informe de práctica profesional

INFORME DE PRÁCTICA PROFESIONAL

VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DEL BRIX INVERTIDO EN BEBIDAS GASEOSAS MEDIANTE EL USO DEL

EQUIPO SOFT DRINK ANALYZER M.

LUIS ALBERTO PÁJARO VILLALOBOSC.C. 1.069’464’904

ASESORES:MARÍA ISABEL MEJÍA CORREA

WILMAR ALEXANDER MEJÍA OSPINA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIAFACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICAMEDELLÍN

Gracias a Dios por todas las bendiciones recibidas.A todo el equipo del Laboratorio Central de Postobón S. A. por la

oportunidad brindada.A mis padres Elsy y Luis Roberto por todos los sacrificios realizados para

alcanzar este sueño.A Dionys por todo el apoyo y la comprensión manifestado todo este

tiempo.Y a todas aquellas personas involucradas en este proyecto.

2

Tabla de contenido

1. RESUMEN............................................................................................................................11

2. INTRODUCCIÓN...............................................................................................................12

3. OBJETIVOS.........................................................................................................................14

3.1. GENERAL.....................................................................................................................14

3.2. ESPECÍFICOS.............................................................................................................14

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................15

5. MARCO TEÓRICO............................................................................................................16

5.1. VALIDACIÓN DE MÉTODOS...............................................................................16

5.1.1. Definición e importancia del proceso de validación..................16

5.1.2. Necesidad de un proceso de validación...........................................17

5.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS...................................19

5.2.1. Según la normalización y estado de desarrollo del método.19

5.2.1.1. Métodos normalizados o estándar...............................................19

5.2.1.2. Métodos no normalizados (modificación de un método normalizado)................................................................................................................20

5.2.1.3. Métodos desarrollados por el laboratorio...............................21

5.2.2. Parámetros a validar según la normalización y estado de desarrollo del método................................................................................................21

5.2.3. Según la categoría del método [1]......................................................22

5.2.3.1. Categoría I.................................................................................................22

5.2.3.2. Categoría II................................................................................................22

5.2.3.3. Categoría III..............................................................................................22

5.2.4. Parámetros a validar según la categoría del método..............22

5.3. PARÁMETROS DE RENDIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL MÉTODO..................................................................................................................................23

5.3.1. Linealidad...........................................................................................................23

5.3.1.1. Evaluación estadística de linealidad [1]...................................25

5.3.1.2. Análisis de la varianza (ANOVA)...................................................28

5.3.1.2.1......................................................Homogeneidad de las varianzas28

3

5.3.1.2.2...........Prueba de normalidad o distribución normal de los residuales...................................................................................................................29

5.3.1.2.2.1..................................Prueba verificación de la pendiente31

5.3.1.2.2.2......................................Prueba verificación del intercepto32

5.3.1.3. Pasos generales para evaluar la linealidad y el rango de trabajo 32

5.3.2. Rango....................................................................................................................33

5.3.3. Robustez.............................................................................................................33

5.3.3.1. Procedimiento para el cálculo de robustez............................34

5.3.3.2. Diseño y ejecución de experimentos..........................................35

5.3.4. Selectividad [9]...............................................................................................36

5.3.4.1. Determinación de la selectividad [2].........................................37

5.3.5. Estabilidad.........................................................................................................38

5.3.6. Exactitud [9].....................................................................................................38

5.3.6.1. Veracidad...................................................................................................39

5.3.7. Precisión.............................................................................................................42

5.3.7.1. Repetibilidad............................................................................................43

5.3.7.1.1..........................................................Repetibilidad del instrumento44

5.3.7.1.2....................................................................Repetibilidad del método45

5.3.7.2. Precisión intermedia............................................................................45

5.3.7.3. Reproducibilidad....................................................................................46

5.4. EQUIPO Y PRINCIPIO DE MEDICIÓN.............................................................47

5.4.1. Especificaciones del equipo.....................................................................47

5.4.1.1. Métodos predeterminados...............................................................48

5.4.2. Principio de medición [12].......................................................................52

5.4.2.1. Definición de densidad y gravedad específica.....................52

5.4.2.2. Método oscilatorio del tubo en U.................................................52

5.4.2.3. Análisis de velocidad del sonido...................................................53

5.4.2.4. El número de densidad (d)...............................................................54

4

5.4.2.5. El número de sonido (s).....................................................................54

5.4.3. Calibración.........................................................................................................55

5.4.3.1. Cálculo de la densidad del aire......................................................55

5.4.3.2. Densidad del agua.................................................................................56

5.4.4. Conversión a grados Brix (°Bx)..............................................................56

5.5. EL AZÚCAR.................................................................................................................58

5.5.1. Definición...........................................................................................................58

5.5.2. Composición......................................................................................................58

5.5.3. Propiedades químicas y físicas.............................................................59

5.5.4. Proceso de inversión del azúcar...........................................................60

5.5.4.1. Definición...................................................................................................60

5.5.4.2. El fenómeno de inversión..................................................................62

5.6. BRIX...............................................................................................................................62

5.6.1. El concepto de Brix.......................................................................................62

5.6.2. Importancia de la medición del Brix en la industria alimenticia.........................................................................................................................64

6. DESARROLLO DEL PROYECTO.................................................................................65

6.1. VALIDACIÓN DEL EQUIPO SOFT DRINK ANALYZER M PARA LA MEDICIÓN DE LA DENSIDAD Y BRIX INVERTIDO DE UNA MUESTRA GASEOSA................................................................................................................................65

6.1.1. Equipos usados en la validación...........................................................65

6.1.1.1. Estación de desgasificación.............................................................65

6.1.1.2. Baño maría.................................................................................................66

6.1.1.3. Balanza........................................................................................................66

6.1.1.4. Reactivos....................................................................................................66

6.1.1.5. Otros recursos.........................................................................................66

6.1.2. Parámetros a validar y valores estimados para su aceptación.........................................................................................................................67

6.1.3. Muestras y patrones de referencia.....................................................68

6.1.3.1. Muestra control.......................................................................................69

6.1.3.2. Patrón de referencia............................................................................70

6.1.4. Condiciones ambientales..........................................................................70

6.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN.....................................................................71

5

6.2.1. Verificación de las lecturas. Comparación entre tabla NBS y el ICUMSA...........................................................................................................................71

6.2.2. Comparación entre los equipos DMA-58 y SDA-M......................71

6.2.3. Validación del equipo Soft Drink Analyzer M................................71

6.2.3.1. Linealidad...................................................................................................72

6.2.3.2. Rango............................................................................................................72

6.2.3.3. Robustez.....................................................................................................73

6.2.3.4. Selectividad...............................................................................................73

6.2.3.5. Estabilidad.................................................................................................75

6.2.3.6. Exactitud.....................................................................................................75

6.2.3.7. Precisión.....................................................................................................76

6.2.3.7.1...............................................................................................Repetibilidad77

6.2.3.7.1.1...............................................Repetibilidad del instrumento77

6.2.3.7.1.2.........................................................Repetibilidad del método77

6.2.3.7.2..............................................................................Precisión intermedia77

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS..........................................................................................78

7.1. VERIFICACIÓN DE LAS LECTURAS. COMPARACIÓN ENTRE TABLA NBS Y EL ICUMSA...............................................................................................................78

7.2. COMPARACIÓN ENTRE LOS EQUIPOS DMA-58 Y SDA-M...................88

7.3. Validación del equipo Soft Drink Analyzer M........................................89

7.3.1. Comparación entre las lecturas con el procedimiento normal de inversión y las lecturas sin inversión.........................................................89

7.3.2. Linealidad...........................................................................................................93

7.3.3. Rango....................................................................................................................99

7.3.4. Robustez...........................................................................................................100

7.3.4.1. Análisis de estabilidad de la muestra......................................100

7.3.4.2. Tiempo de desgasificación.............................................................104

7.3.5. Selectividad...................................................................................................107

7.3.6. Estabilidad.....................................................................................................108

7.3.7. Exactitud.........................................................................................................108

6

7.3.8. Precisión..........................................................................................................110

7.3.8.1. Repetibilidad del método.................................................................110

7.3.8.2. Precisión intermedia...........................................................................111

8. CONCLUSIONES.............................................................................................................113

9. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................115

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Parámetros a evaluar según la normalización y estado de desarrollo del método ........................................................................................................................21Tabla 2. Parámetros a evaluar según su categoría.......................................................22Tabla 3. Ecuaciones necesarias para el cálculo de la varianza en una regresión lineal.30Tabla 4. Procedimiento para evaluar la linealidad.........................................................32Tabla 5. Cálculo de robustez.........................................................................................36Tabla 6. Procedimiento general para cálculo de exactitud............................................41Tabla 7. Factores influyentes en la precisión................................................................47Tabla 8. Datos técnicos del equipo...............................................................................48Tabla 9. Métodos predeterminados por el equipo.........................................................49Tabla 10. Composición del aire seco en (v/v)................................................................56Tabla 11. Condiciones promedio del Laboratorio Central y cálculo de la densidad de aire...............................................................................................................................56Tabla 12. Propiedades físicas y químicas de la sacarosa...............................................60Tabla 13. Descripción de las muestras en el desarrollo del proyecto............................69Tabla 14. Condiciones ambientales promedio en el Laboratorio Central.......................70Tabla 15. Valores teóricos de las soluciones de Brix dto y su correspondiente valor en Brix inv..........................................................................................................................72Tabla 16. Rango de Brix invertido en bebidas gaseosas...............................................72Tabla 17. Rango de trabajo para evaluación de los ºBx................................................73Tabla 18. Tiempos de desgasificación de las bebidas...................................................73Tabla 19.Componentes seleccionados para el análisis de especificidad.......................74Tabla 20. Diseño de experimentos para especificidad..................................................74Tabla 21. Evaluación de estabilidad..............................................................................75Tabla 22. Patrón utilizado para el cálculo de exactitud.................................................76Tabla 23. Estándares utilizados en el cálculo de exactitud...........................................76Tabla 24. Diseño de experimentos para precisión intermedia.......................................77Tabla 25. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 6,316.............78Tabla 26. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 7,370.............78Tabla 27. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 8,421.............79Tabla 28. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 9,473.............79Tabla 29. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 10,526...........79Tabla 30. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 11,579...........80Tabla 31. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 12,631...........80Tabla 32. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 13,683...........80Tabla 33. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 14,735...........81

7

Tabla 34. Diferencia entre las lecturas obtenidas por los polinomios ICUMSA...............81Tabla 35. Intervalo del ºBx inv., en el que se mantiene constante la densidad.............82Tabla 36. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 6,316.............83Tabla 37. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 7,370.............83Tabla 38. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 8,421.............84Tabla 39. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 9,473.............84Tabla 40. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 10,526...........84Tabla 41. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 11,579...........85Tabla 42. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 12,631...........85Tabla 43. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 13,683...........85Tabla 44. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 14,735...........86Tabla 45. Diferencia entre las lecturas obtenidas por el polinomio ICUMSA (Sac/Pura) y la tabla NBS..................................................................................................................86Tabla 46. Intervalo del ºBx inv., en el que se mantiene constante la densidad.............87Tabla 47. Prueba de las varianzas.................................................................................88Tabla 48. Prueba de las medias....................................................................................88Tabla 49. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en densidad....................................................................................................88Tabla 50. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en ºBx inv.......................................................................................................89Tabla 51. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en densidad....................................................................................................90Tabla 52. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en ºBx inv.......................................................................................................90Tabla 53. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en densidad....................................................................................................91Tabla 54. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en ºBx inv.......................................................................................................91Tabla 55. Cálculo del contenido volumétrico de las diferentes muestras de mercado.. 93Tabla 56. Resultados para el estudio de linealidad en el SDA-M en ºBx directo............93Tabla 57. Resultados para estudio de linealidad en el SDA-M en ºBx invertido.............94Tabla 58. Parámetros de regresión lineal en el estudio de linealidad............................94Tabla 59. Resultados de la homogeneidad de las varianzas.........................................96Tabla 60. Resultados obtenidos en el análisis de ANOVA..............................................96Tabla 61. Normalidad de los residuos...........................................................................97Tabla 62. Test de verificación de la pendiente..............................................................97Tabla 63. Test de verificación término independiente...................................................98Tabla 64. Porcentaje de recuperación (%R) para los datos utilizados en el estudio de linealidad......................................................................................................................99Tabla 65. Sesgo del ºBx para los datos utilizados en el estudio de linealidad...............99Tabla 66. Resultados prueba de estabilidad de las muestras gaseosas......................100Tabla 67. Prueba de normalidad para la estabilidad de las muestras gaseosas..........103Tabla 68. Normalidad de la prueba de Tiempo de desgasificación..............................104Tabla 69. Normalidad eliminando datos extraños o dudosos......................................105Tabla 70. Datos obtenidos de la prueba de robustez..................................................106Tabla 71. Preparación de las soluciones con datos reales para análisis de selectividad.................................................................................................................................... 107

8

Tabla 72. Respuesta en términos de ºBx para las soluciones en el análisis de selectividad.................................................................................................................107Tabla 73. Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las distintas soluciones...................................................................................................................108Tabla 74. Cálculo de especificidades...........................................................................108Tabla 75. Resultados de exactitud para calibración con agua ultra pura....................109Tabla 76. Verificación de los patrones en términos de densidad.................................109Tabla 77. Verificación de los patrones en términos de ºBx.........................................109Tabla 78. Resultados de la repetibilidad del método en el SDA-M...............................110Tabla 79. Intervalos de confianza para el análisis de repetibilidad.............................111Tabla 80. Datos para el estudio de similitud de varianzas..........................................111Tabla 81. Resultados del estudio de similitud de las varianzas de los analistas..........111Tabla 82. Comparación de los coeficientes de variación.............................................112

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Gráfico de la función respuesta......................................................................24Figura 2. Distribución normal.......................................................................................30Figura 3. Algoritmo para evaluar la robustez de un método analítico...........................34Figura 4. Verificación de exactitud................................................................................39Figura 5. Procedimiento para el cálculo de la exactitud................................................41Figura 6. Precisión.........................................................................................................43Figura 7. Equipo Soft Drink Analyzer M.........................................................................47Figura 8. Esquema del proceso de medición en un densímetro....................................53Figura 9. Relación entre la densidad y la velocidad del sonido.....................................57Figura 10. Estructura química de la sacarosa................................................................59Figura 11. Reacción de inversión de azúcar por hidrólisis ácida....................................61Figura 12. Condiciones ambientales en el laboratorio...................................................70Figura 13. Regresión lineal para la densidad respecto a ºBx dto..................................95Figura 14. Regresión lineal para la densidad respecto al ºBx inv..................................95Figura 15. Estabilidad de la Colombiana Nacional a través del tiempo.......................101Figura 16. Estabilidad de la Manzana Interior a través del tiempo..............................102Figura 17. Estabilidad de la Seven Up a través del tiempo.........................................102

1. RESUMEN

10

En este trabajo se evaluó la capacidad del equipo Soft Drink Analyzer M (SDA-M) de la casa fabricante Anton Paar GmbH para determinar el Brix invertido de una muestra de gaseosa, sin llevar a cabo el proceso fisicoquímico de inversión. Para ello se realizaron diferentes validaciones siguiendo las normas nacionales e internacionales, con el fin de que el equipo adquirido por el Laboratorio Central de Postobón S.A. fuera utilizado en la evaluación mensual de la calidad de los productos, en reemplazo del equipo DMA-58 de la misma casa fabricante. En el trabajo se evaluó el rendimiento del SDA-M y se analizaron los resultados obtenidos para los parámetros de validación que incluyen: linealidad, rango, precisión, exactitud, robustez, entre otros.

Basado en el tratamiento estadístico, el análisis y la interpretación de los datos, los resultados indican que no existe una diferencia significativa entre los equipos comparados (el DMA-58 y el SDA-M) para el rango de Brix que normalmente poseen las bebidas gaseosas de la compañía (entre 6,000 y 15,000 ºBx). Por lo que se puede concluir que el SDA-M puede sustituir al DMA-58 como equipo en el análisis cotidiano de ºBx de las muestras gaseosas que se llevan a cabo en el Laboratorio Central, mostrando una mayor eficiencia en términos de tiempo de análisis de la muestra ya que éste tarda entre 4 a 5 minutos, mientras que el DMA-58 tarda entre unos 9 a 12 minutos.

2. INTRODUCCIÓN

11

Gaseosas Posada-Tobón (POSTOBÓN S.A.), es una empresa líder en el país que por 107 años se ha enfocado al desarrollo, la innovación, producción, comercialización y distribución de una gran variedad de bebidas no alcohólicas y refrescantes, entre las que se encuentran: Gaseosas, Jugos, Aguas, Hidratantes, Bebidas de té y Energizantes.

Una de las áreas más importantes de la compañía es la División Nacional de Gestión Calidad, que durante mucho tiempo ha mantenido un compromiso integral con el aseguramiento de la calidad de todas las marcas del portafolio de productos, al igual que las materias primas utilizadas en el proceso de producción, brindando con ello un soporte técnico y legal, ante cualquier eventualidad.

El Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A. es uno de los pilares fundamentales para el fortalecimiento de todo el proceso de gestión de calidad. En él se realizan análisis fisicoquímicos, microbiológicos y sensoriales, además de seguimientos a materias primas y empaques; todo con el objetivo de que los productos que el consumidor recibe, siempre se encuentren dentro los parámetros de calidad establecidos por la compañía para satisfacer sus gustos y necesidades, superando en todo momento sus expectativas; esto se logra haciendo evaluaciones mensuales de calidad del portafolio de productos, de los diferentes centros productores que se encuentran distribuidos en todo el territorio nacional.

Dentro de los análisis fisicoquímicos que se realizan en el Laboratorio Central, se encuentran: Determinación de grados Brix, pH, Acidez Titulable y Porcentaje de Acidez, así como el Volumen de Carbonatación, entre otros. Los resultados de estos análisis son precisos y de alta confiabilidad, y cumplen con los lineamientos establecidos en las normas nacionales e internacionales.

Uno de los parámetros de gran importancia para la compañía es el grado Brix (°Bx), que puede definirse básicamente como el porcentaje en peso de azúcar presente en la bebida, jarabe o jugo, ya que es éste precisamente el componente que se encuentra en mayor proporción, en comparación a los demás componentes que son utilizados en la fabricación de la bebida como lo son: el acidulante, el saborizante, el colorante, entre otros.

12

El azúcar, que es esencialmente sacarosa (un disacárido), sufre un proceso de inversión bajo condiciones ácidas y cambiantes de temperatura en el producto terminado, aumentando el porcentaje de sólidos disueltos en la muestra y haciendo compleja la medición del Brix en forma directa en el Laboratorio Central, ya que se desconoce el grado de inversión que tiene la bebida desde su fabricación hasta el momento del análisis.

Por esta razón, para poder determinar el Brix en el Laboratorio Central, es necesario llevar a cabo un procedimiento de inversión total en las muestras, en el cual se favorece la reacción de descomposición de la sacarosa y se alcanza el 100% en el grado de inversión, lo que evita interferencias e incertidumbres en el dato medido.

En este proyecto se evaluó la capacidad del equipo Soft Drink Analyzer M (densímetro distribuido por la casa fabricante Anton Paar GmbH) para determinar el Brix invertido en una muestra de bebida gaseosa sin tener que llevar a cabo el proceso fisicoquímico de inversión total, proceso que toma entre 2 y 3 horas, desde el momento del precalentamiento en el baño María hasta la medición y adquisición de los datos. Esto implica una mejora en los procedimientos internos del laboratorio, ya que se logra un ahorro en el tiempo de análisis y reporte de datos, mostrando con ello una optimización en la medición de dicha variable en comparación con el densímetro DMA 58 del mismo fabricante y que actualmente se utiliza en el Laboratorio Central.

13

3. OBJETIVOS

3.1. GENERAL

Validar la capacidad de un Soft Drink Analyzer M para determinar el Brix invertido de una bebida gaseosa sin llevar a cabo el proceso fisicoquímico de inversión empleado en el Laboratorio Central de Postobón S.A.

3.2. ESPECÍFICOS

Elaborar un instructivo práctico de calibración y operación del equipo Soft Drink Analyzer M para el buen uso de éste, de forma tal que se eviten errores en la lectura del Brix.

Evaluar la confiabilidad de una lectura de Brix invertido tomada por el Soft Drink Analyzer M frente a una medición realizada con el procedimiento convencional de inversión forzada, en términos de exactitud y precisión.

Estandarizar e implementar el procedimiento de medición de Brix invertido en bebidas gaseosas para tenerlo en cuenta en la evaluación mensual de calidad del Laboratorio Central.

14

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Dentro de la División Nacional de Gestión Calidad de Postobón S.A. se cuenta con el Laboratorio Central, en él se realizan numerosos análisis fisicoquímicos que van encaminados al aseguramiento de la calidad de toda la gama de productos de la compañía.

El Laboratorio Central de Postobón S.A., juega un papel fundamental a la hora de cumplir este objetivo puesto que en él se realiza mensualmente una evaluación de producto terminado elaborados por los 19 centros productores distribuidos a lo largo del territorio colombiano; esto con el fin de que el producto que recibe el cliente cumpla con los lineamientos establecidos por la compañía.

Este proyecto busca evaluar la capacidad del equipo Soft Drink Analyzer M (SDA-M) para medir la densidad y por medio de relaciones matemáticas determinar el Brix invertido (ºBx inv) de una muestra de gaseosa, sin llevar a cabo el proceso fisicoquímico de inversión, y de esta forma poder incluirlo en la evaluación mensual de calidad en sustitución del equipo DMA-58 en el que se hace necesaria la inversión, procedimiento que tarda entre 3 y 4 horas antes de que la muestra sea analizada y que ha venido desempeñando este papel durante los últimos años.

Teniendo en cuenta el volumen de muestras que se analizan en este laboratorio, el SDA-M ofrece una gran ventaja a la hora de obtener los mismos resultados, puesto que no se hace necesario la inversión de las muestras lo que conlleva a un ahorro de tiempo y dinero (compra y utilización de reactivos).

En este trabajo se llevó a cabo la validación de un método analítico, más exactamente la modificación de un método analítico normalizado, ya que incluye el cambio de un equipo. Esta validación evalúa si la modificación realizada, es decir, el cambio de equipo, influye en los resultados obtenidos en el análisis de manera significativa.

15

5. MARCO TEÓRICO

5.1. VALIDACIÓN DE MÉTODOS

5.1.1. Definición e importancia del proceso de validación

La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados entregados por dicho método son confiables. Cuando se realiza la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines previstos.

En este sentido, es importante que para el proceso de validación se asigne a un responsable de realizar dicha tarea. De manera que, la validación se efectúe en forma metódica, ordenada, trazable y confiable.

Otras definiciones sobre el proceso de validación son:

Establecimiento de evidencia documental de que un procedimiento analítico conducirá con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos. [1]

Según la Norma Técnica Colombiana NTC 17025 de 2005, la validación es la confirmación a través del examen y el aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico. [2]

Otra definición la define como el establecimiento de una base de datos experimental que certifica el rendimiento de un método analítico teniendo en cuenta su objetivo de diseño. [3]

Por otra parte, la validación es una confirmación por medio de una evaluación, que suministra la evidencia necesaria para ratificar que los objetivos de diseño del método bajo especificaciones particulares se cumplen en su totalidad. [3]

En todo proceso de validación existen dos objetivos fundamentales, el establecimiento de un método de análisis y la confirmación de su desempeño a través de tratamientos estadísticos que proporcionan los criterios de aceptación, rechazo o reanálisis de las lecturas hechas en dicho proceso; en otras palabras, el objetivo primordial de la validación es probar la aptitud del método utilizado, así como la capacidad del

16

laboratorio y su personal, con base en los parámetros estadísticos utilizados en el procedimiento.

5.1.2. Necesidad de un proceso de validación

La asociación europea de laboratorios enfocada al mejoramiento y la estandarización de métodos de análisis químico, Eurachem, propone algunas pautas para promover la buena práctica en las mediciones de análisis químico, estás son: [4]

Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un objetivo definido.

Los analistas encargados de los análisis deben estar calificados y deben ser competentes con las tareas asignadas, además deben mostrar que pueden realizar los análisis de forma adecuada.

Debe existir un aseguramiento periódico e independiente del desempeño de las técnicas de laboratorio.

Las mediciones analíticas deben hacerse usando métodos y equipos evaluados, con el fin de asegurar que éstos son adecuados para su propósito. En este último ítem en el que de forma implícita se menciona la validación, se puede ver que hace parte fundamental de las buenas prácticas para las mediciones de análisis fisicoquímico realizadas en un laboratorio.

También se pueden mencionar algunas otras razones que avalan o justifican la validación de los métodos analíticos, por mencionar algunos se tienen:

Demostrar que los métodos son adecuados para los análisis propuestos en las condiciones descritas. La validación es una herramienta que permite obtener pruebas documentales al respecto.

Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad en los resultados, lo cual a su vez minimizará el número de fallos y repeticiones, permitiendo un importante ahorro en costes.

Trabajar con métodos validados permite no sólo el conocimiento del método analítico, sino también cumplir con las exigencias de las normas legales NTC-ISO-IEC 17025, como también de las buenas prácticas de laboratorio, con el fin de asegurar la calidad.

Según la norma NTC-ISO-IEC 17025 versión 2005, el laboratorio debe validar los métodos no-normalizados, los métodos

17

diseñados/desarrollados por el laboratorio, los métodos normalizados empleados por fuera del alcance propuesto, ampliaciones y modificaciones de métodos normalizados; a fin de confirmar que los métodos sean los apropiados para el uso propuesto.

La validación debe ser tan extensiva como sea necesario para cumplir con todas las necesidades de la aplicación o campo de aplicación determinados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento empleado para la validación, y un informe en cuanto a la afinidad del método. [2]

La validación hace parte de un proceso continuo de mejoramiento de calidad de los laboratorios, es por ello que un proceso de validación debe realizarse cuando:

Se desarrolla un nuevo método para un problema en particular (primera validación).

Cambio o actualización de equipos de análisis. Obsolescencia y correspondiente actualización del método. Se renueva el principio activo o se realizan correcciones al

procedimiento debido a condiciones de logística o de diseño. Se establece un método usado en otro laboratorio o con diferentes

analistas. Cuando el control de calidad indica que el método establecido

reporta valores que varían con el tiempo. Cuando existen alteraciones de fondo en la matriz de análisis. Se desea demostrar la equivalencia de dos métodos, comparación

entre un método alternativo y uno normalizado.

Estos factores no son excluyentes y por lo tanto pueden efectuarse varios a la vez. Se recomienda, entonces, cuando sea necesaria una re-validación, realizar la mayor cantidad de cambios previstos a futuro, y de esta forma no será necesario ejecutar validaciones de manera seguida; es decir, si por algún motivo se realiza una corrección en el procedimiento y es necesaria la validación, se debe realizar una búsqueda bibliográfica de la técnicas actuales para el método en cuestión y evaluar si en ese momento existen mejores técnicas para dicho análisis y si es apropiada su aplicación.

El proceso de validación está limitado por el alcance que se requiere, es importante definir bien los objetivos iniciales y el alcance que tendrá, para de esta forma optimizar los ensayos. Es de anotar, que en una re-validación no es necesario realizar todo el proceso de validación, en ocasiones solo es necesario realizar el correspondiente análisis de robustez y precisión. [3]

18

5.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS

Los métodos analíticos se pueden clasificar según:

La normalización y estado de desarrollo del método. La categoría del método.

5.2.1. Según la normalización y estado de desarrollo del método

Estos pueden ser de tres tipos:

Métodos normalizados. Métodos no normalizados. Métodos desarrollados por el laboratorio.

5.2.1.1. Métodos normalizados o estándar

Los métodos estándar son aquellos publicados por organizaciones internacionales, regionales o nacionales; por organizaciones técnicas respetables; referencias legales; métodos publicados por la FDA (Food and Drug Administration) y que se ejecutan tal como se describen en la norma. Estos métodos incluyen aquellos publicados por:

United States Pharmacopeia (USP). National Formulary (NF). Homeopathic Pharmacopeia of the United States. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical

Chemists (AOAC). American Public Health Association (APHA). Pesticide Analytical Manual (PAM). Food Additives Analytical Manual. Food Chemicals Codex. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM). FDA Macroanalytical Procedures Manual (MPM). ORA Laboratory Information Bulletins (LIBs).

Se prefiere usar los métodos estándar, sin embargo es necesaria la verificación de la capacidad analítica dentro de los laboratorios en los cuales es usado. Un método estándar puede estar complementado con

19

detalles adicionales sobre como los laboratorios deben proceder para asegurar una aplicación consistente.

Aquellos métodos especificados por fabricantes de equipos de análisis también son considerados como métodos estándar, por ejemplo los suministrados por HACH en el Handbook de análisis de agua por métodos espectrofotométricos.

El laboratorio que va a utilizar un método normalizado debe verificarlo contra sus especificaciones de validación, atendiendo los requisitos para el aseguramiento de la calidad, y no necesita validarlo. Esta verificación permite demostrar que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente. [2, 3]

5.2.1.2. Métodos no normalizados (modificación de un método normalizado)

Los métodos no normalizados son aquellos que no han sido publicados por fuentes autorizadas y/o validadas. Es muy probable que los métodos sin normalización no dispongan de datos de validación o estudios colaborativos fiables o suficientes, por esto se recomienda realizar una validación en cuanto sea posible. Si el método sufre cambios, se requerirá una revalidación del método.

El laboratorio que va a modificar un método normalizado debe revalidarlo para demostrar que las especificaciones del método original no se ven afectadas por la modificación introducida. El nivel de revalidación requerido aumenta conforme a la magnitud de los cambios realizados.

Se consideran cambios menores, por ejemplo, la modificación del tamaño de la muestra y sustitución de reactivos. Se considera cambios mayores, por ejemplo, el cambio de procedimiento o equipo, y cambios en el alcance (aplicación a matrices que no se especifiquen). [5]

5.2.1.3. Métodos desarrollados por el laboratorio

20

Cuando sea el caso, el laboratorio debe demostrar que tiene un plan en el que se incluye la evaluación de su capacidad en cuanto a personal, equipo y demás recursos que le permitan desarrollar métodos propios.

Los métodos desarrollados por el laboratorio deben estar adecuadamente validados, documentados y autorizados antes de su uso. Cuando sea posible, se debe emplear material de referencia con una matriz equivalente a la muestra, o bien debe utilizarse un método de ensayo normalizado alterno, preferiblemente de diferente principio de medición, para comparar los resultados. Estos métodos deben cumplir al menos los mismos requisitos de documentación, indicados para los métodos no normalizados. [2]

5.2.2. Parámetros a validar según la normalización y estado de desarrollo del método

Los parámetros a evaluar en una validación cuando se utiliza una norma (método normalizado), una norma modificada (método no normalizado) o un método desarrollado por el laboratorio, se describen en la tabla 1.

Tabla 1. Parámetros a evaluar según la normalización y estado de desarrollo del métodoTipo de método A comprobar Determinar Control

Método normalizado.

- Exactitud.- Repetibilidad.- Incertidumbre.- Límite de detección (si la norma lo indica).

- Rango.- Linealidad.- Recuperación.- Robustez.- Selectividad.- Estabilidad (resistencia).- Reproducibilidad.

- Realizar protocolo de control de calidad.- Controles intralaboratorio.- Participar de interlaboratorios.

Modificación de un método

normalizado.

- Exactitud.- Repetibilidad.- Reproducibilidad.

- Linealidad.- Rango.- Robustez.- Selectividad.- Estabilidad (resistencia).


Método desarrollado por el laboratorio.

- Exactitud.- Repetibilidad.- Reproducibilidad.

- Selectividad/especificidad.- Linealidad.- Exactitud.- Rango.- Repetibilidad.- Reproducibilidad.- Estabilidad (resistencia).- Límite de detección.- Límite de cuantificación.- Recuperación.- Robustez.


21

- Sensibilidad.- Incertidumbre.

5.2.3. Según la categoría del método [1]

Los métodos analíticos también pueden clasificarse según el fin con el que va a ser utilizado y pueden agruparse en las siguientes tres categorías:

5.2.3.1. Categoría IPara la cuantificación de materia prima o principio activo en producto terminado.

5.2.3.2. Categoría IIPara determinar impurezas en materia prima o compuestos de degradación en producto terminado; o para análisis de residuos en material biológico o alimentos.

5.2.3.3. Categoría III

Para determinar las características de funcionamiento como disolución o liberación de droga en el organismo.

5.2.4. Parámetros a validar según la categoría del método

Los parámetros que se evalúan según la categoría del método se muestran en la tabla 2.

Tabla 2. Parámetros a evaluar según su categoríaParámetro Categoría I Categoría II Categoría III

Selectividad. Si Si SiSensibilidad. * * *Linealidad. Si Si *Rango. Si Si *Exactitud. Si Si *Precisión. Si Si SiLímite de detección. No Si *Límite de cuantificación. No Si *Estudio comparativo (interlaboratorios).

* * *

Robustez. Si Si SiIncertidumbre. * Si Si

* Se deja a criterio del laboratorio, realizar siempre y cuando sea posible su determinación según las restricciones del método.

5.3. PARÁMETROS DE RENDIMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL MÉTODO

22

Los parámetros que ayudan a la caracterización de un método y que se consideraron para este proyecto son:

Linealidad. Rango. Robustez. Selectividad. Estabilidad (resistencia). Exactitud. Precisión: Repetibilidad, Reproducibilidad y Precisión intermedia.

5.3.1. Linealidad

La linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultado instrumental que sea proporcional a la cantidad de analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio.

Con el fin de determinar el rango lineal, se puede realizar un gráfico de concentración versus respuesta, que se conoce como Función Respuesta (normalmente llamada recta de calibración Figura 1). Ésta se establece cada día con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de trabajo limpios, de valor teórico conocido, que cubran el intervalo de trabajo.

23

Figura 1. Gráfico de la función respuesta.

Para los métodos cuantitativos es necesario determinar el rango de concentración del analito donde el método debe ser aplicado. La linealidad y rango son dos parámetros muy relacionados; sin embargo, el rango se distingue de la linealidad en que éste toma en cuenta además la precisión y la exactitud de los valores obtenidos, y por lo tanto se trabaja como un parámetro distinto. Sin embargo ambos se obtienen a partir del mismo grupo de ensayos.

La evaluación de la linealidad es muy útil para determinar qué tipo de calibración es requerido en el uso rutinario del método, este nos puede definir si la curva de calibración requiere solo un punto o requiere de muchos puntos, para obtener una regresión adecuada. Se recomienda aproximadamente 6 puntos de calibración, aunque esto depende en mayor medida del método y del instrumento a usar [4].

La relación entre la respuesta del método y la concentración no debe ser necesariamente lineal, en caso de ser curva esta debería ser repetible en el transcurso del tiempo.

Existen dos formas de realizar un diagnóstico de linealidad, ambas útiles bajo ciertas condiciones:

24

Los puntos de la curva se realizan a partir de soluciones preparadas con pesadas independientes, sin realizar sucesivas diluciones. Esto porque cuando se realiza una dilución, si el analito alcanza su límite de solubilidad, parte de este no estará disuelto y por lo tanto formará una respuesta no lineal. Sin embargo, este procedimiento no es muy recomendable cuando se preparan soluciones de baja concentración, ya que el error al pesar será relativamente mayor a bajas concentraciones. Esta metodología debe realizarse cuando las concentraciones son suficientemente altas.

La otra forma de realizar la aproximación lineal es preparando soluciones a partir de alícuotas de una solución stock o estándar, así, es posible obtener concentraciones bajas en caso de ser necesarias en el análisis.

Para la evaluación de la linealidad existen algunos criterios mínimos para llevar a cabo dicha finalidad, entre ellos se tienen:

Dentro del rango establecido se recomienda estudiar al menos 5 niveles de concentración y analizarlas por triplicado (K=5, número de réplicas ni=3), para un total de 15 determinaciones (n=15).

Las muestras a analizar pueden prepararse a partir de los estándares del analito de concentración conocida, o bien a partir de un lote de concentración conocida. De esta última forma, el estudio de linealidad puede servir también para evaluar la recuperación y con ella la exactitud del método.

Para realizar los análisis se debe hacer pesadas independientes, siempre que sea posible (por ejemplo 15 pesadas), ya que así se elimina el posible error sistemático en el que se podría incurrir partiendo de una sola preparación y realizando disoluciones.

5.3.1.1. Evaluación estadística de linealidad [1]

Para llevar a cabo una evaluación estadística de la linealidad y aleatoriedad de los resultados obtenidos, se recurre a las siguientes fórmulas y criterios:

Cálculo de la regresión lineal

25

Ecuación de la recta:y=b∗x+a(1)

Valor estimado para una concentración teórica x̂ i:

ŷ i=b∗x̂ i+a (2)

Valor residual:

e i= ŷ i− yi(3)

Término independiente:

a= y−b∗x=∑ y−b∗∑ x

n(4)

Donde:

y=∑ y

n; x=

∑ x

n(5)

Pendiente:

b=∑ ( x−x )∗( y− y )

∑ ( x−x )2(6)

Coeficiente de correlación:

r=∑ ( x−x )∗( y− y )

√∑ ( x−x )2∗( y− y )2(7)

Cálculo de la varianza residual:

26

V RES=S y ; x2 =[∑ ( y− y )2

n−2 ]∗(1−r2 )=∑ ( ŷ i− y i )2

n−2=∑ ei

2

n−2(8)

Cálculo de la varianza de la pendiente:

Sb2=

S y ; x2

∑ x2−(∑ x )

2

n

(9)

Cálculo de varianza del término independiente:

Sa2=

Sb2∗(∑ x )2

n(10)

Para el análisis de linealidad se define:

x=¿ Es la concentración teórica.y=¿ La respuesta del equipo.b=¿ El valor de la pendiente.a=¿ La intersección con el eje o el término independiente.

Coeficiente de correlación (r ) y coeficiente de determinación (r2 )

En la práctica, el coeficiente de correlación (r ) indica una correlación entre la concentración y la respuesta con una probabilidad elevada. Es recomendable que el coeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.990.

La información obtenida mediante el cálculo de (r ) es limitada y no justifica por sí sola la linealidad. Mientras que el coeficiente de determinación (r2 ) aporta una mayor significancia estadística, puesto que

expresa la proporción de la variación total de ( y ) explicada por el modelo.

5.3.1.2. Análisis de la varianza (ANOVA)

27

Para llevar a cabo el análisis de varianza (ANOVA) se deben cumplir los siguientes requerimientos:

Homogeneidad de las varianzas. Normalidad de los residuales.

5.3.1.2.1. Homogeneidad de las varianzas

La homogeneidad de la varianzas se puede comprobar aplicando, por ejemplo un prueba de Cochran que indicará si el factor de concentración tiene alguna influencia en la variabilidad de los resultados.

Estadísticamente sería más correcto normalizar previamente las respuestas, ya que de lo contrario se compararán coeficientes de variación que corresponden a medias de concentraciones diferentes entre sí. Sin embargo, es habitual efectuar una prueba sin cumplir este requisito cuando el intervalo de concentraciones no es excesivamente amplio.

El valor de C exp se calcula como:

C exp=SMáximo2

∑ S i2 (11)

Donde:

Si2=¿ Varianza de cada grupo K.

SMáximo2 =¿ Varianza máxima de los K grupos.

Si C exp<CTablas significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

El CTablas se estima como:

28

CTablas=C (k ;υ ;α )(12)

Donde:

k=¿ Es el número de grupos de datos (grupo de réplicas).υ=¿ El grado de libertad definido como nMáximo−1, donde nMáximoes el mayor valor de los tamaños de muestra.α=¿ Es el nivel de significancia.

Las varianzas no deben ser estadísticamente diferentes entre sí para el grado de significación escogido, generalmente α=0.05 (5%).

En caso de que la homogeneidad de las varianzas no se cumpla, caben dos posibilidades:

Si se debe a la mayor variabilidad de uno de los extremos del rango, este se puede acortar siempre y cuando los márgenes especificados lo permitan.

Puede plantearse el análisis a otro nivel de concentraciones, tal que las variaciones no sean significativas.

5.3.1.2.2. Prueba de normalidad o distribución normal de los residuales

Distribución continua conocida también como distribución Gaussiana, la distribución de una variable normal está completamente determinada por dos parámetros, su media (μ ) y su desviación estándar (σ ). La distribución normal se caracteriza por tener una única moda, que coincide con su media y su mediana. Su expresión gráfica (figura 2) es una curva normal, cuya forma es similar a los histogramas con forma de campana. Es conocida como campana de gauss que es simétrica respecto a su media y asintótica al eje de abscisas, esto hace que cualquier valor entre y es teóricamente posible. El área total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Para este tipo de variables existe una probabilidad de un 50% de observar un dato mayor que la media, y un 50% de observar un dato menor.

29

Figura 2. Distribución normal.

Las pruebas de normalidad más utilizadas son:

Test de Shapiro-Wilk. Test de Kolmogorov-Smirnov.

El test de Shapiro-Wilk fue diseñado para tamaños de muestra moderados y puede detectar desviaciones de la normalidad por asimetría o curtosis. Mientras que la prueba de Kolmogorov-Smirnov compara la función de distribución de los datos con la distribución normal, y mide la máxima distancia entre ambas curvas.

Una vez comprobada la homogeneidad de las varianzas y la normalidad de los residuales, se procede con el cálculo de la ANOVA, mediante el siguiente procedimiento matemático mostrado en la tabla 3:

Tabla 3. Ecuaciones necesarias para el cálculo de la varianza en una regresión lineal.

Suma de cuadradosGrados de libertad

VarianzaEstadístic

o

Regresión SCREG=∑ n i∗( ŷ i− y )2 1 V REG=SCREG

1F1=

V REG

V RES

Residual SCRES=∑ ( ŷ i− y i )2 n−2 V RES=

SCRES

n−2Falta de ajuste SCFA=∑ n i∗( ŷ i− y i)

2 k−2 V FA=SCFA

k−2F2=

V FA

V exp

Error experimental SCexp=∑∑ ( y ij− y i )

2 ∑ ni−k V exp=SCRES

∑ n i−k

Total SCT=∑∑ ( yij− y )2 ∑ ni−1 V T=SCT

∑ ni−1

30

Donde:i=¿ Número del grupo.j=¿ Número de la serie.n=¿ Número total de lecturas.ni=¿ Número de réplicas en un grupo.k=¿ Número de grupos o concentraciones.SCREG=¿ Suma de cuadrados debido a la regresión.V REG=¿ Varianza de la regresión.SCRES=¿ Variación residual debida al error experimental dentro de los grupos más la variación debida a la falta de ajuste.V RES=¿ Variación residual.SCexp=¿ Cálculo del error experimental (suma de cuadrados debido a las réplicas dentro de las mismas series).V exp=¿ Varianza del error experimental.SCFA=¿ Cálculo del error de regresión o de falta de ajuste (se debe a la dispersión de resultados entre los valores de la recta de regresión y las medias de cada grupo).SCT=¿ Suma de los cuadrados total.

Existen relaciones entre las sumas de cuadrado.

SCT=SCexp+SCFA+SCREG(13)

SCRES=SCexp+SCFA(14)

Una vez comprobados los supuestos y calculados los estadísticos F1 y F2 se procede a verificar las siguientes hipótesis:

F1; exp>F1 ;Tabla Demuestra la existencia de una pendiente distinta a 0.F2; exp<F2 ;Tabla Demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos.

5.3.1.2.2.1. Prueba verificación de la pendiente

Con este test se busca corroborar la significancia estadística de la pendiente, esto se logra calculando el intervalo de confianza para la pendiente según la fórmula:

b± t∗Sb(15)

En la cual:

t=¿ Es el valor de la distribución de Student para un grado de libertad n−2, con un nivel de significancia de α=0.05.

31

El intervalo no incluye el valor de cero para considerar la pendiente significativa.

5.3.1.2.2.2. Prueba verificación del intercepto

De igual forma se verifica la significancia estadística del intercepto, en este caso se tiene que:

a± t∗Sa (16 )

Se concluye entonces que la ordenada es estadísticamente significativa si el rango incluye el valor de cero.

Cuando no se cumpla el test de verificación del intercepto, es necesario llevar a cabo una interpolación de los resultados obtenidos de cualquier muestra de por lo menos dos estándares (inferior y superior). De manera tal que se obvia el sesgo del método.

5.3.1.3. Pasos generales para evaluar la linealidad y el rango de trabajo

Para tener una idea más ordenada sobre la toma de datos para evaluar el rango de trabajo y la linealidad, se resumen los pasos en la tabla 4.

Tabla 4. Procedimiento para evaluar la linealidad.

AnálisisNúmero de

repeticionesCálculo

Blanco y materiales de referencia, o blancos fortificados a varias

concentraciones.

Se necesita al menos 6 puntos distintos.

3 por cada punto.

Graficar los resultados de la medida ( y ) versus la

concentración preparada (x ).

Examinar de forma visual el rango de trabajo.

Materiales de referencia o blancos fortificados en al menos

10 puntos distintos.

3 por cada punto. Graficar los resultados de la medida ( y ) versus la

concentración preparada (x ).

Examinar de forma visual los puntos atípicos que no deberían estar presentes en la regresión.

Se debe calcular el coeficiente de regresión apropiado. Se calculan y

grafican los valores residuales (diferencia entre el valor actual y el valor predicho por la ecuación de la

recta para cada valor de (x )).

Distribución aleatoria alrededor de la línea, confirma linealidad.

Tendencias sistemáticas indica no

32

linealidad.

5.3.2. Rango

Se define como el intervalo entre la concentración inferior y superior para las cuales se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método.

5.3.3. Robustez

Una medida de que tan efectivo es un método analítico es saber la fiabilidad de los resultados obtenidos cuando no es ejecutado de forma ideal. En cualquier método siempre habrá etapas que no son efectuadas de manera cuidadosa, estas variaciones podrían traer efectos negativos en su rendimiento y es posible que el método no cumpla su objetivo. Estas etapas deben ser identificadas y si es posible, también se debe evaluar la influencia sobre el rendimiento del método, valorándose a través de pruebas de robustez, también llamado algunas veces rigidez.

En el método, se realizan variaciones de forma deliberada para investigar los efectos subsecuentes en el rendimiento. Con estos resultados es posible identificar que variables afectan de manera significativa y por lo tanto, asegurar que cuando se haga uso de él, estas sean controladas de forma eficiente.

La AOAC International define la robustez como la habilidad de un procedimiento analítico para tolerar pequeñas variaciones de las condiciones del procedimiento, especialmente en variables como: volumen, temperatura, concentración, pH, tiempo de extracción y configuración del instrumento analítico. [6] Generalmente la robustez es usada para estudiar el efecto de ciertas variables sobre la precisión y/o exactitud.

5.3.3.1. Procedimiento para el cálculo de robustez

Para el cálculo de robustez se debe seguir los siguientes pasos:

Identificar los factores de variación. Establecer los niveles de influencia.

33

Seleccionar el diseño experimental. Definir el protocolo de experimentos. Ejecutar los experimentos y determinaciones. Calcular los efectos. Realizar análisis de varianza o prueba t para cuantificar la

significancia del factor sobre la respuesta del método.

En la figura 3 se expone el algoritmo a seguir para la evaluación de la robustez de un método.

Figura 3. Algoritmo para evaluar la robustez de un método analítico.

5.3.3.2. Diseño y ejecución de experimentos

El diseño de experimentos establece la metodología estadística sistemática para investigar la relación entrada-respuesta en alguno de los siguientes objetivos:

Identificar variables o factores de diseño importantes.

34

Optimizar producción o métodos de análisis. Realizar prueba de robustez.

El último objetivo es el de mayor importancia para este estudio en específico. En la investigación se tienen gran cantidad de tipos de diseño de experimentos, existen de tipo rudimentario como los análisis factoriales completos o aquellos que hacen uso de recursos computacionales para análisis de gran cantidad de datos.

Diseño factorial completo: se recomienda este tipo de análisis factoriales para una cantidad baja de factores relevantes, entre 2, 3 ó 4 factores que requieren 4, 8 y 16 ensayos respectivamente. Este tipo de diseño tiene en cuenta las interacciones entre los factores y su cuantificación, pero tiene la gran desventaja que a mayor cantidad de factores el número de ensayos se eleva de manera exponencial.

Diseño factorial fraccional: un diseño factorial fraccional es un experimento donde sólo se escoge una fracción adecuada de todo el conjunto de combinaciones requeridas para un diseño factorial completo.

Existen otros tipos de diseño que son optimizaciones de los anteriores, los más conocidos y recomendados para validación de métodos analíticos son los propuestos por Plackett-Burman y Youden-Staider [7].

Diseño univariable: en los análisis univariable, cada factor es evaluado individualmente y luego por análisis de varianza u otras pruebas estadísticas se determina su significancia. Este análisis también es recomendado por la AOAC y IUPAC [8], además son altamente efectivos cuando las interacciones entre factores son casi nulas. En este caso se realizan n+1 ensayos, donde el experimento adicional es el método efectuado al 100 %.

Para llevar a cabo el diseño de experimentos, se deben usar alícuotas o estándares de una misma solución y con una concentración conocida. Se recomienda realizar los experimentos de manera aleatoria o por bloques aleatorios, que consiste en analizar porciones del total de muestra periódicamente, con esto además se verifica el efecto del tiempo; sin embargo, cuando son muchas las variables la logística experimental puede resultar imposible, aún más cuando el equipo con el cual se

35

valida tiene un tiempo de uso limitado. El tiempo es un factor determinante cuando ciertos accesorios del instrumento sufren cambios significativos, por ejemplo las columnas en un cromatógrafo.

En la tabla 5 se muestra un procedimiento general de evaluación de la robustez.

Tabla 5. Cálculo de robustez.

Análisis Repeticiones Cálculo ComentariosIdentificar las variables que pueden afectar significativamente y realizar diseño de experimentos.

Usar materiales de referencia o muestras de composición conocida (estándares).

Mínimo 9 medidas por cada

experimento.

Un mínimo de tres factores.

Determinar el efecto (E) sobre la media para cada factor.

Realizar Análisis de varianza y/o t contra un ensayo realizado al 100 % o contra el

valor verdadero.

Se recomienda el uso de diseño univariable.

5.3.4. Selectividad [9]

La selectividad es el grado en que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de interferentes. Estos interferentes frecuentemente se encuentran en la matriz de interés. En otras palabras, la selectividad es la capacidad de un método analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la muestra.

Existe un término el cual es confundido con la selectividad, este término es la especificidad la cual sugiere que ningún compuesto, excepto el analito, contribuye al resultado.Para realizar una prueba de selectividad, Klaus Danzer [10] propuso una novedosa forma cuantitativa de medir la selectividad/especifidad para métodos multicomponentes y monocomponentes, mediante la realización varios ensayos usando distintas concentraciones del compuesto de interés y de las interferencias.

5.3.4.1. Determinación de la selectividad [2]

En un método que opere de forma selectiva, la respuesta del ensayo debe ser sólo función de la especie a la cual se le está realizando la

36

cuantificación, esto se puede expresar en forma de una función de la siguiente manera:

y A=f (x A ) (17)

Donde ( y A) es la señal o respuesta obtenida en el momento de cuantificar el compuesto A, y (x A) es la concentración del compuesto A en la muestra analizada; pero en realidad, la respuesta o señal obtenida se debe a la interferencia de varios componentes presentes en la muestra, de ésta forma la función queda definida como:

y A=f (x A , xB , xC…xN )(18)

Asumiendo que las influencias son lineales, se obtiene la siguiente ecuación para determinaciones monocomponentes:

y A= y0+S A; A∗x A+S A; B∗xB+…+S A; N∗xN (19)

Para métodos de determinación multicomponentes, se puede expresar de la siguiente forma:

y A= y A0+SA ; A∗xA+S A; B∗x B+…+SA ;N∗xN yB= yB 0+SB; A∗x A+SB;B∗xB+…+SB; N∗xN (19a)

yC= yC 0+SC; A∗x A+SC ;B∗xB+…+SC ;N∗xN yN= yN 0+SN ; A∗x A+SN ; B∗x B+…+SN ; N∗xN

Donde los coeficientes S I ;J representan la sensibilidad parcial de la respuesta para el componente (I ) respecto al componente (J ).

Debido a que el método a validar según este trabajo es para determinaciones monocomponentes, la selectividad o especifidad se puede obtener de la siguiente manera:

Spec ( AB…N )= S A; A∗x A

∑j=A

N

¿ SA ;J∗¿x J

(20)

En ocasiones las sensibilidades parciales pueden ser negativas, es decir, tienen un efecto negativo en la respuesta, por lo tanto en el cálculo de la especifidad se usan los valores absolutos de estas sensibilidades parciales. Un valor de Spec>0.9 indica especifidad suficiente. De la misma forma valores de Spec<0.9 muestran poca especifidad del método.

37

Las sensibilidades parciales se calculan resolviendo el sistema de ecuaciones lineales obtenido al aplicar la ecuación (20), para cada experimento realizado en base al diseño de experimentos que se desee seguir.

5.3.5. Estabilidad

Se debe determinar el tiempo máximo, para el cual una muestra preparada para análisis conserva todas sus características, de tal manera que los datos que se obtienen de ella sean confiables. El tiempo que transcurre desde el momento en que se destapa la muestra y su análisis es de 3 horas aproximadamente, la estabilidad de las muestras se evalúa a condiciones ambientales controladas. Las muestras se dejaban libres al ambiente como ocurre en la operación de la planta.

5.3.6. Exactitud [9]

Se define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia. El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinación de componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo.

Cuando se aplica a un método de ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación de veracidad y precisión. En el siguiente esquema de “Tiro al Blanco”, ampliamente utilizado para ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldrían a los resultados analíticos y el círculo rojo al centro, indica el rango en el cual se espera esté el valor de referencia (o verdadero), en la figura 4 se muestra esquemáticamente la exactitud.

38

Figura 4. Verificación de exactitud.

Como se puede observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es más exacto.

5.3.6.1. Veracidad

Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado.La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación.

Sesgo (s): Es la diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error aleatorio.

s= xm−μ(21) Porcentaje de recuperación (%R): Es la fracción de la

sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis. Su valor se obtiene al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La recuperación permite ver el rendimiento de un

39

método analítico en cuanto al proceso de extracción y a la cantidad del analito existente en la muestra original.La recuperación esta intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra. Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno, en lo posible en tres niveles.

(%R )=( xmμ )∗100(22)Donde:xm=¿ Es el valor promedio de los datos para esa concentración.μ=¿ Es el valor aceptado como verdadero.

Existen dos procedimientos en general para determinar la exactitud de un método. El primero y más común es realizar la comparación contra un material de referencia, que puede ser un estándar trazable, un placebo o una muestra con una cantidad de analito conocida. El segundo método es comparar los resultados con otra técnica aún más exacta o que por consenso común es referencia. Este caso se usa cuando no existen materiales de referencia certificados o trazables. En la figura 5 se puede observar la anterior clasificación en forma de diagrama.

Figura 5. Procedimiento para el cálculo de la exactitud.

40

El uso de materiales de referencia o estándares está dado según los siguientes criterios:

Material de referencia o patrones certificados: se usan para validación de métodos a largo plazo. Su uso no es extensivo.

Estándares: utilizados en los cálculos de exactitud a corto plazo, verificaciones y estudios no críticos.

Por último los cálculos de regresión lineal se realizan de igual forma como se trabajaron en el cálculo de linealidad. En la tabla 6 se ilustra un procedimiento general que permite evaluar la exactitud del método. [3]

Tabla 6. Procedimiento general para cálculo de exactitud.

Análisis Repeticiones Cálculo Comentarios

Analizar la muestra/referencia

por el método a validar.

Un mínimo de 3 veces por nivel, y 9 determinaciones

en total como mínimo.

Promedio y desviación estándar por nivel de

concentración.Si hay suficientes datos realizar una

prueba de hipótesis para la media.

Comparación por recuperación y

diferencia.

El criterio de aceptación depende mucho del tipo de análisis y uso que se

le dé, en general se acepta una

recuperación de 100 ± 3 %, cuando se realizan

con materiales de referencia y 100 ± 5 %

con estándares.

Analizar la muestra/referencia

por el método a validar y un método

independiente preferiblemente

validado o primario.

Un mínimo de 10 veces por nivel.

Promedio y desviación estándar por nivel de

concentración.Comparación por recuperación y

diferencia. Y análisis de regresión si hay suficientes datosDar una medida

relativa de la parcialidad del

método.

Métodos independientes tienen parcialidades por su propia cuenta, por lo

tanto esta exactitud es relativa y no absoluta.Los métodos primarios idealmente no tienen parcialidad, por lo que

son mejores para realizar las medidas de exactitud. Se tiene un criterio de aceptación

de 100 ± 5 %.

5.3.7. Precisión

La precisión de un procedimiento analítico expresa el nivel de concordancia o grado de dispersión entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestras homogéneas bajo condiciones prescritas. Se evalúa mediante análisis de réplicas, análisis repetidos de un estándar estable o análisis de adiciones conocidas sobre las muestras. [11]

41

El objetivo de la precisión es dar a conocer la variabilidad ó el más ó menos del método de ensayo. Dicha variabilidad se debe a errores aleatorios inherentes del método de ensayo. Como resultado de estos errores, los datos obtenidos no serán idénticos a pesar de que los análisis sean efectuados sobre la misma muestra. Los factores que pueden influir en los resultados de un ensayo son: el analista, el equipo de medición, los reactivos, etc. De ahí la importancia del estudio de la precisión.

La precisión puede organizarse como se muestra en la figura 6:

Figura 6. Precisión.

De la figura se puede apreciar los diferentes estudios de precisión como lo son:

Repetibilidad. Precisión intermedia. Reproducibilidad.

5.3.7.1. Repetibilidad

Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método, en ítems de análisis idénticos en el mismo

42

laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo.Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones (mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analito en un material de referencia. Calcular la desviación estándar (σ ) y el porcentaje de coeficiente de variación (%CV ).

El coeficiente de variación se puede calcular como:

%CV=( σx )∗100(23)Se calcula también el intervalo de confianza como:

x± t∗( σ√n )(24)Donde:t=¿ Es el estadístico de Student con n−1 grados de libertad y α=0.05.

En la repetibilidad se pueden analizar los siguientes factores:

Repetibilidad del instrumento. Repetibilidad del método.

5.3.7.1.1. Repetibilidad del instrumento

Se calcula a partir de mediciones repetidas realizadas a una muestra homogénea que ha pasado por todo el proceso del método, es decir, realizar mediciones a la misma muestra como tal y no réplicas de ella. El número de mediciones en este ensayo está condicionado por la cantidad de muestra que destruye el equipo en su determinación. Se recomienda de 6 a 10 veces.

43

5.3.7.1.2. Repetibilidad del método

A diferencia del ensayo anterior, en este caso se parte de alícuotas de una misma muestra homogénea y se les realiza todo el procedimiento indicado de forma individual; se analizan de forma independiente como si fueran réplicas de una misma muestra y con un mismo analista. Tal como lo propone la ICH se recomiendan mínimo 9 mediciones para un total de 3 niveles de concentración (3 mediciones por nivel).

La repetibilidad del método debe ser mayor a la repetibilidad del instrumento, su relación teórica está dada por la ecuación propuesta por Carporal-Gautier [2]:

CV Método=√2∗CV Instrumento(25)

5.3.7.2. Precisión intermedia

Expresa la variación dentro de un mismo laboratorio:

Diferentes días de análisis. Distintos analistas. Distintos equipos, etc.

Se recomienda un diseño matricial y aleatorio, para muestras preparadas de forma independiente, mínimo por triplicado para cada factor y un mínimo de 9 determinaciones en total. La precisión intermedia se calcula entonces como el coeficiente de variación global de todas las respuestas obtenidas o la respectiva desviación estándar.

El criterio de aceptación de la precisión intermedia está dado por:

CV Precisión intermedia<2∗CV repetibilidadmétodo (26)

Antes de analizar los datos para calcular la precisión intermedia, se verifica que los analistas tengan varianzas similares, esto se logra realizando una prueba F o ANOVA, de la misma forma como se hizo en la prueba de robustez.Las hipótesis a confirmar:H 0=¿ Las varianzas de los analistas son iguales, σ 0=σ1H 1=¿ Las varianzas son distintas, σ 0≠σ1

44

Teniendo las varianzas de dos conjuntos de datos se calcula:

F=S12

S22 (27)

La hipótesis nula se acepta si:F1−( α2 )

≤F≤ F( α2 )

(28)

Donde F1−( α2 );F

( α2 ) se leen de la tabla estadística de la distribución F con

γ 1; γ2 grados de libertad y un nivel de significancia de 5%.

5.3.7.3. Reproducibilidad

Es la precisión de los valores obtenidos en los ensayos bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo método de análisis, en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros.

Para determinar la precisión de la reproducibilidad intralaboratorio (es decir, la precisión dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un material de referencia o material control una vez por cada semana o el comportamiento de la curva de calibración en 3 días distintos.

También, se puede determinar registrando por lo menos 10 mediciones en días distintos, o en un mismo día cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos y largo intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Con los datos, se calcula la desviación estándar (σ ) y el porcentaje de coeficiente de variación (%CV ).

Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validación de un método, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en consideración que estos utilicen el mismo método y misma muestra, en un intervalo de tiempo preferentemente

45

establecido, se determina de este modo la desviación estándar de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios. [9]

En la tabla 7 se mencionan algunos factores que pueden incidir en los estudios de repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad. [2]

Tabla 7. Factores influyentes en la precisión.

Factor RepetibilidadPrecisión

intermediaReproducibilidad

Laboratorio Igual Diferente DiferenteAnalista Igual Diferente DiferenteEquipo Igual Diferente DiferenteTiempos de análisis Igual Diferente DiferenteOtros factores (reactivos, condiciones ambientales, etc.)

Igual Igual Diferente

5.4. EQUIPO Y PRINCIPIO DE MEDICIÓN

5.4.1. Especificaciones del equipo

El densímetro Soft Drink Analyzer M (SDA-M) de la casa fabricante Anton Paar y mostrado en la Figura 7, posee las especificaciones [12] indicadas en la tabla 8.

Figura 7. Equipo Soft Drink Analyzer M.

Tabla 8. Datos técnicos del equipo.

Rango de medición.Densidad. 0 a 3 g/cm3

Temperatura. 20 °C (68°F)

46

°Bx actual/fresco/invertido. 0 a 80 °BxGrado de inversión. 0 a 100%

Desviación estándar de la repetibilidad.Densidad. 0,000001 g/cm3

°Bx actual. 0,01 °Bx°Bx fresco/invertido. 0,02 °BxGrado de inversión. 1%Sensor temperatura ± 0,001°CRango de presión.Llenado con jeringa.

Llenado con bomba peristáltica.Trampa de burbuja.

0 a 3 bar

0 a 1 bar

Más información.Tiempo por medición de muestra. 5 minutos por mediciónRequerimiento de muestra para

medición.20 ml de bebida desgasificada.

40 ml para jarabe.Sensor de presión de aire. Si

Automuestreador. Xsample 122Detección de burbuja automático. Si

Visualización de la celda de medición de densidad.

Si, por medio de cámara

Interfaces. 2 x S-BUS, RS-232, 4 x USB, CAN, VGA, Ethernet

Display.Display TFT de 6,5 pulgadas, con iluminación clara y pantalla táctil (640 x 480 px), con diseño ajustable

del display

Piezas en contacto con las muestras.

PTFE, vidrio borosilicato, acero inoxidable DIN 1,4539/UNS N08904 & DIN 1. 1,4571/SS 316Ti,

silicona, tygonDimensiones (inclusive el Xsample

122).482 x 710 x 360 mm

Peso (inclusive el Xsample 122). 28,5 kg

5.4.1.1. Métodos predeterminados

El equipo Soft Drink Analyzer M trae consigo 10 métodos predefinidos que cubren las aplicaciones más comunes, las cuales se pueden modificar para adaptarse a las necesidades del laboratorio o también pueden crearse nuevos métodos (se pueden crear hasta 50 métodos). Cabe anotar que todas las mediciones se ajustan a una temperatura controlada de 20ºC.

Los métodos predeterminados se muestran en la tabla 9:

Tabla 9. Métodos predeterminados por el equipo.

47

Soft Drink fresh

Determina: Concentración de azúcar, concentración de azúcar fresco, grado de inversión, densidad, temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.Método de uso general.

Density & Sound

Determina: Densidad, velocidad del sonido, temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.

Método de uso general.

Density (not visc.-corr.) & Sound

Determina: Densidad (no visc. Corr), Velocidad del sonido, temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.

Método de uso general, para la comparación con instrumentos antiguos sin corrección por viscosidad.

Soft Drink Invert

Determina: Concentración de azúcar, concentración de azúcar invertido, grado de inversión, densidad, temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.

Para medición de la glucosa y la concentración de fructosa de los refrescos en inversión completa.

48

Sound

Determina: Velocidad del sonido, número de sonido (s), temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.


Density Only

Determina: Densidad, gravedad específica, Temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.


HFCS-42

Determina: Densidad, HFCS-42 (azúcar completamente invertida, que contiene 42% de fructosa), temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.


HFCS-55

Determina: Densidad, HFCS-55 (azúcar completamente invertida, que contiene 55% de fructosa), temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.


49

Syrup Invert

Determina: Concentración de azúcar, concentración de azúcar invertido, grado de inversión, densidad, temperatura de lectura, condición principal, visor del tubo en U.

Medición de glucosa y fructosa en jarabes con completa inversión.

Syrup Fresh

Determina: Concentración de azúcar, Concentración de azúcar fresco, grado de inversión, densidad, temperatura de lectura, condición principal, visor de tubo en U.

Para la medición de la sacarosa original en jarabes.

Para cada método, se puede establecer cómo se finalizará la medición.

Finalizar la medición por predeterminación o temperatura de equilibrio (Temperatura de medición en la celda = Ajuste de temperatura): Si se selecciona predeterminación, el instrumento termina la medición antes de que la temperatura de equilibrio se alcance y se calcula la densidad a la temperatura establecida, esto ahorra tiempo en la medición pero disminuye la precisión del resultado.Si se selecciona equilibrio, la medición finaliza cuando la temperatura de equilibrio se establezca. Se puede elegir entre: equilibrio rápido, equilibrio medio y equilibrio lento. Cuanto más lento el equilibrio más preciso son los resultados.

Finalizar la medición por tiempo de espera: Si la medición no se termina después de un tiempo de espera especificado, la medición es abortada. Dicho conteo empieza cuando la temperatura de equilibrio ha sido alcanzada.

50

Es importante resaltar que antes de realizar las mediciones de bebidas gaseosas en el equipo, se debe desgasificar dichas muestras, ya que la presencia de CO2 induce al error en la medición del Brix.

5.4.2. Principio de medición [12]

El Soft Drink Analyzer M (SDA-M), determina simultáneamente dos propiedades físicas independientes de una sola muestra. El instrumento está equipado con una celda de densidad (tubo oscilante en forma de U) y otra de velocidad del sonido, que al combinarlos se obtienen mediciones con alta precisión. Posee además un control de temperatura para las celdas de medición conformado por un termostato incorporado (un Peltier).

5.4.2.1. Definición de densidad y gravedad específica.

La densidad de una muestra está definida como la masa dividida por el volumen:

ρ=mV

(29)

La gravedad específica (SG) se calcula dividiendo la densidad de la muestra sobre la densidad del agua pura a 20°C:

SG=ρmuestraρagua

(30)

5.4.2.2. Método oscilatorio del tubo en U

La muestra se introduce en un tubo de vidrio de borosilicato en forma de U el cual es excitado para que vibre a su frecuencia característica por medios electrónicos. La frecuencia característica cambia dependiendo de la densidad de la muestra.

A través de una determinación precisa de la frecuencia característica, un apropiado ajuste, la densidad de una muestra es determinada por:

Densidad=KA∗Q2∗f 1−KB∗f 2(31)

51

Donde:

KA ;KB=¿ Constante del equipo.Q=¿ Cociente del periodo de oscilación del tubo en U dividido por el periodo de oscilación del oscilador de referencia.f 1; f 2=¿ Términos de corrección por temperatura, viscosidad y no linealidad.

El esquema general de la medición de un densímetro se muestra en la figura 8.

Figura 8. Esquema del proceso de medición en un densímetro.

5.4.2.3. Análisis de velocidad del sonido

La muestra es introducida en la celda de medición de velocidad del sonido que está bordeada por un transmisor ultrasónico en un lado y un receptor por el otro. El transmisor envía ondas de sonido de periodo conocido a través de la muestra. Por determinación del periodo de las ondas sonoras recibidas y bajo consideración de la distancia entre el transmisor y el receptor se puede calcular la velocidad del sonido (v) como:

v=longitud original∗(1∗1,6 E−5∗∆Temp )

PS

divisor−TAU∗f 3

(32 )

Donde:

52

longitud original=¿ Longitud original de la onda sonora (de fábrica ¿5000 μm).∆Temp=¿ Desviación de temperatura a 20°C.PS=¿ Periodo de oscilación de las ondas sonoras recibidas.divisor=¿ 512.TAU=¿ Constante del equipo para velocidad del sonido.f 3=¿ Corrección por temperatura.

Debido a la alta dependencia de la densidad y la velocidad del sonido con la temperatura, las celdas de medición deben estar termostatizadas.

5.4.2.4. El número de densidad (d)

Es igual a la desviación relativa de la densidad de una muestra de agua:

Númerode densidad (d )=densidad−densidadagua

densidadagua

(33)

densidadaguaa20 ° C=0.998204 g

cm3

El número de densidad (d) de una muestra de agua ultrapura desgacificada debe ser igual a 0 ± 0,00010.

5.4.2.5. El número de sonido (s)

Es igual a la desviación relativa de la velocidad del sonido de una muestra de agua:

Númerode sonido (s )=velocidad del sonido−velocidad del sonidoagua

velocidad del sonidoagua

(34)

velocidad del sonidoaguaa20 °C=1482,657 ms

El número de sonido (s) de una muestra de agua ultrapura desgasificada debe ser igual a 0 ± 0,00010.Las mediciones se realizan a 20°C usando un termostato incorporado, la concentración actual de azúcar se calcula basándose en la corrección de viscosidad y la densidad usando la tabla NBS 113 (Anexo 1).

53

5.4.3. Calibración

La calibración del equipo la cual sirve para determinar las constantes KA ;KB, debe ser efectuada con aire deshumidificado y agua ultrapura. Se realiza además una verificación con estándar de 12.00 °Bx directo.

El proceso de calibración se realiza según lo descrito en el manual simplificado adjunto a este trabajo (Anexo 2).

5.4.3.1. Cálculo de la densidad del aire

A una temperatura ( t ) en [°C] y una presión ( p) en [mbar] o [hPa] la densidad del aire (ρ) en [g/cm3] es calculada usando la fórmula para una humedad del aire de 50%:

ρ=0,34844∗p−0,5∗(0,252∗t−2,0582 )

[ (273,15+ t )1000 ]

(35)

Los números son válidos para un contenido de CO2 en el aire de 0.03%

en volumen, los números cambian por ( ±119000 ) para cada cambio en el

contenido de CO2 de volumen ± 0,0001.

La composición del aire seco se presenta en la tabla 10.

Tabla 10. Composición del aire seco en (v/v).

N2 O2 Ar CO2 Ne% en Volumen 78,110 20,938 0,916 0,033 0,002

El Laboratorio Central cuenta con condiciones ambientales promedio que se muestran en la tabla 11:

Tabla 11. Condiciones promedio del Laboratorio Central y cálculo de la densidad de aire.

54

Variables ValorPresión ( p) en [mbar] 850,00

Temperatura (t) en[°C] 20,00

Densidad (ρ) en [g/cm3] 0,001005

5.4.3.2. Densidad del agua

La densidad del agua tiene gran dependencia con la temperatura a la que es leída. Como el equipo está equipado con un Peltier, éste logra controlar la temperatura a un valor de 20,00 ± 0,01°C, puesto que a estas condiciones la densidad del agua tiene un valor de:

ρagua=0,998203g

cm3(36)

Los valores de densidad del agua y densidad del aire tienen una tolerancia de 0.00005 g/cm3.

5.4.4. Conversión a grados Brix (°Bx)

Los densímetros, tanto el DMA-58 como el SDA-M reportan valores de densidad, los cuales se relacionan con los grados Brix (°Bx) a partir de tablas de sacarosa estándar como las reportadas por la National Bureau of Standards (NBS) o por la ICUMSA; además se pueden obtener por medio de ecuaciones desarrolladas a partir de dichas tablas o por normativas internas disponibles en POSTOBÓN S.A. [13] para este caso, el equipo trae consigo un software que puede llevar a cabo dicha conversión, basándose en la tabla NBS.

El valor de Brix actual, está basado en la medición de la densidad que el equipo reporta en el momento del análisis, los valores de Brix fresco, Brix invertido y el grado de inversión se basan en la densidad medida y la velocidad del sonido. La forma en que se relacionan la densidad y la velocidad del sonido son el know how de la casa fabricante Anton Paar, infortunadamente para el alcance de este proyecto no se cuenta esta información. Sin embargo, en la figura 9 se puede observar como las dos celdas de medición se combinan para obtener los respectivos valores de densidad y así relacionarlos con los valores de Brix para cada caso: fresco, actual o invertido.

55

Figura 9. Relación entre la densidad y la velocidad del sonido.

Esta relación es análoga a la regla de la palanca, en la cual hay una correlación lineal de la forma:

y=m∗x (37)

Donde:y=¿ Es el valor de la densidad.x=¿ El valor de la velocidad del sonido de la muestra.m=¿ Valor de la pendiente que relaciona la densidad y la velocidad del sonido.

Para obtener los datos de Brix fresco e invertido, se parte de la densidad medida que se encuentra entre las dos líneas que dictamina el rango de inversión entre 0% y 100%. Existe una compensación por no inversión e inversión total, la cual se traduce en el valor de la pendiente (m) que permite asociar la velocidad del sonido y la densidad. Como se mencionó anteriormente, no se contaba con las expresiones matemáticas para hallar dicha relación de forma exacta, sin embargo se pudieron establecer ecuaciones aproximadas para obtener valores muy cercanos a los reportados por el equipo, estas ecuaciones son:

° Bx fresco ≈° Bxactual

(1+0,0526∗Gradode inversión )(38)

56

° Bx invertido≈1,0526∗° Bx actual

(1+0,0526∗Gradode inversión )(39)

5.5. EL AZÚCAR

5.5.1. Definición

El azúcar es un endulzante natural, conocido normalmente en forma de cristales solidificados de sacarosa, y puede ser producido utilizando dos diferentes materias primas: la caña de azúcar (Saccharum officinarum) o la remolacha azucarera (Beta vulgaris) [14].

Se cree que la caña de azúcar contiene entre el 11% y 17% de sacarosa, mientras que el azúcar de remolacha entre 14% y 17%, no obstante en Colombia todo el azúcar que se produce es de caña de azúcar [15].

5.5.2. Composición

La sacarosa es el tipo de azúcar más importante en la industria, químicamente es un tipo de carbohidrato, y como tal, está formado por átomos de carbono (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O). La sacarosa se clasifica como un carbohidrato doble o disacárido, porque está compuesta por la unión de dos moléculas de monosacáridos o glúcidos. Los monosacáridos que forman la sacarosa (ver figura 10) son glucosa (dextrosa) y fructosa (levulosa).

Figura 10. Estructura química de la sacarosa.

57

La glucosa es un monosacárido dextrorrotatorio (gira a la derecha la luz polarizada), mientras que la fructosa es un monosacárido levorrotatorio (gira a la izquierda la luz polarizada). La sacarosa por su parte, es un compuesto dextrorrotatorio, ya que gira a la derecha +66,5º el plano de la luz polarizada. Si se calienta en un medio ácido o por la acción de una enzima llamada invertasa, la sacarosa (C12H22O11) se descompone para formar glucosa (C6H12O6) y fructosa (C6H12O6), la mezcla generada tiene mayor dulzura, (alrededor de 1,74% más que la sacarosa) y gira a la izquierda -20,0º el plano de la luz polarizada (levógira o levorrotatoria); es por ello que se llama azúcar invertido [16].

5.5.3. Propiedades químicas y físicas.

La sacarosa es estable al aire pero en polvo se torna higroscópica, y puede absorber hasta el 1% de humedad. Se fermenta a concentraciones altas (aproximadamente un 17% en peso), pero es capaz de resistir la descomposición bacteriana.

Se utiliza como preservante, excipiente, agente granulador, tensoactivo para jabones, antioxidante, algunos productos de belleza, entre otras.

Algunas de las propiedades físicas y químicas son mencionadas en la tabla 12.

Tabla 12. Propiedades físicas y químicas de la sacarosa.

Masa molar 342,3 gForma Polvo cristalinoColor BlancoOlor InodoroCambio de estado

Punto de fusión/campo de fusión:

Punto de ebullición/campo de ebullición:

185 – 187 °C

Indeterminado

Punto de inflamación No aplicaInflamabilidad (sólido, gaseiforme) La sustancia no es inflamablePeligro de explosión La sustancia no es explosivaDensidad a 20°C 1,587 g/cm3

Densidad a granel a 20°C 0,94 kg/m3

Solubilidad en/miscibilidad con agua a 20°C 600 g/lDescomposición térmica/condiciones que deben evitarse

No se descompone al emplearse adecuadamente

Reacciones peligrosas No se conocen reacciones peligrosasProductos de descomposición peligrosos Monóxido de carbono, dióxido de carbono

58

5.5.4. Proceso de inversión del azúcar

5.5.4.1. Definición

El propósito de la inversión es dividir la molécula de sacarosa y formar una molécula de glucosa y otra de fructosa, esto se logra mediante una hidrólisis, en este proceso químico una molécula de agua rompe el enlace de la sacarosa y se une a las moléculas derivadas. Para una solución de sacarosa, la hidrólisis requiere un medio ácido y calentamiento, entre más bajo sea el pH se acelerará más la reacción. La reacción que se presenta bajo las condiciones antes mencionadas es [17]:

C12H 22O11

Sacarosa(P .M .)342,30

+H 2OAgua

(P . M . )18,00H→

+¿; ∆C6H 12O6

Glucosa(P .M . )180,16

+C6H 12O6

Fructosa(P .M . )180,16

(40)¿

Durante este proceso, la molécula de agua se divide en sus componentes hidrógeno (H+) e hidróxido (OH-), los cuales rompen el enlace de oxígeno que une a los dos monosacáridos, de tal forma que: el hidrógeno se combina con el oxígeno para formar glucosa, mientras que el hidróxido se combina con el átomo de carbono libre para formar la fructosa (ver figura 11).

59

Figura 11. Reacción de inversión de azúcar por hidrólisis ácida.

Si se expresa la reacción de inversión en términos de pesos moleculares, es decir; 342,30 g de sacarosa reaccionan con 18,00 g de agua para formar 180,60 g de glucosa y 180,60 g de fructosa, esto significa que si se parte de una cantidad conocida de 342,30 g de sacarosa en solución, al invertir se obtiene un peso extra de 18,00 g de sacarosa pero esta vez en forma de los dos monosacáridos: glucosa y fructosa.

Si la reacción anterior toma lugar en una cantidad X g de solución total (sacarosa + agua), esto significa que después de la reacción habrán 18 g más de sólidos disueltos en la misma cantidad X g de solución. El incremento de sólidos puede ser expresado como un factor de 360,32 g finales342,30g iniciales

=1,05264 en otras palabras, se puede esperar que el Brix

después de la inversión aumente en 5,26 % los sólidos disueltos, respecto a su lectura en Brix directo, según la siguiente expresión:

Aumento ensólidos disueltos=( 360,32g−342,30g342,30g )∗100=5,26% (41)

60

5.5.4.2. El fenómeno de inversión

Las soluciones de azúcar tienen la propiedad de rotar el plano de la luz polarizada en sentido horario (derecha) ó anti-horario (izquierda), la glucosa por ejemplo rota la luz en sentido horario y se define como dextrógiro, si el giro es hacia la izquierda, como pasa con la fructosa, se denomina levógira. La reacción de inversión se expone a continuación con los respectivos ángulos de rotación de los azúcares involucrados para aclarar este fenómeno:

Sacarosaα=+66,5 °

+AguaH→

+¿ ;∆ Glucosaα=+52,7 °

+ Fructosaα=−92,4 °

(42 )¿

Mezcla (α )=−20,0 º

El ángulo de rotación (α ) o rotación específica es el ángulo formado por el plano de la luz polarizada sobre la horizontal y es característico de cada azúcar, si el ángulo es levógiro se denota por un signo menos (-).

La reacción muestra pues que la sacarosa y la glucosa son azúcares dextrógiras, mientras la fructosa es levógira, después de la inversión la glucosa y fructosa quedan en relación 50/50 %, la mezcla entonces tiene un ángulo de rotación que debería ser la suma de los efectos de cada monosacárido. Como la rotación levógira de la fructosa es mayor que la aportada por la glucosa, la solución final tendrá una rotación levógira.

En conclusión el término "invertido" se deriva del cambio de la dirección de la rotación de la luz polarizada que ocurre después de invertir el azúcar. Por lo tanto el azúcar invertido no es más que una mezcla glucosa/fructosa producto de la inversión de la sacarosa [3].

5.6. BRIX

5.6.1. El concepto de Brix

El Brix es uno de los parámetros fundamentales en la industria de refrescos. Generalmente el Brix indica la cantidad de sólidos disueltos en una solución. En la industria de refrescos se utiliza específicamente para cuantificar el azúcar en una bebida, jarabe o jugo.La escala de medición de Brix fue creada por un químico alemán del siglo XIX, el profesor A.F.W. Brix, en cuyo honor lleva el nombre el

61

sistema. Él encontró que al sumergir un hidrómetro en un jugo de fruta, se podía conocer, a partir de su densidad, el porcentaje muy aproximado de azúcar presente en el jugo.

De forma teórica, el Brix se define como el porcentaje de azúcar disuelto en una solución de agua en base peso a peso y se expresa en grado Brix (°Bx), así por ejemplo; una solución de 12,00 °Bx significa que hay 12,00 g de azúcar disuelto en 100 g de solución. Se debe tener en cuenta que en un refresco o cualquier otra bebida azucarada hay además del azúcar, otros sólidos disueltos, los cuales al estar en menor cantidad comparadas con el azúcar, y se consideran como “azúcar” ya que su aporte a la medición de °Bx es muy bajo.

El error que se puede introducir individualmente por una variedad de ingredientes disueltos en diversas formulaciones es tan pequeño que se acepta sobre una base universal y se ignora en la mayoría de casos. Así entonces, en la industria de bebidas, todos los productos: bebidas, jarabes, jugos, etc., se consideran como soluciones puras de azúcar. [18]

Existen dos conceptos relacionados con el Brix, estos son: Brix fresco, Brix invertido. El Brix fresco es el valor de un producto (jarabe o bebida) en el momento de su preparación; es el valor de Brix obtenido en el ensayo inmediatamente después de la preparación general, de acuerdo con el valor teórico calculado a partir del contenido total de sólidos disueltos en el producto. El Brix fresco, por lo tanto implica que no haya inversión en el producto.

El Brix invertido, por su parte, es el valor de Brix de un producto en el que se invirtió todo el contenido de sacarosa en glucosa y fructosa. Si el proceso de inversión se ha iniciado en una solución de azúcar pero no se ha llevado completamente, entonces se puede hablar de un producto parcialmente invertido.

Las bebidas gaseosas producidas en las diferentes plantas de producción de Postobón S.A. poseen un rango de Brix típico entre 7 y 13 °Bx, pero se debe tener en cuenta que para su preparación es necesario el uso de soluciones concentradas denominadas jarabes. En la preparación de una bebida gaseosa se hace una distinción entre lo que es el jarabe simple y el jarabe terminado. El jarabe simple es la

62

solución que sólo posee agua y azúcar las cual reporta un Brix de aproximadamente 61°Bx, el jarabe terminado se obtiene mediante una disolución del jarabe simple y la inclusión del resto de componentes propios de cada producto con excepción del gas carbónico (CO2), este jarabe posee un Brix que puede estar entre los 35 y 60°Bx.

5.6.2. Importancia de la medición del Brix en la industria alimenticia

En las bebidas no alcohólicas, que para el caso de Postobón S.A. son los refrescos, además del agua componente que se encuentra en mayor proporción, el azúcar es parte fundamental del proceso y puede aportar aproximadamente el 13% del contenido de la bebida, dando a ésta su nivel característico de dulzura.

Interactuando con los otros componentes, el dulzor determina el perfil característico aceptado por el consumidor, cualquier desviación importante del contenido de azúcar, podría tener como consecuencia la pérdida de aceptación por parte del consumidor y por lo tanto, colocaría en serios apuros a la compañía.

Como se ha mencionado anteriormente el Brix es una medida del contenido de azúcar en una bebida y es un estándar fundamental del proceso y de control del producto; por lo que necesita ser monitoreado continuamente en la línea de producción con gran precisión para obtener una desviación de concentración mínima en el producto. Además, los procesos de producción de cualquier gaseosa implica grandes cantidades de jarabe y llenadoras del alta velocidad que empaquetan cientos de botellas de vidrio, botellas plásticas (PET, PBR) y latas por minuto según sea el caso; una desviación en la concentración de azúcares, afectará la calidad del producto, disminuyendo el rendimiento de producción y a su vez, afectando negativamente los costos totales de producción.

6. DESARROLLO DEL PROYECTO

63

6.1. VALIDACIÓN DEL EQUIPO SOFT DRINK ANALYZER M PARA LA MEDICIÓN DE LA DENSIDAD Y BRIX INVERTIDO DE UNA MUESTRA GASEOSA.

Como se mencionó anteriormente el objetivo de esta validación es demostrar la aptitud o competencia del SDA-M para la determinación del ºBx inv en bebidas gaseosas sin llevar a cabo la inversión de la muestra.

6.1.1. Equipos usados en la validación

Para la validación se utilizaron algunos equipos y recursos del laboratorio que facilitaron dicho procedimiento, estos son:

6.1.1.1. Estación de desgasificación

Este equipo se usa para la desgasificación previa de bebidas gaseosas, posee 10 puestos de desgasificación por medio de burbujeo con aire y durante un tiempo determinado a flujo y presión constante. El desgasificador está conformado por:

Filtro de aire en línea. Trampa de aceite. Trampa de NaOH con fenolftaleína para absorción de CO2. Trampa de humedad. Fuente de aire. Válvula. Manómetro y medidor de flujo. Tubo de inserción o difusor.

Condiciones de operación:

Todos los puestos de desgasificación deben ser usados. Para desgasificar menos de 10 muestras, completar los puestos con recipientes llenos de agua.

Presión: 7,5 psi. Flujo de aire: 5,5 LPM O2. Volumen de muestra: 250 ml.

6.1.1.2. Baño maría

64

Baño maría Memmert AUM-500PD con control de temperatura en un rango de 25 a 100 °C. Para inversión de las muestras.

6.1.1.3. Balanza

Marca: Mettler-Toledo.Modelo: PM4800.Clase de exactitud: clase 2.Precisión: 0,2 g.Rango: 0 – 4000 g.

6.1.1.4. Reactivos

Sacarosa grado reactivo. HCl 2,5 N. Agua destilada. Aire a presión constante.

6.1.1.5. Otros recursos

Tubos de ensayo de 30 ml con tapa rosca. Gradillas metálicas para calentamiento. Viales para el automuestreador del densímetro. Beaker de 250 ml. Vasos desechables de 500 ml para la estación de desgasificación

de bebidas.

Para la determinación del grado Brix se lleva a cabo el siguiente procedimiento:

Para Brix directo

La preparación de las muestras para las lecturas de Brix directo (ºBx dto) deben garantizar su homogeneidad, es decir, ausencia de burbujas de aire o CO2.

Para Brix invertido

La preparación de las muestras de Brix invertido (ºBx inv) deben garantizar su homogeneidad.

65

Verter en un tubo de ensayo aproximadamente 30 ml de la muestra y adicionar 2 gotas de HCl a 2,5 N.

Calentar durante 50 min a una temperatura de 94ºC en baño maría, para inversión.

Dejar enfriar a temperatura ambiente. Una vez realizada la adecuación de las muestras se procede a la

lectura de densidad y ºBx inv en el densímetro, según el siguiente procedimiento: Se debe realizar una verificación con agua y un estándar de

sacarosa de 12,63 ºBx inv para el equipo DMA-58 y 12,00ºBX dto para el equipo SDA-M, aceptar una diferencia en el valor teórico reportado por el agua de ±0,00005 g/cm3 usando agua destilada, si no es aceptable la diferencia, se debe calibrar el equipo.

Se sirven las muestras en los viales, los cuales deben ser purgados previamente con la muestra y se procede a su lectura.

Para establecer el rango de trabajo en el cual se harán las mediciones, se tiene en cuenta que las bebidas gaseosas son elaboradas para que las lecturas de Brix directo abarquen un rango entre 6 y 14 ºBx dto, para el caso de Brix invertido este rango aumenta ligeramente del orden de 5,26% el °Bx dto.

6.1.2. Parámetros a validar y valores estimados para su aceptación

Como se mencionó anteriormente los parámetros a validar teniendo en cuenta las sugerencias descritas en la tabla 1 son:

Linealidad. Rango. Robustez. Selectividad. Estabilidad (resistencia). Exactitud. Precisión:

o Repetibilidad.o Reproducibilidad.

66

o Precisión intermedia.

Los valores estimados de aceptación para los parámetros a validar son: [3]

Linealidad: Como primer criterio de aceptación se tiene el coeficiente de correlación que será ≥ 0,999; además deberá superar la prueba ANOVA de regresión lineal y la significancia de la pendiente y el intercepto.

Robustez: Este parámetro tendrá una desviación estándar de 0,03 ºBx como valor máximo de variabilidad significativa.

Selectividad: Se debe obtener para las muestras preparadas una especificidad mayor a 0,90.

Exactitud: El Laboratorio Central de Postobón S.A. acepta un sesgo ≤0,03ºBx.

Precisión.o Repetibilidad: Debe ser menor a 0,02 ºBx para todas las

concentraciones medidas, el criterio fue estimado a partir de la experiencia en el laboratorio.

o Precisión intermedia: El valor establecido debe tener como máximo un valor de 0,03 ºBx para precisión intermedia o reproducibilidad. Se debe verificar además que la precisión intermedia sea menor a 2 veces la repetitividad del método en términos del coeficiente de variación.

6.1.3. Muestras y patrones de referencia

Como se ha mencionado anteriormente, el rango de trabajo real se determinó por las muestras que típicamente se analizan de forma rutinaria en el Laboratorio Central que para el producto terminado corresponde a un valor entre 6 y 14 ºBx.Las muestras a analizar durante el desarrollo del proyecto fueron tomadas en la planta de Postobón Bello, siguiendo los lineamientos establecidos para la toma de muestra:

No tomar muestras al comienzo o terminación de un lote de producción.

Se debe esperar un tiempo de al menos 5 minutos en el cual las muestras sean producidas de manera estable sin que sus

67

propiedades cambien abruptamente, especialmente los grados Brix y el volumen de CO2.

Clasificar por altura de llenado y sellado.

En la tabla 13 se presentan las muestras utilizadas para el desarrollo del trabajo.

Tabla 13. Descripción de las muestras en el desarrollo del proyecto.

ProductoPresentació

nCodificación Fecha de Producción

Colombiana Nacional 1250 ml28FEB13 13:02L1B0001708672

11 de octubre 2012

Manzana Interior 1250 ml28FEB13 09:28L1B0001708671

11 de octubre 2012

Seven Up 1250 ml02MAR13 06:48L1B0001709779

13 de octubre 2012

Dentro del conjunto de bebidas gaseosas que la compañía maneja, estos son los productos más representativos de la marca y que abarcan el rango de Brix trabajado normalmente en el laboratorio.

6.1.3.1. Muestra control

En este proceso de validación se utilizan dos tipos de muestras control que tienen objetivos diferentes, estás pueden ser llamadas: muestra control general y muestra control para robustez.

Muestra control general: La muestra que se eligió como muestra control general es el agua destilada ya que se usa tanto en las verificaciones como en las calibraciones de los equipos, tiene la gran ventaja de no degradarse o contaminarse fácilmente, y es por ello que su análisis garantiza la validez de posteriores determinaciones. El agua destilada debe ser analizada al inicio de cualquier ensayo, grupo de lectura o medición que se desea realizar, hay que tener en cuenta que los resultados obtenidos por el agua no serán reportados ya que ésta sólo actúa como verificador del estado del equipo.

Muestra control para robustez: Para el ensayo de robustez se define un ensayo control, el cual corresponde a la medición de la muestra sin hacer una modificación deliberada, esta muestra permitirá evaluar el efecto que acarrea las modificaciones hechas de forma consciente.

68

6.1.3.2. Patrón de referencia

El patrón de referencia utilizado para ambos densímetros fue el agua ultra pura, orden No: 244214, Anton Paar GmbH. El valor reportado para la densidad del agua es 0,99820 ±0,00002 g/cm3 a 20°C (95%). (Certificado agua ultra pura (ver Anexo 3).

6.1.4. Condiciones ambientales

Las condiciones ambientales promedio del Laboratorio Central en el que se realizaron las pruebas pueden verse en la tabla 14 y figura 12:

Tabla 14. Condiciones ambientales promedio en el Laboratorio Central.

Parámetros Intervalo (95% de confianza)Temperatura (ºC) 21,18 ± 1,64 ºC

Humedad relativa (%HR) 61,51 ± 8,11

Figura 12. Condiciones ambientales en el laboratorio.

El proceso de validación se llevó a cabo desde el día 03 de julio de 2012 hasta el día 30 de octubre de 2012. Los datos relacionados con las condiciones ambientales pueden verse en el Anexo 4.

6.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN

6.2.1. Verificación de las lecturas. Comparación entre tabla NBS y el ICUMSA

69

Los dos equipos que están involucrados en la validación por diseño de fábrica, incluyen las tablas NBS para la determinación del grado Brix a partir de la densidad de la muestra evaluada.

El Laboratorio Central de Postobón S.A., se rige para cualquier análisis de azúcar en el ICUMSA (Comisión Internacional de Métodos Uniformes para el Análisis del Azúcar, por sus siglas en inglés), el cual es un organismo internacional de normalización que publica procedimientos detallados de laboratorio para el análisis de azúcar, cuenta con dos polinomios que permiten el cálculo de la densidad: el polinomio ICUMSA de sacarosa pura y el polinomio ICUMSA de azúcares invertida (ver Anexo 5), se debe establecer si hay diferencia entre estos dos polinomios, luego se compara la tabla NBS con el ICUMSA para saber si hay discrepancia entre las dos formas de calcular la densidad. Para ello se realizó una serie de lecturas a diferentes concentraciones.Una vez realizada esta verificación se comparan los equipos involucrados.

6.2.2. Comparación entre los equipos DMA-58 y SDA-M

Para observar si hay discrepancia entre los dos equipos, se realizaron preparaciones de solución de sacarosa a diferentes concentraciones (6,00 a 14,00 ºBx) y a partir de una misma preparación se hicieron las lecturas por triplicado para ambos equipos.

6.2.3. Validación del equipo Soft Drink Analyzer M

Basándose en los procedimientos descritos en la sección de marco teórico que hace referencia a la validación, se designan los siguientes experimentos.

6.2.3.1. Linealidad

El análisis de linealidad en el densímetro SDA-M, se realiza en ambas escalas de medición de grado Brix; es decir, en la escala de Brix directo y en la escala de Brix invertido. Los análisis se realizaron para 9 concentraciones por triplicado, los resultados obtenidos de las mediciones están expresados como densidad (g/cm3). Los rangos evaluados fueron:

70

Densímetro: Rango directo: 6,00 a 14,00 ºBx dto (9 concentraciones). Rango invertido: 6,32 a 14,74 ºBx inv (9 concentraciones).

Las soluciones preparadas se detallan en la tabla 15.

Tabla 15. Valores teóricos de las soluciones de Brix dto y su correspondiente valor en Brix inv.

Valor teórico de las solucionesBrix directo (ºBx dto) Brix invertido (ºBx inv)

6,000 6,3167,000 7,3688,000 8,4219,000 9,47310,000 10,52611,000 11,57912,000 12,63113,000 13,68414,000 14,736

6.2.3.2. Rango

En la tabla 16, se reporta el valor de Brix invertido para las bebidas gaseosas que normalmente son evaluadas de forma cotidiana en el Laboratorio Central.

Tabla 16. Rango de Brix invertido en bebidas gaseosas.

Valor mínimo Valor máximoBrix invertido 10,25 12,36

Teniendo en cuenta que se realizará un análisis de linealidad, el rango de trabajo se amplia de manera que abarque los valores de Brix directo y Brix invertido, por lo que se define el siguiente intervalo de trabajo (ver tabla 17).

Tabla 17. Rango de trabajo para evaluación de los ºBx.

Valor mínimo Valor máximoRango de lectura de Brix 6,00 14,74

6.2.3.3. Robustez

71

Para la evaluación de robustez se pudo identificar sólo una variable que puede incidir de manera importante en el cálculo de densidad de la muestra, este factor es:

Tiempo de desgasificación de la muestra.

En esta prueba se evaluarán cuatro tiempos de desgasificación sin invertir la muestra, y se compararán con el procedimiento normal de preparación de la muestra para la lectura del Brix invertido. En la tabla 18 se muestran los tiempos de la prueba.

Tabla 18. Tiempos de desgasificación de las bebidas.

Tiempo de desgasificación (min)

8101214

El tiempo de referencia establecido en el estudio de desgasificación realizado en el Laboratorio Central de Postobón S.A. es de 12 min.

6.2.3.4. Selectividad

Como es sabido, las bebidas gaseosas además de contener azúcar y agua, poseen otros componentes que se encuentran en menor cantidad respecto a los dos mencionados anteriormente.

El azúcar contribuye con más del 95% de los sólidos disueltos en este tipo de bebidas, pero este porcentaje está sujeto a cambios debidos a las especificaciones de cada producto. Es importante resaltar que el concepto de grado Brix considera a este tipo de bebidas como una solución de agua y sacarosa, es por ello que se hace necesario el estudio del efecto que los otros componentes aportan al valor de ºBrix reportado por el equipo.

Teniendo en cuenta que no todos los componentes pueden alterar de forma significativa la lectura de Brix, sólo se tendrán en cuenta algunos que estén en mayor proporción. Estos componentes se muestran en la tabla 19. [3].

Tabla 19.Componentes seleccionados para el análisis de especificidad.

72

Componentes Estado Variable Rango (g/100g)Azúcar Sólido x1 7 13

Ácido débil Sólido x2 0 0,5

Ácido fuerte (Sol. 85%) Líquido x3 0 0,05

Benzoato de potasio Sólido x4 0 0,045

Emulsión naranja Emulsión x5 0 0,15

Enturbiante Emulsión x6 0 0,45

La variable x i corresponde a la concentración expresada en gramos presentes por cada 100 gramos de muestra.

El análisis de especificidad se realiza tanto para Brix directo como invertido, preparando 12 soluciones de 100 gramos cada una, con la respectiva cantidad de componentes especificada en la tabla 20.

Tabla 20. Diseño de experimentos para especificidad.

Solución x1 x2 x3 x4 x5 x6 Agua (g)

Total (g)

1 7,000 0,000 0,000 0,045 0,150 0,000 92,805 1002 7,000 0,000 0,050 0,045 0,150 0,000 92,755 1003 7,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,450 92,550 1004 7,000 0,500 0,050 0,045 0,000 0,000 92,405 1005 7,000 0,500 0,050 0,000 0,150 0,000 92,300 1006 7,000 0,500 0,000 0,000 0,000 0,450 92,050 1007 13,000 0,000 0,050 0,000 0,000 0,000 86,950 1008 13,000 0,000 0,050 0,045 0,000 0,450 86,455 1009 13,000 0,000 0,000 0,000 0,150 0,450 86,400 10010 13,000 0,500 0,050 0,000 0,150 0,450 85,850 10011 13,000 0,500 0,000 0,045 0,000 0,450 86,005 10012 13,000 0,500 0,000 0,045 0,150 0,000 86,305 100

6.2.3.5. Estabilidad

La estabilidad de la muestra se evaluó en condiciones ambientales controladas, una vez desgasificada la muestra se hicieron mediciones a diferentes horas el mismo día (ver tabla 21), esto con el fin de demostrar si el dejar una muestra a condiciones ambientales y de forma descuidada incide de manera significativa en el valor de Brix reportado.

Tabla 21. Evaluación de estabilidad.

73

Muestra Colombiana Nacional

Manzana Interior

Seven Up

Tiempos de lecturas

- - -

Inmediatamente 8 8 81 Hora 8 8 82 Horas 8 8 83 Horas 8 8 8

Número de lecturas

96

6.2.3.6. Exactitud

El parámetro de exactitud se puede evaluar respecto a dos valores de referencia: patrones y estándares.

Exactitud con patrones: Es sabido que las soluciones patrón son costosas y vienen en volúmenes pequeños que permiten realizar una cantidad limitada de lecturas, generalmente 3 mediciones. Con el agua ultra pura patrón de referencia para el densímetro, se realiza una calibración e inmediatamente se leen varios estándares. Con estos datos se establece el sesgo y la recuperación.

Exactitud con estándares: el cálculo de exactitud con estándares se puede realizar con los datos obtenidos en la evaluación de linealidad. Estos resultados estarán expresados en términos de ºBx, determinando la exactitud en el rango de trabajo a diferentes concentraciones, se debe tener en cuenta que los análisis se realizaron por triplicado y no es posible realizar una prueba de hipótesis concluyente. Los cálculos y resultados obtenidos para este caso son idénticos a los expuestos en el análisis del rango.

Como se mencionó anteriormente la exactitud es evaluada de dos formas usando el mismo patrón de referencia (agua ultra pura):

Calibración con agua destilada: La calibración se hace de forma rutinaria utilizando agua destilada obtenida en el laboratorio. Se verifica el sesgo en función de la densidad con respecto al patrón de referencia después de una debida calibración (ver tabla 22).

74

Tabla 22. Patrón utilizado para el cálculo de exactitud.

Patrón de referencia T (ºC) Densidad teórica (g/cm3)Agua ultra pura 20 0,99820 ± 0,00002

Calibración con patrón de referencia: Esta calibración comprende la misma metodología que la anterior, sólo que esta vez en lugar de utilizar agua destilada se usa el patrón de referencia y se analizan los estándares distintos preparados en el laboratorio (ver tabla 23). El procedimiento permite evaluar el sesgo en función de la densidad y el ºBx.

Tabla 23. Estándares utilizados en el cálculo de exactitud.

Estándares Valor teórico (ºBx)Agua destilada 0,000

8,00 ºBx 8,00010,00 ºBx 10,00012,00 ºBx 12,000

6.2.3.7. Precisión

La precisión engloba diferentes tipos de estudios: repetibilidad instrumental, repetibilidad del método, precisión intermedia y reproducibilidad.

Este trabajo incluye cálculos de repetibilidad instrumental, de método y la precisión intermedia. Por otra parte los cálculos correspondientes a la reproducibilidad involucran a otros laboratorios que posean un nivel de análisis similar o superior al que se tiene en el Laboratorio Central, este estudio sobrepasa los límites de este proyecto y se deja propuesto para futuros estudios en la empresa.

6.2.3.7.1. Repetibilidad

6.2.3.7.1.1. Repetibilidad del instrumento

La repetibilidad instrumental del equipo SDA-M no aplica para este instrumento debido a que el densímetro lleva a cabo las lecturas de forma parcialmente destructiva, esto se debe a que al momento de realizar la lectura de una muestra se regresa parte de ésta al vial con la muestra original llegando a contaminarla. Además, el equipo no permite

75

realizar más de dos mediciones de la misma muestra, ya que gasta gran parte de la muestra enjuagando la celda de medición por tanto no se pueden obtener datos concordantes; lo que conlleva a la obtención de desviaciones estándar mayores a las que se pueden obtener en la repetibilidad del método y esto por supuesto es improbable.

6.2.3.7.1.2. Repetibilidad del método

El ensayo de repetibilidad del método se efectuó sobre 10 alícuotas de una misma muestra homogénea, que se analiza a través de 3 niveles de concentración 7, 10, 13 ºBx, por el mismo instrumento y el mismo analista.

6.2.3.7.2. Precisión intermedia

Para el cálculo de la precisión intermedia, cada analista realizó tres análisis por día en el instrumento, los factores a evaluar incluyen el día, el analista, el instrumento, etc. El diseño de experimento se observa en la tabla 24.

Tabla 24. Diseño de experimentos para precisión intermedia.

Densímetro SDA-M

Día 1 Día 2 Día 3 Total analistaAnalista H 3 3 3 9Analista W 3 3 3 9

Total de análisis en el equipo 18

76

7. RESULTADOS Y ANÁLISIS

En esta sección se mostrarán los resultados más significativos obtenidos en el estudio de validación, para obtener más información sobre el procedimiento, los cálculos y los resultados parciales, se sugiere ver los anexo 6.

7.1. VERIFICACIÓN DE LAS LECTURAS. COMPARACIÓN ENTRE TABLA NBS Y EL ICUMSA

Para esta verificación se realizaron preparaciones de sacarosa a diferentes concentraciones que abarcan desde 6,00 a 14,00 ºBx dto. Se realizó el proceso de inversión y las muestras fueron leídas en el equipo DMA-58, los datos obtenidos por el equipo fueron comparados con los valores obtenidos por ambos polinomios ICUMSA (Sac/pura y Azuc/inv); los resultados se muestran en las tablas 25 a 33.

Tabla 25. Resultados de la verificación de las lecturas ºBx inv teórico: 6,316.

Datos Teórico

s

# Muestra

s

Lectura de °Bx en DMA 58

Polinomio ICUMSA (Sac/Pura)

Polinomio ICUMSA (Azúc/Inv)

°Bx - °Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

6,000 1 6,337 1,02318

6,337 1,02317 6,337 1,02319

°Bx inv

6,316 2 6,331 1,02315

6,331 1,02314 6,331 1,02316

3 6,344 1,02321

6,344 1,02319 6,344 1,02321

Promedio

6,337 1,02318

6,337 1,02317 6,337 1,02319

Desv. Est. (S)

0,00651

0,00003

0,00651 0,00003 0,00651 0,00003


Datos Teórico

s

# Muestra

s


Polinomio ICUMSA

(Sac/Pura)



°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

7,002 1 7,378 1,02739 7,378 1,02737 7,378 1,02739

°Bx inv

7,370 2 7,385 1,02741 7,385 1,02740 7,385 1,02742

3 7,381 1,02740 7,381 1,02739 7,381 1,02740

77

Promedio

7,381 1,02740 7,381 1,02739 7,381 1,02740

Desv. Est. (S)

0,00351 0,00001 0,00351

0,00002 0,00351 0,00002

78


Datos Teórico

s

# Muestra

s





°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

8,000 1 8,427 1,03165 8,427 1,03165 8,427 1,03165

°Bx inv

8,421 2 8,424 1,03164 8,424 1,03164 8,424 1,03164

3 8,427 1,03165 8,427 1,03165 8,427 1,03165

Promedio

8,426 1,03165 8,426 1,03165 8,426 1,03165

Desv. Est. (S)

0,00173 0,00001 0,00173 0,00001 0,00173 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s


Polinomio ICUMSA

(Sac/Pura)



°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

9,000 1 9,474 1,03595 9,474 1,03594 9,474 1,03594

°Bx inv

9,473 2 9,472 1,03594 9,472 1,03594 9,472 1,03593

3 9,472 1,03594 9,472 1,03594 9,472 1,03593

Promedio

9,473 1,03594 9,473 1,03594 9,473 1,03593

Desv. Est. (S)

0,00115 0,00001 0,00115

0,00000 0,00115 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s





°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

10,000 1 10,518 1,04026 10,518 1,04026 10,518 1,04025

79

°Bx inv

10,526 2 10,521 1,04027 10,521 1,04027 10,521 1,04026

3 10,520 1,04026 10,520 1,04027 10,520 1,04025

Promedio

10,520 1,04026 10,520 1,04027 10,520 1,04025

Desv. Est. (S)

0,00153 0,00001 0,00153 0,00001 0,00153 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s





°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

11,000 1 11,566 1,04462 11,566 1,04463 11,566 1,04460

°Bx inv

11,579 2 11,579 1,04467 11,579 1,04468 11,579 1,04465

3 11,566 1,04462 11,566 1,04463 11,566 1,04460

Promedio

11,570 1,04464 11,570 1,04465 11,570 1,04462

Desv. Est. (S)

0,00751 0,00003 0,00751 0,00003 0,00751 0,00003


Datos Teórico

s

# Muestra

s





°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

12,000 1 12,604 1,04897 12,604 1,04898 12,604 1,04894

°Bx inv

12,631 2 12,608 1,04899 12,608 1,04900 12,608 1,04895

3 12,608 1,04899 12,608 1,04900 12,608 1,04895

Promedi 12,607 1,04898 12,607 1,04899 12,607 1,04895

80

oDesv.

Est. (S)0,00231 0,00001 0,00231 0,00001 0,00231 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s





°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

12,999 1 13,650 1,05339 13,650 1,05341 13,650 1,05334

°Bx inv

13,683 2 13,650 1,05339 13,650 1,05341 13,650 1,05334

3 13,652 1,05340 13,652 1,05341 13,652 1,05335

Promedio

13,651 1,05339 13,651 1,05341 13,651 1,05334

Desv. Est. (S)

0,00115 0,00001 0,00115 0,00000 0,00115 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s




°Bx - °Bx inv Densidad

°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

13,999 1 14,695 1,05783 14,695 1,05786 14,695 1,05777

°Bx inv

14,735 2 14,684 1,05779 14,684 1,05781 14,684 1,05772

3 14,694 1,05783 14,694 1,05785 14,694 1,05776

Promedio

14,691 1,05782 14,691 1,05784 14,691 1,05775

Desv. Est. (S)

0,00608 0,00002 0,00608 0,00003 0,00608 0,00003

A continuación se muestran las diferencias entre los valores obtenidos por el polinomio ICUMSA (Sac/Pura) y el polinomio ICUMSA (Azúc/Inv), con el fin de establecer si existe una diferencia significativa entre las dos formas de obtención del valor de densidad (ver tabla 34).

81

Tabla 34. Diferencia entre las lecturas obtenidas por los polinomios ICUMSA.

Valor del °Bx invValores de densidad [g/cm3]

DiferenciaPolinomio ICUMSA(Sac/Pura)

Polinomio ICUMSA(Azúc/Inv)

6,337 1,02317 1,02319 -0,00002

6,331 1,02314 1,02316 -0,00002

6,344 1,02319 1,02321 -0,00002

7,378 1,02737 1,02739 -0,00002

7,385 1,02740 1,02742 -0,00002

7,381 1,02739 1,02740 -0,00001

8,427 1,03165 1,03165 0,00000

8,424 1,03164 1,03164 0,00000

8,427 1,03165 1,03165 0,00000

9,474 1,03594 1,03594 0,00000

9,472 1,03594 1,03593 0,00001

9,472 1,03594 1,03593 0,00001

10,518 1,04026 1,04025 0,00001

10,521 1,04027 1,04026 0,00001

10,520 1,04027 1,04025 0,00002

11,566 1,04463 1,04460 0,00003

11,579 1,04468 1,04465 0,00003

11,566 1,04463 1,04460 0,00003

12,604 1,04898 1,04894 0,00004

12,608 1,04900 1,04895 0,00005

12,608 1,04900 1,04895 0,00005

13,650 1,05341 1,05334 0,00007

13,650 1,05341 1,05334 0,00007

13,652 1,05341 1,05335 0,00006

14,695 1,05786 1,05777 0,00009

14,684 1,05781 1,05772 0,00009

14,694 1,05785 1,05776 0,00009

De lo anterior se observa que se presenta una mayor diferencia a medida que el valor de densidad va en aumento, por lo que esta diferencia afecta el valor reportado de °Bx invertido.

Para saber el grado de influencia que tiene la variación de la densidad con respecto al °Bx invertido, en la tabla 35 se establece un valor de densidad para un °Bx invertido determinado; el objetivo fue encontrar el intervalo del °Bx invertido en el que el valor de la densidad permanece constante.

82

Tabla 35. Intervalo del ºBx inv., en el que se mantiene constante la densidad.

Densidad referencia lectura del equipoPolinomio ICUMSA

(Sac/Pura)Polinomio ICUMSA

(Azúc/Inv)

1,023186,340 6,3356,341 6,336

- -

1,027407,384 7,3807,385 7,381

- -

1,031658,427 8,4258,428 8,426

- 8,427

1,035949,472 9,4739,473 9,4749,474 -

1,0402610,517 10,52110,518 10,52210,519 -

1,0446411,569 11,57611,570 11,577

- -

1,0489812,603 12,61412,604 12,615

- -

1,0533913,646 13,66113,647 13,662

- 13,663

1,0578214,686 14,70614,687 14,707

- 14,708

De las tablas anteriores se puede observar que para una diferencia máxima de ± 0,00009 g/cm3 en el valor de la densidad, el Brix invertido se modifica en un valor de ±0,022 aunque este valor se encuentra un poco por encima de la incertidumbre reportada por el fabricante cuyo valor es de ±0,020; la incertidumbre en la medición que puede ser tolerada en el Laboratorio Central, sin que se afecte de manera significativa los resultados de los análisis es de un valor igual a ±0,030. Por lo tanto, se puede concluir que la medición del Brix invertido no es afectada de manera significativa, esto significa que no hay diferencia entre reportar el valor del Brix invertido con el polinomio ICUMSA (Sac/Pura) o el polinomio ICUMSA (Azúc/Inv).

De igual forma se hace la comparación entre el polinomio ICUMSA (Sac/Pura) y la Tabla NBS (ver tablas de 36 a 44).


Datos # Lectura de °Bx en Polinomio ICUMSA Tabla NBS

83

Teóricos

Muestras

DMA 58 (Sac/Pura)


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

6,000 1 6,337 1,02318 6,337 1,02317 6,337 1,02318

°Bx inv

6,316 2 6,331 1,02315 6,331 1,02314 6,331 1,02316

3 6,344 1,02321 6,344 1,02319 6,344 1,02321

Promedio

6,337 1,02318 6,337 1,02317 6,337 1,02318

Desv. Est. (S)

0,00651 0,00003 0,00651 0,00003 0,00651 0,00003


Datos Teórico

s

# Muestra

s


Polinomio ICUMSA

(Sac/Pura)

Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

7,002 1 7,378 1,02739 7,378 1,02737 7,378 1,02739

°Bx inv

7,370 2 7,385 1,02741 7,385 1,02740 7,385 1,02742

3 7,381 1,02740 7,381 1,02739 7,381 1,02740

Promedio

7,381 1,02740 7,381 1,02739 7,381 1,02740

Desv. Est. (S)

0,00351 0,00001 0,00351 0,00002 0,00351 0,00002


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

8,000 1 8,427 1,03165 8,427 1,03165 8,427 1,03166

°Bx in

8,421 2 8,424 1,03164 8,424 1,03164 8,424 1,03164

84

v3 8,427 1,03165 8,427 1,03165 8,427 1,03166

Promedio

8,426 1,03165 8,426 1,03165 8,426 1,03165

Desv. Est. (S)

0,00173 0,00001 0,00173 0,00001 0,00173 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

9,000 1 9,474 1,03595 9,474 1,03594 9,474 1,03595

°Bx inv

9,473 2 9,472 1,03594 9,472 1,03594 9,472 1,03594

3 9,472 1,03594 9,472 1,03594 9,472 1,03594

Promedio

9,473 1,03594 9,473 1,03594 9,473 1,03594

Desv. Est. (S)

0,00115 0,00001 0,00115 0,00000 0,00115 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

10,000 1 10,518 1,04026 10,518 1,04026 10,518 1,04026

°Bx inv

10,526 2 10,521 1,04027 10,521 1,04027 10,521 1,04027

3 10,520 1,04026 10,520 1,04027 10,520 1,04026

Promedio

10,520 1,04026 10,520 1,04027 10,520 1,04026

Desv. Est. (S)

0,00153 0,00001 0,00153 0,00001 0,00153 0,00001

85


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

11,000 1 11,566 1,04462 11,566 1,04463 11,566 1,04462

°Bx inv

11,579 2 11,579 1,04467 11,579 1,04468 11,579 1,04466

3 11,566 1,04462 11,566 1,04463 11,566 1,04462

Promedio

11,570 1,04464 11,570 1,04465 11,570 1,04463

Desv. Est. (S)

0,00751 0,00003 0,00751 0,00003 0,00751 0,00002


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

12,000 1 12,604 1,04897 12,604 1,04898 12,604 1,04897

°Bx inv

12,631 2 12,608 1,04899 12,608 1,04900 12,608 1,04899

3 12,608 1,04899 12,608 1,04900 12,608 1,04899

Promedio

12,607 1,04898 12,607 1,04899 12,607 1,04898

Desv. Est. (S)

0,00231 0,00001 0,00231 0,00001 0,00231 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS


°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

12,999 1 13,650 1,05339 13,650 1,05341 13,650 1,05339

°Bx

13,683 2 13,650 1,05339 13,650 1,05341 13,650 1,05339

86

inv

3 13,652 1,05340 13,652 1,05341 13,652 1,05340

Promedio

13,651 1,05339 13,651 1,05341 13,651 1,05339

Desv. Est. (S)

0,00115 0,00001 0,00115 0,00000 0,00115 0,00001


Datos Teórico

s

# Muestra

s



Tabla NBS

°Bx - °Bx inv Densidad

°Bx Densidad

°Bx Densidad

°Bx dto

13,999 1 14,695 1,05783 14,695 1,05786 14,695 1,05784

°Bx inv

14,735 2 14,684 1,05779 14,684 1,05781 14,684 1,05779

3 14,694 1,05783 14,694 1,05785 14,694 1,05783

Promedio

14,691 1,05782 14,691 1,05784 14,691 1,05782

Desv. Est. (S)

0,00608 0,00002 0,00608 0,00003 0,00608 0,00003

En la tabla 45 se muestran las diferencias entre los valores obtenidos por ambos métodos, en la tabla 46 se muestra una densidad de referencia y el ºBx correspondiente.

Tabla 45. Diferencia entre las lecturas obtenidas por el polinomio ICUMSA (Sac/Pura) y la tabla NBS

Valor del °Bx invValores de densidad [g/cm3]

DiferenciaPolinomio ICUMSA(Sac/Pura)

Tabla NBS

6,337 1,02317 1,02318 -0,00001

6,331 1,02314 1,02316 -0,00002

6,344 1,02319 1,02321 -0,00002

7,378 1,02737 1,02739 -0,00002

7,385 1,02740 1,02742 -0,00002

7,381 1,02739 1,02740 -0,00001

87

8,427 1,03165 1,03166 -0,00001

8,424 1,03164 1,03164 0,00000

8,427 1,03165 1,03166 -0,00001

9,474 1,03594 1,03595 -0,00001

9,472 1,03594 1,03594 0,00000

9,472 1,03594 1,03594 0,00000

10,518 1,04026 1,04026 0,00000

10,521 1,04027 1,04027 0,00000

10,520 1,04027 1,04026 0,00001

11,566 1,04463 1,04462 0,00001

11,579 1,04468 1,04466 0,00002

11,566 1,04463 1,04462 0,00001

12,604 1,04898 1,04897 0,00001

12,608 1,04900 1,04899 0,00001

12,608 1,04900 1,04899 0,00001

13,650 1,05341 1,05339 0,00002

13,650 1,05341 1,05339 0,00002

13,652 1,05341 1,05340 0,00001

14,695 1,05786 1,05784 0,00002

14,684 1,05781 1,05779 0,00002

14,694 1,05785 1,05783 0,00002

Tabla 46. Intervalo del ºBx inv., en el que se mantiene constante la densidad.

Lectura del equipo a la densidad de referenciaPolinomio ICUMSA

(Sac/Pura)Tabla NBS

1,023186,340 6,3366,341 6,337

- 6,338

1,027407,384 7,3817,385 7,382

- -

1,031658,427 8,4258,428 8,426

- -

1,035949,472 9,4719,473 9,4729,474 9,473

1,0402610,517 10,51710,518 10,51810,519 10,519

1,0446411,569 11,57011,570 11,571

- -

1,0489812,603 12,60512,604 12,606

- -

1,0533913,646 13,64913,647 13,650

- 13,651

88

1,0578214,686 14,69114,687 14,692

- -

Por los resultados mostrados en las tablas previas, se puede deducir que no existe una diferencia notoria que conlleve a errores significativos si se lee con la Tabla NBS o con el polinomio ICUMSA (Sac/Pura). Esto se da, porque con una diferencia máxima de ±0,00002 g/cm3 en el valor de densidad, el ºBx inv se modifica en una cantidad igual a ±0,006. Este valor se encuentra muy por debajo de la incertidumbre que reporta el fabricante del equipo cuyo valor es de ±0,02.

7.2. COMPARACIÓN ENTRE LOS EQUIPOS DMA-58 Y SDA-M

Los resultados del estudio de comparación entre los dos equipos se muestran en las tablas 47 a 48. Para la prueba de las varianzas se formulan las siguientes hipótesis:

Tabla 47. Prueba de las varianzas.

Hipótesis nula H0 S²a = S²b Las varianzas son igualesHipótesis alterna H1 S²a ≠ S²b Las varianzas son diferentes

La prueba se hará con un nivel de significancia de 5%.Se procede entonces con la prueba de las medias de los valores de densidad reportados por ambos equipos, para esto se formula la siguiente hipótesis:

Tabla 48. Prueba de las medias.

Hipótesis nula H0 µa = µb Las medias son igualesHipótesis alterna H1 µa ≠ µb Las medias son diferentes

De igual forma se realizó la prueba con un grado de significancia del 5% (ver tabla 49 - 50).

Tabla 49. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en densidad.

Cálculos basados en la densidadEquipo DMA-58 Equipo SDA-M

89

Media (µa) 1,04040 Media (µb) 1,04035Desviación Estándar (Sa) 0,01141 Desviación Estándar (Sb) 0,01140Varianza (S²a) 0,00013 Varianza (S²b) 0,00013Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27

Test de FFexp 1,00099Grado Libertad (a) 26Grado Libertad (b) 26Niv. Signif. (α) 0,050Ftabla 1,92921

Como Fexp<Ftabla significa que ambos métodos tiene varianzas estimadas iguales y por tanto, precisiones semejantes.

Test de ts² 0,00013texp 0,01775Grado Libertad 52Niv. Signif. (α/2) 0,050ttabla 2,00665

Como texp<ttabla significa que no hay diferencia entre las dos medidas.

Tabla 50. Análisis estadístico para la comparación entre las lecturas de los densímetros basados en ºBx inv.

Cálculos basados en ºBx inv.Equipo DMA-58 Equipo SDA-M

Media (µa) 10,52696 Media (µb) 10,51430Desviación Estándar (Sa) 2,75131 Desviación Estándar (Sb) 2,74939Varianza (S²a) 7,56971 Varianza (S²b) 7,55916Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27





En ambos casos se acepta la hipótesis nula; es decir, no hay diferencias significativas entre las lecturas que reportan los densímetros DMA-58 y SDA-M con relación a la densidad y el Brix.

90

7.3. Validación del equipo Soft Drink Analyzer M

7.3.1. Comparación entre las lecturas con el procedimiento normal de inversión y las lecturas sin inversión

Para esta prueba se utilizaron tanto las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones como las muestras de mercado, que para este caso son: Colombiana nacional, Manzana interior y Seven up, ya que son los sabores más representativos de la marca. Los datos obtenidos se muestran en las tablas 51 a 54.


Muestra: SacarosaCálculos basados en la densidad

Muestra con inversión Muestra sin inversiónMedia (µa) 1,04035 Media (µb) 1,038202Desviación Estándar (Sa) 0,01140 Desviación Estándar (Sb) 0,010885Varianza (S²a) 0,00013 Varianza (S²b) 0,000118Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27






Muestra: SacarosaCálculos basados en ºBx inv.

Muestra con inversión Muestra sin inversiónMedia (µa) 10,514 Media (µb) 10,523Desviación Estándar (Sa) 2,74939 Desviación Estándar (Sb) 2,77066

91

Varianza (S²a) 7,55916 Varianza (S²b) 7,67654Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27






Muestra: Colombiana nacional, Manzana interior; Seven upCálculos basados en la densidad

Muestra con inversión Muestra sin inversiónMedia (µa) 1,042183 Media (µb) 1,040350Desviación Estándar (Sa) 0,001572 Desviación Estándar (Sb) 0,001368Varianza (S²a) 2,470E-06 Varianza (S²b) 1,871E-06Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27



Test de ts² 2,17E-06texp 4,57078Grado Libertad 52Niv. Signif. (α/2) 0,050ttabla 2,00665

Como texp>ttabla significa que existe diferencia entre las dos medidas.

92


Muestra: Colombiana nacional, Manzana interior; Seven upCálculos basados en ºBx inv.

Muestra con inversión Muestra sin inversiónMedia (µa) 10,994 Media (µb) 10,992Desviación Estándar (Sa) 0,36835 Desviación Estándar (Sb) 0,373508Varianza (S²a) 0,13568 Varianza (S²b) 0,139508Número de datos (na) 27 Número de datos (nb) 27





El resultado obtenido en el análisis de las bebidas gaseosas basado en la densidad, muestra que hay diferencia entre las medidas, esto se debe a que cuando el proceso de inversión es llevado a cabo, los sólidos se aumentan en un 5,26% dando valores mayores en densidad. Por el contrario, las lecturas realizadas sin el proceso de inversión reportan un valor de densidad menor, ya que la muestra en el momento del análisis no está completamente invertida, sino que tienen cierto grado de inversión (menor cantidad de sólidos).

Como la densidad es utilizada para calcular el contenido volumétrico de una muestra, se hace necesario saber en qué medida se ve afectado dicho cálculo cuando se reportan los valores de densidad con y sin inversión. Para ello se emplea la siguiente expresión:

Contenido= Peso lleno−Peso vacíoDensidad

(43)

93

Los resultados del estudio se muestran en la tabla 55.

Tabla 55. Cálculo del contenido volumétrico de las diferentes muestras de mercado.

Variables

Muestras con el procedimiento de inversión y desgasificación de 12

min.

Muestras sin inversión y desgasificación 12 min.

Colombiana nacional

Manzana interior

Seven up

Colombiana nacional

Manzana interior

Seven up

Tipo de muestra

Litrón(1250mL)

Litrón (1250mL)

Litrón (1250mL)

Litrón(1250mL)

Litrón (1250mL)

Litrón (1250mL)

Peso lleno (g)

2215,7 2242,7 2238,5 2215,7 2242,7 2238,5

Peso vacío (g)

931,2 930,8 927,3 931,2 930,8 927,3

Densidad (g/mL)

1,04026 1,04227 1,04402 1,03870 1,04037 1,04198

Contenido (mL)

1235 1259 1256 1237 1261 1258

Los resultados obtenidos muestran una pequeña diferencia en el contenido entre las muestras con y sin inversión, esta diferencia de 2mL causada por la discrepancia de densidad no es significativa, si se tiene en cuenta que la altura de llenado, así como el peso vacío de la botella de vidrio o PET afectan mayormente el cálculo de contenido.

7.3.2. Linealidad

Los datos obtenidos en el análisis de linealidad se muestran a continuación:

En ºBx directo

Tabla 56. Resultados para el estudio de linealidad en el SDA-M en ºBx directo.

ºBx dto teórico

Lectura de densidad (g/cm3)

Promedio (g/cm3)

Lectura ºBx dto Promedio ºBx dto

1 2 3 1 2 36,003 1,0217

91,0217

91,0218

01,02179 5,994 5,995 5,995 5,995

7,003 1,02583

1,02583

1,02583

1,02583 6,997 6,997 6,997 6,997

8,000 1,02988

1,02987

1,02989

1,02988 7,994 7,992 7,996 7,994

94

9,000 1,03396

1,03397

1,03398

1,03397 8,992 8,994 8,995 8,994

10,004 1,03812

1,03812

1,03812

1,03812 10,001

10,002

10,003

10,002

11,003 1,04226

1,04226

1,04226

1,04226 11,000

11,001

11,001

11,001

12,000 1,04643

1,04644

1,04643

1,04643 11,998

12,000

12,000

11,999

13,000 1,05065

1,05065

1,05065

1,05065 13,002

13,002

13,003

13,002

14,003 1,05488

1,05488

1,05489

1,05488 14,002

14,002

14,003

14,002

En ºBx invertido

Tabla 57. Resultados para estudio de linealidad en el SDA-M en ºBx invertido.

ºBx dto

teórico

ºBx inv

teórico

Lectura de densidad (g/cm3)

Promedio

(g/cm3)

Lectura ºBx inv Promedio ºBx inv

1 2 3 1 2 3

6,003 6,319 1,02314

1,02314

1,02315

1,02314 6,329 6,330 6,336 6,332

7,003 7,371 1,02738

1,02737

1,02737

1,02737 7,378 7,376 7,377 7,377

8,000 8,421 1,03163

1,03163

1,03163

1,03163 8,423 8,422 8,423 8,423

9,000 9,473 1,03591

1,03591

1,03591

1,03591 9,466 9,467 9,466 9,466

10,004 10,530 1,04028

1,04028

1,04030

1,04028 10,523

10,523

10,528

10,525

11,003 11,582 1,04462

1,04462

1,04463

1,04463 11,567

11,567

11,570

11,568

12,000 12,631 1,04896

1,04897

1,04897

1,04897 12,602

12,604

12,604

12,603

13,000 13,684 1,05339

1,05338

1,05340

1,05339 13,649

13,648

13,652

13,650

14,003 14,740 1,05780

1,05779

1,05780

1,05780 14,686

14,684

14,686

14,685

Con estos valores, se calcula los parámetros de regresión lineal evaluados en la linealidad para cada ensayo. Los datos obtenidos se presentan en la tabla 58.

Tabla 58. Parámetros de regresión lineal en el estudio de linealidad.

SDA-MMétodos

Parámetros ºBx dto ºBx invIntercepto (a) 0,99682 0,99699Pendiente (b) 0,00414 0,00412

95

r 0,99997 0,99998r² 0,99994 0,99995

S²b 4,312E-11 3,114E-11S²a 4,601E-09 3,681E-09

Existen en la literatura diversos polinomios que pueden convertir la densidad a grados Brix, los cuales tiene un orden de 3, 4 o incluso 5 que cubren un amplio rango de trabajo. Sin embargo, se puede observar que cuando se evalúan rangos estrechos para este caso 6,000 a 14,735 °Bx, la linealidad es elevada y puede corroborarse por las gráficas y los coeficientes de correlación (mayores a 0,999…).

Las gráficas que soportan la afirmación anterior se muestran a continuación (figuras 13 y 14).

En ºBx directo

Figura 13. Regresión lineal para la densidad respecto a ºBx dto.

En ºBx invertido

96

Figura 14. Regresión lineal para la densidad respecto al ºBx inv.

Para completar el estudio de linealidad, se realiza la prueba llamada ANOVA y la verificación de los supuestos en linealidad. Los resultados de estos análisis se muestran a continuación.

Homogeneidad de las varianzas: Se realizó mediante el test de Cochran, los resultados se muestran en la tabla 59.

Tabla 59. Resultados de la homogeneidad de las varianzas.

Test de Cochran

Parámetros ºBx dto ºBx inv

Gexp 0,4532 0,2924

Niv. Signif. (α) 0,05 0,05

# Muest. (ni) 3 3

# Total Exp. (n) 27 27

# Exp. (k) 9 9

Gtabla 0,4775 0,4775

Como Gexp < Gtabla significa que las varianzas de las concentraciones son homogéneas, es decir, que el factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

Prueba ANOVA: los resultados de esta prueba se muestran a continuación (ver tabla 60).

Tabla 60. Resultados obtenidos en el análisis de ANOVA.

97

Parámetros Densímetro SDA-MºBx dto ºBx inv

SCREG 0,00308041 0,0033814SCRES 1,9400E-07 1,5523E-07SCFA 1,9362E-07 1,5444E-07SCEXP 4,0133E-10 7,873E-10GLREG 1 1GLRES 25 25GLFA 7 7GLEXP 18 18

GLTOTAL 26 26VREG 0,00308041 0,0033814VRES 7,7609E-09 6,2093E-09VFA 2,7662E-08 2,2063E-08VEXP 2,2301E-11 4,374 E-11F1;Exp 3,969E+05 5,446E+05

F1;Tabla 4,242 4,242¿Pendiente ≠0? Si Si

F2;Exp 1240,57 504,41F2;Tabla 2,577 2,577

¿Linealidad? No No

Los resultados muestran lo siguiente:

F1; Exp> F1; Tabla; demuestra la existencia de una pendiente distinta de cero.F2; Exp> F2; Tabla; demuestra que no hay linealidad en los resultados obtenidos.

Normalidad de los residuos: La normalidad de los residuos fue analizada por el método de Shapiro-Wilk, los resultados se muestran en la tabla 61.

Tabla 61. Normalidad de los residuos.

Test de Shapiro - WilkDensímetro SDA-M

ºBx dto ºBx inv# Muestras 27 27Promedio 0,00333 0,01357

Suma de cuadrados (SC) 3,120E-04 1,115E-02b 0,0171707 1,015E-01W 0,945 0,924

Wtabla 0,923 0,923¿Normalidad? Si Si

En los resultados se muestra que W>Wtabla, indicando que hay normalidad en los datos obtenidos.

Significancia de pendiente e intercepto: Permiten evaluar si la recta pasa por el origen de coordenadas, determinando si

98

la variable independiente es significativamente distinta de cero. Los resultados de este test se observan en las tablas 62 a 63.

Tabla 62. Test de verificación de la pendiente.

Test de verificación de la pendiente o de linealidadParámetros Densímetro SDA-M

ºBx dto ºBx invS²yx 7,761E-09 6,209E-09Sb² 4,312E-11 3,114E-11Sb 6,567E-06 5,580E-06

Test de ttexp 630,02 737,95

Niv. Signif. () 0,05 0,05ttabla 2,060 2,060

Intervalo (b) Mayor 0,00415 0,00413Menor 0,00412 0,00411

¿b≠0? Si Si

Los resultados muestran que se cumple con el Test de t de la pendiente ya que texp>ttabla.

Tabla 63. Test de verificación término independiente.

Test de verificación de la variable independiente o de proporcionalidadParámetros Densímetro SDA-M

ºBx dto ºBx invS²yx 7,761E-09 6,209E-09Sa² 4,601E-09 3,681E-09Sa 6,783E-05 6,068E-05

Test de ttexp 14695,06 16431,61747

Niv. Signif. () 0,05 0,05ttabla 2,060 2,060

Intervalo (a) Mayor 0,99696 0,99712Menor 0,99668 0,99687

¿a=0? No No

Los resultados muestran que:

No se cumple con el Test de t de la variable independiente ya que texp>ttabla. En este caso, se sugiere que antes de cualquier medición con el equipo SDA-M se debe leer dos muestras estándares, uno en un punto inferior y otro en un punto superior. Se recomienda utilizar agua destilada como verificador del punto inferior y una solución de sacarosa de 12,00°Bx dto como verificador del punto superior.

99

Los resultados obtenidos por el densímetro SDA-M hablan de un coeficiente de correlación muy satisfactorio en ambas escalas de medición (ºBx dto y ºBx inv).

Se observa también que en el análisis de ANOVA, el equipo falla en la comprobación de la linealidad por regresión, esto se debe fundamentalmente a que el SDA-M cuenta con una muy buena repetibilidad en cada serie de datos; es decir, la desviación de los datos obtenidos es numéricamente baja lo que causa un aumento significativo en el valor de F2; Exp. Pese a esto, se corroboró que la pendiente es estadísticamente diferente de cero, hecho comprobado en el análisis de ANOVA así como en la prueba t de significancia.

Con relación al intercepto de la regresión lineal, se obtiene un valor diferente de cero, ya que el valor de densidad obtenido para el valor mínimo de Brix; es decir, cero, es de 0,99820 g/cm3 cuando se analiza el agua destilada.

Como se ha visto anteriormente, se confirma la no linealidad entre la densidad y los grados Brix de las soluciones. Pero si se tiene como único criterio el coeficiente de correlación, es posible asumir con un alto grado de confiabilidad que existe linealidad en el rango trabajado de 6,000 a 14,735 ºBx.

7.3.3. Rango

A partir de los datos que se obtienen en el análisis de linealidad se puede obtener la recuperación y el sesgo de las diferentes concentraciones preparadas. Con estos valores, se puede establecer el rango de trabajo permitido, los datos fueron tabulados en las tablas 64 y 65.

Tabla 64. Porcentaje de recuperación (%R) para los datos utilizados en el estudio de linealidad.

Concentraciones Densímetro SDA-M % de Recuperación

ºBx dto teórico

ºBx inv teórico

Valor promedio en ºBx dto

Valor promedio en ºBx inv

En ºBx dto

En ºBx inv

6,003 6,319 5,995 6,332 99,87 100,217,003 7,371 6,997 7,377 99,91 100,088,000 8,421 7,994 8,423 99,93 100,029,000 9,473 8,994 9,466 99,93 99,9310,004 10,530 10,002 10,525 99,98 99,95

100

11,003 11,582 11,001 11,568 99,98 99,8812,000 12,631 11,999 12,603 99,99 99,7813,000 13,684 13,002 13,65 100,02 99,7514,003 14,740 14,002 14,685 99,99 99,63

Tabla 65. Sesgo del ºBx para los datos utilizados en el estudio de linealidad.

Concentraciones Densímetro SDA-M Sesgo de la medición

ºBx dto teórico

ºBx inv teórico

Valor promedio en ºBx dto

Valor promedio en ºBx inv

En ºBx dto

En ºBx inv

6,003 6,319 5,995 6,332 -0,008 0,0137,003 7,371 6,997 7,377 -0,006 0,0068,000 8,421 7,994 8,423 -0,006 0,0029,000 9,473 8,994 9,466 -0,006 -0,00710,004 10,530 10,002 10,525 -0,002 -0,00511,003 11,582 11,001 11,568 -0,002 -0,01412,000 12,631 11,999 12,603 -0,001 -0,02813,000 13,684 13,002 13,65 0,002 -0,03414,003 14,740 14,002 14,685 -0,001 -0,055

Como puede notarse, ambas escalas de medición tiene una muy buena recuperación en las distintas concentraciones evaluadas. Cabe resaltar que el sesgo en las lecturas de ºBx inv son elevadas a concentraciones altas si se comparan con las obtenidas en las concentraciones bajas. Las posibles causas de este comportamiento es que no hubo una completa inversión de la muestra ó al momento de preparar la solución los recipientes pudiesen estar contaminados con trazas de otros compuestos o incluso por polvo.

7.3.4. RobustezEl análisis de robustez comprende los siguientes análisis:

7.3.4.1. Análisis de estabilidad de la muestra

La prueba de estabilidad de las muestras implicadas se estudió en condiciones ambientales controladas. Las muestras se desgasificaron en el tiempo establecido por el estudio de desgasificación de 12 minutos. El estudio buscaba demostrar si la evaluación de la muestra a diferentes tiempos de análisis (2, 4, 6, 8 horas), exponiéndolas a las condiciones ambientales del laboratorio y de forma desatendida, afectaban significativamente los resultados obtenidos. Los resultados obtenidos de dicho estudio se muestran en la tabla 66.

Tabla 66. Resultados prueba de estabilidad de las muestras gaseosas.

Muestras Datos basados en el ºBrix (Como azúcar invertida)

101

Muestras comerciales sin invertirColombiana Nacional

2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 HorasPromedio 10,542 10,551 10,558 10,573

Desv. Est. (s) 9,910E-04 2,673E-03 8,345E-04 2,532E-03Varia. (s²) 9,821E-07 7,143E-06 6,964E-07 6,411E-06

Muestras (n) 8 8 8 8Ex. 0,000000 0,008875 0,016000 0,031000

SE (s=0,03) 0,015000 0,015000 0,015000 0,015000t 0,591667 1,066667 2,066667

Niv. Signif. (α) 0,05 0,05 0,05Grado Libertad 14 14 14

ttabla 2,1448 2,1448 2,1448¿Efecto Significativo? No No No

Manzana Interior2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas

Promedio 11,015 11,026 11,029 11,042Desv. Est. (s) 7,440E-04 1,923E-03 4,121E-03 2,669E-03

Varia. (s²) 5,536E-07 3,696E-06 1,698E-05 7,125E-06Muestras (n) 8 8 8 8

Ex. 0,000000 0,011750 0,014250 0,027000SE (s=0,03) 0,015000 0,015000 0,015000 0,015000

t 0,783333 0,950000 1,800000Niv. Signif. (α) 0,05 0,05 0,05Grado Libertad 14 14 14


Seven Up2 Horas 4 Horas 6 Horas 8 Horas



Ex. 0,000000 0,019375 0,025750 0,037750SE (s=0,03) 0,015000 0,015000 0,015000 0,015000



A continuación se muestran las gráficas que dan soporte al análisis anterior (figuras 15, 16 y 17):

102

Figura 15. Estabilidad de la Colombiana Nacional a través del tiempo.

Figura 16. Estabilidad de la Manzana Interior a través del tiempo.

103

Figura 17. Estabilidad de la Seven Up a través del tiempo.

Se puede observar la poca estabilidad de las muestras si se dejan expuestas a las condiciones ambientales del laboratorio. En el tiempo estudiado claramente se vé un aumento en el valor reportado de Brix, esto puede deberse a que al pasar las horas, el agua contenida en la bebida puede volatilizarse de manera lenta, con lo que se aumenta levemente el valor de los grados Brix.

Aunque según el análisis este aumento en el valor del grado Brix no es significativo, se recomienda leer las muestras antes de que hayan transcurrido 8 horas despues de abierta la muestra. Se debe tener en cuenta que en el densímetro las muestras son servidas en un automuestreador y que el análisis de 20 muestras pueden demorarse entre de 1 hora y media a 2 horas.

Test de normalidad para la estabilidad

Se hace necesario el test de normalidad para los datos obtenidos, este test se realizó mediante la prueba de Shapiro – Wilk, los resultados se muestran a continuación (tabla 67).

Tabla 67. Prueba de normalidad para la estabilidad de las muestras gaseosas.

Datos basados en el ºBrix (Como azúcar invertida)

Muestras comerciales sin invertir

Colombiana Nacional

2 Hora 4 Hora 6 Hora 8 Hora

104

# Muestras 8 8 8 8

Promedio 10,542 10,551 10,558 10,573

S.C. 6,875E-06 5,088E-05 4,875E-06 4,487E-05

b 0,002448 0,006570 0,002017 0,006341

W 0,871951 0,848528 0,834935 0,896091

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818

¿Normalidad? Si Si Si Si

Manzana Interior


# Muestras 8 8 8 8

Promedio 11,015 11,026 11,029 11,042

S.C. 3,500E-06 2,587E-05 1,189E-04 4,988E-05

b 0,001701 0,004929 0,010689 0,006690

W 0,826783 0,938939 0,961133 0,897339

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818


Seven Up


# Muestras 8 8 8 8

Promedio 11,419 11,438 11,445 11,457

S.C. 1,380E-04 2,388E-05 2,150E-05 5,150E-05

b 0,011212 0,004640 0,004265 0,006516

W 0,910918 0,901841 0,846216 0,824331

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818


Los resultados muestran que hay normalidad en los datos estudiados.

7.3.4.2. Tiempo de desgasificación

Inicialmente se realizó un test de normalidad en la evaluación del tiempo de desgasificación estos resultados se muestran en la tabla 68.

Tabla 68. Normalidad de la prueba de Tiempo de desgasificación.

Datos basados en el ºBrix (Como azúcar invertida)

Muestras comerciales sin invertir

Colombiana Nacional

8 min 10 min 12 min 14 min

# Muestras 8 8 8 8

Promedio 10,532 10,546 10,532 10,531

S.C. 1,009E-04 3,088E-05 6,888E-05 1,519E-04

105

b 0,008070 0,005420 0,007694 0,010285

W 0,646 0,951 0,859 0,697

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818

¿Normalidad? No Si Si No

Manzana Interior


# Muestras 8 8 8 8

Promedio 11,013 11,041 11,017 11,010

S.C. 7,150E-05 2,489E-04 1,309E-04 6,687E-05

b 0,007808 0,015384 0,009679 0,008095

W 0,853 0,951 0,716 0,980

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818

¿Normalidad? Si Si No Si

Seven Up


# Muestras 8 8 8 8

Promedio 11,495 11,425 11,427 11,433

S.C. 4,706E-03 1,795E-04 6,139E-04 3,890E-03

b 0,055215 0,013082 0,024325 0,052747

W 0,648 0,953 0,964 0,715

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818

¿Normalidad? No Si Si No

Esta variable es de suma imoprtancia debido a que si el tiempo de descarbonatación es muy bajo, puede haber presencia de CO2 en la muestra, con lo cual se altera el resultado de la densidad y por ende el ºBx. Por otra parte, si el tiempo de descarbonatación es muy prolongado, la inyección de aire puede provocar la evaporación del agua presente en la muestra gaseosa lo que puede ocacionar errores en la lectura.

Como puede observase, los resultados de la normalidad muestran que en algunos conjuntos de datos no hay normalidad, por lo tanto se plantea un método descrito en la lietratura que permite tratar datos dudosos y fuera de rango [19]. Este método, consiste en eliminar los datos que posiblemente fueron alterados (datos dudosos o extraños) y realizar nuevamente el test de Shapiro-Wilk. Los resultados obtenidos luego de este procedimiento (ver tabla 69) se muestran a continuación.

Tabla 69. Normalidad eliminando datos extraños o dudosos.

106

Datos basados en el ºBrix (Como azúcar invertida)Muestras comerciales sin invertir

Colombiana Nacional Manzana Interior

Seven Up

8 min 14 min 12 min 8 min 14 min

# Muestras 6 6 6 6 6

Promedio 10,533 10,533 11,019 11,506 11,420

S.C. 2,833E-06 2,833E-06 2,833E-06 1,320E-04 1,080E-04

b 0,001567 0,001567 0,001567 0,011418 0,009576

W 0,866 0,866 0,866 0,988 0,849

Wtabla 0,818 0,818 0,818 0,818 0,818

¿Normalidad? Si Si Si Si Si

De esta forma se comprueba la normalidad de los datos obtenidos en el estudio de desgasificación. Los resultados del análisis de a diferentes tiempos de desgasificación se muestran en la tabla 70.

Tabla 70. Datos obtenidos de la prueba de robustez.

Muestras

Datos basados en el ºBrix (Como azúcar invertida)Muestras comerciales sin invertir

Colombiana Nacional8 min 10 min 12 min 14 min



Ex. 0,000000 0,014000 0,000000 -0,001500SE (s=0,03) 0,0150 0,0150 0,0150 0,0150



Manzana Interior8 min 10 min 12 min 14 min



Ex. -0,003625 0,024000 0,000000 -0,006750SE (s=0,03) 0,0150 0,0150 0,0150 0,0150



Seven Up

107

8 min 10 min 12 min 14 minPromedio 11,495 11,425 11,427 11,433

Desv. Est. (s) 2,593E-02 5,064E-03 9,365E-03 2,357E-02Varia. (s²) 6,722E-04 2,564E-05 8,770E-05 5,557E-04

Muestras (n) 8 8 8 8Ex. 0,068625 -0,001375 0,000000 0,005875

SE (s=0,03) 0,0150 0,0150 0,0150 0,0150t 4,575 0,092 0,392

Niv. Signif. (α) 0,05 0,05 0,05Grado Libertad 14 14 14

ttabla 2,145 2,145 2,145¿Efecto Significativo? Si No No

Como puede observarse, la mayoría de los datos analizados no presenta un efecto significativo variando el tiempo de desgasificación. Sin embargo, el ensayo del producto Seven Up a los 8 minutos mostró que a este tiempo la desgasificación es insuficiente, esto puede deberse a que hay presencia de CO2 en la muestra, lo que conlleva a un error significativo en la lectura. Por esta razón, se necesita de un tiempo mínimo de 10 minutos para llevar a cabo esta operación, en donde se presenta valores muy cercanos al valor de referencia.

7.3.5. Selectividad

Siguiendo las recomendaciones para la preparación de las soluciones expuestas en las tablas 19 y 20, las preparaciones y las respuestas obtenidas en términos de Brix directo y brix invertido se muestran en la tabla 71 y tabla 72 respectivamente.

Tabla 71. Preparación de las soluciones con datos reales para análisis de selectividad.

Solución

x1 x2 x3 x4 x5 x6Agua (g)

Total (g)

1 7,0151 0,0000 0,0000 0,0465 0,1488 0,0000 92,7896100,000

0

2 7,0016 0,0000 0,0505 0,0458 0,1512 0,0000 92,7509100,000

0

3 6,9851 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4874 92,5275100,000

0

4 6,9938 0,5218 0,0484 0,0472 0,0000 0,0000 92,3888100,000

0

5 7,0255 0,5570 0,0541 0,0000 0,1484 0,0000 92,2150100,000

0

6 7,0547 0,4765 0,0000 0,0000 0,0000 0,4532 92,0156100,000

0

7 13,0750 0,0000 0,0490 0,0000 0,0000 0,0000 86,8760100,000

0

8 13,0180 0,0000 0,0513 0,0449 0,0000 0,4561 86,4297100,000

0

9 13,0560 0,0000 0,0000 0,0000 0,1496 0,4467 86,3477100,000

0

10 12,9940 0,4962 0,0522 0,0000 0,1497 0,4523 85,8556100,000

0

108

11 13,0630 0,5106 0,0000 0,0452 0,0000 0,4512 85,9300100,000

0

12 12,9860 0,4978 0,0000 0,0449 0,1498 0,0000 86,3215100,000

0

Total120,267

83,0599 0,3055 0,2745 0,8975 2,7469

1072,4479

-

Tabla 72. Respuesta en términos de ºBx para las soluciones en el análisis de selectividad.

Instrumento DensímetroSolución Respuesta en

Brix dtoRespuesta en Brix inv

1 7,024 7,5002 7,226 7,6053 7,119 7,4914 7,475 7,8665 7,594 7,9956 7,121 7,8037 13,101 13,7928 13,276 13,8869 13,054 13,73110 13,394 14,11711 13,414 14,12512 13,307 14,005

Realizando una regresión múltiple por el método de mínimos cuadrados, se determinan las sensibilidades parciales y se reportan en la tabla 73.

Tabla 73. Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las distintas soluciones.

Parámetros S11 S12 S13 S14 S15 S16 y0 r2

Densímetro

Directo1,000

21.0851

1,3986

0,7235

0,12390,387

7-0,0038

0,99996

Invertido

1,0532

1,03991,200

10,727

0-

0,03010,359

90,0812

0,9998

Las especificidades de cada una de las soluciones se pueden apreciar en la tabla 74.

Tabla 74. Cálculo de especificidades.

Equipo DensímetroSolución Spec (Adto) Spec (Ainv)

1 0,9926 0,99602 0,9828 0,98803 0,9737 0,97674 0,9128 0,92065 0,9096 0,92046 0,9106 0,91867 0,9948 0,99588 0,9789 0,98159 0,9855 0,988810 0,9417 0,9489

109

11 0,9449 0,949912 0,9565 0,9616

A partir de los cálculos obtenidos en este estudio se observa claramente que las especificidades calculadas para cada una de las soluciones analizadas son mayores a 0,900; esto confirma una adecuada especifidad del método en la matriz de bebida gaseosa preparada.

El valor teórico del factor de inversión total es de 1,0526. Las soluciones invertidas aquí analizadas presentan una sensibilidad parcial respecto a la sacarosa de 1,04428, desviandose ligeramente del valor teórico (±0,00832).

7.3.6. Estabilidad

El estudio de estabilidad de la muestra se hizo previamente en el estudio de robustez.

7.3.7. Exactitud

La exactitud fue evaluada por medio de los datos obtenidos en el estudio de linealidad y por los patrones de referencia. Los datos obtenidos de este análisis se muestran a continuación.

Exactitud por datos de linealidad: Este análisis está basado en los datos obtenidos en el ensayo de linealidad. Ver tablas 62 y 63.

Exactitud debido a patrones: La calibración del equipo se realizó con agua ultra pura (ver Anexo 1, Anexo 7).

Los resultados de exactitud se observan en la tabla 75:

Tabla 75. Resultados de exactitud para calibración con agua ultra pura.

Patrón T (ºC)Densidad

teórica (g/cm3)# de

lecturas

Densidad promedio (g/cm3)

Sesgo (g/cm3)

Agua Ultra pura 20.000 0,998203 15 0,998205 0,000002

La verificación se realiza mediante agua destilada y soluciones de sacarosa (tablas 76 y 77)arrojando los siguientes resultados.

Tabla 76. Verificación de los patrones en términos de densidad.

110

Patrones T (ºC) Densidad teórica (g/cm3)

# de lecturas

Densidad promedio (g/cm3)

Sesgo (g/cm3)

Agua 20,000 0,998203 3 0,998183 -0,0000207,000 ºBx 20,000 1,025856 3 1,025833 -0,000023

10,000 º Bx 20,000 1,038117 3 1,038119 0,00000213,000 ºBx 20,000 1,050641 3 1,050650 0,000009

Tabla 77. Verificación de los patrones en términos de ºBx.

Patrones T (ºC) ºBx teórico

# de lecturas

ºBx promedio

% R Sesgo (ºBx)

Agua 20,000 - 3 - - -7,000 ºBx 20,000 7,000 3 6,997 99,957 -0,00310,000 º

Bx20,000 10,000 3 10,002 100,020 0,002

13,000 ºBx

20,000 13,000 3 13,002 100,018 0,002

Se puede decir en términos generales que el SDA-M posee una exactitud satisfactoria teniendo en cuenta que la incertidumbre reportada por el fabricante es de ±0,02 ºBx en el rango de trabajo. Sin embargo, aunque en algunos de los análisis anteriores se obtuvieron valores por encima de esta incertidumbre, eran cobijados por la incertidumbre de las mediciones aceptadas por el Laboratorio Central de ±0,03.

7.3.8. Precisión

7.3.8.1. Repetibilidad del método

Los resultados que se tuvieron en el análisis de repetibilidad del método se muestran en la tabla 78.

Tabla 78. Resultados de la repetibilidad del método en el SDA-M.

Soft Drink Analyzer MBrix directo Brix invertido

Concentración (ºBx)

7,003 10,004 13,000 7,371 10,530 14.736

Número de datos (n)

9 9 9 9 9 9

Promedio (ºBx) 6,997 10,002 13,002 7,379 10,522 14,725Desviación estándar

0,00060 0,00100 0,00127 0,003240 0,002789 0,003644

Coeficiente de variación (%CV)

0,0086 0,0100 0,0098 0,0439 0,0265 0,0247

111

Puede notarse que las desviaciones estándares de las diferentes mediciones en el análisis de repetibilidad del método no superan el criterio establecido por el fabricante de ±0,02 en ºBx y mucho menos el establecido en el laboratorio de ±0,03 en ºBx para este tipo de análisis.

Por lo tanto, se puede concluir que el equipo no muestra desviaciones significativas entre el valor reportado y el valor teórico, al analizar varias muestras de la misma concentración.

Intervalo de confianza para el análisis de la repetibilidad: El intervalo de confianza puede calcularse mediante la siguiente expresión:

μ=x ±(t α2 )∗s

√n(44 )

Los resultados se muestran a continuación (tabla 79).

Tabla 79. Intervalos de confianza para el análisis de repetibilidad.

Concentración teórica (ºBx dto) Soft Drink Analyzer MInstrumental Método

7,003 N/A 6,997 ± 0,00034510,004 N/A 10,002 ± 0,00102913,000 N/A 13,002 ± 0,001244

Concentración teórica (ºBx inv) Soft Drink Analyzer MInstrumental Método

7,371 N/A 7,379 ± 0,00282510,530 N/A 10,522 ± 0,00289713,684 N/A 13,650 ± 0,001384

Los resultados están basados en un nivel de significancia de 5% (=0,05) y para unos grados de libertad de 6 (G.L.=6).

7.3.8.2. Precisión intermedia

112

Los resultados obtenidos a partir del estudio de similitud de las varianzas se muestran a continuación (tabla 80 y tabla 81).

Tabla 80. Datos para el estudio de similitud de varianzas.

Analista 1 Analista 2Concentración (ºBx inv) 7,368 14,736 7,368 14,736

Muestras - - - -1 7,369 14,739 7,368 14,7362 7,365 14,738 7,367 14,7353 7,366 14,740 7,367 14,7384 7,366 14,737 7,364 14,7225 7,366 14,737 7,364 14,7226 7,368 14,738 7,366 14,7237 7,364 14,735 7,363 14,7228 7,366 14,735 7,364 14,7239 7,367 14,734 7,362 14,722

Promedio 7,366 14,737 7,365 14,727Desviación estándar 0,00150 0,00200 0,00206 0,00705

Varianza 2,250E-06 4,000E-06 4,250E-06 4,975E-05

Tabla 81. Resultados del estudio de similitud de las varianzas de los analistas.

Concentración (ºBx inv) 7,368 14,736# de muestras por analista 9 9

Fexp 0,72761 0,28355248F(/2) 4,43326 4,43326

F[1-(/2)] 0,22557 0,22557Grados de libertad 8 8Varianzas iguales Si Si

Como Fexp<F(α/2) significa que ambos métodos tiene varianzas estimadas iguales y por tanto, precisiones semejantes.

Por último, el análisis de precisión intermedia se completa comparando los coeficientes de variación obtenidos en las pruebas realizadas por cada uno de los analistas. Estos resultados se muestran en la tabla 82.

Tabla 82. Comparación de los coeficientes de variación.

Criterio de comparación del coeficiente de variación (C.V. %)Concentración (ºBx inv) 7,368 14,736

Analista 1 0,02143 0,01357Analista 2 0,02862 0,04789

Total 0,02608 0,048842*C.V. (%) del método 0,08280 0,04949

Cumple Si Si

Se puede observar que los coeficientes de variación de cada uno de los analistas implicados en el ensayo no superan el criterio de aceptación [2*C.V. (%) del método]. Sin embargo, cabe resaltar que las

113

desviaciones estándar obtenidas por los analistas en cada ensayo son menores a los valores establecidos de ±0,02 y ±0,03 en ºBx, por tal motivo se puede asumir que tanto la repetibilidad del método así como la precisión intermedia guardan similitud.

8. CONCLUSIONES

El estudio de validación realizado en este trabajo muestra que el equipo Soft Drink Analyzer-M (SDA-M) puede sustituir al densímetro DMA-58 en el análisis de Brix para las bebidas gaseosas y ser incluido en la evaluación mensual de calidad, los resultados estadísticos realizados con el test de Fisher y el test de t-student, demostraron que entre los dos equipos no existe una diferencia significativa de las lecturas reportadas para los grados Brix y la densidad, en otras palabras, el SDA-M puede efectuar el análisis de grados Brix para las bebidas gaseosas sin llevar a cabo el proceso de inversión total obteniendo los mismos resultados confiables y precisos que los mostrados por el DMA-58 con el procedimiento normal de inversión, lo que se traduce en un ahorro de tiempo a la hora de reportar los valores de una variable fundamental como lo es el Brix, para mantener los estándares de calidad de la compañía.

Se pudo comprobar también, que ambos equipo reportan el valor de Brix basándose en la Tabla NBS y no en el ICUMSA como se creía

114

anteriormente. Este estudio mostró que para el rango de Brix trabajado, ambas Tablas no poseen diferencias significativas que afectaran el valor reportado de dicha variable, por lo que no hay inconveniente en reportar el Brix con una u otra Tabla.

En términos generales, los valores arrojados en esta validación mostraron que se cumplieron los criterios de aceptación establecidos inicialmente, en el análisis de Robustez basado en el tiempo de desgasificación se ratificó que el tiempo óptimo para esta operación está entre 10 a 14 minutos, tiempos menores como por ejemplo 8 minutos, conllevan a errores en las lecturas de Brix para bebidas gaseosas con un nivel de carbonatación alto (Pepsi, Seven Up, entre otras). En términos de estabilidad de la muestra, se sugiere que los análisis de Brix no superen las 8 horas luego de que las muestras sean destapadas, esto con el fin de evitar datos erróneos en las lecturas, ya que se observó un cambio a razón de 0,01ºBx cada 2 horas, aunque este efecto no es significativo hay que tenerlo en cuenta por que puede llevar a que una muestra quede por fuera del rango establecido para cada producto.

Otro de los ítems evaluados como lo es la Selectividad mostró que aunque una bebida gaseosa posee otros componentes lo que se mide principalmente es azúcar (sacarosa), esto se debe a que los otros componentes (acidulantes, enturbiante, colorante, etc.) se encuentran en proporciones bajas en relación al compuesto de interés (el azúcar) y su participación en la lectura es mínima.

En relación a la Linealidad se encontró que no se cumplía de forma general, esto se debe a que el SDA-M cuenta con una muy buena repetibilidad que se traduce en desviaciones numéricamente bajas, lo que implica valores altos en la prueba de Fisher. Con relación al intercepto se pudo observar que era diferente de cero, por lo que se incumplía con otro criterio de linealidad, sin embargo, para el rango trabajado se muestra una tendencia lineal, que es soportado por los coeficientes de correlación (r ) y de distribución (r2 ) los cuales presentan

valores mayores a 0,999.

Por último para la evaluación de la Precisión del equipo basado en la repetibilidad del método y la precisión intermedia se encontró que

115

los valores de los coeficientes de variación son inferiores al criterio de repetibilidad establecido por el fabricante cuyo valor es de ±0,02 y es mucho menor al establecido por el Laboratorio Central De Postobón S.A. para el análisis del Brix cuyo valor es de ±0,03.

Teniendo en cuenta los criterios aquí expuestos y los resultados obtenidos en cada uno de ellos, dejan en consideración la posibilidad de que el equipo SDA-M pueda ser incluido en la evaluación mensual de calidad realizada en el Laboratorio Central De Postobón S.A. como sustituto del densímetro DMA-58.

9. BIBLIOGRAFÍA

[1] Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI); “Validación de Métodos Analíticos.”; Primera Edición; Barcelona; 2001.

[2] CASTRO VELÁSQUEZ, Jaime Andrés; “Elaboración e Implementación del Procedimiento de Validación de Métodos de Análisis Fisicoquímicos utilizados en el Laboratorio Central de Postobón S.A.”; Universidad de Antioquia; 2008.

[3] BEDOYA LORA, Franky Esteban; “Homologación de métodos de análisis fisicoquímicos empleados en Postobón S.A. para materias primas y producto terminado, y validación del método para la determinación de los grados Brix.”; Universidad de Antioquia; 2009.

[4] EURACHEM; “The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics”;

116

Primera Edición; United Kingdom; 1998. [Citado el 26 de septiembre de 2012].Disponible en internet: http://www.eurachem.org

[5] Oficina de acreditación Guatemala, C.A.; “Política de selección y validación de métodos de ensayos”; [Citado el 27 de septiembre de 2012]. Disponible en internet: http://www.mineco.gob.gt/mineco/calidad/acreditacion/ogagec016.pdf

[6] AOAC INTERNATIONAL; “Official Methods of Analysis”; Décimo octava Edición; United States of America; 2006.

[7] AOAC INTERNATIONAL; “Statistical Manual of AOAC”; Washington D.C.; 1975.

[8] IUPAC, ISO, AOAC INTERNATIONAL; “Harmonized Guidelines for Singlelaboratory Validation of Methods of Analysis”; Pure Appl. Chem., Vol. 74; Budapest; 1999.

[9] Instituto de Salud Pública. “Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la medición: Aspectos generales sobre la validación de métodos.”; Primera edición; Santiago de Chile, 2010.

[10] KLAUS Danzer; “Selectivity and Specificity in Analytical Chemistry: General Considerations and Attempt of a Definition and Quantification”; Fresenius J Anal Chem 2001; Springer-Verlag 2001.

[11] CHUNG CHOW Chan; HERMAN Lam; LEE Y. C.; XUE-MING Zhang; “Analytical method validation and instrument performance verification”; Editores John Wiley & Song, Inc; New Jersey, 2004.

[12] ANTON PAAR, “Instruction manual: Soft Drink Analyzer M”; Anton Paar GmbH; Austria, 2010.

[13] POSTOBÓN S.A., “Normas Internas para Producción y Análisis Fisicoquímicos de Postobón S.A.”

[14] BOLÍVAR RUIZ, Mario; “El Libro Blanco del Azúcar, una historia de proteccionismo”; RIL Editores; Santiago de Chile 2005.

[15] MARTÍNEZ COVALEDA, Héctor J.; “Agroindustria y Competitividad: estructura y dinámica en Colombia 1992-2005”; A.C. Graficolor; Bogotá, Abril de 2006.

117

http://www.mineco.gob.gt/mineco/calidad/acreditacion/ogagec016.pdf

http://www.eurachem.org/guides/mval.htm

[16] PERAFAN, Felipe; “Azúcar de Caña”; Abril de 2005 [citado el 7 de agosto de 2012].Disponible en Internet: www.perafan.com/ea02azuc.html

[17] SHACHMAN, Maurice; “The Soft Drinks Companion: A technical handbook for the beverage industry”; CRC PRESS; New York, 2005.

[18] MEJÍA OSPINA, Wilmar Alexander; “Determinación de los parámetros de Brix invertido en refresco de fruta para la evaluación de calidad de Postobón S.A.”; Universidad de Antioquia, 2008.

[19] DÍAZ, Abel; “Diseño Estadístico de Experimentos”; Editorial Universidad de Antioquia; Primera edición; Medellín; 1999.

118

http://www.perafan.com/ea02azuc.html

informe de práctica profesional

Documents