AMINOÁCIDOS: SOLUBILIDAD, CURVA DE TITUACIÓN Y SEPARARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Jessica A. Monsalve, Sayda M. SuárezFacultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales.

Universidad de los Llanos, Villavicencio-Colombia

RESUMEN

La cromatografía de capa fina, consiste en la separación de una mezcla por medio de la diferencia de las solubilidades entre dos sistemas disolventes, a partir de esto se realizó la separación de los aminoácidos: tirosina, glicina, triptófano y una muestra problema, que se revelaron e identificaron mediante la reacción con la Ninhidrina.

La representación gráfica de la variación del pH de una solución debida al agregando de una base o un acido se denomina curva de titulación. La curva de titulación surge entonces de la relación entre la cantidad de acido o base agregada a una solución y la variación del pH de la misma. Se llevó a cabo la titulación de Metionina y Glicina, con el ácido HCl y la base NaOH, para determinar el punto isoeléctrico de cada uno.

Palabras Claves: solubilidad, separación por cromatografía de capa fina, curvas de titulación, índice hidropático, factor de retención, punto isoeléctrico, pK.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son básicamente veinte aminoácidos diferentes, los cuales contienen un grupo carboxilo (-COOH, acido débil) y un grupo amino (-+NH3, base débil) unidos al mismo átomo de carbono. Estos aminoácidos difieren unos de otros únicamente por la naturaleza de sus grupos R, que varían en estructura, tamaño, carga eléctrica y reactividad química1.

Todos los aminoácidos presentan al menos un grupo ácido y un grupo básico que se ionizan cuando están en solución, por lo que los aminoácidos pueden tener propiedades de acido y de base, es decir, son anfotéricos2. Cada grupo tiene un pK, el cual corresponde al pH en el que se encuentra la misma

cantidad de la forma no ionizada que de la ionizada.

Los aminoácidos tienen al menos dos pK, por lo que tienen mayor capacidad amortiguadora, ya que presentan de tres a cuatro formas iónicas diferentes. Cuando la forma iónica tiene una carga neta de cero (zwitterion), se dice que se encuentra en su punto isoeléctrico o pi. Al variar el pH, cambia la proporción de las formas iónicas y es posible ver la capacidad amortiguadora de los aminoácidos. Cada aminoácido tiene sus propios pK, puesto que presenta diferentes sustituyentes en sus cadenas laterales.

En la práctica de laboratorio se hizo la titulación, de la glicina y metionina, con HCl, hasta lograr un pH de 1.5 y

1 Gonzales et al, 2009; Moore & Langley, 20082 VOET & VOET. Fundamentos de bioquímica, 2004

NaOH, llegando a un pH de 12.5, para luego determinar los valores de pK y el punto isoeléctrico de cada uno.

Se realizo la separación de mezclas por medio de cromatografía de capa fina, en la cámara cromatografica ocurre la separación de las mezclas debido al disolvente, el arrastre de mezclas se llevo a cabo por la fase móvil y la estacionaria.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CURVA DE TITULACIÓN

METIONINA

Figura 1: Estructura del Aminoácido Metionina.

Estructuralmente el Aminoácido Metionina contiene un grupo carboxilo, un grupo amino, un átomo de Hidrogeno y una cadena lateral tioeter, es decir, un puente de azufre entre una cadena carbonada; al contener los grupos carboxilo y amino se puede comportar como acido o base dependiendo de la sustancia con la que reaccione denominándoseles anfóteras, cada uno de estos grupos son ionizables presentan una fuerza en la cual la molécula es capaz de disociarse denominada pK, en la que estos grupos puede ganar o perder protones quedando cargados positiva o negativamente, el promedio de los pK se obtiene el punto isoeléctrico donde la carga neta es cero.

En la titulación del aminoácido con ácido clorhídrico 0,1M, el aminoácido actúa como donador de protones, acidificándose a medida que se aumenta el volumen del titulante; al titular con Hidróxido de Sodio (NaOH), el aminoácido actúa como aceptador de protones.

HCl pH NaOH pH 0.00 5.75 0.00 7.32

1 3.83 1 7.452 3.53 2 7.023 3.31 3 7.754 3.17 4 7.825 3.06 5 7.936 2.97 6 8.127 2.88 7 8.208 2.81 8 8.309 2.75 9 8.38

10 2.68 10 8.4511 2.62 11 8.5312 2.57 12 8.5913 2.53 13 8.6614 2.48 14 8.7315 2.44 15 8.7816 2.40 16 8.8417 2.36 17 8.8818 2.32 18 8.9319 2.28 19 8.9820 2.25 20 9.0521 2.22 21 9.1022 2.19 22 9.1423 2.15 23 9.1824 2.12 24 9.2425 2.09 25 9.3026 2.07 26 9.3627 2.05 27 9.4128 2.02 28 9.4629 2.00 29 9.5330 1.97 30 9.5931 1.96 31 9.6432 1.93 32 9.7133 1.90 33 9.7834 1.88 34 9.8735 1.86 35 9.9236 1.84 36 10.0537 1.83 37 10.1738 1.80 38 10.32

39 1.78 39 10.4940 1.76 40 10.7241 1.75 41 10.9542 1.73 42 11.1543 1.71 44 11.4144 1.70 46 11.5845 1.68 48 11.7146 1.66 50 11.7947 1.65 52 11.9248 1.64 54 11.9749 1.62 56 12.0350 1.60 58 12.0851 1.59 60 12.1552 1.58 65 12.2354 1.55 70 12.3056 1.53 72 12.4658 1.50 74 12.47

    76 12.48

Tabla 1: Titulación con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminoácido Metionina.

En el eje de abscisas se representa la cantidad de agente titulante y en el eje de ordenadas, el pH obtenido.

Se determinaron dos pK para el aminoácido, tal como lo muestra la grafica 1. Puede notarse, que no se encontraron los pK exactos del aminoácido, pero se establece un rango para estos y el punto isoeléctrico.

-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 800

2

4

6

8

10

12

14Curva de Titulación de Metionina

mL de Titulante HCl/NaOH

pH

pK1: 2,3

pK1: 2,3

pI: 5,74

Grafica 1: Curva de titulación Aminoácido Metionina.

Datos Teóricos

Alfa-COOH: 2.28 Alfa-NH3

+: 9.21

Punto Isoeléctrico: 5.743

Formula:

pI= pKa1+ pKa22

pI=2.28+9.212

=5.74

Datos Prácticos

pKa: Metionina

pK1= 2,3

3 http://es.wikipedia.org/wiki/Metionina

pK2= 9,6 pI=2,23+9,62

=5,91

GLICINA

CURVA DE TITULACIÓN

-150 -100 -50 0 50 100 150 -

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

Curva de Titulación de la GLICINA

mL de Titulante HCl/NaOH

pH

Grafica 2: Curva de titulación Aminoácido Glicina.

El aminoácido glicina es un ácido diprótico, que se caracteriza por tener dos constantes de ionización y por consiguiente dos pKs:El primero (pK1) corresponde a la disociación del grupo carboxilo (-COOH). El segundo (pK2) corresponde a la disociación del grupo amino (NH3

+).

Entre estos dos pK se sitúa el punto de equivalencia de las dos disociaciones iónicas: se conoce como punto isoeléctrico, para el cual las cargas (+) y (-) se encuentran en equilibrio.4

4 http://www.um.es/bbmbi/Areas/Quimica/Practicas/Practica01/Practica01.htm

Datos Teóricos

pKa Glicina

Alfa-COOH: 2.34Alfa-NH3

+: 9.60

Punto Isoeléctrico: 5.74

Formula:

pI= pKa1+ pKa22

pI=2.34+9.602

=5.97

Datos Prácticos

pKa: Glicina.

pK1= 1,63pK2= 10,2

pI=1,52+10,22

=5,86

HCl pH NaOH pH0 6.45 0 6.671 4.14 1 7.882 3.80 2 8.23 3.60 3 8.344 3.47 4 8.525 3.35 5 8.596 3.27 6 8.767 3.18 7 8.868 3.10 8 8.879 3.05 9 8.93

10 2.99 10 8.9611 2.94 11 9.0212 2.88 12 9.0813 2.84 13 9.1214 2.80 14 9.1715 2.76 15 9.2216 2.72 16 9.2417 2.69 17 9.318 2.65 18 9.3419 2.62 19 9.3920 2.58 20 9.4221 2.55 21 9.4622 2.51 22 9.4823 2.49 23 9.5124 2.45 24 9.5525 2.42 25 9.5526 2.40 26 9.6527 2.38 27 9.7128 2.35 28 9.7629 2.32 29 9.830 2.30 30 9.8131 2.27 31 9.8832 2.24 32 9.9633 2.22 33 10.0134 2.20 34 10.0635 2.17 35 10.1436 2.15 36 10.237 2.13 37 10.2238 2.11 38 10.3439 2.08 39 10.540 2.07 40 10.5241 2.04 41 10.5442 2.03 42 10.76

43 2.01 43 10.8344 1.99 44 10.8445 1.96 45 10.8746 1.94 46 10.9847 1.92 47 11.0448 1.91 48 11.1349 1.90 49 11.1550 1.89 50 11.251 1.88 51 11.2352 1.87 52 11.3153 1.85 53 113354 1.84 54 11.3555 1.83 55 11.3856 1.82 56 11.457 1.81 57 11.4158 1.79 58 11.4359 1.78 59 11.4560 1.77 60 11.4661 1.76 61 11.4762 1.75 62 11.4863 1.74 63 11.564 1.73 64 11.5165 1.72 65 11.5266 1.72 66 11.5367 1.71 67 11.5468 1.70 68 11.5569 1.69 69 11.5670 1.692 70 11.5772 1.679 71 11.5874 1.660 72 11.5976 1.651 73 11.678 1.638 74 11.60780 1.625 75 11.61282 1.615 76 11.61984 1.603 77 11.6286 1.594 78 11.6388 1.587 79 11.63490 1.575 80 11.6492 1.568 81 11.64794 1.558 82 11.6596 1.552 83 11.65698 1.544 84 11.66

100 1.535 85 11.667102 1.528 86 11.67104 1.522 87 11.674106 1.515 88 11.68108 1.509 89 11.684111 1.500 90 11.687

    91 11.69    92 11.693    93 11.7

    94 11.702    95 11.705    96 11.706    97 11.71    98 11.711    99 11.712    100 11.714    105 11.729    110 11.73    115 11.74    120 11,75    125 11.755

Tabla 2: Titulación con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminoácido Glicina.

En el caso de la Metionina se obtuvieron pK1 y pK2, de acuerdo a su orden de disociación, primero está el carboxilo (2,3) y luego el grupo amino (9,6). El punto medio entre los dos pK1 y pK2 es el punto de inflexión de la curva de titulación, o sea el punto isoeléctrico que en este caso vendría siendo 5,74

Lo mismo sucede con la glicina, primero se disocia el grupo carboxilo (1,63) y luego el amino (10,2), el punto isoeléctrico es de 5,86.

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA EN AMINOÁCIDOS.

FACTOR DE RETENCIÓN:La relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa se conoce como Rf

a= Distancia desde el punto de siembra hasta el frente de elución del solvente.

b= Distancia desde el punto de siembra hasta donde aparece la mancha de color después del desarrollo de la cromatografía.

RF=ba

Figura 2: separación de mezclas por cromatografía en capa fina.

MUESTRA PROBLEMA: esta sustancia contenía dos compuestos donde el proceso de cromatografía permitió la separación de las dos mezclas.

RF= 15,6

= 0,178

RF=3,55,6

= 0,63

TRIPTOFANO

RF=3,75,8

= 0,637

TIROCINA

RF=3,15,8

= 0,534

GLICINA

RF= 15,6

= 0,178

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utilizo para separar moléculas relativamente pequeñas. La separación de mezclas de las moléculas es mediante la cromatografía de capa fina que consiste en reparto entre dos fases. Consiste de una fase estacionaria y una fase móvil, los disolventes más

polares eluyen rápidamente a los solutos que tengan mayor tendencia a quedar retenidos. Cuanto más polar sea el disolvente, menor es su poder de elusión, porque disuelve menos a los solutos no polares; sabiendo que los aminoácidos son polares y apolares, donde la parte polar tiende a ser atraída por el agua debido a que es hidrofílica; y la parte apolar tiende a esconderse debido a que es hidrofobica; las Moléculas más polares quedan más retenidas en la fase estacionaria, es decir "corren menos", mientras que las moléculas menos polares se ven menos retenidas y avanzan a mayor velocidad arrastradas por eluyente. En este proceso se determino el factor de retención, se tomo las mediciones del eluyente y como las sustancias eran incoloras se les roció un poco del reactivo de ninhidrina para observar el recorrido de la separación, se obtuvo para la glicina 0,178 y 0,63, tirosina 0,534, muestra problema 0,178, triptófano 0,637. Donde, las moléculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce la elución van siendo desplazadas por la fase móvil. El factor de retención para la muestra problema fueron dos RF, donde según los valores, se relacionan para determinar que el analito contiene dos sustancias que son glicina y triptófano se afirma que la cromatografía sirve para la separación de dos mezclas.

CONCLUSIONES

A través de la práctica, se comprobaron las características anfóteras del aminoácido, ya que al titular con acido se encontró una aproximación del Pk1 del carboxilo así mismo al titular con hidróxido el Pk2

aproximado del amino apareció, así al

encontrar los 2 pK se demuestra las propiedades dipolares de los aminoácidos.

Se separo una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina. Se identificó los compuestos desconocidos en una mezcla por comparación del cromatograma de la mezcla con el del compuesto conocido.

BIBLIOGRAFÍA

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David L. Nelson, Michael N. Cox, Lehninger -   PRINCIPIOS DE BIOUIMICA. 4º edición.

Aum, Stuart. INTRODUCCIÓN A LA QUÍMICA ORGÁNICA Y BIOLÓGICA. 1 ed.   Compañía           Editorial Continental, S.A. de C.V. México (1981)

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Dickson T.R. Introduccion a la química, Edit Publicaciones cultural 16ª ed México 1999 pp. 259Allier Rosalía etal LA MAGIA DE LA QUÍMICA editorial EPSA, México DF 1995 1º edición pp123 - 12

FIGURAS:

Figura 1: Estructura del Aminoácido Metionina.

Figura 2: separación de mezclas por cromatografía en capa fina.

TABLAS:

Tabla 1: Titulación con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminoácido Metionina.

Tabla 2: Titulación con HCl 0,1 M y NaOH 0,1 M, en muestra de Aminoácido Glicina

GRAFICAS: Grafica 1: Curva de titulación Aminoácido Metionina.

Grafica 2: Curva de titulación Aminoácido Glicina.