Protocolo para inmuno detección tipo “Western”.

Electro transferencia.

• Recuperar el gel de poliacrilamida de la cámara de electroforesis y lavarlo con agua desionizada una vez para eliminar del exceso de SDS u otros detergentes.

• Equilibrar el gel en 50 ml de amortiguador de transferencia durante 15 min para estabilizar el tamaño del gel y retirar el SDS.

• Lavar la membrana de nitrocelulosa en agua desionizada una vez y equilibrarla en amortiguador de transferencia durante 5 min.

• Ensamblar el cartucho de transferencia con sus componentes en el siguiente orden:1)Porción color negro del cassette2)Fibra3)Papel filtro4)Gel5)Membrana6)Papel filtro y aplanar con un tubo de ensayo para eliminar burbujas entre las capas7)Fibra8)Cerrar el cartucho

Notas. Las piezas del papel filtro y la membrana deben cortarse a un tamaño de por lo menos 8.5 x 7 cm para ajustarse a un gel correspondiente a la cámara de electroforesis “SE 250 Mighty Small II”. La membrana debe manejarse estrictamente sólo con pinzas en todo momento y jamás entrar en contacto con las manos u otras superficies fuera de los contenedores o bandejas previamente lavados y dispuestos para este fin. Todos los contenedores usados para los geles y membranas, deben lavarse de manera efectiva para evitar contaminación por ensayos previos.

• Armar la cámara de electro trasferencia e insertar el cartucho en la orientación correcta según el color de los electrodos (la porción color negro del cartucho debe quedar mirando hacia el electrodo negativo del sujetador, también en color negro). Colocar el agitador magnético, la capsula enfriadora y agregar la cantidad necesaria de amortiguador de transferencia para llenar el tanque de la cámara y cubrir el cartucho.

• Encender el agitador e iniciar la trasferencia a 350 mA durante 1 h con 30 min.

• Recuperar la membrana del cartucho y lavarla con agua desionizada dos veces. Si se requiere, la membrana se puede almacenar en amortiguador TTBS a 4°C.

Inmuno detección.

• Bloquear la membrana con 25 ml de una solución de leche libre de grasa al 5% en amortiguador TTBS durante 1 h a temperatura ambiente en agitación moderada.

• Lavar la membrana tres veces con 50 ml de amortiguador TTBS durante 15, 10 y 5 min por lavado.

• Mezclar la dilución requerida del anticuerpo primario con el volumen adecuado de una solución de leche libre de grasa al 5% en amortiguador TTBS y agregar a la membrana; incubar a temperatura ambiente durante 1 h en agitación moderada.

• Lavar la membrana tres veces con 50 ml de amortiguador TTBS durante 15, 10 y 5 min por lavado.

• Mezclar la dilución requerida del anticuerpo secundario con el volumen adecuado de amortiguador TTBS y agregar a la membrana; incubar a temperatura ambiente durante 1 h en agitación moderada.

• Lavar la membrana tres veces con 50 ml de amortiguador TTBS durante 15, 10 y 5 min por lavado.

Visualización por quimioluminiscencia.

• Mezclar el sustrato quimioluminiscente en una proporción 1:1 hasta un volumen de 800 a 900 μl finales.

• Escurrir la membrana por el borde en una toalla de papel y colocarla en una bandeja o contenedor plano limpio; gotear el sustrato sobre la membrana hasta cubrirla en su totalidad e incubar durante 3 a 5 min. La membrana no debe secarse.

• Eliminar el exceso de sustrato de la membrana escurriéndola por el borde en una toalla de papel y encerrarla entre dos piezas de acetato trasparente.

• Colocar la membrana con los acetatos en un cassette de revelado.

• Con la luz blanca apagada en el cuarto oscuro y usando la luz roja de seguridad, colocar una pieza de película autoradiográfica sobre la membrana y cerrar el cassette de revelado. La película debe manejarse siempre con guantes.

• Exponer varias piezas de película en diferentes intervalos desde 1 min hasta 10 min o hasta encontrar un tiempo optimo. Revelar las películas con las soluciones en el siguiente orden:

• 1)Revelador• 2)Agua• 3)Fijador

• Secar las películas al aire y analizar el patrón de bandeo.

Amortiguadores.

Amortiguador de transferencia.

pH 9.9 Bicarbonato de sodio 10 mMCarbonato de sodio 3 mMMetanol 20%

0.84 g0.318 g200 ml

Aforar a 1000 ml con agua fría y almacenar a 4°C.

Amortiguador TTBS.

pH 7.4 Tris/HCl 10 mMNaCl 2.92%Tween-20 0.1%

2.42 g29.2 g1 ml

Ajustar el pH con HCl concentrado y aforar a 1000 ml con agua; almacenar a 4°C. Se recomienda prepararlo fresco dado que el Tween-20 es foto sensible y se oxida con el tiempo.

Notas. Si ocurre bandeo inespecífico en la detección, agregar desde 0.5% de BSA a la solución bloqueadora del anticuerpo primario.