infraČervenÁ a ramanova spektroskopie aneb co nÁm...
TRANSCRIPT
![Page 1: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/1.jpg)
INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE
aneb
CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O
(BIO)MOLEKULÁCH
Vladimír Baumruk
Seminář BCM094 „Úvod do problémů současné biofyziky“
![Page 2: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/2.jpg)
vibrační spektroskopieinfračervená spektroskopie (IČ)Ramanova spektroskopie (RS)
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
Ramanova optická aktivita (ROA)
vibrační optická aktivita (VOA)
Metody
2
![Page 3: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/3.jpg)
CO2 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4 ⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS
⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ
střed symetrie ⇒ alternativní zákazvibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramana)
frekvence vibrace
f – silová konstanta (síla vazby)μ – redukovaná hmotnost
(průměrně velký protein má přibližně 20 000 vibračních stupňů volnosti !!!)
Vibrační spektroskopie – princip
3
![Page 4: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/4.jpg)
h h E ERν ν= ± −0 2 1( )
Vibrační spektroskopie – princip
⇒ vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu)
⇒ vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti)
Ramanův posuv νvib = ν0-νR
4
![Page 5: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/5.jpg)
Vibrační spektroskopie – spektra
Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové
inte
nzit
a ro
zpty
lu
pro
pust
nost
(%)
IČ
Raman
daleká IČ
5
![Page 6: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/6.jpg)
ν1 460 cm-1
plně symetrickáν2 214 cm-1
2x degenerovanáν3 780 cm-1
3x degenerovanáν4 313 cm-1
3x degenerovaná
polarizované spektrum
depolarizované spektrum
Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl4)
6
![Page 7: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/7.jpg)
Detailní pohled na ν1 pás v Ramanově spektru CCl4
Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl(jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)
C 35Cl337Cl
C 35Cl4C 35Cl237Cl2
C 35Cl 37Cl3
ν1 - symetrická valenční vibrace
7
![Page 8: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/8.jpg)
strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice)
neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií)
velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)
je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul
Proč vibrační spektroskopie ?
8
![Page 9: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/9.jpg)
Výhody vibrační spektroskopie
RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivitypo skončení měření).Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné,suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Probiomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejichstruktura v krystalu a v roztoku.Nenáročné na objem vzorku (cca 10 μl pro konvenční RS, 20 μl pro IČ).Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (≈ 10-15 s) - využití vibračníspektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupnépomocí fluorescence či NMR.Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazenípásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).
9
![Page 10: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/10.jpg)
Specifické výhody Ramanovy spektroskopie
Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii(na rozdíl od IČ).
Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, přikterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatickémolekuly).
Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1,daleká IČ oblast)
Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).
Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)
10
![Page 11: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/11.jpg)
Nevýhody vibrační spektroskopie
Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, alenižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečněkompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodovámutace) modifikací.
Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (≈ 10-100 μg/μl) byťv malých objemech.
Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii(na rozdíl od Ramanova rozptylu).
Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (vesrovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistotavzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).
11
![Page 12: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/12.jpg)
Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“dané molekuly.
Složité molekuly ⇒ vibrační módy a jim příslušející spektrální pásynemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduševypočítány.
⇒ vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury.⇒ Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako
„otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislémetody.
⇒ Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží strukturyurčené pomocí difrakčních nebo NMR metod.
⇒ Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv.normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickýmicharakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) ⇒ správně přiřazenýpás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohotostrukturního rysu.
Vibrační konformační markery
12
![Page 13: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/13.jpg)
Ve vibračních spektrech nukleových kyselin rozlišujeme dva základnítypy strukturních markerů:
nukleosidové konformační markery jako indikátory konformace cukru atorze glykosylu citlivé k torzním úhlům δ (C2´-endo nebo C3´-endokonformace cukru) a χ (anti nebo syn orientace báze)
páteřní konformační markery jako indikátory fosfodiesterové torzecitlivé k torzním úhlům α a ξ popisujícím rotaci kolem esterových vazeb5´O-P a 3´O-P)
Vibrační strukturní markery
Ve vibračních spektrech proteinů rozlišujeme řadu strukturníchmarkerů, které jsou citlivými indikátory bezprostředního okolípostranních řetězců, jejich interakce s ním a konformace (Trp, Tyr,Cys). Pásy amidu I, II a III jsou citlivými indikátory sekundárnístruktury.
13
![Page 14: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/14.jpg)
C2’ endo/anti C3’ endo/anti C2’ endo/anti (pyrimidiny)C3’ endo/syn (puriny)
B-DNA A-DNA Z-DNA
Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA,a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA aA-DNA obsahuje 20 nukleotidůstejné sekvence. Z-DNA jetvořena alternujícími GC páry.
Kanonické struktury DNA
14
![Page 15: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/15.jpg)
C3´endo Sugar Pucker
C2´endo Sugar Pucker
Deoxyguanosinev
B-DNA
Deoxyguanosinev
Z-DNA
A. Poloha osy helixu (+) v rovině páru bazí pro B-DNA, A-DNA a Z-DNA.
B. Konformace nukleosidů v kanonických DNA strukturách. Nahoře: C2’ endo pucker s anti torzíglykosylu vyskytující se u všech reziduí v B-DNA a upyrimidinových reziduích v Z-DNA. Diagram také ilustrujepáteřní (α, β, γ, δ, ε, ζ) a glykosylové torzní úhly (χ). Dole: C3’ endo/syn vyskytující se v purinovýchreziduích v Z-DNA. V A-DNA všechna rezidua zaujímajíC3’ endo sugar pucker s anti glykosylovou torzí.
Kanonické struktury DNA
15
![Page 16: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/16.jpg)
Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označenyjsou nukleosidové a páteřní konformační markery.
Spektra kanonických struktur DNA
16
![Page 17: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/17.jpg)
A·B hybrid
B-form
A-form
A-form
A. poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura)B. poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form)C. poly(dA-dT).poly(dA-dT) fiber při 75% RH (A-form)D. poly(rA).poly(dT) fiber při 75% RH (A-form)
Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku
Ramanova spektra
17
![Page 18: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/18.jpg)
Raman spectra of poly(rA)+poly(rU) mixtures
Raman shift (cm-1)
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsity
(rel
ativ
e un
its)
0
50
100
150
2000 % A5 % A10 % A15 % A20 % A24 % A30 % A36 % A42 % A50 % A56 % A65 % A75 % A85 % A95 % A100 % A
Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku
Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA)(fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.
18
![Page 19: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/19.jpg)
Interakce poly(rA) s poly(rU)
Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U.
19
![Page 20: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/20.jpg)
Constructed RS of poly(rA)
wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600
Inte
nsity
/ re
l. un
its
0
20
40
60
80
100
120
140
Constructed RS of poly(rU)
wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600
Inte
nsity
/ re
l. un
its
020406080
100120140160180200220
Constructed RS of poly(rA).poly(rU)
wavenumbers / cm-1600 800 1000 1200 1400 1600
Inte
nsity
/ re
l. un
its
0
20
40
60
80
100
120
140
Constructed RS of poly(rU).poly(rA).poly(rU)
wavenumbers / cm -1600 800 1000 1200 1400 1600
Inte
nsity
/ re
l. un
its
020406080
100120140160180
Constructed UV abs. spectrum of poly(rA)
wavelength / nm220 240 260 280 300
Abso
rban
ce /
rel.
units
0
1
2
3
Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)
wavelength / nm220 240 260 280 300
Abs
orba
nce
/ rel
. uni
ts
0
1
2
3
Constructed UV abs. spectrum of poly(rA).poly(rU)
wavelength / nm220 240 260 280 300
Abso
rban
ce /
rel.
units
0
1
2
3
Constructed UV abs. spectrum of poly(rU)poly(rA).poly(rU)
wavelength / nm220 240 260 280 300
Abso
rban
ce /
rel.
units
0
1
2
3
Calculated fractions of species
poly(rA) content / %0 20 40 60 80 100
Rel
ativ
e fra
ctio
n
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
single str. poly(rA)single stranded poly(rU)duplex poly(rA).poly(rU)triplex poly(rU).poly(rA).poly(rU)
782
998
1092
1230
1627
1471
1397
1687
727
1101
784
814
1232
1302
1338
1482 15
7416
22
1689
632
630
647
727
782
816
869 10
9111
02
1183
1236
1262
1301
1348
1381
1480
1378
1513
1576
1615
1670
1694
1729
923
981
1006
1510
919
985
1008
643
918
644
727
811
1008 10
98
1177
1219 12
5213
0513
3813
7914
2514
8415
09 1579
Byly identifikovány 4 složky:jednovláknová poly(rU),jednovláknová poly(rA)poly(rA).poly(rU) duplex apoly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex.
Byla izolována spektra čistých komponent
20
Interakce poly(rA) s poly(rU)
![Page 21: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/21.jpg)
IČ spektrum proteinu v H2O (tučně) a D2O (slabě). Tloušťka kyvety byla cca 6 μm (H2O) respektive 20 μm (D2O).
Vibrační spektroskopie proteinů
21
![Page 22: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/22.jpg)
wavenumber(cm-1)6008001000120014001600
0
200
400
600
800
1000
1200
1400 c-Myb(R2R3) fragment
1654
1621
(W1)
1579
(W2)
1553
(W3)
1461
δCH
314
46 δ
CH2
1360
(W7)
1340
δCH
2+ W
7
1126
(W13
)10
6010
11 (W
16)
876 (
W17
)85
3 (Y)
759 (
W18
)82
3 (Y)
643
677
amide I amide III
1267
54011
75 δ
CH3
wavenumber (cm-1)24002600
Ram
an in
tens
ity
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
2554
νS-Hcysteine
Fragment c-Myb(R2R3) obsahuje 6 tryptofanů (3 v R2 i R3), 2 tyrosiny (1 v R2 i R3),a 1 cystein (v R2). Jejich pásy v Ramanově spektru dominují.
Ramanovo spektrum (R2R3) fragmentu proteinu c-Myb(minimální sekvence pro specifickou vazbu k cílové sekvenci DNA)
Vibrační spektroskopie proteinů
22
![Page 23: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/23.jpg)
Ramanova spektra (600-1800 cm-1) fd viru excitovaná 514.5 nm(dole, 50 mg/mL), 257 nm (uprostřed, 0.5 mg/mL) a 229 nm(nahoře, 0.5 mg/mL).
Rezonance s aromatickými zbytky (229 nm) – spektru dominují pásy Trp (W) a Tyr (Y) proteinových podjednotek
Rezonance s virovou DNA (257 nm ) -spektru dominují pásy bazí jednovláknové DNA (A,G,T,C)
Nerezonanční excitace (514,5 nm) – spektrudominují pásy proteinových podjednotek obálky viru (tvoří cca 88% hmotnosti viru)
Volba excitace ⇒ selektivita !!!
Ramanova a rezonanční Ramanova spektroskopie
G @ 668 cm-1 ⇒ 3´endo/anti (A marker)amid I @ 1651 cm-1 ⇒ α helix
Phe
23
![Page 24: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/24.jpg)
Schematické znázornění vibračních módů amid I, amid II a amid III v molekule N-methylacetamidu, modelu peptidové skupiny v trans konformaci. Jejich frekvence odrážejí strukturu polypeptidového řetězce (NH2-CαHR1-CO-NH-CαHR2-CO-) nezávisle na typu postranního řetězce (R1, R2, …).
Vibrační spektroskopie a struktura peptidů a proteinů
24
![Page 25: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/25.jpg)
FT- IČ spektra
vlnočet (cm-1)
15001550160016501700
abso
rban
ce
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 diferenční FT- IČ spektra
vlnočet (cm-1)
15001550160016501700
ΔA
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3 VCD spektra
vlnočet (cm-1)
15001550160016501700
ΔA
x105
-5
0
5
Tvarová variabilita FT-IČ (vlevo), diferenčních FT-IČ (uprostřed) a VCD (vpravo) spekter referenčního souboru 19 proteinů v H2O v oblasti amidu I a II. FT-IČ spektra jsou normali-zována na Amax = 1 amidu I. Diferenční spektra byla získána odečtením průměrného FT-IČ spektra referenčního souboru od jednotlivých spekter.
sekundární strukturaKabsch a Sander
helix β-struktura obrátka ohyb ostatní
minimum 0 0 6,9 1,9 11,1
maximum 77,1 47,7 20,9 20,5 33,0
střední hodnota 26,7 23,1 12,8 13,7 23,7
směrodatná odchylka 20,4 14,5 3,8 4,8 5,9
Distribuce sekundárních struktur v referenčním souboru 19 proteinů (v % zastoupení jednotlivých konformací).
Vibrační spektroskopie a struktura proteinů
25
![Page 26: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/26.jpg)
Stabilita proteinů (folding ↔ unfolding)WT (přirozený) mutant (Pro → Ala)
26
![Page 27: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/27.jpg)
Vibrační spektroskopie a počítačové modelování proteinů
27
![Page 28: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/28.jpg)
Vlevo: kyselý α1-glykoprotein (orosomukoid) v nativním stavu.Vpravo: vazba progesteronu vede k transformaci α-helikálního segmentu ve smyčce nad
β-barelem na antiparalelní β-strukturu (označeno šipkou).
Vazba progesteronu s orosomukoidem
28
![Page 29: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/29.jpg)
Dependence of the Raman S-H frequency and bandwidth on hydrogen bonding
Cysteine S-H stretching vibration (2500 - 2600 cm-1)
Raman spectrum (670-2800 cm-1) of the P22 trimeric tailspike protein at 10°C. The inset at upper right, which shows an amplification of the spectral interval 2480-2620 cm-1, exhibits the compositeS-H stretching profile (bands at 2530, 2550, 2565 and 2585 cm-1) of the eight cysteine residues per unit. The data are not corrected for solvent contribution. From Raso et al. J. Mol. Biol. 307 (2001) 899.
Side-Chain Conformations and Local Environments
29
![Page 30: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/30.jpg)
Cysteine
A. The Raman S-H profiles observed for the wild-type tailspike and for each of eight Cys → Ser mutants, as labeled.
B. Raman difference spectra computed as mutant minus wild-type, for each of theeight Cys → Ser mutants. In each trace, the S-H Raman signature of the mutated Cys site is revealed as a negative band.
Spectral contributions and hydrogen-bond strengths of cysteine sulfhydryl groups of
the native P22 tailspike proteinS-H Raman signatures (2480-2630 cm-1)of tailspike cysteine residues
Side-Chain Conformations and Local Environments
30
![Page 31: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/31.jpg)
( ) ( )R LI I IΔ = + − +pro molekulu (+)
pro molekulu (-) ( ) ( )R LI I I−Δ = − − −
L-alanyl-L-alanin D-alanyl-D-alanin(+) (-)
vlnočet (cm-1)
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
IR+I
L (x10
-8)
0
20
40
60
80
IR-IL (x
10-5
)
-20
-10
0
10
20 L-Alanyl-L-Alanin
D-Alanyl-D-Alanin
ROA
Raman
Vibrační optická aktivita - princip
31
![Page 32: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/32.jpg)
Vibrační optická aktivita (VOA)
diferenční metoda – měříme rozdílnou odezvu chirální molekuly vůči pravo- a levotočivě kruhově polarizovanému záření,
spojuje stereochemickou citlivost konvenční optické aktivity s vyššímrozlišením a tudíž i bohatším strukturním obsahem a konformační citlivostí vibrační spektroskopie,
v případě konformačně flexibilních molekul můžeme pomocí VOA rozlišitkonformace, jež jsou stabilní z hlediska časové škály vibračních pohybů (narozdíl od NMR, kde díky pomalejší časové škále (v porovnání s konformačníkonverzí) může dojít k vyrušení strukturních rysů, je vibrační spektrum váženým průměrem spekter jednotlivých konformerů).
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
Ramanova optická aktivita (ROA)
32
![Page 33: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/33.jpg)
stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
ROA – základní aplikace
33
![Page 34: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/34.jpg)
34
ROA – určení absolutní konfiguraceChirálně deuterovaný neopentan (R)-[2H1, 2H2, 2H3]-neopentan
Haesler et al., Nature 446, 526 (2007).
Ramanova a ROA spektra (R)-[2H1,2H2,2H3]-neopentanu. Dvě horní křivky ukazují změřená spektra. Spodní křivkyukazují jednotlivá vypočítaná spektra devíti rotamerů R1 to R9 a zprůměrované spektrum směsi všech rotamerů.
vlnočet (cm-1) vlnočet (cm-1)
![Page 35: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/35.jpg)
stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
ROA – základní aplikace
35
přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnostiseparace enantiomerů
![Page 36: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/36.jpg)
36
Měření enantiomerní čistoty
wavenumber [cm-1]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
( IR-IL ) x
10-6
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
vlnočet (cm-1)
ROA [ ] %R SEE
R S
c cfc c
−=
+
Soubor ROA spekter 19 vzorků trans-pinanu o různé enantionerní čistotě.
enantiomerní čistota
from ROA data
enantiomeric excess (%)-100 -50 0 50 100
scor
e V i1
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.99912R =
Lineární regrese
J. Hrudíková, Bakalářská práce (2007).
![Page 37: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/37.jpg)
stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
ROA – základní aplikace
37
přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnostiseparace enantiomerů
určení konformace biologických molekul v roztoku(proteinů, nukleových kyselin, cukrů, virů …)
![Page 38: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/38.jpg)
ROA a Ramanova spektra (1S)-(-)-a-pinenu: (a) zjednodušený (tzv. polární) a (b) konvenční model výpočtu ROA intenzit, (c) experimentální ROA spektrum, (d) simulované a (e) experimentální Ramanovo spektrum.
Simulace Ramanových a ROA spekter
(1S)-(-)-α-pinene
exp
exp
38
![Page 39: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/39.jpg)
PLP in H2O
IR-IL
PLP in TFE
hinge peptide in H2O
wavenumber (cm-1)
200 500 800 1100 1400 1700
Ramanova optická aktivita peptidů
ROA spektra poly-L-prolinu v TFE
ROA spektra hinge peptidu, paralelního dimeru oktapeptidu Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Prove vodě
ROA spektra poly-L-prolinu ve vodě
39
![Page 40: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/40.jpg)
valenční vibrace skeletu(νCα-C, νCα-Cβ, νCα-N)~ 870 – 1150 cm-1
rozšířená oblast amidu III(νCα-N, + δN-H a δCα-H)
~ 1230 – 1340 cm-1
oblast amidu I(νC=O)~ 1630 – 1700 cm-1
ROA proteinů
Amid III Amid I
X-ray PDB:69,2% α-helix
1,7% 310-helix
43,5% β-list
1,7% α-helix
1.3% 310-helix
28,7% α-helix
10,9% 310-helix
6,2% β-list
40
![Page 41: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/41.jpg)
α-helix β-list
disorder
order
ROA proteinů – PCA (Principal Component Analysis)
41
![Page 42: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/42.jpg)
the simplest amino acid
ideal benchmark system for studying:
conformational behavior
interaction with solvent
L-Alanine
42
![Page 43: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/43.jpg)
χ (CH3)
60 90 120 150 180
E (k
cal/m
ol)
0
1
2
3
B3LYP/6-31G** B3LYP/6-311G** B3LYP/6-31++G**
ψ (COO-)
-90 -45 0 45 90
E (k
cal/m
ol)
0
2
4
6
8
B3P86/6-31G** B3P86/6-311G** B3P86/6-31++G**
ϕ (NH3+)
0 30 60 90 120
E (k
cal/m
ol)
0
1
2
3
χ (CH3)
60 90 120 150 180
ϕ, ψ
-30
0 ϕ (NH3+)
ψ (COO-)
ψ (COO-)
-90 -45 0 45 90
ϕ, χ
-60
-30
ϕ (NH3+)
0 30 60 90 120
ψ, χ
-60
-30
0
ψ (COO-)χ (CH3)
ϕ (NH3+)
χ (CH3)
B3LYP/COSMO/6-31++G**
1D scan 2D scan
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
Dependencies of molecular energy (E, left) and dihedral angles (right) on the angles ϕ, ψ, and χ. The remaining coordinates in the one-dimensional scans were allowed to fully relax.
L-Alanine – potential energy surface
43
![Page 44: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/44.jpg)
Wavenumber
400 800 1200 1600
IR +
IL
0
4
Wavenumber
400 800 1200 1600
(IR -
IL ) × 1
04
-1
0
1
Wavenumber
400 800 1200 1600
IR +
IL
0
4
Wavenumber
400 800 1200 1600
(IR -
IL ) × 1
04
-1
0
1
Wavenumber
400 800 1200 1600
IR +
IL
0
4
Wavenumber (cm-1)
400 800 1200 1600
(IR -
IL ) × 1
04
-1
0
1
3 4 5 6 7 8 9 11 12,1310 14,15 16 1718,1920,21
22,23 24 25,26
68 128153
98
175
128
180140113
88
135
105138
65 to 85
173 135
113 85
-60-35
25 15
-80
20
-15
6015
60
70
-5
0
70
40
-55
0
70
10-65
60
-25
70
-25
10 -40 to -90
20-75 -55
25
2510
-40-15
-30
60
85
25-60
1525
65 -3525 60
-35 45
20
55 to 90-90 to -30
Mode number:
60
105
600
115
25
95
25
10 75 115
55
25 60
60
520
70
20
85105
5530
30
8085
35
15
ϕ (NH3+)
ψ (COO-)
χ (CH3)
NH3+
COO-
CH3
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689 44
![Page 45: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/45.jpg)
Wavenumber
400 800 1200 1600
(IL + IR
) × 1
0-9
0
2
Wavenumber
400 800 1200 1600
(IR -
IL ) × 1
0-5
-5
0
5
12,13 24
20,2
1
25,26
22,2
3
12,13
17
20,21
Wavenumber
400 800 1200 1600
IR +
IL
0
3
Wavenumber (cm-1)
400 800 1200 1600
(IR -
IL ) × 1
04
-5
0
5
Experiment
Calculation
114
89
10
12,13 16
17
19
181415
22
23
20,21
2,3
4 56 8 9
10
11 12,1314 17 24
18
20,21 25,26
22,2
3
1915 16
7
4 65
7
8 9 11
10
1415
1718
19
4
8 910
11
1415
16
18
19 22
23
L-Ala
D-Ala
Raman
ROA
Raman and ROA spectra can be reliably interpreted if the movement of flexible molecular parts is considered
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
L-Alanine
45
![Page 46: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/46.jpg)
There is a significant difference between
Ala-Pro x Pro-Ala
Gly-Pro x Pro-Gly
ROA (Raman) can directly reflect flexibility of the molecule
Model dipeptides
46
![Page 47: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/47.jpg)
Gly-Pro Pro-Gly
×ψ ψϕ ϕ
rigidity × flexibility
Model dipeptides
47
![Page 48: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/48.jpg)
Hinge peptide and its analogs
hinge peptide(double thread)
single thread Met analog
Model of an entire human IgG1 molecule.1
S-S bridged tetrapeptide(H-Gly-Cys-OH)2
1Padlan E.A, Mol. Immunol. 31 (1994) 169.
HINGE peptide is a fragment 225-232/225’-232’ from the core of human immunoglobulin IgG1. It acts in this parentmolecule as a swivel point crosslinking two rather heavy peptide chains. Being a parallel dimer of the octapeptideH-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH (C2 symmetry). The sequence is rich in proline residues and isexpected to be quite rigid also due to a presence of two disulphide bridges. The peptide offers several advantagesfor use as a universal carrier of various active sequences (immunologically neutral, possesses six independentterminal groups: -NH and -OH on Thr residues and C-terminal carboxyl).
48
![Page 49: INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE aneb CO NÁM …fu.mff.cuni.cz/biomolecules/media/files/courses/Vibrace_BCM094.pdf · struktura v krystalu a v roztoku. ¾Nenáročné na objem](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081618/608590cefceb902ca51508ef/html5/thumbnails/49.jpg)
(H-Gly-Cys-OH)2
wavenumber (cm-1)200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
IR-IL (x
10-6
)
-2
-1
0
1
poly(L-Pro)
IR-IL (x
10-6
)
-2
-1
0
1
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH
IR-IL (x
10-6
)
-3
-2
-1
0
1
2
3
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
IR-IL (x
10-6
)
-1
0
1
1643
1612
1456
1480
13201283
1258
1205
1193
1162
981
1004
937
893
924
659
523
322
212
95 1352
325
523
924
1003
1205
1255
1453
1612
1643
1481
892
938
976
1162
1193 13
2012
82
1352
1622
1606
1481
1459
1327
1351
1195
97894
692
210
00
1208
327
535
40314
5
900
668
834
834
1683
1415
1328
1393
1286
123011
82
1037
970
22011
5
1415
1683
1162
(H-Gly-Cys-OH)2
wavenumber (cm-1)200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
IR+I
L (x10
-9)
0
2
4
6
poly(L-Pro)
IR+I
L (x10
-9)
0
1
2
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OHIR
+IL (x
10-9
)
02468
10121416
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
IR+I
L (x10
-9)
0
2
4
6
8
667
510
501
510
657
ν(S-
S)ν(
S-S)
ν(C-
S)ν(
C-S)
Amide I
Amide I
Amide III
1252
1454
δ(CH
2)14
5214
53δ(
CH2)
δ(CH
2)
1633
1655
1655
Amide I
1685
49