alimentaria. (7) Excluidos los quesos en los que el fabricante pueda demostrar, a satisfacción de las autoridades competentes, que el producto no plantea un riesgo de enterotoxina estafilocócica.

IV. MATERIALES E INSUMOS Queso fresco Balanza digital Placas preti Pipetas Frasco tapa rosca Contador de colonias Espátula de drigalski Varilla de vidrio

INSUMOS Agar Baird Parker Agar manitol sado Emulsión de yema de huevo

REACTIVOS Y COLORANTES

Reactivo para la catalasa (peróxido de hidrogeno) Kit para la coloración Gram Cepas o patrones de referencia}

V. PROCESDIMIENTO

PARA EL DÍA 1 Y 2

Pesar 10 gr de muestra colocar en un recipiente que contiene 90 ml de agua peptona al 0.1% mezclar y homogenizar por 1 min y proceder a preparar las diluciones.

Preparar las diluciones hasta 10-3 e inocular 1 ml de cada dilución en placas preti de 15 mm de agar Baird Parker por duplicado para cada dilución.

Incubar a 35C°o 37C°/24 horas. Seleccionar para la numeración 0.1 ml de homogenizado de sus diluciones

respectivamente a la superficie del medio Baird Parker.

DIA 3

Elegir las placas que contienen colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco rodeadas áreas claras .para hacer un recuento elegir las placas entre 20 a 200 colonias aisladas y contar.

Seguidamente repicar no menos de 5 colonias sospechosas de S.aureus en agar manitol, realza la prueba de la catalasa, coloración Gram.

CALCULOS REALIZADOS:

Para agar Baird Parker

63 gr-------------------950ml

X-------------------92ml

X= 6.10 gr de Baird Parker

Para agar manitol

111gr------------------1000 ml

X--------------------35 ml

X= 3.9 gr

microbiologia agroindustrial 2015-I

Para agua peptona

120 ml-----------------100%

X----------------1%

X= 1.2 gr

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AGROINDUSTRIAL -IA 504-EAPIA-UMANBA


DIAGRAMA DE FLUJO DE PROCEDIMIENTO (muestra solida)

DIAGRAMA DE COLORACION GRAM

Extendido y fijación

Lavar por 1min

Lavar por 1min

Lavar por 1min


Cristal violeta

Lugol

Alcohol acetona

Safranina


Observar a 10x y 100x

VI. RESULTADOS

Cuadro N°02 de investigación y numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positiva.

Medio de cultivo

Factor de dilución (ml)

Color de colonias

Por cuadrantes

Ufc/ml

Agar Baird Parker + yema de huevo

10−1Amarillento cremoso 1.37 x104

10−2Amarillento cremoso 5.1 x104

10−3translucidos cremosos 9 x104

Volumen de dilución = 0.1ml / Ufc/ml= NVxFd

Cuadro N°03 prueba de confirmación de coagulosa positiva.

Coloración Gram

Acidez del manitol

Prueba de catalasa

Se realizó la coloración Gram respectivamente con dos portaobjetos. No se logró divisar cocos en racimos en el microscopio óptico.

En el agar manitol dio un viraje de color rojo, esto nos indica que es negativo (-).

En esta prueba no teníamos el reactivo (peróxido de hidrogeno al 3%), se intentó hacer con el 0,025% de H2O2. sin embargo este concentrado no era lo adecuado para descomponer la enzima de catalasa.Por lo tanto no se logró observar la efervescencia.


49 37

26 25

13 10

4 24

1 0

5 3


VII. DISCUSIONES

Este microrganismo Staphylococcus aureus es reconocido como patógeno humano siendo el agente de un amplio aspecto de intoxicación de origen comunitario y hospitalario.

En el momento del proceso de fabricación en el que se prevea que el número de estafilococos será el máximo 104105 ufc/g o 1.04105 x105 ufc/g de colonias, pero sin embargo el número de colonias encontradas en queso fresco era de la práctica era de 1.37 x104 ufc/g dando en un parámetro permisible de consumo humano.

Haciendo las pruebas respectivas de Staphylococcus aureus de coagulasa positiva, encontrando una prueba negativa en la prueba confirmativa de acidez del manitol, mientras en la coloración y de la catalasa no se observó bien las características de S.aureus. Por factores de problema del microscopio óptico y un reactivo que no se encontró en laboratorio de microbiología.

VIII. CONCLUSIONES

Pudimos ver: cómo podemos mostrar en los resultados con una carga microbiana fue de 1.37 x104 ufc/g, la especie calculada corresponde a S.aureus coagulasa positiva, esto nos representa que el alimento es en límites permisibles de consumo según las nomas dadas.

Siendo productoras de enfermedades que puede causar este microorganismo son los vómitos violentos y hasta puede ser incontrolables. Los alimentos implicados y más frecuentes son: pollo, crema productos de panadería y quesos elaborados.


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