Activité de la platforme

Octobre 2012-Décembre 2013 :

Journée porte ouverte à l’IRB afin de présenter le projet INGESTEM et les services offerts par la plateforme : Plus de 80 personnes présentes Mise en place Administrative de la plateforme : -Ecriture d’une chartre de fonctionnement et de contrats de reprogrammation, (définie le cadre légal de la prestation apportée)-Mise à disposition de la totalité du budget INGESTEM dédié à l’IRB-Montpellier via le CHU,-Signature d’un d’accord de transfert de technologie entre DNAvec (Invitrogen) pour produire le virus Sendai (OKSM facteurs) sur Montpellier (IRB) grâce aux infrastructures spécifiques de l’IRB (P2/P3).-Mise en place d’une collaboration technique avec Dr.Roux (Genève) spécialisés sur le virus sendai afin d’exprimer de nouveaux facteurs (Lin28, …) et de conseils pour résoudre les potentiels problèmes de production et d’expressionMise en place Technique : Ecriture des protocoles de routine et de reprogrammation à partir de Fibroblastes : Feeders SNL, production virus (Lentivirus, rétrovirus non intégratifs, virus sendai…)Mise en place Pratique : Constitution de stock de feeders (SNL), plasmides, achats milieux, primers, etc …Mise en place Stratégique : Point de départ Lentivirus/Rétrovirus afin de qualifier le personnel et les protocoles et les control qualités pour évoluer ensuite sur une stratégie non intégratives. Mise en Place Organisationnelle : Réunion Comité de direction tous les semaines

Objectifs à court term (1-2 mois) :-Qualification de la platforme-Détermination des meilleurs conditions de culture pour reprogrammer -Création de « custom chips » afin d’analyser l’expression et les changements de CNV/SNP :Sur les genes définissant l’état fibroblastique et iPS. -Demande de financement via le CHU

Objectifs à moyen term (1 an) : Mise en place des méthodes de reprogrammation non intégratives avec une maitrise totale des différents aspects de la production permettant une transition potentielle clinique plus probable :-Production du Virus Sendai (DNAvec) sur Montpellier et Production de beta-FGF sur Montpellier: Permettant une diminution des coûts associes aux milieux -> plus d’utilisateurs-Production de proteines (oct4,KLF, Sox…) pour faire des iPS-Optimisation des conditions de culture pour produires des iPS.-Création d’un blog/site web (plus de flexibilité) et/ou en utilisant un system déjà existant (INGESTEM), permettant un partage plus fluide des protocols et publications, photo des cellules, questions associées à la culture des iPS…. -Collaboration avec ReproCell afin de créer des ateliers ou période d’apprentissage sponsorise par ReproCell et Ozyme pour les milieux .

Objectifs à long term (3 ans): - indépendance financière de la plateforme et identifications des facteurs

Objectifs

Contrôle de la qualitée des iPS :Test de pluripotence

Test de pluripotence ButQualité du contrôle pour démontrer la

pluripotence

Morphologie des colonies Vérifier que les iPS ont une morphologie similaire au hES Faible

Immunostaining Marquage de la pluripotence:Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Moyen

RT-PCR Détecte le niveau et la qualité d'expression des genes :Oct4, Tra-1-60,Sox2, Tra-1-80, Nanog et SSEA Moyen-Bon

Génération d'EBCapacité à se différencier dans les trois feuillets

embryonnaires (ecto,endo, mésoderme et disparition des marqueurs de la pluripotence)

Moyen-Bon

Microarray ou RNA-seq Comparaison avec hES Moyen-Bon

Teratoma formation Capacité à se différencier dans les trois feuillets embryonnaires (ecto,endo, mésoderme ) IN VIVO Bon

Contrôle des Conditions de culture

Xvivo configuration :

-Incubateurs ne peuvent pas être contaminés par les manipulateurs ou l’air de la pièce.

-Les cellules ne subissent AUCUN changements dans les paramètres de culture contrôlé par le Xvivo (atmosphère composition hypoxie, température,…) qui s’ils ne sont pas maitrisés participent à l’apparition d’abérration chromosomique.