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INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
Enero – Diciembre 2006
Estandarización de las condiciones de inmovilización de Candida sp. para la reducción de cromo hexavalente
Clave del Proyecto: 20060533
Director del Proyecto: Dr. Eliseo Cristiani Urbina. Resumen En el presente trabajo se estandarizaron las condiciones de inmovilización de una
cepa de Candida sp. en perlas de alginato de calcio. Se determinó el efecto de la
concentración de alginato y de biomasa inicial inmovilizada sobre la reducción del
Cr(VI).
Se encontró que la concentración de alginato juega un papel importante en la
obtención de perlas adecuadas para la inmovilización de las células y para la
reducción del Cr(VI). La concentración de alginato más adecuada para ello fue de
aproximadamente 0.8% (w/v).
La concentración inicial de biomasa inmovilizada más apropiada para la reducción de
Cr(VI) depende de la concentración inicial del metal que se utilice. En general, las
eficiencias globales y las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) más altas
se obtuvieron a concentraciones celulares iniciales de 2-2.5 g/L.
De los estudios cinéticos de reducción de Cr(VI) por células libres e inmovilizadas de
Candida sp. LMB2, utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la literatura
y las encontradas en este trabajo, se encontró que, en general, las células libres
presentaron una mayor capacidad para reducir el Cr(VI) que las células inmovilizadas,
lo que está acorde con lo reportado en la literatura. Asimismo, se encontró que las
condiciones de inmovilización establecidas en este trabajo son más favorables para la
reducción del Cr(VI) por la levadura Candida sp. LMB2 que las recomendadas en la
literatura.
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Introducción El cromo es uno de los metales pesados más utilizados en los procesos industriales, lo
que ha ocasionado que grandes cantidades de éste sean liberados al medio ambiente.
De acuerdo a estimaciones realizadas por la Agencia de Protección del Ambiente de
los Estados Unidos de América (USEPA), cada año se descargan a la atmósfera más
de 1 642 500 kg de cromo.
El cromo existe en nueve estados de oxidación, del -2 al +6; sin embargo, en los
ambientes naturales el metal se encuentra principalmente en dos estados de valencia,
como cromo trivalente [Cr(III)] y como cromo hexavalente [Cr(VI)]. Estos dos estados
de oxidación del cromo son los más estables y comunes en el medio ambiente, pero
sus propiedades fisicoquímicas y toxicológicas difieren significativamente entre sí. El
cromo hexavalente es sumamente tóxico, exhibe propiedades carcinogénicas,
mutagénicas y teratogénicas y, además, es altamente soluble en agua, por lo que es
muy móvil a través de los ecosistemas; en contraste, el cromo trivalente es
considerablemente menos tóxico, menos soluble en agua, mucho menos móvil que el
Cr(VI) y es un elemento traza esencial para el metabolismo de carbohidratos, lípidos y
aminoácidos en mamíferos.
Debido a su alta toxicidad, el cromo hexavalente es considerado por la USEPA como
un contaminante prioritario y como uno de los 17 agentes químicos más peligrosos
para la salud del ser humano.
En la actualidad existen diversos métodos fisicoquímicos para remover el cromo
hexavalente presente en suelos y aguas contaminadas con el metal. Sin embargo,
estos métodos presentan diversas desventajas, tales como: costo alto, selectividad
baja, una baja eficiencia de remoción del metal (principalmente cuando el cromo
hexavalente se encuentra en concentraciones inferiores a 100 mg/L), se generan lodos
químicos difíciles de tratar, etc. A fin de subsanar algunas de estas desventajas, se
han propuesto algunos métodos biológicos utilizando microorganismos vivos. Estos
métodos se consideran en la actualidad como una alternativa potencial para el
tratamiento de los ecosistemas y efluentes industriales contaminados con cromo
hexavalente, ya que son de bajo costo y altamente eficientes en la remoción de
pequeñas cantidades del metal.
Sin embargo, el tratamiento biológico de efluentes industriales que contienen cromo
hexavalente es difícil porque el metal es altamente tóxico para los organismos vivos y
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les causa pérdida de su actividad celular y de su viabilidad. Con el fin de proteger a los
microorganismos del efecto letal del cromo hexavalente, es conveniente colocar una
barrera de protección entre los microorganismos y el metal pesado. Esto último puede
lograrse mediante técnicas de inmovilización por atrapamiento en gel.
En trabajos previos realizados en el Laboratorio “Ing. Pablo Hope y Hope” de la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, se logró el aislamiento de una cepa de
levadura que es capaz de transformar altas concentraciones de cromo hexavalente a
trivalente, el cual es 100 veces menos tóxico y 1000 veces menos mutagénico que la
forma hexavalente. La levadura fue identificada mediante técnicas de biología
molecular como Candida sp. A pesar de su alta capacidad de reducción del cromo
hexavalente, la levadura es altamente susceptible a los efectos tóxicos del metal.
Posteriormente, Candida sp. se inmovilizó en perlas de gel de alginato de calcio al 2%
(w/v) mediante la técnica de atrapamiento con el propósito de protegerla del efecto
tóxico del metal. Durante estos estudios se observó que la reducción del cromo
hexavalente por las células inmovilizadas era muy inferior a la de las células libres
(investigaciones realizadas con el apoyo económico de la Coordinación General de
Estudios de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional, con clave de
proyecto 20050250).
Con base en lo anterior, en este trabajo se llevó a cabo la estandarización de las
condiciones de inmovilización de la cepa de Candida sp., a fin de incrementar la
eficiencia y velocidad de reducción del metal de las células inmovilizadas.
Material y métodos Microorganismo Se utilizó una cepa de levadura que fue aislada por la M. en C. Liliana Morales Barrera
a partir del agua residual de una curtidora, y que posteriormente Juvera-Espinosa
(2006) la seleccionó de entre 28 cepas diferentes de levadura y la identificó como
Candida sp. LMB2.
Durante el desarrollo del presente trabajo la levadura se mantuvo creciendo
activamente mediante resiembras secuenciales y alternadas en medios de cultivo
líquidos con 1 mM de Cr(VI) y sin Cr(VI). Lo anterior se debió a que la levadura
Candida sp. LMB2 perdía parte de su capacidad para reducir Cr(VI) después de ser
cultivada consecutivamente en medios de cultivo con Cr(VI).
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Medios de cultivo Se utilizó el medio de cultivo YPG (tabla 1) para preservar la cepa de Candida sp.,
bajo condiciones de refrigeración (aproximadamente a 4 ºC). Para la propagación del
inóculo, así como para realizar los experimentos de reducción de Cr(VI) se empleó el
medio de cultivo propuesto por Morales-Barrera (2005), cuya composición se muestra
en la tabla 2.
Tabla 1. Composición química del medio YPG
Componente Concentración [g/L]
Agar bacteriológico 20
Extracto de levadura 10
Glucosa 20
Peptona de caseína 10
Tabla 2. Composición química del medio de cultivo líquido
Componente Concentración [g/L]
Glucosa 10
(NH4)2SO4 3
KH2PO4 1
MgSO4 7H2O 0.3
KCl 0.1
Extracto de levadura 0.1
CaCl2 0.05
FeCl3 0.001
K2CrO4 Variable
Desarrollo del inóculo A matraces Erlenmeyer de 1 L con 250 mL de medio de cultivo estéril se les adicionó
una pequeña cantidad de la levadura Candida sp. LMB2. Los matraces se mantuvieron
en agitación constante a una temperatura de 28-30 °C, durante 72 horas.
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Posteriormente, la biomasa se separó asépticamente mediante centrifugación a 1000
rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se desechó y el paquete celular se lavó dos
veces con agua destilada estéril y se separó mediante centrifugación. El paquete
celular resultante se resuspendió en una pequeña cantidad de agua destilada estéril
para obtener finalmente una suspensión celular concentrada, la cual se utilizó como
inóculo.
A fin de conocer la concentración de biomasa de la suspensión celular, un pequeño
volumen de ésta se filtró a través de membranas de fibra de vidrio con un tamaño de
poro de 1.2 μm (Whatmann GF/A), las cuales se habían colocado previamente a peso
constante. A continuación, las membranas y la torta de células se deshidrataron en
una estufa a 90 ºC hasta alcanzar un peso constante. La concentración de biomasa se
estimó por diferencia de pesos de la masa celular.
Métodos experimentales Inmovilización de las células de Candida sp. Se utilizó la técnica de atrapamiento en gel para inmovilizar las células de Candida sp.
Para ello se disolvieron cantidades variables de alginato de sodio en agua destilada, a
una temperatura de aproximadamente 60 ºC. Las soluciones de alginato así obtenidas
se esterilizaron en una autoclave a 120 ºC, durante 15 minutos, y posteriormente se
enfriaron a temperatura ambiente.
A continuación se les agregó un volumen determinado de suspensión celular
concentrada para obtener alguna concentración deseada de biomasa. Las
suspensiones celulares resultantes (alginato-biomasa) se agitaron manualmente y
posteriormente se extruyeron a través de una manguera de silicón estéril (Masterflex
96410 – 14), con ayuda de una bomba peristáltica que operó a velocidades diferentes,
dependiendo de la concentración de alginato utilizada. Las gotas formadas se
colectaron en recipientes que contenían una solución de CaCl2 al 5% (w/v), y se
mantuvieron en reposo durante una hora para permitir el intercambio de los cationes
sodio y calcio. En seguida, las perlas de alginato de calcio con biomasa inmovilizada
se lavaron dos veces con agua destilada estéril (Kolot y col., 1988).
Estudio cinético de remoción abiótica de Cr(VI). Durante el desarrollo del presente trabajo se emplearon dos tipos de controles
abióticos. Uno de ellos consistió en medio de cultivo líquido al que se le adicionó un
volumen determinado de una solución stock estéril de cromato de potasio a 20 g/L
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para obtener concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1 y 2 mM, pero no se agregó
biomasa de Candida sp. LMB2. Este tipo de control sirvió para determinar si, bajo las
condiciones ensayadas, los componentes del medio de cultivo podían transformar
(reducir químicamente) el Cr(VI) a Cr(III).
El otro tipo de control abiótico sirvió para determinar si las perlas de alginato de calcio
sin biomasa eran capaces de reducir y/o adsorber el Cr(VI) presente en los medios de
cultivo. Para ello se emplearon matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 50 mL
de medio de cultivo con concentraciones iniciales de cromo hexavalente de 1 y 2 mM,
a las que se les adicionó la misma cantidad de perlas de alginato de calcio al 2% (w/v)
que a los matraces problema (en donde se realizaron los estudios de reducción de
Cr(VI) por Candida sp. LMB2) pero no se les adicionó biomasa de levadura.
Todos los matraces que se utilizaron como controles abióticos se mantuvieron bajo las
mismas condiciones de agitación y temperatura que los matraces problema. Se
colectaron muestras de cada uno de los controles cada 48 horas, a las que se les
determinó la concentración de cromo hexavalente residual.
Determinación del efecto de la concentración inicial de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente por Candida sp. LMB2. Se evaluó el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI) por
las células inmovilizadas de Candida sp. LMB2, a fin de determinar la más adecuada.
En estos experimentos se ensayaron dos concentraciones iniciales de Cr(VI), las
cuales fueron de 1.5 mM y 3.6 mM. Para los experimentos realizados con una
concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, se obtuvieron perlas de alginato de calcio
con células inmovilizadas de Candida sp. LMB2. La concentración inicial de biomasa
se mantuvo constante a 1 g/L, mientras que la concentración de alginato se varió en el
intervalo de 0.2 a 2% (w/v).
Los cultivos se mantuvieron en agitación constante a 28-30° C, durante diferentes
periodos de tiempo, los cuales dependieron de las condiciones ensayadas. Se
colectaron muestras de cada uno de los cultivos cada 24 horas, a las cuales se les
determinó la concentración de cromo hexavalente y de glucosa residual.
Para los experimentos realizados con una concentración inicial de cromo hexavalente
de 3.6 mM, se elaboraron perlas de alginato de calcio que contenían a la levadura
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Candida sp. LMB2 a una concentración inicial de biomasa de 1 g/L, mientras que la
concentración de alginato varió en el intervalo de 0.5 a 2.0% (w/v). Los cultivos se
mantuvieron en agitación constante a 28-30 ºC durante diferentes periodos de tiempo.
Se recolectaron muestras de cada uno de los cultivos cada 24 h, a las que se les
determinó las concentraciones de Cr(VI) y de glucosa residual.
Determinación de la concentración inicial de biomasa inmovilizada más adecuada para la reducción de cromo hexavalente. A continuación se determinó el efecto de la concentración inicial de biomasa
inmovilizada sobre la reducción de cromo hexavalente. Para ello se ensayaron
diferentes concentraciones celulares iniciales y dos concentraciones de alginato. Las
concentraciones de alginato utilizadas fueron la que sugiere la literatura especializada
(2% w/v) y la que se determinó previamente en este trabajo. Las concentraciones
celulares ensayadas fueron 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 g/L para ambos casos y para la
concentración determinada en este trabajo se ensayó también una concentración
celular de 3 g/L.
Asimismo, a ambas concentraciones de alginato, se utilizaron dos concentraciones
iniciales de Cr(VI). Cuando se empleó una concentración de alginato de 2% (w/v), los
experimentos se llevaron a cabo a 1 y 2 mM de Cr(VI), y cuando se utilizó la
concentración de alginato determinada en este estudio como la más adecuada para la
reducción del metal, se emplearon concentraciones de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM. Esto
último se debió a que el grado de reducción del metal alcanzado con la concentración
de alginato encontrada en este estudio fue mayor que el obtenido con la concentración
recomendada en la literatura.
Los experimentos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 50
mL de medio de cultivo líquido, los cuales se mantuvieron en agitación constante a 28-
30 °C durante el tiempo que requiriera cada cultivo para reducir el cromo hexavalente.
Se recolectaron muestras cada 24 horas, a las que se les determinó la concentración
de cromo hexavalente y de glucosa residual.
Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y del consumo de glucosa de las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2 Una vez realizada la determinación de las concentraciones de alginato y de biomasa
inicial más adecuadas para la reducción de Cr(VI) por las células inmovilizadas de
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Candida sp. LMB2, se procedió a comparar los parámetros del proceso de reducción
del metal (eficiencia global y velocidad volumétrica de reducción de cromo
hexavalente) de las células inmovilizadas y de las libres.
Se realizó el estudio cinético comparativo de la reducción de Cr(VI) y del consumo de
glucosa por las células libres y las inmovilizadas. Para las células inmovilizadas se
utilizaron dos condiciones de inmovilización, la sugerida en la literatura y la encontrada
en este trabajo como la más apropiada para el desempeño de la levadura.
Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y del consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, empleando las condiciones de inmovilización sugeridas en la literatura. La mayoría de los estudios relacionados con la remoción de contaminantes por células
inmovilizadas se han llevado a cabo utilizando una concentración celular inicial de 0.5
g/L y una concentración de alginato de 2% (w/v) (Kolot, 1988). Debido a esto, en el
presente trabajo se emplearon esas condiciones para determinar su efecto sobre la
reducción del Cr(VI) y del consumo de glucosa por las células inmovilizadas de
Candida sp. LMB2.
Las concentraciones iniciales de cromo hexavalente ensayadas tanto para los cultivos
con células libres como para las inmovilizadas fueron de 0.75, 2.25 y 3.75 mM. Los
cultivos microbianos se desarrollaron en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL
de medio de cultivo líquido, los cuales se mantuvieron en agitación constante a 28-30
°C durante el tiempo de incubación necesario para permitir la mayor reducción posible
del Cr(VI).
Se recolectaron muestras cada 24 horas, a las que se les determinó la concentración
de cromo hexavalente y de glucosa residual.
Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, empleando las condiciones de inmovilización encontradas en este trabajo. A continuación se realizaron los estudios cinéticos comparativos de la reducción de
Cr(VI) y de consumo de glucosa de las células libres y de las inmovilizadas, utilizando
las concentraciones de alginato y de biomasa inmovilizada que fueron encontradas
experimentalmente en este trabajo como las más adecuadas para la reducción de
Cr(VI).
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Estos experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 mL que
contenían 50 mL de medio de cultivo. Se ensayaron dos concentraciones iniciales de
Cr(VI), de 1.5 y 3.6 mM. Los cultivos se incubaron con agitación constante a 28-30 ºC,
durante el tiempo necesario para permitir que las células redujeran el Cr(VI) presente
en los medios de cultivo.
Se recolectaron muestras cada 24 h, a las que se les determinó la concentración de
Cr(VI) y de glucosa residual.
Métodos analíticos Determinación de la concentración celular La determinación de la concentración celular del inóculo y de los cultivos en
suspensión se realizó por medio del peso seco de la masa celular. Para ello, las
muestras se filtraron a través de membranas de fibra de vidrio (Whatman GF/A) de 1.2
μm. Posteriormente, las membranas se colocaron en una estufa a 95°C, hasta
alcanzar un peso constante. El peso de la biomasa se estimó por diferencia de pesos.
Determinación de la concentración de glucosa: Se llevó a cabo mediante un método enzimático, utilizando a la glucosa oxidasa y
peroxidasa (Worthington, 1972).
Determinación de la concentración de cromo hexavalente. La determinación de la concentración de cromo hexavalente se realizó por el método
de la 1,5-difenilcarbohidrazida, conforme a los procedimientos descritos en el Hach
Water Analysis Handbook (2002).
Resultados y discusión Meta 1: Determinar el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI).
Remoción abiótica de cromo hexavalente. Con la finalidad de determinar si la reducción de Cr(VI) se debía únicamente a la
actividad biológica de Candida sp. LMB2, o en su defecto establecer qué porcentaje de
la reducción se debía a las células, en el presente trabajo se utilizaron controles
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abióticos. Estos controles son de suma importancia para establecer si las variables de
operación, tales como el medio de cultivo, los soportes utilizados para la inmovilización
y las condiciones ambientales utilizadas (por ejemplo, pH, potencial de óxido-
reducción, temperatura, etc.) tienen alguna influencia sobre la remoción de los
contaminantes.
Los controles abióticos que se emplearon fueron los siguientes: 1) controles libres de
células y de perlas de alginato de calcio, y 2) controles con perlas de alginato sin
biomasa inmovilizada. Estos controles se incubaron a las mismas condiciones de
operación que los cultivos con células libres e inmovilizadas con los que se realizaron
los estudios cinéticos de reducción de Cr(VI). Los primeros controles sirvieron para
determinar si los componentes del medio de cultivo (por ejemplo, el extracto de
levadura, etc.) eran capaces de reducir el Cr(VI) a Cr(III); los segundos controles
permitieron establecer si el Cr(VI) era adsorbido por el alginato de calcio y/o reducido
por los componentes del medio de cultivo bajo las condiciones de ensayo.
En los controles abióticos libres de células y de perlas de alginato de calcio se
utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.0 y 2.0 mM, asimismo en los
controles con perlas de alginato de calcio sin biomasa se emplearon concentraciones
iniciales del metal de 1.0 y 2.0 mM. Se recolectaron muestras cada 48 horas durante
un periodo total de incubación de 240 horas, a las que se les determinó la
concentración de cromo hexavalente residual.
En ninguno de los controles a los que no se les adicionó biomasa ni perlas de alginato
se presentaron variaciones considerables en las concentraciones de Cr(VI) residual a
lo largo del periodo de incubación, lo que indica que los componentes del medio de
cultivo no fueron capaces de transformar químicamente el Cr(VI) a Cr(III). Además,
estos resultados sugieren que cualquier reducción de Cr(VI) que se detecte en los
cultivos con células en suspensión (células libres) se deberá únicamente a la actividad
biológica de la levadura Candida sp. LMB2.
En los controles con perlas de alginato de calcio sin biomasa inmovilizada se observó
que la concentración del metal no disminuyó en todo el periodo de incubación
ensayado, sino que se incrementó ligeramente, lo que probablemente se debió a una
pequeña evaporación del agua que provocó la concentración de los compuestos
presentes en los medios de cultivo. Para fines prácticos estos resultados sugieren que
la concentración de Cr(VI) permaneció prácticamente constante a lo largo del tiempo
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de cultivo y que el alginato de calcio no adsorbió cantidad alguna del Cr(VI) presente
en los medios de cultivo.
Los resultados obtenidos con los dos tipos de controles abióticos sugieren que los
componentes del medio de cultivo no reducen el Cr(VI) a Cr(III) y que las perlas de
alginato no adsorben algo del metal, por lo que cualquier reducción del Cr(VI) que se
detecte en los cultivos con células libres e inmovilizadas en gel de alginato de calcio se
debió exclusivamente a la actividad biológica de las células viables de Candida sp.
LMB2.
Efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y el consumo de glucosa por las células inmovilizadas de Candida sp. La consistencia de los geles poliméricos que se utilizan para la inmovilización de las
células microbianas puede ser modificada variando las condiciones de elaboración de
los mismos. Entre las variables que afectan la consistencia de los geles se tienen a la
naturaleza química y a la concentración del polímero que se emplee (King, 1988). Si
se utilizan diferentes concentraciones de polímero se obtendrán geles con diferentes
características de permeabilidad y con diferentes propiedades de transferencia de
masa y energía. Por consiguiente, la concentración del polímero que se emplee para
la preparación de los geles repercutirá en el desempeño de los microorganismos
inmovilizados. Con base en lo anterior, en el presente trabajo se evaluó el efecto de la
concentración de alginato sobre la reducción del Cr(VI) y el consumo de glucosa por la
levadura Candida sp.
Se observó que, al variar la concentración de alginato, la consistencia del gel fue
diferente, lo que ocasionó cambios en la forma de las perlas obtenidas por extrusión. A
medida que disminuyó la concentración de alginato, la forma de la perla se hizo más
irregular.
Es importante mencionar que las concentraciones de alginato que se reportan en este
trabajo toman en consideración el volumen total obtenido al mezclar la suspensión
celular con la solución de alginato de sodio (a una determinada concentración del
polímero) y con una pequeña cantidad de agua destilada estéril que se adicionó para
alcanzar la concentración deseada de alginato. Debido a esto, la concentración final
de alginato fue siempre menor a la de la solución original de alginato por que ésta se
diluyó parcialmente por la adición de la suspensión celular y de agua estéril.
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Con la finalidad de obtener perlas individuales con un tamaño lo más uniforme que
fuera posible, así como de minimizar la formación de conglomerados de perlas, se
modificó la velocidad de la bomba peristáltica a las diferentes concentraciones de
alginato ensayadas. Esto fue necesario ya que se observó que al disminuir la
concentración de alginato, se incrementaba el tiempo necesario para la extrusión de
las perlas. Si la velocidad de la bomba no se disminuía, se formaban aglomerados de
perlas.
Las escalas utilizadas de la bomba peristáltica para variar el flujo volumétrico de la
mezcla alginato de sodio-suspensión celular (que fue vertida en una solución de
cloruro de calcio al 5% (w/v)) en función de la concentración final de alginato, se
muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Escalas de la bomba peristáltica en función de la concentración de alginato
Concentración final de alginato en la mezcla
Escala de la bomba
Tiempo aproximado de vertimiento de la solución (10 mL)
0.2 % 0,70 30 min
0.3 % 0,90 25 min
0.4 % 1,57 20 min
0.6 % 1,60 18 min
0.8 % 1,70 13 min
1.0 % 1,80 8 min
2.0 % 1,91 5 min
En la tabla anterior se aprecia que el tiempo necesario para obtener perlas individuales
de alginato de calcio aumentó al disminuir la concentración del polímero. Para
preparar perlas de alginato de calcio con concentraciones finales del polímero en el
intervalo de 0.2 a 0.6% se requirieron tiempos de operación muy largos, lo que influyó
negativamente en la velocidad global del proceso de inmovilización.
Asimismo, es conveniente mencionar que cuando se utilizaron concentraciones finales
de alginato menores a 0.8%, la bomba peristáltica tenía que ser apagada
continuamente y la solución de cloruro de calcio debía mantenerse con agitación lenta
para evitar la formación de conglomerados de perlas. En síntesis, el uso de
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concentraciones finales de alginato inferiores a 0.8% (w/v) ocasiona muchos
problemas de operación que hacen impráctico su uso.
A continuación se presentan los resultados obtenidos del efecto de la concentración de
alginato sobre la reducción de Cr(VI) y el consumo de glucosa por las células
inmovilizadas de Candida sp. LMB2, cuando se utilizaron concentraciones iniciales del
metal de 1.5 y 3.6 mM.
Efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa, cuando se utilizó una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM. Para determinar el efecto de la concentración de alginato sobre la reducción de Cr(VI),
a una concentración inicial del metal de aproximadamente 1.5 mM, se prepararon
perlas de alginato de calcio con células inmovilizadas de Candida sp. Se ensayaron
diferentes concentraciones de alginato, las cuales fueron de 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0,
1.2, 1.4, 1.8 y 2 % (w/v) y la concentración inicial de biomasa inmovilizada fue de 1
mg/mL.
En la tabla 4 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos
requeridos para alcanzar las concentraciones de Cr(VI) residual más bajas. Se aprecia
que se obtuvieron altas eficiencias de reducción a todas las concentraciones de
alginato ensayadas, las cuales se encontraron en el intervalo del 95.2 al 100%.
Asimismo, los tiempos de incubación necesarios para alcanzar niveles bajos de Cr(VI)
residual en el medio de cultivo fueron menores cuando se utilizaron concentraciones
de alginato del 0.2 al 1% (w/v) (de 143 a 196 h); a concentraciones superiores se
requirieron tiempos de incubación superiores a 230 h. El menor tiempo de incubación
requerido para reducir todo el Cr(VI) inicialmente presente en el medio de cultivo
[eficiencia global de reducción de Cr(VI) de 100%] fue de 143 h y se obtuvo a una
concentración de alginato de 0.4% (w/v).
Tabla 4. Eficiencias globales y tiempos necesarios para reducir el Cr(VI) (1.5 mM)
cuando se emplearon diferentes concentraciones de alginato.
Concentración inicial de Cr(VI) [mM]
Concentración de alginato [% w/v]
Concentración inicial de biomasa
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración más
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[mg/mL] baja de Cr(VI) residual [h]
1.5 0.2 1.0 99.7 178
1.5 0.3 1.0 100 190
1.5 0.4 1.0 100 143
1.5 0.6 1.0 100 178
1.5 0.8 1.0 100 196
1.5 1.0 1.0 97.8 192
1.5 1.2 1.0 98.6 238
1.5 1.4 1.0 98.6 268
1.5 1.8 1.0 95.2 268
1.5 2.0 1.0 100 238
Posteriormente se estimó la velocidad volumétrica global de reducción de cromo
hexavalente para cada uno de los cultivos ensayados, con el propósito de determinar
el efecto de la concentración inicial de alginato sobre la velocidad a la que la levadura
inmovilizada es capaz de reducir el metal.
En la figura 1 se muestran las velocidades volumétricas globales de reducción de
cromo hexavalente, a las diferentes concentraciones de alginato ensayadas. El
comportamiento general observado es que al aumentar la concentración de alginato, la
velocidad de reducción del metal disminuye. Las mayores velocidades se obtuvieron
cuando se utilizaron concentraciones de alginato del 0.2 al 0.4% y las velocidades más
bajas se alcanzaron a concentraciones del polímero de 1.4 a 2% (w/v). En los estudios
de remoción o degradación de contaminantes orgánicos reportados en la literatura
especializada generalmente se ha utilizado una concentración de alginato de 2% (w/v)
(Kolot y col., 1988); sin embargo, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren
que para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2 es más conveniente emplear
concentraciones de alginato inferiores al 1% (w/v), cuando se utiliza una concentración
inicial de Cr(VI) de 1.5 mM.
14
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.8 2
[alginato] % w/v
Velo
cida
d vo
lum
étric
a de
redu
cció
n de
Cr
(VI)
[mg/
L x
h]
Figura 1. Velocidad volumétrica global de reducción de Cr(VI) a diferentes
concentraciones de alginato, cuando se utilizaron concentraciones iniciales del metal y
de biomasa de 1.5 mM y 1 g/L, respectivamente.
El hecho de que las mayores velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se
hayan obtenido a concentraciones bajas de alginato sugieren que el polímero no tuvo
algún efecto protector sobre las células inmovilizadas. Se esperaba que al aumentar la
concentración de alginato en la matriz polimérica (perlas) se incrementaría la
reducción del Cr(VI), ya que las células estarían más protegidas de los efectos tóxicos
del metal. Sin embargo, los resultados demostraron que cuando se utiliza una
concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, los efectos tóxicos del metal no son tan
significativos como para que la matriz polimérica de alginato proteja a las células y
esto podría deberse a que la cepa de levadura utilizada en el presente trabajo es muy
tolerante (resistente) a altas concentraciones del metal (Juvera-Espinosa y col., 2006).
Estos resultados también sugieren que para que el alginato tenga algún efecto
protector sobre las células de Candida sp. deben utilizarse concentraciones más altas
de Cr(VI).
También se determinó la concentración de glucosa residual de cada una de las
muestras recolectadas durante el periodo de incubación, con la finalidad de establecer
si el alginato tenía algún efecto sobre el consumo del monosacárido de cada uno de
los cultivos ensayados, utilizando una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM y, de
esta manera, determinar si el polímero ocasionaba alguna resistencia a la
transferencia de la principal fuente de carbono y energía presente en el medio de
cultivo (glucosa).
15
Se observó que todos los cultivos microbianos fueron capaces de consumir
completamente el monosacárido en aproximadamente 120 h de incubación. A tiempos
inferiores a éste, los niveles de glucosa residual en los cultivos con altas
concentraciones de alginato fueron ligeramente inferiores a los alcanzados con los
cultivos en los que se emplearon concentraciones bajas del polímero. Estos resultados
sugieren que la matriz polimérica de alginato no ocasionó resistencia a la transferencia
de la glucosa.
Con base en los resultados anteriores se concluye que cuando se utiliza una
concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, la reducción del metal por las células
inmovilizadas de Candida sp. se favorece a concentraciones bajas de alginato.
Efecto de la concentración inicial de alginato sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa por Candida sp., cuando la concentración inicial del metal fue de 3.6 mM. A continuación se determinó el efecto de la concentración de alginato sobre la
reducción de Cr(VI) y consumo de glucosa por las células inmovilizadas de Candida
sp., cuando se utilizó una concentración inicial del metal de 3.6 mM. Para ello se
ensayaron cuatro concentraciones de alginato, que fueron de 0.5, 1.0, 1.5 y 2% (w/v).
Es importante mencionar que a la concentración de alginato de 0.5 % (w/v) se
presentaron los problemas de operación que se mencionaron anteriormente durante la
preparación de las perlas.
En la tabla 5 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI), así como los
tiempos de incubación que requirieron los cultivos con células inmovilizadas para
disminuir los niveles iniciales del metal hasta valores bajos. Se observa que los
cultivos presentaron eficiencias de reducción del metal muy semejantes, de 88 a
92.7%, y que éstas fueron alcanzadas en un tiempo de incubación de 262 h.
Tabla 5. Eficiencias globales y tiempos de reducción del metal (3.6 mM) a diferentes
concentraciones de alginato de calcio y a una concentración inicial de biomasa de 1
g/L
Concentración inicial de Cr(VI) [mM]
Concentración de alginato [% w/v]
Concentración inicial de biomasa
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración más
16
[ g/L] baja de Cr(VI) residual [h]
3.6 0.5 1.0 92.7 262
3.6 1.0 1.0 88 262
3.6 1.5 1.0 88.8 262
3.6 2.0 1.0 89.2 262
Aun cuando la eficiencia de reducción de Cr(VI) fue ligeramente mayor cuando se
utilizó una concentración de alginato de 0.5% (w/v), los resultados de eficiencia
obtenidos a las concentraciones de alginato ensayados no son significativamente
diferentes como para asegurar que alguna de ellas sea la más adecuada para que las
células inmovilizadas de Candida sp. reduzcan el Cr(VI).
En la figura 2 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de
cromo hexavalente obtenidas para cada uno de los cultivos ensayados. Se aprecia
que, al igual que las eficiencias globales, las velocidades volumétricas de los cultivos
fueron muy similares. Estos resultados corroboran la afirmación que se hizo
anteriormente en el sentido de que no es posible establecer una concentración óptima
de alginato para la reducción de Cr(VI) (al menos de las ensayadas) cuando se utiliza
una concentración inicial del metal de 3.6 mM.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.5 1 1.5 2
[alginato] % w/v
Velo
cida
d vo
lum
étric
a de
redu
cció
n de
Cr
(VI)
[mg/
Lx h
]
Figura 2. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal cuando se utilizó
una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, 1 g/L de biomasa, y diferentes
concentraciones de alginato
17
Las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) obtenidas a una concentración
inicial del metal de 3.6 mM, a las diferentes concentraciones de alginato ensayadas,
fueron semejantes a las alcanzadas a bajas concentraciones del polímero cuando se
utilizó una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, lo que podría sugerir que el
alginato protege en cierta medida a las células cuando se emplean concentraciones
altas del metal.
Los resultados obtenidos a concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM indican
que es posible obtener velocidades volumétricas globales de reducción de Cr(VI)
aceptables cuando se emplean concentraciones bajas de alginato [inferiores al 1%
(w/v)]. Esto último es de suma importancia ya que el uso de menores cantidades de
polímero disminuiría notablemente el costo del proceso de reducción del metal.
Asimismo, se determinó el consumo de glucosa de todos los cultivos ensayados a una
concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, para establecer si la inmovilización de las
células a diferentes concentraciones del polímero afectaba las actividades metabólicas
de Candida sp. LMB2.
Se encontró que, aun cuando a las 48 h de incubación la velocidad de consumo del
monosacárido fue mayor cuando se utilizó una concentración de alginato de 1 y 1.5%
(w/v), a tiempos posteriores el consumo fue semejante para todas las concentraciones
de alginato utilizadas. Estos resultados confirman lo observado en los experimentos
realizados a 1.5 mM de Cr(VI) en el sentido de que la matriz polimérica de alginato no
ocasiona una resistencia a la transferencia de glucosa, por lo que esto no es un
proceso limitante en la reducción del metal.
Los resultados obtenidos a las concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM
sugieren que para lograr altas velocidades de reducción del metal es más conveniente
utilizar concentraciones bajas de alginato, de aproximadamente 0.8% (w/v). Además, a
esta concentración del polímero no se presentan los problemas de heterogeneidad en
la forma de las perlas ni se incrementa considerablemente el tiempo requerido para la
preparación de éstas. Debido a lo anterior, en el presente trabajo se seleccionó esta
concentración de alginato para realizar estudios posteriores y se comparó con la
concentración de alginato comúnmente reportada en la literatura (2%).
18
Meta 2: Determinar el efecto de la concentración de biomasa sobre la reducción de Cr(VI).
Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción del cromo hexavalente y el consumo de la principal fuente de carbono y energía. En los estudios realizados por Juvera-Espinosa (2006) se encontró que la densidad
celular inicial juega un papel importante en la reducción de Cr(VI) por las células en
suspensión (células libres) de Candida sp. LMB2. En esos estudios se informó que las
mayores eficiencias y velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se lograban
cuando se utilizaban concentraciones de biomasa entre 1.4 y 2 g/L. A concentraciones
inferiores y superiores a éstas se observó una disminución drástica en los parámetros
cinéticos del proceso de reducción del metal.
Por lo anterior, en el presente trabajo se evaluó el efecto de la concentración inicial de
biomasa inmovilizada en perlas de alginato sobre la reducción de Cr(VI) y el consumo
de glucosa. Para estos estudios se realizaron experimentos con densidades celulares
iniciales en el intervalo de 0.5 a 2.5-3 g/L y con dos concentraciones diferentes de
alginato, las cuales fueron de 0.8 y 2% (w/v). La concentración de 2% (w/v) fue
seleccionada como patrón de comparación ya que es la que generalmente se utiliza en
los estudios de inmovilización en alginato de calcio. Como se mencionó anteriormente,
la concentración de alginato de 0.8% se seleccionó porque a ésta se obtienen
velocidades adecuadas de reducción de Cr(VI) y se reducen los problemas y el tiempo
requeridos para la preparación de las perlas.
Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa cuando se emplearon concentraciones iniciales del metal de 1 y 2 mM, y una concentración de alginato de 2 % (w/v). Para determinar el efecto de la concentración inicial de biomasa inmovilizada sobre la
biorreducción del Cr(VI), a una concentración de alginato de 2%, se realizó un
experimento utilizando dos concentraciones iniciales de cromo hexavalente, las cuales
fueron de 1 y 2 mM. Para estos estudios se utilizaron concentraciones iniciales de
biomasa de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 g/L.
En la tabla 6 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI), así como los
tiempos de incubación que requirieron los cultivos con células inmovilizadas para
disminuir los niveles iniciales del metal hasta valores bajos. Se observa que las
19
eficiencias globales de reducción de Cr(VI) fueron altas para las dos concentraciones
ensayadas del metal.
A una concentración inicial de Cr(VI) de 1 mM, la menor eficiencia global de reducción
del metal (98.3%) se obtuvo a una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L, y se
requirió un mayor tiempo de incubación para alcanzar esa eficiencia (232 h). Aun
cuando se obtuvo una elevada eficiencia de reducción de Cr(VI) a una concentración
inicial de biomasa de 2.5 g/L (99.7%), el tiempo necesario para la reducción fue mayor
(214 h) que el requerido a una concentración de biomasa de 2 g/L (183 h).
Cuando se utilizó una concentración de Cr(VI) de 2 mM, las menores eficiencias
globales de reducción de Cr(VI) se obtuvieron a las concentraciones iniciales de
biomasa de 0.5 y 2.5 g/L. Los resultados anteriores están acordes con lo reportado por
Juvera-Espinosa (2006).
Tabla 6. Eficiencias globales y tiempos de reducción del metal (1 y 2 mM) a diferentes
concentraciones iniciales de biomasa y a una concentración de alginato de calcio de
2%
Concentración inicial de Cr (VI) [mM]
Concentración de alginato de sodio [% w/v]
Concentración inicial de biomasa [g/L]
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración más baja de Cr(VI)
1.0 2 0.5 98.3 232
1.0 2 1.0 100 214
1.0 2 1.5 100 214
1.0 2 2.0 100 183
1.0 2 2.5 99.7 214
2.0 2 0.5 96.7 306
2.0 2 1.0 99.9 306
2.0 2 1.5 99.9 306
2.0 2 2.0 98.4 306
2.0 2 2.5 94.9 306
A una concentración inicial de Cr(VI) de 1 mM, el menor tiempo requerido para reducir
totalmente el metal fue de 183 h y se obtuvo a una concentración inicial de biomasa de
20
2 g/L. En contraste, a una concentración inicial de Cr(VI) de 2.0 mM, el menor tiempo
requerido para alcanzar los niveles más bajos de Cr(VI) residual fue de 306 h; a
tiempos posteriores a éste la concentración del metal se mantuvo constante, lo que
sugiere que los cultivos microbianos ya no fueron capaces de reducir más cromo.
A continuación se estimaron las velocidades volumétricas globales de reducción de
Cr(VI) para las diferentes concentraciones ensayadas de Cr(VI) y de biomasa
inmovilizada, las cuales se muestran en la figura 3.
Las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) fueron mayores cuando se utilizó
una concentración inicial del metal de 2 mM, para todas las concentraciones de
biomasa ensayadas, lo cual podría deberse a la mayor cantidad del metal inicialmente
presente en el medio de cultivo. Estos resultados sugieren que el efecto tóxico ejercido
por una concentración de Cr(VI) de 2 mM no fue el suficiente como para inhibir
totalmente la capacidad de reducción de las levaduras.
A una concentración de Cr(VI) de 1 mM, las velocidades volumétricas de reducción del
metal fueron similares en el intervalo de concentraciones iniciales de biomasa de 0.5 a
1.5 g/L. A esta concentración de Cr(VI), la mayor velocidad se alcanzó a una
concentración inicial de biomasa de 2 g/L, la cual fue sensiblemente superior a la de
los cultivos inoculados con una menor concentración de biomasa.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.5 1 1.5 2 2.5
[Biomasa] g/L
Velo
cida
d vo
lum
étric
a de
redu
cció
n de
Cr (
VI) [
mg/
L x
h]
1 mM Cr(VI)2 mM Cr(VI)
Figura 3. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal, cuando se
utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1 y 2 mM , de alginato de 2% y a
diferentes concentraciones de biomasa inmovilizada.
21
En contraste, cuando se utilizó una concentración inicial de cromo hexavalente de 2
mM, el comportamiento fue diferente, ya que no se presentaron diferencias
significativas en los valores de velocidad volumétrica global de reducción de Cr(VI)
entre los cultivos con diferentes concentraciones iniciales de biomasa inmovilizada.
Aun así, las mayores velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) se obtuvieron a
concentraciones iniciales de biomasa de 1 y 1.5 g/L.
También se determinó la concentración de glucosa residual de cada una de las
muestras recolectadas durante el periodo de incubación, con la finalidad de observar
cómo se llevaba a cabo el consumo del monosacárido en cada uno de los cultivos
ensayados, a las dos diferentes concentraciones iniciales de cromo hexavalente
utilizadas.
Se encontró que la concentración inicial de biomasa afecta las velocidades de
consumo de glucosa, ya que, en general, al aumentar la concentración inicial de
levadura inmovilizada se requirieron tiempos de incubación más cortos para agotar
completamente el monosacárido presente en el medio de cultivo. Este comportamiento
se presentó a las dos concentraciones de Cr(VI) ensayadas, aunque fue más evidente
a la concentración de 2 mM.
Los mayores tiempos requeridos para consumir totalmente la glucosa se obtuvieron
con los cultivos que tuvieron una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L, lo cual
resulta lógico si se considera que en estos cultivos había una menor demanda de la
fuente de carbono y energía.
Al comparar los tiempos requeridos para el consumo total del monosacárido y para la
reducción de Cr(VI), fue evidente que la glucosa fue agotada a tiempos inferiores a los
requeridos para la reducción casi total del Cr(VI). Este comportamiento se presentó
tanto en los experimentos en los que se determinó el efecto de la concentración de
alginato como de la biomasa inicial inmovilizada sobre la reducción del Cr(VI). Como la
reducción de Cr(VI) requiere energía metabólica para llevarse a cabo, es probable que
la falta de la principal fuente de carbono y energía para el crecimiento de los
microorganismos haya limitado la velocidad de reducción del metal. A pesar de ello,
las levaduras fueron capaces de reducir casi completamente el Cr(VI), probablemente
utilizando parte del poder reductor almacenado en sus materiales de reserva.
22
Efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de cromo hexavalente y consumo de glucosa, cuando se utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM, y una concentración de alginato de 0.8 % (w/v). Se determinó el efecto de la concentración inicial de biomasa sobre la reducción de
Cr(VI) cuando la levadura se inmovilizó en perlas de alginato de calcio con una
concentración del polímero de 0.8% (w/v), la cual fue la que se determinó previamente
como adecuada para la reducción de Cr(VI), ya que los tiempos para la obtención de
perlas individuales y las velocidades volumétricas de reducción del metal fueran
aceptables, comparadas con concentraciones más altas de alginato.
En la tabla 7 se muestran las eficiencias y los tiempos requeridos para la reducción del
metal para las condiciones en las que se realizó el presente experimento.
Tabla 7. Eficiencias y tiempos de reducción del metal obtenidos a diferentes
concentraciones iniciales de biomasa y cuando la concentración de alginato fue de
0.8% (w/v).
Concentración inicial de Cr(VI) [mM]
Concentración de alginato [% (w/v)]
Concentración inicial de biomasa [g/L]
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración más baja de Cr(VI) residual [h]
1.5 0.8 0.5 100 191
1.5 0.8 1.0 100 145
1.5 0.8 1.5 100 116
1.5 0.8 2.0 100 116
1.5 0.8 2.5 100 116
1.5 0.8 3.0 100 145
3.6 0.8 0.5 67 240
3.6 0.8 1.0 98 240
3.6 0.8 1.5 100 240
3.6 0.8 2.0 100 192
3.6 0.8 2.5 100 192
3.6 0.8 3.0 100 240
23
Cuando la concentración inicial de Cr(VI) fue de 1.5 mM, todos los cultivos con
levaduras inmovilizadas fueron capaces de reducir totalmente el Cr(VI) presente en los
medios de cultivo, por lo que las eficiencias globales de reducción del metal fueron del
100%. Sin embargo, el tiempo que se necesitó para reducir el Cr(VI) varió
considerablemente con respecto a la concentración inicial de biomasa ensayada. El
menor tiempo de reducción se obtuvo en el intervalo de concentraciones iniciales de
biomasa de 1.5 a 2.5 g/L, con un valor de 116 horas.
A una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, las eficiencias globales de reducción
del metal de los cultivos con una concentración inicial de levadura de 0.5 y 1.0 g/L
fueron de 67 y 98%, respectivamente. En cambio, a concentraciones iniciales más
altas de biomasa, los cultivos presentaron una eficiencia global del 100%. De estos
resultados se puede apreciar que existe una relación entre la cantidad de Cr(VI) que
puede ser reducido por las levaduras y la concentración de éstas. Por consiguiente, la
baja eficiencia de reducción de Cr(VI) obtenida cuando se utilizó 0.5 g/L de biomasa se
atribuye a que a cada célula de levadura le correspondió una mayor cantidad de
Cr(VI), por lo que estuvo sujeta a mayores efectos tóxicos que a su vez provocaron
una disminución en su capacidad de reducción del metal.
Con relación al tiempo de incubación requerido para reducir 3.6 mM Cr(VI), se observó
que el menor tiempo fue de 192 h y se obtuvo cuando la concentración inicial de
biomasa fue de 2 y 2.5 g/L. A la concentración de biomasa de 3.0 g/L, el tiempo
necesario fue semejante al obtenido a bajas concentraciones de biomasa (0.5-1.5 g/L).
Este comportamiento se asemeja al obtenido a 1.5 mM de Cr(VI).
A la misma concentración inicial de biomasa, el tiempo requerido para reducir el Cr(VI)
fue mayor cuando se utilizó una concentración del metal de 3.6 mM, comparada con la
de 1.5 mM.
A continuación se compararon los tiempos requeridos para reducir el cromo
hexavalente cuando se utilizaron concentraciones de alginato de 0.8%
(concentraciones del metal de 1.5 y 3.6 mM) y de 2% w/v (concentraciones del metal
de 1 y 2 mM). Se encontró que los tiempos necesarios para reducir casi totalmente el
metal fueron inferiores cuando se empleó una concentración de alginato de 0.8%
(w/v), a pesar de que se utilizaron concentraciones más altas de Cr(VI). Estos
resultados corroboran una vez más que la concentración inicial de alginato afecta la
capacidad de reducción de la levadura inmovilizada.
24
En la figura 4 se muestran las velocidades volumétricas globales de reducción de
cromo hexavalente alcanzadas a las concentraciones iniciales de cromo hexavalente
de 1.5 y 3.6 mM y de biomasa de 0.5 - 3.0 g/L.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.5 1 1.5 2 2.5 3
Concentración inicial de biomasa g/L
Velo
cida
d vo
lum
étric
a de
redu
cció
n de
C
r VI m
g / l
h
1.5 mM de Cr(VI)3.6 mM de Cr(VI)
Figura 4. Velocidades volumétricas globales de reducción del metal, cuando se
utilizaron concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM , de alginato de 0.8% y
a diferentes concentraciones iniciales de biomasa inmovilizada.
Se observa que las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) fueron similares a
las dos concentraciones iniciales de cromo cuando se utilizaron concentraciones de
biomasa de 0.5, 1, 1.5 y 3 g/L. En contraste, las velocidades obtenidas a las
concentraciones de biomasa de 2 y 2.5 g/L fueron significativamente diferentes, siendo
mayores las alcanzadas a 3.6 mM de Cr(VI).
A una concentración inicial de Cr(VI) de 1.5 mM, las mayores velocidades volumétricas
de reducción del metal se obtuvieron a concentraciones de biomasa de 1.5 – 2.5 g/L, y
para el caso de los cultivos a 3.6 mM, las velocidades más altas se obtuvieron a
concentraciones iniciales de biomasa de 2 y 2.5 g/L.
Si se toma en consideración que a 1.5 mM de Cr(VI) se obtuvo una eficiencia global de
reducción del metal del 100% a todas las concentraciones iniciales de biomasa, las
concentraciones celulares más adecuadas para la reducción total de 1.5 mM de Cr(VI)
se encuentran en el intervalo de concentraciones de biomasa de 1.5 a 2.5 g/L, ya que
en él se obtiene una completa reducción del metal y este proceso se lleva a cabo a
altas velocidades volumétricas. Asimismo, a una concentración inicial de Cr(VI) de 3.6
25
mM, las concentraciones celulares más apropiadas para reducir el Cr(VI) son de 2-2.5
g/L, ya que en este intervalo se reduce todo el metal inicialmente presente en el medio
de cultivo con velocidades adecuadas.
La velocidad volumétrica de reducción del metal obtenida a concentraciones iniciales
de Cr(VI) de 1.5 mM y de biomasa de 1.5-2.5 g/L fue 40% superior a la alcanzada con
una concentración celular de 0.5 g/L. De igual manera, la velocidad obtenida a 3.6 mM
de Cr(VI) y a las concentraciones de biomasa de 2-2.5 g/L fue 110% mayor a la
alcanzada con 0.5 g/L de biomasa.
Al comparar las velocidades volumétricas de reducción de Cr(VI) obtenidas a las
concentraciones de alginato de 0.8 y 2% (w/v), se observó que cuando las células
fueron inmovilizadas a una concentración de 0.8%, la velocidad fue prácticamente el
doble de la obtenida con 2% de alginato de calcio, aun cuando se utilizaron
concentraciones iniciales de Cr(VI) superiores. Estos resultados confirman el hecho de
que a menor concentración de alginato de calcio para la inmovilización de Candida sp
LMB2, el desempeño de la levadura en cuanto a la reducción del metal es mejor.
Posteriormente se determinó la relación existente entre el consumo de la principal
fuente de carbono y la concentración inicial de biomasa, a las dos concentraciones
iniciales de Cr(VI) utilizadas.
En general se observó que a medida que se incrementó la concentración inicial de
biomasa, el consumo de glucosa fue más rápido. A una concentración inicial de Cr(VI)
de 1.5 mM, los cultivos con concentraciones celulares superiores a 2 g/L consumieron
totalmente el monosacárido en menos de 48 h de incubación. De igual manera a 3.6
mM de Cr(VI), los cultivos con concentraciones iniciales de biomasa superiores a 1.5
g/L agotaron más rápidamente la glucosa del medio de cultivo.
En aquellos cultivos en los que se redujo totalmente el Cr(VI) se observó que la
glucosa fue consumida completamente antes de que se completara la reducción del
metal, lo que podría haber afectado la velocidad de reducción de éste debido a la falta
de la principal fuente de electrones.
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) ensayadas, las menores velocidades
volumétricas de consumo de glucosa se obtuvieron con los cultivos que fueron
inoculados con 0.5 g de células/L y, además, las levaduras no consumieron en su
26
totalidad al monosacárido. Esto fue más evidente cuado se utilizó una concentración
inicial de Cr(VI) de 3.6 mM, en donde las levaduras sólo consumieron
aproximadamente el 60% de la glucosa inicialmente suministrada y, a partir de las 100
h de incubación, ya no se detectó variación en la concentración del monosacárido
residual.
Como se mencionó anteriormente, las concentraciones celulares iniciales más
adecuadas para reducir 1.5 y 3.6 mM fueron de 1.5-2.5 y 2-2.5 g/L, respectivamente,
ya que con ellas se obtuvieron las eficiencias globales (100%) y velocidades
volumétricas de remoción del metal más altas. Por consiguiente, se seleccionaron las
concentraciones de 2 y 2.5 g/L para realizar estudios posteriores.
Meta 3: Evaluar la remoción de cromo hexavalente por células libres e inmovilizadas. Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2. La levadura Candida sp. LMB2 es muy sensible a los esfuerzos de corte que se
originan en los reactores agitados mecánicamente, lo que afecta negativamente su
crecimiento, consumo de glucosa y su capacidad para reducir Cr(VI). A fin de
favorecer el óptimo desempeño de la levadura, es conveniente utilizar sistemas de
reacción en los que las fuerzas de corte sean menores que las generadas en los
reactores agitados mecánicamente, como por ejemplo en columnas de lecho
empacado. El uso de estas columnas requiere que las células microbianas sean
inmovilizadas en algún soporte inerte que retenga a los microorganismos dentro del
reactor y que, al mismo tiempo, permita la reducción del Cr(VI) en forma continua.
Sin embargo, el atrapamiento de los microorganismos en el interior de la matriz de los
soportes puede provocar cambios en el metabolismo de las células debido a que se
forman gradientes de pH, concentración de nutrimentos y productos, temperatura, etc.,
lo que puede afectar positiva o negativamente el comportamiento de las células. Es
por ello que es conveniente estandarizar las condiciones de inmovilización, a fin de
encontrar las que sean más convenientes para el propósito que se persigue.
Para determinar si la inmovilización de las células afecta sus procesos metabólicos de
remoción de contaminantes, es necesario realizar estudios comparativos del
desempeño de las células libres (células en suspensión) e inmovilizadas. Con base en
27
lo anterior, en el presente trabajo se realizó un estudio comparativo de la reducción de
Cr(VI) y de consumo de glucosa por células libres e inmovilizadas en perlas de
alginato de calcio de Candida sp. LMB2.
Al inicio de este trabajo se utilizaron condiciones de inmovilización propuestas en la
literatura, las cuales fueron las siguientes: concentración de alginato de 2% (w/v) y una
concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L (Kolot, 1988). Para estos experimentos se
utilizaron tres concentraciones iniciales de Cr(VI), de 0.75, 2.25 y 3.75 mM. Los
resultados obtenidos de reducción de Cr(VI) se muestran en la siguiente sección.
Como se verá más adelante, los parámetros del proceso de reducción de las células
inmovilizadas no fueron adecuadas para la reducción del metal por Candida sp. LMB2,
por lo que fue necesario estandarizar las condiciones de inmovilización a fin de reducir
los problemas que ocasionaron una baja expresión del potencial de la levadura para
reducir el metal.
Ya establecidas las condiciones de inmovilización, en cuanto a la concentración inicial
de biomasa (2-2.5 g/L) y de alginato (0.8% w/v), se procedió a realizar el experimento
comparativo de reducción de Cr(VI) y de consumo de glucosa entre las células libres e
inmovilizadas, utilizando dos concentraciones iniciales de Cr(VI), de 1.5 y 3.6 mM.
A continuación se compararon los niveles de reducción del metal alcanzados con las
dos metodologías, la propuesta en la literatura especializada y la de este trabajo.
Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas en alginato de calcio de Candida sp., utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la literatura. Como se mencionó anteriormente, las células de Candida sp. LMB2 se inmovilizaron
en perlas de alginato al 2% (w/v). La cantidad de células adicionada a la solución de
alginato fue la suficiente para obtener una concentración inicial de biomasa de 0.5 g/L
en todos los cultivos. Asimismo, se utilizaron como controles cultivos de células libres
con la misma concentración inicial de biomasa. Tanto en los experimentos con células
libres como con las inmovilizadas se emplearon tres concentraciones iniciales de
Cr(VI), de 0.75, 2.25 y 3.75 mM.
Las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos requeridos para alcanzar
esas eficiencias se muestran en la tabla 8.
28
Tabla 8. Eficiencias globales y tiempos requeridos para la reducción del metal por las
células libres e inmovilizadas de Candida sp. (metodología de inmovilización propuesta
en la literatura).
Concentración inicial de Cr(VI) [mM]
Concentración de alginato [% w/v]
Concentración inicial de biomasa [g/L]
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración mas baja de Cr(VI) residual [h]
0.75 2 0.5 99.9 212
0.75 0 (células
libres) 0.5 100 45
2.25 2 0.5 63 212
2.25 0 (células
libres) 0.5 100 143
3.75 2 0.5 9 212
3.75 0 (células
libres) 0.5 61 212
Las células libres fueron capaces de reducir por completo 0.75 y 2.25 mM de Cr(VI)
(eficiencias globales del 100%); sin embargo, sólo redujeron 61% del metal
inicialmente añadido al medio de cultivo cuando se utilizó una concentración de 3.75
mM de Cr(VI). El tiempo necesario para reducir el metal se incrementó a medida que
aumentó la concentración inicial de Cr(VI).
En contraste, las células inmovilizadas sólo fueron capaces de reducir casi por
completo 0.75 mM de Cr(VI) (eficiencia global de 99.9%) y su eficiencia disminuyó
drásticamente a concentraciones superiores del metal, alcanzándose valores de
eficiencia tan bajas como 9% al final del periodo de incubación (212 h).
Aun cuando la eficiencia global de reducción de Cr(VI) de las células libres e
inmovilizadas fue semejante cuando se utilizó una concentración inicial del metal de
0.75 mM, el tiempo requerido para ello varió considerablemente, 45 h para las células
libres y 212 h para las inmovilizadas, lo que significa aproximadamente un 470% de
diferencia.
29
En la figura 5 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de
Cr(VI) de las células en suspensión e inmovilizadas de Candida sp LMB2. Es notorio
que la velocidad de reducción del metal de las células libres fue mucho mayor que la
de las inmovilizadas.
Los resultados anteriores demuestran que las células libres de Candida sp. son
capaces de tolerar y reducir muy altas concentraciones de Cr(VI). Asimismo, es
evidente que las condiciones de inmovilización propuestas en la literatura no son
adecuadas para la reducción de Cr(VI) por las células de Candida sp. LMB2, por lo
que fue necesario estandarizarlas a fin de obtener eficiencias y velocidades
volumétricas lo más cercanas posibles a la de las células libres.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.75 2.25 3.75Concentración inicial de Cr (VI)
Velo
cida
d vo
lum
étric
a gl
obal
de
redu
cció
n de
Cr (
VI) [
mg/
L x
h]
Libres
Inmovilizadas 2.0%de alginato
Figura 5. Velocidades volumétricas globales de reducción de Cr(VI) de las células
libres e inmovilizadas, utilizando condiciones de inmovilización propuestas en la
literatura
Asimismo, se determinó el consumo de glucosa de las células inmovilizadas y libres.
Las velocidades iniciales de consumo de glucosa de las células libres fueron mayores
que las de las inmovilizadas, a todas las concentraciones de Cr(VI) ensayadas.
Se observó que el tiempo que requirieron las células libres e inmovilizadas para
consumir el monosacárido se incrementó conforme aumentó la concentración del
metal. A las concentraciones de Cr(VI) de 0.75 y 2.25 mM, el tiempo que requirieron
30
las células libres para consumir la glucosa fue mucho menor que el de las
inmovilizadas. Aun cuando a una concentración de Cr(VI) de 3.75 mM, ni las células
libres ni las inmovilizadas consumieron toda la glucosa presente en el medio de
cultivo, el porcentaje de consumo de las células libres fue ligeramente mayor al final
del experimento.
Los resultados obtenidos en el presente experimento muestran claramente que la
inmovilización de Candida sp. LMB2 en perlas de alginato con una concentración de
polímero de 2% (w/v) y a una concentración celular inicial de 0.5 g/L no es conveniente
para lograr altas eficiencias y velocidades volumétricas de reducción del metal, por lo
que era necesario estandarizar las condiciones de inmovilización.
Estudio cinético comparativo de la reducción de cromo hexavalente y de consumo de glucosa por las células libres e inmovilizadas de Candida sp. LMB2, utilizando las condiciones de inmovilización propuestas en este trabajo. Una vez realizado el experimento anterior, en donde se hizo evidente la necesidad de
estandarizar el método de inmovilización, se procedió a realizar el estudio cinético
comparativo de reducción de Cr(VI) y de consumo de glucosa de las células libres e
inmovilizadas, utilizando para ello las condiciones de inmovilización encontradas
experimentalmente en el presente trabajo (concentración de alginato de 0.8% w/v y de
biomasa de 2.0 – 2.5 g/L).
En la tabla 9 se muestran las eficiencias globales de reducción de Cr(VI) y los tiempos
de incubación requeridos para alcanzar esas eficiencias.
Tabla 9. Eficiencias globales y tiempos de incubación requeridos para reducir el metal
de las células libres e inmovilizadas (metodología de inmovilización propuesta en este
tabajo)
Concentración inicial de Cr(VI) [mM]
Concentración de alginato [%]
Concentración inicial de biomasa [g/L]
Eficiencia [%]
Tiempo en el que se alcanzó la concentración mas baja de Cr(VI) residual [h]
1.5 0.8 2.0 100 116
1.5 0 (células
libres) 2.0 100 91
31
1.5 0.8 2.5 100 116
1.5 0 (células
libres) 2.5 100 191
3.6 0.8 2.0 100 192
3.6 0 (células
libres) 2.0 100 96
3.6 0.8 2.5 100 192
3.6 0 (células
libres) 2.5 100 144
A las dos concentraciones iniciales de Cr(VI) y de biomasa ensayadas, las células
libres y las inmovilizadas fueron capaces de reducir completamente el Cr(VI) presente
en los medios de cultivo, por lo que las eficiencias globales de reducción del metal
fueron del 100%. Con excepción de los cultivos realizados a una concentración inicial
de Cr(VI) de 1.5 mM y de biomasa de 2.5 g/L, los tiempos que requirieron las células
libres para reducir todo el Cr(VI) fueron inferiores a los necesitados por las células
inmovilizadas. A pesar de ello, la diferencia de tiempo no fue tan grande como la
obtenida con el método de inmovilización propuesto en la literatura.
Al comparar los resultados de eficiencia global de reducción de Cr(VI) obtenidas con
las dos metodologías de inmovilización (las propuestas en la literatura y en este
trabajo) se apreciaron grandes diferencias. Por ejemplo, se observó que las células
que fueron inmovilizadas utilizando las condiciones propuestas en la literatura sólo
fueron capaces de reducir 9% de 3.75 mM de Cr(VI) en un tiempo de incubación de
212 h, en cambio, las células inmovilizadas con las condiciones propuestas en este
trabajo tuvieron la capacidad de reducir 100% de 3.6 mM de Cr(VI) en un tiempo de
cultivo de 192 h. Con base en estos resultados se deduce que las condiciones de
inmovilización propuestas en este trabajo son más adecuadas que las descritas en la
literatura para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2.
En la figura 6 se presentan las velocidades volumétricas globales de reducción de
cromo hexavalente de las células libres y de las inmovilizadas, cuando se utilizó una
concentración inicial del metal de 1.5 mM. A una concentración inicial de biomasa de 2
g/L, las velocidades obtenidas en ambos cultivos (células libres e inmovilizadas) fueron
semejantes (ligeramente mayor para las células libres); en contraste, a una
concentración celular inicial de 2.5 g/L, la velocidad de reducción de las células
inmovilizadas fue superior a la de las células en suspensión.
32
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
2 2.5
Concentración inicial de biomasa g/L
Velo
cida
d vo
lum
étric
a g
loba
l de
redu
cció
n de
Cr V
I mg
/ l h
Libres
inmovilizadasal 0.8%
Figura 6. Velocidades volumétricas globales de reducción de cromo hexavalente (1.5
mM) de las células libres e inmovilizadas
Cuando la concentración inicial del metal fue de 3.6 mM, la velocidad de reducción de
Cr(VI) de las células libres fue mayor que la de las células inmovilizadas, a las dos
concentraciones iniciales de biomasa ensayadas. A pesar de ello, las células
inmovilizadas fueron capaces de reducir todo el Cr(VI) inicialmente adicionado a los
medios de cultivo.
A las dos concentraciones iniciales de cromo hexavalente ensayadas, las células libres
presentaron mayores velocidades de reducción del metal cuando se utilizó una
concentración inicial de biomasa de 2 g/L. En cambio, las mayores velocidades
volumétricas de reducción de Cr(VI) de las células inmovilizadas se obtuvieron a
concentraciones celulares iniciales de 2 y 2-2.5 g/L, cuando se utilizaron
concentraciones iniciales de Cr(VI) de 1.5 y 3.6 mM, respectivamente. Es evidente que
los niveles de reducción del metal alcanzados tanto por las células libres como por las
inmovilizadas dependen de las concentraciones iniciales del metal y de biomasa que
se utilicen.
A pesar de que las condiciones de inmovilización propuestas en este trabajo son más
apropiadas para la reducción de Cr(VI) que las descritas en la literatura, las células
libres presentaron un mejor desempeño en la remoción del metal. Esto podría deberse
a que las células de Candida sp. LMB2 son muy tolerantes al metal, por lo que no fue
evidente que la matriz polimérica protegiera a las células del efecto tóxico ejercido por
el Cr(VI).
33
De la misma manera que en los experimentos anteriores, se determinó la variación de
la concentración de glucosa residual con respecto al tiempo de incubación para todos
los cultivos ensayados.
Se observó que tanto las células libres como las inmovilizadas fueron capaces de
consumir toda la glucosa del medio de cultivo y que el tiempo requerido para ello fue
mayor a la concentración más alta ensayada de Cr(VI) (3.6 mM), lo que podría
deberse a un mayor efecto tóxico del metal.
Además se observó que el tiempo que necesitaron las células libres e inmovilizadas
para agotar la glucosa presente en el medio fue menor al requerido para reducir todo
el Cr(VI).
Los resultados anteriores demuestran que la inmovilización de las células de Candida
sp. LMB2 en alginato de calcio no impide la reducción del cromo hexavalente, aunque
los niveles de reducción alcanzados son inferiores a los obtenidos con las células
libres. A pesar de esto último, la inmovilización de las células en perlas de alginato de
calcio permitirá la reducción continua del Cr(VI) en una columna de lecho empacado,
lo cual no puede lograrse con las células libres. Estos estudios serán abordados
próximamente por una tesista de licenciatura.
En la literatura consultada únicamente se encontraron dos informes sobre reducción
de Cr(VI) utilizando células inmovilizadas. Tucker y col. (1998) reportaron que las
células de Desulfovibrio desulfuricans inmovilizadas en gel de poliacrilamida fueron
capaces de reducir 0.5 mM de Cr(VI) con una eficiencia del 86-96%. Pattanapipitpaisal
y col. (2001) informaron que las células libres de Microbacterium liquefaciens MP30
redujeron más rápidamente 0.1 mM de Cr(VI) que las células inmovilizadas en polivinil
alcohol-nitrato (40% de eficiencia), polivinil alcohol-borato (100% de eficiencia) y
polivinil alcohol-alginato (100% de eficiencia). Las células de Candida sp. LMB2
inmovilizadas en alginato de calcio utilizadas en este trabajo fueron capaces de
remover 3.6 mM de Cr(VI) con una eficiencia del 100%.
Metodología de inmovilización de la levadura Candida sp. LMB2 en perlas de alginato de calcio para la reducción biológica de cromo hexavalente. La metodología sugerida en el presente trabajo para inmovilizar a la levadura Candida
sp. LMB2 para la biorreducción del cromo hexavalente se resumen a continuación:
34
Se disuelve alginato de sodio en agua destilada, a una temperatura de
aproximadamente 60 ºC. La concentración inicial de alginato en esta solución debe ser
mayor al 1% (w/v).
La solución se esteriliza en una autoclave a 120 ºC, durante 15 minutos, y
posteriormente se enfría a temperatura ambiente.
A continuación se agrega un volumen determinado de suspensión celular para obtener
una concentración de biomasa comprendida en el intervalo de 2.0 a 2.5 g/L y una
concentración de alginato de 0.8% (w/v).
La suspensión celular resultante (alginato-biomasa) se agita manualmente y
posteriormente se extruye a través de una manguera de silicón estéril (Masterflex
96410 – 14), con ayuda de una bomba peristáltica, la cual debe operar a una velocidad
tal que permita la formación de perlas individuales.
Las gotas formadas se colectan en recipientes que contengan una solución de CaCl2
al 5% (w/v), y se mantienen en reposo durante una hora para permitir el intercambio
de los cationes sodio y calcio.
En seguida, las perlas de alginato de calcio con biomasa inmovilizada se lavan dos
veces con agua destilada estéril y posteriormente se utilizan como inóculo para los
estudios de reducción de Cr(VI).
Conclusiones 1) En las condiciones ensayadas en el presente estudio, los componentes del medio
de cultivo no redujeron el Cr(VI) y el alginato de calcio no adsorbió cantidad alguna del
metal, por lo que todo el Cr(VI) que fue removido en los experimentos se debió
únicamente a la actividad biológica de las células.
2) La inmovilización de las células de Candida sp. LMB2 en perlas de alginato de
calcio no impidió la reducción del Cr(VI) por la levadura.
3) La concentración de alginato más adecuada para la obtención de perlas individuales
y para la reducción biológica de cromo hexavalente fue de aproximadamente 0.8 %
(w/v).
35
4) La concentración inicial de biomasa más adecuada para la reducción del cromo
hexavalente por las células inmovilizadas de Candida sp. LMB2 depende de la
concentración inicial del metal que se utilice. En general, las eficiencias globales y
velocidades volumétricas de reducción del metal más altas se obtuvieron a una
concentración celular inicial de 2.0 – 2.5 g/L.
5) La técnica de inmovilización en gel de alginato de calcio propuesta en el presente
trabajo es más adecuada para la reducción de Cr(VI) por Candida sp. LMB2 que la
descrita en la literatura especializada, por lo que se utilizará posteriormente para la
reducción continua del metal en una columna de lecho empacado.
Referencias 1. Hach Water Analysis Handbook. 2002. Hach Company. Colorado, USA. 4th. ed. pp. 433-444,
1210-1211.
2. Juvera-Espinosa, J. 2006. Evaluación de la remoción de cromo hexavalente por levaduras.
Tesis de Licenciatura. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico
Nacional.
3. Juvera-Espinosa, J.; Morales-Barrera, L. & Cristiani-Urbina, E. 2006. Isolation and
characterization of a yeast strain capable of removing Cr(VI). Enzyme and Microbial
Technology 40: 114-121.
4. King, A. 1988. Flavor encapsulation with alginates. En: Flavor encapsulation (S. Risch & G.
Reyneccius, Ed.), pp. 122-125. ACS Symposium Series 370, American Chemical Society,
Washington, D.C.
5. Kolot F. B., 1988. Inmobilized microbial systems; Principles, techniques and Industrial
Applications. Robert E. Krieger publishing company, Malabar Florida.
6. Morales-Barrera, L. 2005. Aislamiento de microorganismos y estudio de su capacidad para
remover cromo hexavalente. Tesis de maestría. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del
Instituto Politécnico Nacional.
7. Pattanapipitpaisal, P.; Brown, N.L. & Macaskie, L.E. 2001. Chromate reduction by
Microbacterium liquefaciens immobilized in polyvinyl alcohol. Biotechnol. Lett. 23: 61-65.
36
8. Tucker, M.D.; Barton, I.L. & Thomson, B.M. 1998. Reduction of Cr, Mo, Se, and U by
Desulfovibrio desulfuricans immobilized in polyacrylamide gels. Ind. Microbiol. Biotechnol. 20
(1): 13-19.
Impacto La principal contribución de este trabajo fue la formación de recursos humanos, tanto a
nivel licenciatura como de posgrado. En este proyecto participaron activamente 3
estudiantes de licenciatura, 1 de maestría y 1 de doctorado. Una de las estudiantes de
licenciatura ya sustentó el examen profesional, otro estudiante de licenciatura ya
terminó de escribir la tesis y los demás tesistas continúan con el desarrollo de su
trabajo experimental.
Como productos de la investigación se tiene que se publicaron 2 artículos en revistas
internacionales incluidas en la base de datos del Institute for Scientific Information
(ISI). Además, se publicaron 4 artículos en extenso en memorias de Congresos
Internacionales, con registro ISBN, y se presentaron varios trabajos de investigación
en eventos académicos nacionales e internacionales.
La levadura utilizada en este trabajo es capaz de remover el Cr(VI) mediante un
mecanismo de reducción química, lo cual es lo más deseable desde el punto de vista
de biorremediación, ya que el Cr(III) es 100 veces menos tóxico, 1000 veces menos
mutagénico y mucho menos soluble en agua que el Cr(VI), lo que permite remover el
cromo del ambiente de una manera más sencilla y económica que por los métodos
fisicoquímicos.
En la literatura especializada prácticamente no existen informes sobre la reducción de
Cr(VI) por levaduras, por lo que el uso de este tipo de microorganismos en la remoción
del metal contribuye a generar conocimiento nuevo y útil sobre este tópico de interés
ambiental. Además, los estudios de biología molecular que se han realizado con la
levadura empleada en este trabajo sugieren que es una cepa aún no descrita en la
literatura, por lo que su estudio y caracterización son aún de mayor importancia.
En el presente trabajo se estandarizaron las condiciones de inmovilización de Candida
sp. en perlas de alginato de calcio. Los resultados mostraron que la técnica propuesta
en este trabajo es más recomendable que la reportada en la literatura para la
reducción de Cr(VI) por Candida sp.
37
Ya habiendo obtenido las condiciones de inmovilización más adecuadas para la
reducción de Cr(VI), se realizarán posteriormente estudios de reducción de Cr(VI) en
columnas de lecho empacado, a fin de proponer un sistema continuo de reducción del
metal. Esto es de vital importancia ya que se podría depurar una mayor cantidad de
aguas contaminadas con Cr(VI) en menor tiempo y, además, se podría llegar a
proponer una tecnología novedosa ya que la mayoría de los estudios sobre este tópico
se han realizado en sistemas por lote.
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