inleidingsles automatische celtellingen
TRANSCRIPT
GASO-ASO Klinische Biologie
Inleidingsles automatische celtellingen
dr. apr.-biol. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Algemeen
2
Abbott
Sysmex
Beckman-Coulter
Siemens
Automatische celtellingen
Algemeen
• celtellingen:
– grote aantallen te analyseren stalen
– meetfouten verbonden aan de manuele technieken
volautomatische analysetoestellen.
• volautomatische analyse:
– vertrekkend van 100-200 µL volbloed (K2EDTA),
– zelfstandig uitvoeren van een aantal diluties,
– simultane analyse van verschillende parameters
– resultaten - al dan niet na elektronische verwerking – samengevoegd op rapport
– doorsturen van deze resultaten naar een externe computer (LIS)
3
Automatische celtellingen
Algemeen
• naargelang complexiteit van analysetoestel: 7 (Hb, Hct, RBC, WBC, MCV, MCH, MCHC) tot > 110 meetgegevens al dan niet inclusief volledige (5-diff) of partiële (3-diff) WBC formule
• staalname: manueel of automatisch, vanaf open of gesloten bloedstaal
• allemaal uitgerust met barcode-lezer, zodat de meest frequente en gevaarlijke fouten, namelijk staalverwisselingen, theoretisch kunnen voorkomen worden
4
Automatische celtellingen
Algemeen
• monster volumina Sysmex XE-5000 Sysmex XN
– capillair bloed 40 µL /
– manueel/open 130 µL 88 µL
– automatisch/gesloten 200 µL 88 µL
– lichaamsvochten 130 µL 88 µL
5
Automatische celtellingen
6
Algemeen
• dilutorgedeelte meestal twee hoofdsuspensies bereid
– 1 in functie van analysen i.v.m. WBC en hemoglobine
– 1 sterker verdunde in functie van analysen i.v.m. RBC en PLT.
– metingen ivm WBC worden uitgevoerd na voorafgaande lyse van de RBC.
• hoge precisie bij aanmaak diluties (CV < 0.5 % voor volumes van enkele mL)
– roterende klep (“shear valve” of “sample rotor valve”)
– 3 keramische elementen, 2 vaste en 1 bewegend, met uitsparingen bepaald volume
Automatische celtellingen
7
Algemeen
• werking:
– stap 1 : aanzuiging bloed; de verschillende uitsparingen worden met bloed gevuld
– stap 2 : rotatie van het bewegend gedeelte, waardoor één of meer welbepaalde delen van de bloedlijn afgesneden worden
– stap 3 : terugspuiten afgesneden gedeelten van de bloedlijn met welbepaalde volumes diluens, waardoor zeer nauwkeurige diluties worden verkregen
• van 100 tot 200 µL opgezogen staal: slechts de laatste tientallen µL gebruikt; grootste deel van bloed om toestel te “decontamineren” van voorgaande staal.
Automatische celtellingen
Algemeen
8
Automatische celtellingen
Algemeen
9
Sysmex XE-5000
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
10
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
11
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• Hb referentie methode – manueel
– RBC lyseren in 1:500 verdunning
– stap 1: Hb met gebonden Fe2+ wordt geoxideerd door K3(Fe(CN)6 metHb (Fe3+)
– stap 2: MetHb reageert met KCN stabiel, rood cyaan-hb complex absorptie maximum bij 546 nm
– extinctie vh absorptie maximum is rechtstreeks evenredig met hoeveelheid Hb
• nadelen:
– toxisch KCN
– trage reactie (stabiel complex pas na 5-6 minuten)
– geen meting van sulfHb
12
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode
– SLS = Sodium Lauryl Sulphate = niet-toxisch detergens (~ zeep)
13
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode
– SLS = Sodium Lauryl Sulphate, niet toxisch, deel uitmakend van een zeep
• lysis RBC door absorptie van SLS aan de RBC membraan
14
Bron: CAT A. Vandermeersch
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• hydrofobe groep van SLS reageert met hemoglobine
– Fe2+ (hemo) wordt geoxideerd tot Fe3+ (hemi)
• hydrofiele groep van SLS bindt Fe3+
– vorming stabiel SLS-Hb
• fotometrische bepaling van SLS-Hb bij 540 nm
15 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• interferenties?
– lipemie
• SLS = detergens dus weinig interferentie met lipiden
– hoge WBC telling
• afzonderlijke meetkamer voor Hb
• lysis van WBC dus geringe interferentie
16
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie gemeten hemoglobine
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
17
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• 1949: Wallace Coulter
• 1953: patent
18
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• ~ Coulter principe
– apparaat waarin glazen buis met een zeer kleine opening(= telbuis of aperture) geplaatst is in een suspensie van bloedcellen
– door vacuüm wordt die suspensie in telbuis opgezogen
– tijdens dit proces: elektrische weerstand aangelegd tussen 2 elektroden: één in de celsuspensie, de andere in de telbuis
– elektrolytenoplossing (met suspensie bloedcellen) zorgt voor geleiding van stroom
– owv vacuüm, passage van een cel door nauwe opening van telbuis verandering/verhoging elektrische weerstand (= impedantie)
– hoe groter de cel, hoe hoger de verandering in elektrische weerstand
– Histogram = 2-dimensionaal
19
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
20
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
21
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• impedantie: verandering van elektrische weerstand
• hoogte van het signaal (grafiek piek) is evenredig met het volume van de cel
22
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie RBC histogram
• RBC veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 35 en 120 femtoliter
23 Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie PLT histogram
• PLT veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 2 en 20 femtoliter
24 Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie WBC (3-diff) histogram
• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk
• WBC suspenderen in hypotoon milieu
• selectieve opzwelling van de WBC – granulocyten > mononucleairen
– lysis lymfocyten: detectie celkernen < mononucleairen < genulocyten
25
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie WBC (3-diff) histogram
• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk
• WBC suspenderen in hypotoon milieu
• selectieve opzwelling van de WBC
26
LY
BA
MO NE
EO
Bro
n: A
nal
is B
e (B
eckm
an/C
ou
lter
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
27 B
ron
: An
alis
Be
(Bec
kman
/Co
ult
er
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
29
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
• 2 concentriche vloeistofstromen
– via centraal kanaal: injectie vh staal
– omgeven door een snel stromende elektrolytenoplossing: mantelvloeistof
• beweging mantelvloeistof:
– centrale vloeistofstroom vernauwt
– snelheid midden centrale vloeistofstroom > rand centrale vloeistofstroom
partikels (cellen) worden op 1 lijn gedwongen
slechts 1 cel tegelijk passeert de opening
30
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
31
back sheath-flow
front sheath-flow
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
32
Bro
n: S
ysm
ex B
e/N
l
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• referentie methode
– eenvoudige volume bepaling van de corpusculaire deeltjes in bloed
– bloed wordt opgezogen in speciale capillairen (heparine coating)
– capillairen worden afgesloten met speciale folie en in speciale centrifuge
– speciale centrifuge: scheiding vaste en vloeibare delen tgv verschillende specifiekgewicht van plasma en bloeddeeltjes
Bron: Sysmex Be/Nl 33
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• referentie methode
– waarden aflezen van schaal waarin tube in 10 gelijke fracties verdeeld wordt
– scheidingslijn doorheen de splitsing van de RBC zone en de WBC zone = Hct
Bron: Sysmex Be/Nl 34
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie
– sommatie van alle individuele pulsen in het RBC-kanaal
35
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie
– zelfs met maximale sedimentatie van de RBC in de centrifuge kleine hoeveelheid plasma tussen de cellen
– celtellers houden hiermee rekening dmv een constante
36
Ph = k x VRBC
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet berekening
• methode Beckman-Coulter, Siemens, Abbott
berekening Hct (GEEN rechtstreekse meting) obv meting MCV (impedantie)
MCV (fL) x RBC (10e6/µL)
factor voor “trapped plasma”?
37
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend
38
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)
• RDW (Red Cell Distribution Width) = variatiecoëfficient van erytrocytenvolume
• parameter afgeleid uit frequentiehistogram van RBC volume
• RDW is objectieve maat voor grootteverdeling van RBC populatie maat voor anisocytose.
• eenheid: %
• referentiewaarden: 11,5 - 14,5% (toestelafhankelijk)
39
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)
40
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)
• MPV (Mean platelet volume) = gemiddeld bloedplaatjesvolume
• parameter afgeleid uit het PLT frequentiehistogram
• term “mean” is misleidend : naargelang gebruikte apparatuur is MPV – gemiddelde waarde van het bloedplaatjesvolume – mediaanwaarde van het bloedplaatjesvolume – modus van het bloedplaatjesvolume
• onderliggende oorzaak is dat het bloedplaatjesfrequentiehistogram geen gausskromme is, maar een scheve populatie.
• eenheid : fL (femtoliter)
• referentiwaarden: 7 – 11 tot 9 – 13 fL (instrumentgebonden)
41
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)
42
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie gemeten hemoglobine
• impedantie gemeten RBC, PLT, (WBC + 3-diff), Hct*
berekend MCV*, MCH, MCHC, RDW, MPV
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
* Afhankelijk van type toestel
43
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
44
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
• ~ flow cytometrie = meting in een “flow”
• verstrooiing/afbuiging van licht/laserstraal
– cellen in oplossing komen door een “flow cell”
– mbv hydrodynamische focussering
– laserstraal (coherent, monochromatisch)
• voorwaartse lichtverstrooiing ~ cel volume/grootte
• zijwaartse lichtverstrooiing ~ interne structuur (granulen, kernvorm)
45
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
46
Voorwaartse lichtverstrooiing
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
47
Meting voorwaartse lichtverstrooiing
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
48
Intensiteit van verstrooid licht wordt omgezet in spanning
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
49
Grootte van de spanning ~ grootte van de cel
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
50
Zijwaartse lichtverstrooiing, hoe meer verstrooiing, hoe meer granulatie
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
51 Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• fluorescentie flow cytometrie
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof dringt geperforeerde WBC binnen kleuring DNA/RNA supravitale kleuring
– informatie over:
• celvolume,
• intracellulaire componenten
• celactiviteit (delingsvermogen van de kern, DNA)
• cytoplasma-activiteit (eiwitsynthese, RNA)
52
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• fluorescentie flow cytometrie
– na kleuring detectie door laser (“flow cell”)
– hydrodynamische focusering om cellen 1 voor 1 te laten passeren
– de emissie van licht op de fluorescerende WBC productie licht met langere golflengte dan het originele licht
– intensiteit van fluorescerende licht stijgt met hogere concentratie van de kleuring
53
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
54
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• wat is speciaal aan fluorescentie flow cytometrie?
– polymetine kleurt DNA/RNA = supravitale kleuring
– ook RNA wordt gekleurd (cytoplasma informatie)
• dus niet alleen informatie over – celvolume (voorwaartse verstrooiing)
– intracellulaire componenten, nucleus en granulae... (zijwaartse verstrooiing)
• maar ook informatie over de celactiviteit – duplicatie activiteit van de kern (hoog DNA)
– cytoplasma-activiteit (proteïne synthese, hoog RNA)
4-delige differentiatie!!
55
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
56 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
57 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA
58 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA
59 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA
• “scattergram”
60 B
ron
: Sys
mex
Be/
Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA
• “scattergram”
61
Bro
n: S
ysm
ex B
e/N
l
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA
• “normaal scattergram” “abnormaal scattergram”
62 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
63
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
– herkenning van de centrale positie van elke WBC populatie
– berekening van lokatie en waarschijnljkheid van elk “dal” tussen celpopulaties
– celpopulaties weergeven als wolken in scattergram
– voor elk monster berekening van discriminatoren tussen elke individuele populatie
64 B
ron
: Sys
mex
Be/
Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
a. “centroïden”
• eerste en initiële centroïden beschikbaar
• start positie van centroïden werd bepaald uit duizenden monsters
• deze waarden als start positie voor cluster analyse
65 B
ron
: Sys
mex
Be/
Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
b. “Mahalanobis afstand”
• cel gedetecteerd berekening afstand tussen signaal en aangegeven centroïde
• deze afstand geeft aan tot welke populatie het signaal behoort
66 Bro
n: S
ysm
ex B
e/N
l
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
c. “vorming van celpopulaties”
• signaal identificatie en nieuwe bepaling van centroïden
• dit proces wordt uitgevoerd met 500 celsignalen
• telkens worden centroïden voor lymfocyten, monocyten en granulocyten herberekend
67
Bro
n: S
ysm
ex B
e/N
l
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System - procedure
1. analyse eerste 500 signalen met verplaatsbare centroïden
2. bepaling clusters lymfocyten, monocyten, granulocyten en ghost door analyse van 1000 signalen
3. herhaling stap 1 en 2 tot de waarden stabiel blijven centroïden vaste positie
4. indien geen stabilisatie: geen scheiding van WBC
5. Adaptive Cluster Analysis System wordt uitgevoerd voor alle WBC
6. resultaat: zeer nauwkeurige differentiatie in vgl met manuele microscopie
7. conclusie: goede differentiatie, zelfs voor pathologische en/of oudere monsters (48u)
68
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie (vervolg)
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
69 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• NRBC bepaling
– lyse RBC
– reagens:
• WBC doorlaatbaar maken
• kernen NRBC blijven intact
– SFL/FSC
– automatische correctie WBC
70 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling
– perforatie membranen RBC en WBC
– fluorochroom (polymethine, RNA)
– hydrodynamische focussering
– SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– maturiteit (hoeveelheid RNA):
• LFR (Low Fluorescence Rate)
• MFR (Medium Fluorescence Rate)
• HFR (High Fluorescence Rate
– IRF (Immature Reticulocyte Fraction):
• (MFR + HFR) / (LFR + MFR + HFR)
• Fe-therapie/EPO/BM-transplantatie 71 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling
72 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
138
Reticulocyten kanaal
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling geautomatiseerde erythropoïese
73 dr. apr. D. Kieffer
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling geautomatiseerde erythropoïese (Ret-He)
74 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
– perforatie membranen RBC en WBC
– fluorochroom (polymethine, RNA)
– hydrodynamische focussering
– SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– optische meting PLT
– IPF : hogere RNA-inhoud
• DD/ thrombopenie
• BM transplantatie
75 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
– perforatie membranen RBC en WBC
– fluorochroom (polymethine, RNA)
– hydrodynamische focussering
– SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– optische meting PLT
– IPF : hogere RNA-inhoud
• DD/ thrombopenie
• BM transplantatie
76 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
77
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
– klinische bruikbaarheid IPF onderscheid oorzaken thrombopenie
• toegenomen vernietiging/verbruik: hoog IPF
• afgenomen productie: laaf IPF
78 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
79 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
80 dr. apr. D. Kieffer
A differential cell count is obtained through VCS Technology by the interrogation of 8162 cells using the 3 separate and simultaneous probes: - Direct Current, - Radio Frequency Alternating Current - Laser Light Scatter The value of each of these measurements positions it within the three-dimensional array we term the 3D Dataplot.
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
81 dr. apr. D. Kieffer
A differential cell count is obtained through VCS Technology by the interrogation of 8162 cells using the 3 separate and simultaneous probes: - Direct Current (impedantie)
- cel volume - RF electromagnetic current
(conductiviteit) - interne structuur van de cel - “opaciteit”
- Laser Light Scatter (voorwaartse lichtverstrooiing 10 – 70°)
- vorm - reflectie - structuur - “rotated light scatter”
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
82 dr. apr. D. Kieffer
volume vs “discriminant functions” (2D-plots):
- volume vs light scatter
- neutro - eo - mono - lymfo + baso
- volume vs conductiviteit - lymfo - mono - granulo
- volume vs “gating out neutro + eo” - baso - lymfo - mono
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
83
volume vs “discriminant functions” (2D-plots):
- volume vs light scatter (DF1)
- neutro - eo - mono - lymfo + baso
- volume vs conductiviteit (DF2) - lymfo - mono - granulo
- volume vs “gating out neutro/eo” (DF3) - baso - lymfo - mono
volu
me
DF1
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
84 dr. apr. D. Kieffer
3D-plot: Cell location and color coding:
Lymphocytes (normal and many of the abnormals) are colored in Blue Monocytes (normal and many of the abnormals) are colored in Green. Neutrophil population (normal and many of the abnormals) are colored in Violet. Eosinophils (normal and many of the abnormals) are colored in Orange. Basophils (normal and many of the abnormals) are colored in White/Gray.
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
85 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing
• fluorescentie
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
86 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: cytochemie
Advia – Siemens:
- WBC differentiatie gebaseerd op
• peroxidase kanaal (mono, neutro, eo: peroxidase + 4-chloro-1-naphtol)
mono, lymfo + baso, neutro en eo
• baso/lobulariteit kanaal (na zure lyse)
baso
87 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing
• fluorescentie
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
88 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
89 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl
+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
90 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
91 Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
92 Bron: Sysmex Be/Nl
+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
93 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing
• fluorescentie
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom eigenlijk ook hoofdprincipe!
• depolarizatie verstrooid licht
94 dr. apr. D. Kieffer
RF
Automatische celtellingen
Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom
95 dr. apr. D. Kieffer
( impedance)
RF/DC-methode ~ VCS Coulter
Automatische celtellingen
Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom IMI-kanaal
96 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
• lichtverstrooiing
• fluorescentie
Bijkomende principes
• cytochemie
• specifieke lyse
• hoogfrequent wisselstroom
• depolarizatie verstrooid licht
97 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: depolarizatie verstrooid licht
98 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: depolarizatie verstrooid licht
99 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
SYSMEX: samenvatting verschillende kanalen
100 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
101 dr. apr. D. Kieffer
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Specificaties
24
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
102
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Specificaties
25
detector methode, dilutie parameters
SLS-methode, fotometrie
1:500
HGB
RBC, HCT, PLT-I, MCV, RDW-SD, RDW-CV,
PDW, MPV,P-LCR, PCT
HDF/ DC-detectie methodeimpulse sommatie
1:500
MCH, MCHC
HGB
RBC/PLT-detector
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
103 dr. apr. D. Kieffer
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Specificaties
26
WBC, B
A
SO #‚ BASO %
LYMPH #, LYMPH %, MONO#, MONO %,
EO #, EO%, NEUT+BASO%NEUT+BASO#
IG#, IG%
Flowcytometriediode laser - 1:50
4 DIFFFlowcytometrie
diode laser - 1:51
WBC / BASO
detector methode, dilutie parameters
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
104 dr. apr. D. Kieffer
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Specificaties
27
NRBC #NRBC %
Flowcytometrie diode laser - 1:51
IMIRF/DC – detectie methode - 1:250
IMI #, HPC #, HPC %
NRBC
detector methode, dilutie parameters
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
105 dr. apr. D. Kieffer
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Specificaties
28
RET / PLT-OFlowcytometrie
diode laser 1:204
RET #, RET %, PLT-O
HFR, MFR, LFR, IRF, Ret-He,
IPF%
detector methode, dilutie parameters
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen
106 dr. apr. D. Kieffer
Microscoop
• pro: kwalitatief: alle cellen geïdentificeerd
• contra: kwantitatief: statistisch onnauwkeurig
• contra: trage analyse , één voor één
• contra: expertise noodzakelijk (duur?)
Automaat
• contra: kwalitatief: alle cellen in 5 populaties
• pro: kwantitatief: statistisch nauwkeurig
• pro: snelle analyse
• pro: verwerking meerdere stalen
• pro: moduleerbaarheid
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: statistiek
107 dr. apr. D. Kieffer
dr. apr. D. Kieffer 108
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: BC 2 DXH’s (celtellers) en SMS (uitstrijktoestel)
109 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: 2x Sysmex XE-2100 en 2x uitstrijktoestellen
110 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: BC SMS (uitstrijktoestel)
111 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
112 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
113 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
114 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
115 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
116 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
117 dr. apr. D. Kieffer
118 dr. apr. D. Kieffer
119 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Automatisatie: efficiëntie
• CBC (complete blood count) + diffferentiatie + reticulocyten
• uitstrijktoestel + automatische kleuring
• moduleerbaarheid (koppeling verschillende toestellen)
• “reflex testing” staal opnieuw of met extra analyse
• link met microscopie
120 dr. apr. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Automatisatie: efficiëntie
• link met microscopie: manuele of automatische microscopie
121 dr. apr. D. Kieffer