UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALAFACULTAD DE CIENCIAS MÉDICASUNIDAD INMUNOLOGIA Y MICROBIOLOGIATERCER AÑO, 2015

ACTIVIDAD PRACTICA 11INSTRUCTIVO DE LABORATORIO: HELICOBACTER PYLORI

Dra. Carmen de TerceroDra. Paola Lee Parra

A. INTRODUCCIONEl Helicobacter es una bacteria, bacilo gramnegativo con forma de espiral, móvil, con flagelos unipolares, microaerofílica, productores de ureasa; oxidasa y catalasa positiva.La prevalencia de la infección varía en diferentes naciones. Se han identificado 3 cepas bacterianas que predominan en hispanos, asiáticos e hindúes.

La tipo I, distribuida principalmente en hispanos, peruanos nativos, guatemaltecos, nativos africanos y residentes de Estados Unidos. La tipo II, que predomina en japoneses y chinos; y la tipo III, que se encuentra distribuida principalmente en los indios de Calcuta.

Fue reconocido en 1994 como causa de úlceras gástricas y duodenales por el Instituto Nacional de la Salud (NIH) de Estados Unidos. En 1995 la Agencia Internacional para la Investigación del Cancer (IARC) lo declaró como un carcinógeno humano del grupo I o un carcinógeno definitivo para el carcinoma gástrico.

B. OBJETIVOSQue el estudiante:

1. Reconozca las características estructurales, morfológicas y metabólicas del Helicobacter pylori.

2. Conocer y aplicar las técnicas de laboratorio para identificación de la infección por Helicobacter pylori (diagnóstico).

C. MATERIALES PROPORCIONADO POR LABORATORIO1. Cortes histológicos de biopsias gástricas teñidas con Hematoxilina Eosina para la

identificación de H. pylori.2. Placas de inmunocromatografía para identificación de antígenos de H. pylori en

heces. 3. Gel de agarosa con electroforesis de cepas de H. pylori.4. Cultivos de Helicobacter pylori5. Microscopios6. Aceite de inmersión

D. MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ESTUDIANTE1. Bata blanca de manga larga2. Guantes

E. METODOS DIAGNOSTICOS DE INFECCION POR H. PYLORI

Métodos no invasivos

1. Test de la úrea en aliento Detecta la actividad de la enzima ureasa del Helicobacter pylori. La ureasa hidroliza a la úrea generando compuestos de CO2 y amonio. El CO2 difunde a través de la mucosa gástrica a la circulación general, pasa a la circulación venosa capilar y difunde a través del plexo capilar hacia los alveolos, para ser finalmente expulsado en el aliento espirado. Usando moléculas de carbono marcadas (13C,14C) este CO2 puede ser detectado en muestras de aire espiradas por el paciente. La sensibilidad es alrededor de 88 a 95% y especificidad de 95% a 100%.

2. Serología Es importante herramienta para la detección, aunque los anticuerpos IgM desparecien con rapidez, los anticuepos de tipo IgA e IgG pueden persistir durante meses o años; por lo tanto esta prueba detecta anticuerpos IgG o IgA contra el Helicobacter pylori en el suero, sangre total u orina del paciente, mediante la técnica de ELISA. Como los títulos de anticuerpos persisten durante muchos años esa prueba no se puede emplear para discriminar entre infecciones actuals y antiguas. La sensibilidad es alrededor de 90% a 100%, y la especificidad de 76% a 96%.

3. Detección del antígeno en heces Se ha desarrollado una serie de inmunoesayos monoclonares y policlonales para la identificacion de antígenos de H. pylori excretados en heces. Actualmente son muy usadas por su practicidad, rapidez y exactitud, en la identificación de antígenos bacterianos o anticuerpos, se basan en una reacción antígeno-anticuerpo sobre una superficie de papel filtro en la cual se desplaza la muestra por capilaridad. La sensibilidad y especificidad superan el 95%. La sensibilidad disminuye a 69% si la muestra de heces permanece a temperatura ambiente por 2 a 3 días.

El diagnóstico de H. pylori prueba por detección de antígenos se realiza, colocando la muestra de heces del paciente, previamente tamponada, la cual contiene altas cantidades de antígeno, esta solución antigénica se desplazará por capilaridad en la superficie, hasta encontrar un segmento del papel en el cual se encuentra un anticuerpo anti H. pylori el cual ha sido marcado con oro coloidal y un colorante. Al efectuarse la unión antígeno anticuerpo, instantáneamente estos precipitarán, produciendo una banda coloreada.

Métodos invasivos, Implican la realización de una endoscopía gastrica.

1. Reacción en cadena de la polimerasa y RAPD La reacción en cadena de la polimerasa, más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de una sola hebra de ADN. Por lo que permite el diagnóstico de infecciones bacterianas e identificación de genes de virulencia.

Posteriormente el producto de la PCR se coloca en un gel de agarosa en una cámara de electroforesis, el cual provee un campo eléctrico, donde las moléculas de ADN con carga negativa van hacia el extremo positivo. Las moléculas con menor peso molecular avanzan más que los de mayor peso molecular. El gel se coloca en un transiluminador con rayos Ultra Violeta observándose bandas brillantes, debido a que la gel tiene bromuro de etidio, el cual se mezcla con las moléculas de ADN.

Permite diferenciar recurrencia versus reinfección, permite determinar el índice de fracaso de la terapia antibiotica y un mejor conocimiento de las formas de transmisión y

epidemiología de la infección. La complejidad de la prueba y su elevado costo, no la hacen recomendable de manera rutinaria.

Procedimiento para la realización de la PCR:

1. Desnaturalización del ADN doble cadena: La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN,

2. Hibridación de los iniciadores en zonas específicas de cada una de las hebras patrón, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde.

3. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidostrifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. (Ver figuras)

2. Test de la ureasa en tejido

gástrico biopsiado

Detecta la enzima ureasa en muestras de biopsia del antro gástrico. La más común de las técnicas es la CLOtest (prueba Campylobacter like organism), que consiste en colocar una o dos piezas de tejido biopsiado en agar que contiene úrea y un reactivo de pH. La ureasa hidroliza la

1

.2

3

4Fotos: cortesía Dra. Elisa Hernandez directora de Centro de investigación biomédica, CUM, USAC.

1. Muestra en termociclador2. Amplificación3. Gel de agarosa4. 4. resultado

úrea liberando amonio, el cual alcaliniza el pH, produciendo un cambio de color del reactivo. Esta prueba muestra cambios de coloración desde la primera hora; sin embargo, la recomendación es esperar 24 horas para la lectura final. La obtención de muestras del fondo gástrico además del antro, mejoraría la sensibilidad de la prueba. La sensibilidad se encuentra alrededor de 90% a 95%, y la especificidad entre 95% - 100%.

Fotos: cortesía de Licda. Sue Quan. Laboratorio de Microbiología, CUM, USAC.

3. Identificar Helicobacter pylori en biopsia gástrica Es bastante eficaz para el diagnóstico de la infección proporcionando a la vez información sobre la presencia de gastritis, metaplasia intestinal y malignidad. La sensibilidad y eficacia es comparable a la de la prueba de ureasa en biopsia, y puede mejorarse mediante el uso de coloraciones especiales como Giemsa, Warthin-Starry, Wayson y tinciones de inmunohistoquímica.

1.

Fotos cortesía Dra. Carmen de Tercero, laboratorio de Microbiología, CUM, USAC

4. Cultivo

Es el método diagnóstico más específico; es posible aislar la bacteria en cultivo si se inocula la muestra en un medio de cultivo enriquecido suplementado con sangre, hemina o carbon y se incuba en una atmosfera microaerófila por hasta 2 semanas. Tambien se pueden utilizar diferentes medios como Skirrow, agar Mueller – Hinton, agar infusión cerebro-corazón o agar Wilkins Chalgren.

Fotos: cortesía Licda. Sue Quan laboratorio de Microbiología, CUM, USAC.

F. ACTIVIDADES:

1. Tomando una lámina portaobjetos que contiene un corte histológico de estómago, observe las características de la bacteria y la lesión gástrica presentada, utilice objetivos 4,10,40 X. La primera tinción es de Hematoxilina y Eosina en un corte histológico de la mucosa gástrica región antral, observe el infiltrado inflamatorio linfocitico en la lámina propia y neutrófilos migrando por las paredes de las glándulas gástricas que son hallazgos histológicos de gastritis crónica con actividad. En la segunda tincion con coloración especial de Giemsa podemos observar los abundantes bacilos de H. pylori de color azul en la luz glandular.

2. Interpretar la prueba de Antígenos en heces3. Observe las bandas compatibles con H. pylori, observe las bandas del gen Vac,

discuta con el docente los resultados, escriba sus observaciones: el marcador de peso molecular es de 1000 a 100, este gen es el que es parte de una isla de patogenicidad del H.pylori

4. Observe los medios de cultivo de agar sangre y describa las características morfológicas de las colonias.

5. Observe la prueba rápida de ureasa y analice los resultados.6. Todas las actividades serán presentadas en forma individual, en un reporte que

incluya gráficas o fotografías con su respectiva descripción y análisis.

BIBLIOGRAFIA

1. Murray, Patrick. Microbiología médica 7ma edición. Capítulo 29.2. Ramírez Ramos, Helicobacter pylori 25 años después (1983-2008): epidemiología,

microbiología, patogenia, diagnóstico y tratamiento. Revista de Gastroenterología Perú v.29 n.2 Lima abril/junio 200

3. Lee Parra, Paola. Documento: Bacterias, virus y cáncer. 2014