inmunoensayos

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INMUNODIAGNSTICOEVA BLANCO MOLINARES

INMUNODIAGNSTICODEFINICIN.

REFERENTE LEGAL.

FUNDAMENTACIN TERICA.3.1 CONCEPTO DE SISTEMA INMUNE.3.2 CONCEPTO DE RESPUESTA INMUNE.3.3 CONCEPTO DE ANTIGENO.3.4 CONCEPTO DE ANTICUERPO.3.5 IMPORTANCIA CLNICA DE LAS CLASES DE INMUNOGLOBULINAS-ANTICUERPOS.

INMUNODIAGNSTICO

4 PRINCIPIO DEL INMUNOENSAYO.

4.1 FASES DE LA REACCIN.4.2 FACTORES QUE INCIDEN.4.3 TCNICAS.4.4. APLICACIN.4.5. CONCLUSIN.

DEFINICIN DE INMUNODIAGNSTICO O INMUNOANLISISSon pruebas de laboratorio fundamentadas en la reaccin antigeno - anticuerpo, que permiten hoy dia hacer el diagnstico de enfermedades endocrinas, infecciosas, marcadores tumorales, fertilidad, marcadores cardiacos, y control de drogas de abuso y de uso restrigido.

REFERENTE LEGALDecreto 1011 de 2006: Sistema General de Garanta de Calidad en SGSSS.NTC 5250: adopcin idntica por traduccin de la ISO 15189:2003 requisitos particulares para calidad y competencia. Sistema de Gestion de Calidad en el laboratorio clinico.Decreto 3518 del 6 de octubre de 2006. SIVIGILA.Decreto 2323 del 12 de julio de 2006. Red de Laboratorios

MINISTERIO DE SALUD Y LA PROTECCIN SOCIAL

Alejandro Gaviriatom posesin ante el Presidente de la Repblica, Juan Manuel Santos Caldern, de su cargo como nuevo Ministro de Salud y Proteccin Social el 3 de septiembre de 2012. Fue ratificado para el nuevo periodo.A lo largo de su carrera profesional, Gaviria Uribe se desempe como subdirector de Planeacin Nacional, subdirector e investigador asociado de Fedesarrollo, e investigador en Washington del Banco Interamericano de Desarrollo, entre otros cargos.El nuevo Ministro tiene estudios de doctorado en Economa de la University of California (EE.UU.) y de maestra en Economa de la Universidad de Los Andes. Al aceptar su designacin como Ministro de Salud y Proteccin Social,se desempeaba como Decano de la Facultad de Economa de la Universidad de Los Andes.

Fuente: pag Web del Ministerio de Salud y Proteccin Social.

Tomado de la pagina web del MPS

FUNDAMENTACIN TERICA SISTEMA INMUNEConjunto de rganos, clulas y molculas encargados de la proteccin del hospedero frente a agresores externos e internos, permitiendole a los seres vivos preservar su identidad e integridad.El Sistema Inmunitario es el sexto sentido. Permite reconocer el mundo microscpicoImagen tomada de Google

SISTEMA INMUNE

Fuente: Regueiro

RGANOS LINFOIDES.

Imagen tomada de Regueiro

RESPUESTA INMUNEAGRESOR

BARRERAS NATURALES.PROCESOS: INFLAMACINFAGOCITOSIS.FIJACIN DE COMPLEMENTO

CLULAS DE MEMORIA

ANTICUERPOS

CITOCINAS

INMUNOENSAYOSINMUNOENSAYOSHLACPALTLB

RESPUESTA INMUNEEs el resultado de las interacciones de rganos, clulas y molculas del sistema inmune frente al agresor.El sistema inmunitario evolucion bajo la presin selectiva impuesta por los agentes patgenos.

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RESPUESTA INMUNETIENE DOS MOMENTOS:El inmediato, al contacto con el agresor, llamada respuesta innata.

Uno posterior al contacto, en donde se requiere aprender acerca del agresor y que se denomina adaptativa o especfica.

RESPUESTA INNATARESPUESTA ADAPTATIVA

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RESPUESTA INMUNE En los dos momentos de la respuesta inmunitaria, la deteccin de anticuerpos difiere, debido a que est en relacin con la clase de inmunoglobulina que se sintetiza:

ENTRE EL DA 0 A 10: IgMENTRE EL DA 7 A 15:IgG

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RESPUESTA INMUNE

COMPORTAMIENTO DE LOS ANTICUERPOS EN LA TOXOPLASMOSIS

Fuente: Abbott

AGRESOR - ANTIGENOS

Imgenes tomadas de Google

DEFINICIONES

ANTGENO

INMUNGENO

EPTOPE


ANTGENOSINMUNGENOS EPTOPES

SUPERATIGENOS:

CARACTERSTICAS:Se unen externamente al TCR y a las HLA IIActivan hasta un 20% de los LT.Responsables del shock sptico.

Ejemplos:Estafilococo aureus, Estreptococo pyogenes, Yersinias, Micoplasmas, Retrovirus.26/08/1519

Imagen tomada de Google

CONDICIONES PARA LA INMUNOGENICIDAD26/08/1520 ORGEN COMPLEJIDAD ESTRUCTURAL DSIS VA DE ADMINISTRACIN ESTADO FSICO DEL HOSPEDERO


CARACTERSTICAS DE LOS BUENOS INMUNGENOSAdems de la naturaleza qumica, es importante la estructura de la molcula (Primaria, secundaria) a.a terminal, secuenciacin, composicin de las cadenas laterales, entre otros.

Que sean levgiros y que estn cargados electricamente. 26/08/1521

DETERMINANTES ANTIGNICOSO EPITOPES (OS)SECUENCIALES: depende de la estructura primaria.CONFORMACIONALES: depende de la forma tridimensional.INMUNODOMINANTES: son aquellas regiones contra las cuales se produce la mayor parte de los anticuerpos.OCULTOS. se evidencia cuando el antigeno se desnaturaliza.26/08/1522

26/08/1523

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PAMP O PMAPRNA bicatenario que poseen los virus en proceso de multiplicacin.Secuencias de ADN cpg sin metilar, que aparecen en las bacterias.Rasgos propios de las protenas presentes en las bacterias y otros microbios, como su inicio por n-formilmetionina.Lipopolicaridos (LPS) de las bacterias gram negativas.cidos teicicos de las bacterias gram positivas.Oligosacaridos que llevan manosa, existentes en los las glicoprotenas microbianas.


TLR

RELACIONES DE CONVIVENCIAComensalismo.Mutualismo.Parasitismo.26/08/1526DIGA EL CONCEPTO Y DE EJEMPLOS

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SISTEMA INMUNITARIO VS. ENFERMEDADCul es la razn para que algunas personas estando en contacto con los agentes causales de enfermedad, no la desarrollen?26/08/1527


INMUNOGLOBULINAS VS. ANTICUERPOSDEFINICIN.ESTRUCTURA.FUNCIN.ACCIONES.


VsInmunoglobulinas Anticuerpos


ESTRUCTURA DE LA INMUNOGLOBULINA

Fuente: Regueiro

ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS M y A

Fuente: Regueiro

ISOTIPOS DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Fuente: Regueiro

CARACTERSTICAS DE LAS DIFERENTES CLASES DE IGS

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FIG 10-17

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ACCIN DE LOS ANTICUERPOS IN VIVO

INMOVILIZACIN.

OPSONIZACIN.

HEMLISIS.

NEUTRALIZACIN.

CITLISIS.


FUNCIN DE LOS ANTICUERPOS IN VIVO

Fuente: Regueiro

INMUNOENSAYOS

Detectar enfermedades en etapa subclinica.Confirmar diagnstico sospechado clnicamente.Diferenciar enfermedades con similares presentacin clnica.Predecir el pronstico de una enfermedad.vigilar el tratamiento.Precisar factores de riesgo.Apoyar actividades de promocin y prevencin.Detectar y confirmar alteraciones de los mecanismos de defensa.JUSTIFICACIN DE LOS INMUNOENSAYOS

EL MDICO ENVIA AL PACIENTE AL LABORATORIO PORQUENECESITAINFORMACIN, PARA TOMAR DECISIONES ADECUADAS.EN LTIMAS Y EN ESENCIA


BONDADES DE LOS INMUNOENSAYOSEspecificidad.Sensibilidad.Precisin.Rapidez.Versatilidad.Con la ltima generacin: control de calidad en tiempo real; muestras peditricas; autodilucin; software amigable con ayuda permanente y tutorial en lnea; amplio men disponible; reactivos de excelente calidad y con consumo mnimo; manos libres.

ANTGENO + ANTICUERPO

REACCIN VISIBLE.

PRINCIPIO DEL INMUNOENSAYO

ETAPAS DE LA REACCINUNIN DEL ANTIGENO CON EL ANTICUERPO POR INTERACCIN FSICO-QUMICA ENTRE LAS MOLCULAS.

VISUALIZACIN DE LA UNIN.

FUERZAS DE UNIN Ag-Ac

Fuente: Regueiro

FACTORES QUE INCIDENINTRSECOS O INMODIFICABLES Edad-Raza- Gnero. Altitud. Embarazo. Ciclos biolgicos- Cronobiologa Fase de la enfermedad. Memoria inmunolgica. Manipulacin del sistema inmune: Inmunosupresin, vacunacin, Inmunizacin pasiva, inmunopotencializacin.


Temperatura.Ph.Concentracin de electrolitos.Carga Elctrica Agitacin.Tiempo.Proporcin antgeno-anticuerpo.

FACTORES QUE INCIDENEXTRNSECOS O MODIFICABLES

AFINIDAD: se refiere a la energa de enlace potencial contenida en cada uno de los sitios Fab; las interacciones estn determinadas por el nmero y grupos qumicos reactivos, presentes en el sitio de combinacin y por la especificidad del anticuerpo.

VIDEZ: es el grado de ligazn entre el anticuerpo y su respectivo antigeno. De la avidez depender la velocidad con que se visualice la unin antgeno anticuerpo.

Los anticuerpos clase Ig M tienen mayor videz que los de la clase Ig G.DEFINICIN DE CONCEPTOS

HETEROGENEIDAD DE LA RESPUESTA: basada en el hecho de que una molcula de antgeno puede ser capaz de estimular la sntesis de distintas tipos de anticuerpos, de acuerdo al nmero de inmungenos y epitopes que tenga.

REACTIVIDAD CRUZADA: el anticuerpo puede ligarse al epitope que lo origin o a otro similar. Se presenta cuando hay similitud estructural entre los ANTGENOS. DEFINICIN DE CONCEPTOS

OBTENCIN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

Fuente: Regueiro

CLASIFICACIN DE LOS INMUNOENSAYOS CON BASE EN LA SEGUNDA ETAPAREACCIN DE PRECIPITACIN: MEDIO LIQUIDO- FLOCULACIN MEDIO SLIDO CELULOSA: INMUNOPRECIPITACIN. MEDIO SLIDO AGAROSA: INMUNODIFUSIN, IDR, ELECTROINMUNODIFUSIN, INMUNOELECTROFERESIS, CONTRAINMUNOELECTROFORESIS.

CLASIFICACIN DE LOS INMUNOENSAYOS CON BASE EN LA SEGUNDA ETAPAREACCIN DE AGLUTINACIN: ACTIVA. PASIVA.REACCIN DE NEUTRALIZACIN.REACCIN DE HEMLISIS POR FIJACIN DEL COMPLEMENTO.INMUNOENSAYOS DE MARCAJE: ELISA, RIA, QUIMIOLUMINISCENCIA. INMUNOHISTOQUIMICA. INMUNOFLUORESCENCIA. QUIMIOLUMINISCENCIA. CITOMETRIA DE FLUJO.

CLASIFICACIN DE LOS ANTICUERPOS CON BASE EN LA REACCIN VISIBLEAGLUTININAS.PRECIPITINAS.HEMOLISINAS.ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES.ANTICUERPOS FLOCULANTES.ANTICUERPOS FIJADORES DEL COMPLEMENTO.

APLICACIONES

DIAGNOSTICOS FUNDAMENTADOS EN LOS INMUNOENSAYOSDROGAS TERAPEUTICAS Y DE ABUSO: anticonvulsionantes; estimulantes; benzodiacepinas; barbitricos.

ENFERMEDADES AUTOINMUNES: ANA; ANCA; ENA; SSA; SSB; CARDIOLIPINA; GLIADINA; MIELOPEROXIDASA; FACTOR REUMATOIDE; ANTITIROGLOBULINA

DIAGNOSTICOS FUNDAMENTADOS EN LOS INMUNOENSAYOSINFECTOLOGIA: GRUPO TORCHS; MARCADORES DE HEPATITIS; VARICELA; SARAMPIN; PAPERAS; VIH; EPSTEIN BARR; MICOPLASMA; LEGIONELLA; HELICOBACTER PYLORI; B. BURGDORFERI


DIAGNOSTICOS FUNDAMENTADOS EN LOS INMUNOENSAYOSDETERMINACIN DE HORMONAS: TIROIDES, GLNDULAS SUPRARENALES, PANCREAS, GONADAS, PARATIROIDES, CRECIMIENTO Y DESARROLLO.

MARCADORES TUMORALES: AFP; ACE; PSA TOTAL Y LIBRE; BETA HCG; BETA 2 MICROGLOBULINA; CA 15.3; CA125.


CONSIDERACIONESFUNDAMENTALES PARA LA CONFIABILIDADDE LOS RESULTADOS EN EL LABORATORIO CLNICO

APLICABILIDAD:OPORTUNIDAD.COSTO.SEGURIDAD.COMPLEJIDAD.CONFIABILIDAD:SENSIBILIDAD.ESPECIFICIDAD.EXACTITUD.PRECISIN.SELECCIN DE LAS PRUEBAS

ESPECIFICIDAD Son tiles para confirmar un diagnstico sugerido por otras pruebas. La especificidad hace que casi no se obtengan resultados positivos, cuando la enfermedad est ausente. No debe producir Falsos Positivos (FP). Su utilidad es mayor cuando es positivo. Capacidad de la prueba De detectar y cuantificar el analito en estudio sin dar falsos positivos. Proporcin de individuos sanos, que son identificados correctamente por la prueba.

Es usualmente positivo en presencia de la enfermedad, an en etapas tempranas.No debe dejar por fuera de la deteccin ningn positivo.Puede tener falsos Positivos (FP)Son tiles cuando la probabilidad de la enfermedad es baja y el fin es descubrirla.Su utilidad es mayor cuando es negativa. Capacidad de la prueba de detectar concentracionesMnimas de un analito.

Proporcin de individuos con la enfermedad que son identificados correctamente por la prueba.

SENSIBILIDAD

Condiciones de las Muestras para los anlisis Homognea Representativa Sin cambios qumicos, fsicos ni microbiolgicosCadena de froSeguridad Preservacin

TCNICAS

PRECIPITACIN FUNDAMENTO La reaccin ocurre por la interaccin que se da entre un antgeno y un anticuerpo, siendo los dos macromolculas solubles.

Precipitacin

Consisten en la formacin de un precipitado visible (insolubilizacin) cuando se encuentra un Ag y sus Acs homlogos en solucin formando el complejo Ag+Ac

CARACTERSTICAS- Reacciones muy especficas, aunque poco sensibles.Aplicacin en investigacin, - Realizacin en m. lquido, o mas frecuentemente en medio slido en geles de agar o acetato de celulosa.

REACCIN DE PRECIPITACIN

Tipos de Reacciones de Precipitacin

2.- Inmunodifusin doble en placa ( Ouchterlony) Enfrentamiento de los componente inmunes en un gel de agar. La difusin cruzada de los reactivos da lugar a bandas o lneas de precipitacin. Muy til para estudio de la semejanza o similitud de antgenos

1.- Inmunodifusin simple en placa ( Mancini) El Ag o el antisuero se incorpora a la agarosa fundida Una vez solidificada se coloca el suero o el Ag en pocillos tallados en la capa de agarosa. Se produce una difusin radial del componente situado en el pocillo, que da lugar a una lnea de precipitacin circular de dimetro proporcional a la concentracin del mismo

3.- InmunoelectroforesisMtodo que combina la electroforesis del Ag con una tcnica de precipitacin en gelAparicin de bandas de precipitacin (una por sistema Ag-Ac) de localizacin y morfologa caractersticas.Poco uso en inmunodiagnstico

Tipos de Reacciones de Precipitacin

4.- Contrainmunoelectroforesis o electrosinresisEnfrentamiento del Ag y del suero en un gel de agar favorecido porel efecto de la corriente elctricaMigracin cruzada y acelerada. Presencia de lneas de precipitacin.

SueroAntgeno 1Antgeno 6Antgeno 5Antgeno 4Antgeno 3Antgeno 2Doble difusin en gel(Ouchterlony) Post-coloracinCada lnea de pp= un sistema Ag-Ac

FIG 15-7

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Anti-Ig (Ac)

Ag (Ig)Precipitacin en Agarosa

INMUNODIFUSIN LINEAL

AgAgAgAgAc

AgX

AcX

AcXAgXAgX

AcXY

AgXAgY IDENTIDADIDENTIDAD PARCIALSIN IDENTIDADINMUNODIFUSIN LINEAL

INMUNODIFUSIN RADIAL

Fuente: Regueiro

APLICACIN DE LA IDRCuantificar las inmunoglobulinas y otras protenas plasmticasDiagnostico de Inmunodeficiencias primarias o secundariasHipogammablobulinema severaParasitosis tisularesEnfermedades linfoprolifertivasHepatopatasLES

INMUNOPRECIPITACIN

INMUNOTRANSFERENCIA O WESTERN BLOTSe fundamenta en una electroforesis de protenas en geles de acrilamida y su posterior transferencia a un soporte slido (nitrocelulosa o nylon).

La identificacin de las protenas a estudiar se realiza por incubacin de la membrana o soporte con anticuerpos especficos marcados con enzimas o isotopos radioactivos.

WESTERN BLOT

Fuente: Regueiro

REACCIN DE AGLUTINACIN FUNDAMENTO: Cuando la accin del Anticuerpo est dirigida a epitopes, que estn en la superficie de clulas o hacen parte de membranas de microorganismos, el Anticuerpo produce la agregacin de las diferentes clulas, dando lugar a la aglutinacin.

REACCIN DE AGLUTINACIN

Reaccin de AglutinacinPrueba de aglutinacin de ltex

PRUEBA DE COOMBSCon frecuencia los anticuerpos se unen a los epitopes de la superficie de los eritrocitos, pero no pueden formar la malla de la aglutinacin. La presencia de estos Acs se pueden poner en evidencia usando un Ac contra la IgG humana, el cual es producida en el conejo.

OBTENCIN DEL SUERO DE COOMBS

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PRUEBA DE COOMBS

APLICACIN CLNICA DETECTAR CANTIDADES NO AGLUTINANTES DE ANTICUERPOS ANTIERITROCITOS. DIAGNSTICO DE:ANEMIAS HEMOLTICAS AUTOINMUNES. ERITROBLASTOCIS FETAL. EN BANCO DE SANGRE: RASTREO DE ANTICUERPOS. PRUEBA CRUZADA. VARIANTE DU

AGLUTINACIN PASIVA FUNDAMENTO: Cuando los dos reaccionantes son solubles, se puede transforma una reaccin de precipitacin en una da aglutinacin usando partculas de ltex, carbn o Bentonita a las que se adhieren ya sea el antgeno o el anticuerpo. De esta manera se podr detectar en el suero de los paciente las molculas que se comportan como antgeno o como anticuerpos.

APLICACIN CLNICA Dada la sencilles y rpidez con que se realizan estas pruebas, son catalogadas la mejor opcin en el Inmunodiagnstico de baja complejidad. Son tiles para apoyar el diagnstico de la PCR, el FR, anticuerpos antiestreptolisina O determinacin de HGC, tamizaje para sfilis (RPR)

PRUEBAS

DE

AGLUTI-NACIN

PASIVA

AGLUTI-NACIN PASIVA

CONSIDERACIONES TCNICAS DE LAS PRUEBAS DE AGLUTINACIN PASIVANO SON PRUEBAS CUANTITATIVAS.

REQUIEREN DE CANTIDAD SUFICIENTE DEL ANALITO, POR ELLO UN REPORTE NEGATIVO, NO DESCARTA PATOLOGA.

FIJACIN DEL COMPLEMENTO1. Actividad hemoltica total (CH50 CH100)2. Cuantificacin individual de C3, C4 y C1q esterasa inhibidoraC3

C4

C3 y C4 = normalesActividad total

Indica activacin sostenida del sistema, por cualesquiera de las tres vas.Indica que la activacin del sistema est ocurriendo por la va alterna o lectinas.

Dosificar individualmente los dems factores

FIJACIN DE COMPLEMENTO

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Thank You !Eva Blanco Molinares

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