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Ingo Rechenberg
PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung „Bionik II / Biosensorik“
Zwischen Bionik und Biotechnologie
Wie baut man einen Biosensor ?
Weiterverwendung nur unter Angabe der Quelle gestattet
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Biotechnologie versus Bionik
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Lotus Effekt
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Biotechnologie
Bionik
versus
Lotusblatt-Zellkultur
Erkundung des Effekts
Synthetisches Produkt
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Photobiologische
Wasserstoffproduktion
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Heterocyste
Vegetative ZelleH O2
O 2
H2N
2
Biotechnologie
Bionik
versus
2 2
COCH O
2
2<
<
O H
Algen-Analoga Bakterien-Analoga
2H
BlaualgeNostoc muscorum
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Konstruktion eines
Schallschnelle-Vektormessgeräts
Partikel Geschwindigkeit
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Biotechnologie
Bionik
versus
Technische Schaltung
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Der bionische Ansatz zur Realisation einer künstlichen Nase
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AC
Rezeptor
G-Protein
ATP
ATP
ATPcAMP
cAMP
cAMP cAMP cAMP
cAMP
cAMP
AC = Adenylcyclase
cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat
Vorbild Biologie: Verstärkung durch eine Enzymkaskade
Duftstoff
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Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft
1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor
2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein
3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)
4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP
5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an
6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen
7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal
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Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft
1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt
2. Es entsteht Metarhodopsin
3. Metarhodopsin zerfällt in Opsin und all-trans Retinal
4. Metarhodopsin aktiviert Transducin
5. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE)
6. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP
7. Dadurch schliessen sich Na-Kanäle
8. Es kommt zu einer Hyperpolarisation
9. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV
3 000
2 000
Molekulare Verstärkung: 6 000 000
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Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade
Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !
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"Katalyse ist die Beschleunigung eines langsam verlaufenden chemischen Vorgangs durch die Gegenwart eines fremden Stoffes" (1894).
"Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im Endprodukt einer chemischen Reaktion zu erscheinen, ihre Geschwindigkeit verändert. (1901)" Wilhelm Ostwald
Wilhelm Ostwald (1853-1932)
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Durch einen Molekularstrahl, in dem Moleküle gebündelt in eine Richtung geschickt werden, konnte nachgewiesen werden, dass die Aufspaltung der C-O-Bindung des Methanols gerade an den Kantenatomen ( ) der Palladium-Katalysatorteilchen besonders beschleunigt wurde.
Dr. Jörg Libuda, Prof. Hans-Joachim FreundFritz-Haber-Institut Berlin
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Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade
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NS
N
S
NS
oder
Mechanisches Modell eines Moleküls, das in eine andere Form umgewandelt wird (z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin)
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NS
N
S
Mechanisches Enzym
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NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
· · ·1000
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· · ·1000
1000
1000 000
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NS
1000 000
> 1 000
> 1 000 000
1
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An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten
Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden
Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten
Das sieht dann so aus:
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Extreme Empfindlichkeit
Selektivität auf biologische Stoffe
Was zeichnet den Biosensor aus ?
Extreme Empfindlichkeit
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Der geschichtlich erste Biosensor, der die
Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte
Der Glukose-Biosensor
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Messlösung
Elek
trode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?
Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickeltText
Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode
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S cha lt-kre is
S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nze igegerä t
S ensor
Schema eines Biosensors
Molekulare Formerkennung
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Funktionsprinzip eines Biosensors
AnalytlösungSelektor
(Rezeptor) Effekt Transducer
Elektrode
Thermistor
Piezokristall
Verstärker
ChemischeSubstanz
Temperatur
Licht
Masse
ElektrischesPotenzial
El e
ktri
sch
es
Sig
na
l
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In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden
Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix
Kovalente atomare Bindung des Enzyms
Enzym in semipermeabler Membran-Hülle
Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms
Enzym
Technisches Substrat
Enzym-Vernetzung
Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen
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Kann noch kein Eiweiß spalten !
Magensäure
Kann Eiweiß spalten.Pepsin: Pepsinogen:
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym
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Immobilisiertes
Magensäure
Messung desEiweiß-Spaltprodukts
Eiweißspaltung
PepsinPepsinogen
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym
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Funktionsprinzip eines Biosensors
AnalytlösungSelektor
(Rezeptor) Effekt Transducer
Elektrode
Thermistor
Piezokristall
Verstärker
ChemischeSubstanz
Temperatur
Licht
Masse
ElektrischesPotenzial
El e
ktri
sch
es
Sig
na
l
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G lucose O 212
G lucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal
G lucono-lactonase
G luconsäure H ++
Kalorimetrie
Am perom etrieLum ineszenz
pH-E lektrodeM O SFET
Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz
Mögliche technische Messaufnehmer
für einen Glukose-Biosensor
Zum Glukosesensor
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Glukose-Sensor heute
Thermodynamik
Mikrogravimetrie Photometrie
Elektrochemie
Transducer
Kalorimetrie
Mechanik Optik
PotenziometrieAmperometrie
KonduktometrieTemperaturmessungWägung
Lumineszenz-, Farb-Messung
Voltammetrie
Potenzialdifferenz bei Strom NullStrom bei konstanter SpannungStrom mit SpannungsänderungWiderstands/ Leitfähigkeitsmessung
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VElektrode 1 E lektrode 2Leitende Brücke
E lektrolyt
M etallstab
E lektro lyt
Wird eine Metallelektrode in einen Elektrolyten getaucht, so werden an der Phasengrenze Ladungsträger verschoben. Die Potenzialdifferenz ist aber separat nicht messbar.
Um das Potenzial zu messen ist eine zweite (Ableit)elektrode notwendig !
Elektrochemische Zelle
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Bei der Amperometrie wird an die Elektroden ein konstantes Potenzial gelegt und der dadurch resultierende Stromfluss gemessen.
Arbeitselektrode Referenze lektrode
E lektro lyt
A
Angelegtes Potenzial
z. B. 600 mV
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)(red
oxln cc
FzTRU
Konzentrationselement
NERNSTsche Gleichung
Semipermeable Membran A gA g e- e-e-
U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration
U
NO3
cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels
cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels
Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie
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Weitere Beispiele für Biosensoren
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Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.
Foto
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schu
ngsz
entru
m J
ülich
Biosensor für Knoblauch
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Foto
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Biosensor für Zyanid
Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.
Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.
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Der Penicillinsensor besteht auseinem Schichtpaket aus Aluminium, p-dotiertem Silizium, Siliziumdioxid,pH-empfindlichem Siliziumnitridund dem Penicillin abbauendenEnzym Penicillinase. Das Enzymist mit “Cross-Linker-Molekülen” an die Oberfläche gekoppelt.
Penicillin-Biosensor
Taucht der Sensor in eine penicillin-haltige. Lösung, werden bei der enzymatischen Reaktion Wasser-stoffionen frei. Diese lagern sich an die Siliziumnitridoberfläche an und ändern die elektrische Kapazität des Schichtpaketes.
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Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment
VerkapselungPlatinelektrode
Siliziumchip
Aktive Sensoroberfläche
Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix
SiO2
300 m µ
130 m µ
Glukosesensor in Mikrosystemtechnik
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G ehäuse
Source (Quelle)
G ate (Tor)M em bran
Enzym gem isch
Drain (Senke)Isolator
Spannungsquelle S trom m essgerät
A
pn n
Referenzelektrode
Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)
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Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.
Kupfer
Isolatoren Halbleiter Metalle
Kunststoffe
GlasGlimmer
DiamantQuarz
Selen
Germanium
Silizium
10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8
Silber
Eisen
Leitfähigkeit 1m
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Silizium
Bor
Phosphor
p-dotiert
n-dotiert
Fähigkeit der Elektronenleitung
und Löcherleitung
im dotierten Halbleiter
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Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken
Zur Menge des Dotierungsstoffs im Halbleiter
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n-dotiert p-dotiert
+
SperrschichtDurchlass+
Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher
Mit Elektronen und „Löchern“ verarmte SchichtMit Elektronen und „Löchern“
angereicherte Schicht
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MOSFET
p-dotiert
n n
p
n-dotiert
DrainSourceGate
Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.
Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor
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n n
p
SG
D
p-dotiert
n-dotiert
MOSFET
Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke. Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.
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n n
p
S DG
p-dotiert
n-dotiert
CEMFET BIOFET
Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.
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Signalmolekül
Rezeptor
Membran
Ionen
VImmobilisierte Enzyme
n n
p
S DG
Vergleich
Na+-Tore / BIOFET
Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!
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A
A
Bei der klassischen Elektronenröhre verhält sich das Steuergitter
wie die Membran einer Sinnes-zelle, deren Durchlässigkeit enzymatisch kontrolliert wird.
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Extreme Empfindlichkeit
Selektivität auf biologische Stoffe
Was zeichnet den heutigen Biosensor aus ?
Extreme Empfindlichkeit
Es fehlt das Kaskadenprinzip !
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Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode
Glukose: Amperometrischer Biosensor
Harnstoff: Potentiometrischer Biosensor
Amperometrischer BiosensorLactat:
Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay
Piezoelektrizität Immunoassay
Candida albicans:
Cholesterin: Amperometrischer Biosensor
Penicillin:
Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:
Potentiometrischer Biosensor
Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode
Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-Sensor
pH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode
Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik
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Zyanid-Biosensor
Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3
Anthrax-Biosensor
Harnstoff-BiosensorEnzym Urease
Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak
Enzym ???
Enzyme für Biosensoren
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Ende
www.bionik.tu-berlin.de
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Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.
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Messlösung
Elek
trode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt