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TÉCNICAS BASADAS EN LA REACCIÓN

ANTÍGENO-ANTICUERPO

Inmunología 05

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Interacción Ag-Ac

Diferentes interacciones no covalentes débiles

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4

Acercamiento ( 1 angstrom ) y complementariedad Ag y Ac

Especificidad

Ensayos inmunológicos

Ag o Ac Moléculas

Diagnóstico Rta. humoral

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Afinidad del Ac : fuerza de unión Ac-Ag

Ag + Ac Ag-Ac k1 / k-1 = Ka

K1

K-1

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Acs. baja afinidad ( 104 y 105) unen Ag debilmente

Acs. alta afinidad ( 1011) unen Ag fuertemente

Ka Diálisis en equilibrio

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A BA B

Inicial Equilibrio

Inicial Equilibrio

Ac Ligando * Equilibrio # [ligando radioactivo] en los dos compartimientos Lig-

Ac

Diálisis en equilibrio

Equilibrio [ligando radioactivo] es igual en los dos compartimientos

A B A B

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Avidez: fuerza de interacción múltiple entre un Ac multivalente y

un Ag complejo

Afinidad funcional

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Ag1Especificidad Ac Ag2 Ag3

Ag1Reacción cruzadaAc

Ag2

Reacciones Ag-Ac especificidad

Epítopo

Sistema ABO

Exposición Ags bacterianosA A Anti-B

B B Anti-A

AB A y B Ninguno

O Ninguno Anti-A / B

A A Anti-B

B B Anti-A

AB A y B Ninguno

O Ninguno Anti-A / B

Tipo Ag Gr Acs séricos

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Reacciones de precipitación• Interacción Ag-Ac malla precipitado

• Ac divalente y Ag di-polivalente

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Ag-Ac solubles

Cambiar solubilidad Anti-Inmunoglobulina

2% PEG 50% Sulfato Amonio Ac para Ig Proteína A

Reacciones de precipitación en solución

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K F6.6

Reacciones de precipitación en geles

Usos: [ Ag ] o [Ac ], pureza preparación antigénica , comparación Ags

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Reacciones de precipitación en geles

Ensayo cuantitativo [ Ag ]

Área anillo precipitación [ Ag ]

Curva patrones de concentración conocidos

Ensayo cualitativo Ag

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Identidad

Antisuero anti-A

Ag epítopo A

AA

AA

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Separación por electroforesis + Identificación por Inmunodifusión doble

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Cuantitativa

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.- Coomb’s (Rh)

.- Aglutinación pasiva: Ags solubles Ag soluble + Gr tto Ac. Tánico o Cloruro de cromio.- Inhibición de aglutinación: sensible para [Ag]

Reacciones AglutinaciónInteracción Ac y Ag particulado: GR o bacteria efecto prozona

( Ac, Acs. incompletos )

Ventajas: simple, económico, ng/ml

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Radioinmunoensayos ( RIA )Técnica muy sensible para detectar Ag o Ac .

Unión competitiva entre Ag* y Ag por Ac de alta afinidad

Desventajas: pérdida de sensibilidad durante el almacenamiento radioactividad, deterioro marcaje y precausiones exposición humana a radioactividad

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E L I S A

Quimioluminiscencia: Substrato luxogénico Sensibilidad (5. 10 –18

M Ag)

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Western Blotting

Identificar proteína

Ag Ac

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Inmunoprecipitación Ags (células o Tejidos) Su uso posterior

Ag-Ac precipitado Perlas + Ac , Perlas + proteina A o G, perlas magnéticas/Ac

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Fluorescencia1944, A. Coons Acs conjugados fluorocromos

Fluorescencia Directa Indirecta (Ac primario) (Ac. Secundario)

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Fluoresceína, Rodamina, Ficoeritrina

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Citometría de Flujo (FACS)

Cuantitativa

Automáticamente analizar y

separar células teñidas Ac

fluorescente

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Aplicaciones:

.- Determinar tipo y número de poblacion de GB separar

.- Densidad de un Ag en una misma población de cel.

.- Tamaño cel.

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OroFerritinaRadioE’s

DAB

OroMicroscopía Inmunoelectrónica:Componentes intracelulares Acs conjugados a marcadores electrodensos

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Purificación de Antígenos / Anticuerpos Cromatografía de Afinidad

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FIJACION DE COMPLEMENTODetectar Ag o Ac (suero) utilizando una fuente de

C' y un sistema indicador (GR carnero sensibilizados)

• Controles:.- Suero + No hemólisis.- Suero Neg. Hemólisis.- Gr solos Lisis espontánea.- Suero en estudio – Ag + C' + GR: Lisis.- Ag – Suero en estudio + C' + GR Lisis

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