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Inhibition de la lipase pancr6atique par le di6thyl-p-nitroph6nyl phosphate en emulsion

Un r6cent travail z a montr6 que la lipase pancr6atique de porc est une est6rase particuli~re, incapable d'agir sur les esters en dispersion mol6culaire, mais capable d'agir sur ces m~mes esters d~s qu'ils se pr6sentent k l '6tat 6mulsifi6. La lipase exerce donc son action au niveau d'une interface sur laquelle elle s'adsorbe d'ailleurs r6ver- siblement ~. L'est6rase h6patique, consid6r6e comme une est6rase typique, hydrolyse par centre les dispersions mol6culaires d'esters. La cr6ation d'une interface ne modifie pas son activitO.

Cette propri6t6 fondamentale de la lipase vis k vis de ses substrats se manifeste- t-elle aussi avec ses inhibiteurs2,3? Le but de la pr6sente note est d 'aborder l '6tude du probl~me avec l 'un des membres (le di6thyl-p-nitroph6nylphosphate ou E 600) du groupe des organophosphates dent l'effet inhibiteur par r6action st0echiom6trique avec les est6rases est bien connu.

La lipase purifi6e (C34,5; 200--700 unit6s) est trait6e k 37 ° et pH 7.6 ( tampon phosphate ou tris(hydroxym6thyl)aminom6thane o.I M), soit par une solution aqueuse de E 6o0, soit par une 6mulsion de cette substance dans la gomme arabique

2 %. Des t6moins sent pr6par6s en rempla~ant la solution ou l'6mulsion de E 60o par un 6gal volume d'eau ou de gomme arabique ~ 2 %. On pr61~ve de temps en temps des 6chantillons oh l 'on dose 5 l 'activit6 lipasique restante. On calcule enfin l'effet inhibiteur en tenant compte, grace aux t6moins, de l ' inactivation spontan6e de la lipase. Cette inactivation est tr~s lente dans les conditions de nos exp6riences.

La Fig. I indique les r6sultats obtenus avec une solution de E 60o dent la concen-

1OO~ =/; a - ZO

II + o

~ 75 i .1.5

50 / v . . _ t.O Fig. I. Act ion du d i6 thy l -p -n i t roph6ny lphospha t e sur la / l ipase pancr6a t ique . • : Solut ion o.3o 7 S; O et D : E m u l -

i I sions 1.o 7 et 7.7 8 S, r e spec t ivemen t . Les courbes en t r a i t s pleins i l lus t ren t la c in6t ique de l ' inh ib i t ion et do iven t 6ire

~ + / + / lues avec les ordonn6es de gauche . La droi te en pointi l l6 25 t % / 0.5 cor respond g la fonct ion log zoo/ ( ioo-x) = K t que dolt

/ \ suivre la r6act ion d ' inh ib i t ion si elle es t d 'o rd re I. Elle es t luo avec les ordonn6es de droite.

' a . . . . . ~

25 50 mln

tration finale est 30.7 % de la saturation k 37 ° (o.3o 7 S) et avec deux 6mulsions de cette substance (concentrations finales: 1.o 7 et 7.78 S).

Les courbes de la Fig. I montrent: I. Contrairement k ce que signale ALDRIDGE s, E 600 en dispersion mol6culaire

n'inhibe pas la lipase, tout au moins darts les conditions de nos essais. Cette contra- diction est d'ailleurs plus apparente que r6eUe car l 'inhibition constat6e par Aldridge est tr~s lente. Elle est en outre r6versible, ce qui suggSre que son m6canisme est

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diff6rent de celui de la r6action covalente caract6ristique des orgauophosphates. 2. D~s qu'une partie de l'organophosphate est en 6mulsion, un effet inhibiteur

consid6rable se manifeste. Relativement lent et incomplet quand la saturation vient d'6tre d6pass6e (1.o 7 S), cet effet devient rapide et total quand la quantit6 de E 600 6mulsifi6 est importante (7.78 S). Dans ce dernier cas, la r6action d'inhibition est approximativement d'ordre I (droite en pointill6 de la Fig. I).

On pourrait objecter ici que la lipase n'est plus active au cours de certains de nos essais, pour la seule raison qu'elle est adsorb6e. Si, apr~s avoir r6alis6 l'exp6rience pr6c6dente off la lipase est presqu'enti~rement inhib6e (6mulsion 7.78 S), on dilue avec du tampon jusqu'k dissolution complete de E 6oo, on ne constate en r6alit6 aucun renouveau d'activit6. La lipase est donc inhib6e de fa~on permanente, m6me apr~s remise en solution.

Ces r6sultats, obtenus avec un seul inkibiteur, ne permettent pas de tirer des conclusions d6finitives. Ils sugg~rent n6anmoins d~s maintenant que la lipase en solution est une prot6ine inactive et qu'elle devient un enzyme all moment de Pad- sorption k une interface. On admet k l'heure actuelle que le centre actif des zymog~nes pancr6atiques est form6 grace k certaines modifications de la structure tertiaire dues

la rupture de liaisons peptidiques. Une hypoth~se de travail assez s6duisante serait de supposer que le centre actif de la lipase est form6 grace k une "d6naturation" partielle due k l'adsorption. Notons pour terminer que l'inhibition sp6cifique des lipases par des inhibiteurs en 6mulsion devrait permettre de mieux diff6rencier les activit6s lipasique et "est6rasiques" des tissusZ,6, 7.

P. DESNUELLE Laboratoire de Chimie Biologique, Facult~ des Sciences, L. SARDA

Marseille (France) G. AILHAUD

x L. SARDA ET P. DESI~UELLE, Biochim. Biophys. Acta, 3 ° (1958) 513 . 2 L. SARDA, G. MARCHIS-MOUREX ET P. DESNUELLE, Biochim. Biophys. Acta, 24 (1957) 425 • 3 ]3. S. HARTLEY ET B. A. KILBY, Biochem. J., 5 ° (1952) 672. • L. SARDA, G. MARCHIS-MOUREN, M. J. CONSTANTIN ET P. DESI~UELLE, Biochim. Biophys. Aaa,

23 (1957) 264. s G. MARCHIS-MOUREN, L. SARDA ET P. DESNUELLE, Arch. Biockem. Biophys., 83 (1959) 3o9. 6 W. 1~. ALDRIDGE, Biochem. J., 57 (1954) 692.

D. K. MYERS, A. SCHTOTE, H. BOER ET H. BORSJE-BAKKER, Biochem. J., 61 (1955) 521-

Received December 8th, 1959 Biochim. Biophys. Acta, 37 (196o) 57o,-571

Direct chromatography of serum lipids without solvent extraction

I t is common practice to make organic-solvent extracts of lipids from tissues and body fluids before subjecting them to chromatographic analysis. However, it seemed plausible that certain lipid-containing body fluids such as plasma, serum, and cyto- plasm and finely dispersed particles such as mitochondria and microsomes, although existing in a predominantly aqueous medium, might be chromatographed directly. The studies on serum which are reported in this paper demonstrate that this is indeed the case. lO-2O ~1 of serum are applied to the paper, allowed to dry and then chroma- tographed in the usual manner z, 8. The solvents are sufficiently polar to rupture the lipid-protein bonds and cause the lipids to migrate as discrete spots. The proteins

Biochim. Biopkys. Acta, 37 (196o) 571-573