INGENIERÍA GENÉTICA II

• Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). “Principles of Gene

Manipulation”, 6th ed. Blackwell Science.

• Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). “Molecular Cloning: A

Laboratory Manual”, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

1

1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

2. VECTORES DE CLONACIÓN

3. BIBLIOTECAS GENÓMICAS

4. BIBLIOTECAS DE ADNc

2

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

• Reconocen secuencias concretas

• Simetría (palíndromes)

3

Ejemplos de palíndromes

• Dabale arroz a la zorra el abad

• La ruta natural

• A man, a plan, a canal: Panama

4

Enzimas de restricción

• Reconocen secuencias concretas

• Simetría (palíndromes)

• Número de nucleótidos en la secuencia

44

N1N2N3N4N5N6N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6N7N8

46 48

256 4096 65536

5

6

Extremos cohesivos

GAATTC

CTTAAG

G-3’

CTTAA-5’

5’-AATTC

3’-G

EcoRI

7

Extremos cohesivos

CTGCAG

GACGTC

CTGCA-3’

G-5’

5’-G

3’-ACGTC

PstI

8

Extremos romos

CCCGGG

GGGCCC

CCC-3’

GGG-5’

5’-GGG

3’-CCC

SmaI

9

Extremos compatibles (I)

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

10

Extremos compatibles (II)

GTCGAG

CAGCTC

GTCGAC

CAGCTG

SalI

CTCGAG

GAGCTC

XhoI

11

Extremos romos

(siempre compatibles)

CCCATC

GGGTAG

CCCGGG

GGGCCC

SmaI

GATATC

CTATAG

EcoRV

12

Extremos no compatibles rellenados,

transformados en romos

(siempre compatibles)

GAATTC

CTTAAG

EcoRI

CTCGAG

GAGCTC

XhoI

G-3’

CTTAA-5’

AA T-3’T

5’-TCGAG

3’-CTCG3’-A

GAATT

CTTAA

TCGAG

AGCTC

•Degradado de cadena sencilla

+ dNTPs

13

• Rellenado parcial

Extremos no compatibles

transformados en compatibles

AAGCTT

TTCGAA

HindIII

TCTAGA

AGATCT

XbaI

A-3’

TTCGA-5’

AG-3’

5’-CTAGA

3’-CC3’-T

AAG

TTCGA

CTAGA

TCC+ dATP, + dGTP

+ dCTP, + dTTP14

VECTORES DE CLONACIÓN

• Plásmidos

• Bacteriófagos

• Cósmidos

• Vectores de alta capacidad

15

pBR322

16

Sac

Not

Bam

Eco

Xho

XbaI I H

I

RI

I I

Xb

aX

ho

Eco

Ba

mN

ot

Sac

I I RI HI

I ISfi I T7

SfiISP6

(0'0

)

brazo izquierdo (20 kpb)brazo

derecho(9 kpb)

(43'0

)

región central

dispensable(14 kpb)

λ-GEM-12

17

ble

c olE 1or i

f1(+) ori

ScaI

Ssp IPvuII

Xmn ISsp I

Ssp IPvuII

Ap aISa cIPstI*

Xba I*

NcoI

Sm aI

Stu I

Ec oRV

PvuII

HindIIISa lIXhoKp n

II

RII

I

RI

Ec oNot

Not

Ec o

BamHI

IztapaCos8.3 kpb

pp cbC

Cm

Tc yc1

cos

cos

NheI

Xba I

18

Cromosoma

eucariótico

Vector de clonaje

(plásmido)

Digestión

ADN Ligasa

Digestión

19

Vector de clonación

digerido con EcoRI y

PvuII

ADN

Ligasa

Extremos cohesivos Extremos romos

Sitio de corte

ADN cromosómico

Sitio de corte

Secuencias de

reconocimiento

20

ADN

“Extraño”

pBR322

PstI

ADN

Ligasa

ADN

Hospedador

Transformación de

células de E. coli

21

Selección

ADN

Hospedador

Transformación de

células de E. coli

Todas las colonias que

tienen plásmidos

Colonias con plásmidos

recombinantes

Agar + tet

Agar + tet

(control)

Agar + tet + amp

22

23

Agrobacterium invade

aprovechando los cortes

Transferencia a placas con agar

Placas con agar, hormonas

y kanamicina

Las plantas, resistentes a kanamicina,

contienen el gen “extraño”

Regeneración de las plantas

24

Planta transformada con el gen para la GFP (proteína verde fluorescente)25

26

27

28

29

30

31

32

BIBLIOTECAS GENÓMICAS

33

34

N =ln (1-p)

ln (1-t)

tamaño del inserto

tamaño del genomat =

p = probabilidad de encontrar el fragmento

deseado

35

BIBLIOTECAS DE ADNc

36

ARNm AAAAAAAAAAAA-3'5'-

TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'

conector-cebador

Transcriptasa reversa5-metil dCTP

dATP, dGTP, dTTP

ARN

ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'

AAAAAAAAAAAA-3'5'-

3'-

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 XhoI

ARNasa HADN polimerasa I

dNTPs

ADN

ADNc 5-met

AAAAAAAAAAAACTCGAG-3'5'-

3'-

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5'

XhoI

Adaptadores EcoR1ADN ligasa de T4

ADN

ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCTC...CTTAA-5'

AAAAAAAAAAAACTCGAG...G-3'5'-AATTC...

3'-G...

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 XhoI EcoRIEcoRI

ADN

ADNc 5-met TTTTTTTTTTTTGAGCT-5'

AAAAAAAAAAAAC-3'5'-AATTC...

3'-G...

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 XhoIEcoRI

Digestión Xho1

37