inno-lia hcv score

8/15/2019 Inno-lia Hcv Score

http://slidepdf.com/reader/full/inno-lia-hcv-score 1/88

25428 v02004-01-23

* INNO-LIA™ is a Trademark of Innogenetics N.V.

INNO-LIA™* HCV Score

I n n o g e n e t i c s

©

2 0 0 4

0459

Manufactured by:

INNOGENETICS N.V.Technologiepark 69052 GhentBelgium+32-9 329 13 29

Distributed by:

INNOGENETICS GmbHLembecker Straβe 1946359 Heiden (Westfalen)Germany+49-2867 99 07 0

INNOGENETICS s.a.r.l.8, Rue du Maréchal de Lattre-de-Tassigny59800 LilleFrance+33-1 49 93 26 18

INNOGENETICS S.r.lVia del Mare 3600040 Pomezia (Roma)Italy+39-06 911 80 375

INNOGENETICS Diagnostica y Terapeutica(IDT) S.A.Calle Botánica 14608908 Hospitalet de Llobregat (Barcelona)Spain+34-93 600 8000

INNOGENETICS N.V.Technologiepark 6

9052 GhentBelgium+32-9 329 13 29



INNOGENETICS®* 2

*INNOGENETICS® is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.

TABLE OF CONTENTS

Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

English

Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7Test principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

Description, preparation for use and recommended storage

conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10Specimen (collection and handling) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11

Test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11Directions for washing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

Directions for incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

Automated test procedure: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

Reading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

Interpretation of the results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17

Interpretation software: LiRAS™ for Infectious diseases . . . . . . .17

Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

Sensitivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

Specificity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19

Reproducibility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

Français

But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

Réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21Description, préparation et conditions de conservation . . . . . . . .21

Materiel necessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22Consignes de sécurité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22Echantillons (recueil et manipulation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23Remarques et précautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Procédure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

Directives de lavage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Directives pour incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

Procédure automatisée: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

Lecture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29



Interprétation des résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

Logiciel d'interprétation: LiRAS™ Maladies infectieuses . . . . . . .30

Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Sensibilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

Spécificité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Reproductibilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33

Deutsch

Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34

Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit . . . . . . . .34

Zusätzlich benötigte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

Sicherheitshinweise und Entsorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35Herstellung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36Hinweise und Vorsichtmaßnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37Waschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39

Inkubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

Ablesen der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 Interpretation der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43

Interpretationssoftware: LiRAS™ für Infektionskrankheiten . . . . .43

Einschränkungen des Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44Leistungsfähigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

Sensitivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

Spezifität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

Italiano

Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione

raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47

Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49Campioni (raccolta e trattamento) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50Procedura del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50Indicazioni per il lavaggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52

Indicazioni per l'incubazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52

Procedura automatica del test: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53

3 INNO-LIA™ HCV Score



Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55Lettura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55

Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55

Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

Software di interpretazione: LiRAS™ per malattie infettive . . . . .56

Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

Sensibilità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57

Specificità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58

Riproducibilità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59

Español

Finalidad de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59Principio del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59

Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60Descripción, preparación para el uso y condiciones de

almacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60

Materiales necesarios que no se suministran . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61Muestra (recogida y manejo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63Procedimiento del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63

Instrucciones para el lavado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65

Instrucciones para la incubación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . .66Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68

Lectura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68

Validación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68

Interpretación de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69

Software de interpretación: LiRAS™ para enfermedades

infecciosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69

Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70

Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70

Especificidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71

Reproducibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72

Português

Utilização . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72Princípio do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73

Descrição, preparação para utilização e condições recomendadasde conservação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73

Material necessário não fornecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74Segurança e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75

Amostra (recolha e manuseamento) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76

INNOGENETICS® 4



Limites e precauções . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76Procedimento do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77

Instruções de lavagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

Instruções de incubação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79

Procedimento de teste automatizado: Auto-LIA™ . . . . . . . . . . . . . . . .79

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81Leitura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81

Validação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81

Interpretação dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82

Software de interpretação: LiRAS™ para doenças infecciosas . .83

Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83Desempenho do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

Especificidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85

Reprodutibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85

Symbols used

Manufactured byFabriqué par Hersteller Prodotto daFabricante

Fabricado por In vitro diagnostic medical devicePour In vitro diagnosticHilfsmittel für medizinische in-vitro-DiagnostikDispositivo medico-diagnostico in vitro

Material médico para diagnóstico in vitro

Dispositivo médico de diagnóstico in vitro

Lot number Numéro de lotChargennummer Numero di lottoNúmero de lote

Catalogue number Référence catalogueKatalognummer CodiceNúmero del catálogo

Número de catálogo




Use byUtiliser jusqu'auVerwenden bisUtilizzare entroFecha de caducidad

Utilizado por Consult instructions for useInstructions d'emploiBedienungsanleitung lesenConsultare le istruzioni per l'usoConsulte las instrucciones de usoConsultar instruções de utilização

Biological risk

Risque biologiqueBiologische GefährdungRischio biologicoRiesgo biológicoRisco biológico

Temperature limitsTempérature de stockageTemperatur genau einhaltenLimiti di temperatura

Límites de temperaturaLimites de temperatura

Contains sufficient for < X > testsConditionnement suffisant pour < X > testsInhalt ausreichend für < X > TestsContenuto sufficiente per < X > testContiene suficientes reactivos para < X > ensayosContém reagente suficiente para < X > testes

Negative ControlContrôle négatif NegativkontrolleControllo negativoControl negativoControlo negativo

Positive ControlContrôle positif

PositivkontrolleControllo positivoControl positivoControlo positivo

INNOGENETICS® 6



StripsBandelettesTeststreifenStrisceTiras

Sample DiluentDiluant échantillonProbenverdünner Diluente del campioneDiluyente de la muestraDiluente da amostra

Wash Solution 5xSolution de lavage 5x

5x konzentrierte WaschlösungSoluzione di lavaggio 5xSolución de lavado 5xSolução de lavagem 5x

Ready-to-use ConjugateConjugué prêt à l'emploiGebrauchsfertiges KonjugatConiugato pronto all'usoConjugado listo para usar

Conjugado pronto a utilizar Ready-to-use Substrate BCIP/NBTSubstrat BCIP/NBT prêt à l'emploiGebrauchsfertiges BCIP/NBT-SubstratSubstrato BCIP/NBT pronto all'usoSustrato BCIP/NBT listo para usar Substrato BCIP/NBT pronto a utilizar

Stop Solution

Solution d'arrêtStopplösungSoluzione di stopSolución de paradaSolução de paragem

English

Intended use

The INNO-LIA™ HCV Score is a Line Immuno Assay (LIA), for the detectionof antibodies to human hepatitis C virus in human serum or plasma.It is intended for use as a supplementary test on human serum or plasmaspecimens found to be reactive using an anti-HCV screening procedure.




Test principle

The INNO-LIA™ HCV Score is a 3rd generation line immunoassay whichincorporates HCV antigens derived from the core region, the E2 hypervariableregion (HVR), the NS3 helicase region, the NS4A, NS4B, and NS5A regions.

The antigens were coated as 6 discrete lines on a nylon strip with plasticbacking. In addition, four control lines are coated on each strip: streptavidincontrol line, 3+ positive control (anti-human Ig), 1+ positive control (human IgG),and the ± cut-off line (human IgG).

The INNO-LIA™ HCV Score is based on the principle of an enzymeimmunoassay. A test sample is incubated in a trough together with the LIA teststrip. If present in the sample, HCV antibodies will bind to the HCV antigenlines on the strip. Subsequently, an affinity-purified alkaline phosphatase-

labelled goat anti-human IgG (H+L) conjugate is added and reacts with specificHCV antigen/antibody complexes, if previously formed. Incubation with theenzyme substrate produces a chestnut-like color, the intensity of which isproportionate to the amount of HCV-specific antibody captured from the sampleon any given line (Fig. 1). Color development is stopped with sulfuric acid.

Reagents

Description, preparation for use and recommended storage conditions

- If kept at 2 - 8°C, opened or unopened, all reagents are stable until theexpiration date. Do not freeze reagents.

- All reagents and the plastic tube containing the test strips must be broughtto room temperature (18 - 25°C) approximately 30 minutes before use andreturned to the refrigerator (2 - 8°C) immediately after use.

- Alterations in the physical appearance of kit reagents may indicateinstability or deterioration.

- After opening the original tube containing the strips, any unused strip

will be stable for 16 weeks if stored at 2 - 8°C in the closed original tubewith desiccant.

Reagents supplied:

Component Quantity Ref. Description

Strips 20 57329 Containing 20 INNO-LIA™ HCV antigen-coated test strips.

Sample Diluent 30 ml 57304 Containing color-coded (green) phosphatebuffer containing sodium chloride,

detergent, bovine protein stabilizers and0.3% chloroacetamide (CAA) aspreservative.

INNOGENETICS® 8



Ready-to-use Conjugate 45 ml 57301 Containing color-coded (red) goat anti-human IgG labeled with alkalinephosphatase in Tris buffer containingbovine stabilizers, detergent and 0.01%methylisothiazolone (MIT)/0.1% CAA aspreservative.

Negative Control 0.12 ml 57307 Containing basematrix of human originwith 0.01% MIT/0.1% CAA aspreservative.

Positive Control 0.12 ml 57308 Containing inactivated human serumpositive for antibodies to HCV with0.01% MIT/0.1% CAA as preservative.

Ready-to-use BCIP/NBT 45 ml 57302 Containing 5-bromo-4-chloro-3-indolylSubstrate phosphate/nitroblue tetrazolium in

dimethyl formamide, with 0.01% MIT/

0.1% CAA as preservative.Stop Solution 45 ml 57303 Containing 0.1 mol/l sulfuric acid.

Wash Solution 45 ml 57299 Containing color-coded (blue) Tris buffer containing sodium chloride, detergentand 0.02% bromo-nitro-dioxane aspreservative, to be diluted 5x in distilledwater. Diluted wash solution is stable for 2 weeks if kept at 2 - 8°C.

Incubation tray 2 - With 11 troughs each.

Adhesive sealers 5 -Data reporting sheet 1 - For storage of developed strips.

Reading card 1 - For identification of reactive antigen lines.

Materials required but not provided

- Distilled or deionized water.- Precision pipettes (with disposable tip) capable of delivering 10 µl,

20 - 200 µl, and 200 - 1000 µl, respectively.

- Orbital shaker or rocker (see Directions for incubation).- Vortex mixer or equivalent.- Graduated cylinders: 10, 25, 50 and 100 ml.- Tweezers for strip handling.- Timer.- Optional:

• hot air fan (hair dryer) or dry incubator at 37°C• a repetitive pipette together with disposable vials for the addition of

sulfuric acid, conjugate, substrate and wash solution

• vacuum aspirator which contains 5% sodium hypochlorite solutionin a waste bottle.




Safety and environment

- Please refer to the safety data sheet and product labeling for information on potentially hazardous components.

R43, S24-37Irritant! (Xi) Avoid contact with skin. May cause sensitization by skincontact. Wear suitable gloves.Contains 2-Chloroacetamide: Sample Diluent, Ready-to-use Conjugate,Ready-to-use BCIP/NBT Substrate and Negative Control.

- Specimens, Positive and Negative Control should always be handled as

potentially infectious.- The Positive Control has been found to be negative for anti-HCV andHbsAg. The Negative Control has been found to be negative for anti-HIV-1/HIV-2, anti-HCV and HbsAg. No test method can offer completeinsurance that blood products will not transmit infectious agents.Therefore, all blood components and biological materials should beconsidered as being potentially infectious and should be handled assuch. Only adequately trained personnel should be permitted to performthe test procedure. All blood components and biological materials should

be disposed of in accordance with established safety procedures.• Autoclave for at least 15 minutes at 121°C.• Incinerate disposable material.• Mix liquid waste with sodium hypochlorite so that the final

concentration is ± 1% sodium hypochlorite. Allow to stand overnightbefore disposal. C AUTION: Neutralize liquid waste that contains acidbefore adding sodium hypochlorite.

- Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safetyspectacles when manipulating dangerous or infectious agents.

- Waste should be handled according to the institution's waste disposalguidelines. All federal, state, and local environmental regulations shouldalso be observed.

- Do not aspirate the stop solution in a waste bottle, which containssodium hypochlorite.

Specimen (collection and handling)

- The INNO-LIA™ HCV Score may be performed on human serum or plasma collected in tubes containing citrate, heparin or EDTA asanticoagulants.

- Before storage, serum or plasma should be separated from blood clotor blood cells by centrifugation.

INNOGENETICS® 10



- Store the specimens at 2 - 8°C. For storage longer than one week,freeze at -20°C or lower.

- Do not use heat-treated specimens.- Repeatedly (more than 3 times) frozen and thawed samples may

produce erroneous results.

Remarks and precautions

- Do not use the kit beyond the expiration date.- Do not mix reagents with different lot numbers.- Make sure correct sample volume and washing times are used for

the test procedure needed.- Avoid microbial contamination of reagents.- Ensure that the samples and controls are homogeneous before use.- Do not touch the membrane of the strip. Always manipulate the strips

with the plastic backing.- Use a new pipette tip for each specimen.- Make sure that the test strips are placed in the troughs with their

membrane side facing upwards.- All incubation steps should be performed using an orbital shaker or

rocker (use rocker only for overnight sample incubation).The shaking of the solutions over the strips is important in achievingeven line staining and maximum sensitivity. During shaking, the strip

surface should be completely submerged.- Cover the troughs with an adhesive sealer to avoid drying of the stripsduring the overnight sample incubation.

- Unused and developed strips should be kept away from strong light andheat.

- The kit should only be used by personnel trained in clinical laboratorypractices.

- Re-use of strips or troughs will result in erroneous results.- Cutting strips will result in erroneous interpretation of the results.

Test procedure

Please read Remarks and precautions before performing the test.

- 16 hours sample incubation

1. Use the required amount of test troughs, taking into account that for each test run, a Positive and a Negative Control should be assayed.Identify test troughs as controls and specimens, and place them in the tray.

2. Add 1 ml of Sample Diluent to each specimen test trough.3. Add 10 µl of the appropriate specimen or control to the appropriatelylabelled trough.




4. Remove the required amount of LIA test strips from their container, andadd one strip to each of the test troughs. The test strip is placed membraneside upwards into the trough using tweezers.THE STRIP MUST BE COMPLETELY SUBMERGED.

5. Cover the troughs with an adhesive sealer (see Remarks and precautions).

Incubate the samples by placing the tray on a shaker or rocker (seeDirection for incubation) and agitate OVERNIGHT (16 ± 2 h) at roomtemperature (18 - 25°C).NOTE:• Carefully remove the adhesive sealers to avoid cross-contamination.

6. Wash each test strip 3 times (5 minutes) with 1 ml Wash Solution(see Directions for washing).

7. Add 1 ml of Conjugate Solution to each test trough.8. Incubate with the conjugate by placing the test tray on the shaker or

rocker and agitate for 30 minutes at room temperature (18 - 25°C).9. Wash each test strip 3 times (5 minutes) with 1 ml Wash Solution

(See Directions for washing).10. Add 1 ml of Substrate Solution to each test trough.11. Incubate with the substrate by placing the test tray on the shaker or

rocker, and agitate for 30 minutes at room temperature (18 - 25°C).12. Aspirate liquid. Add 1 ml of Stop Solution to each trough.13. Incubate with the stop solution by placing the test trough on the shaker or

rocker, and agitate for 10 - 30 minutes at room temperature (18 - 25°C).

14. Aspirate Stop Solution.15. Remove the strips from the test troughs and place them, membrane

side upwards, on absorbent paper using tweezers. As soon as the stripshave dried completely, results can be interpreted. To accelerate the dryingprocess, place strips in a dry incubator at 37°C for 30 minutes or use ahot air fan for 1 minute. Developed strips will retain their color if stored inthe dark.

- 2 and 3 hours sample incubation

For the "2 hours and 3 hours sample incubation" protocol the same 15 stepsas for the test procedure "16 hours sample incubation" will be followed, butchanges to steps 3 - 5 - 6 and 9 have to be taken into account. Samplevolume for specimens and controls will increase from 10 to 20 µl (step 3) andsample incubation time changes to 2 and 3 hours (step 5). Washing after sample incubation changes for the 2 hours procedure to 3 times 10 minutesand for the 3 hours procedure to 3 times 6 minutes (step 6); finally the secondwashing is 3 times 3 minutes for the 2 and 3 hours sample incubation.

INNOGENETICS® 12



Summary test procedures with highlighted differences (bold), given infollowing table:

16 hours sample 2 hours sample 3 hours sampleincubation incubation incubation

Sample Diluent 1 ml 1 ml 1 mlSpecimen 10 µl 20 µl 20 µlControls 10 µl 20 µl 20 µlLIA test strips 16 hours ± 2 hours 2 hours 3 hoursWashing 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 10 min 1 ml/3 x 6 minRTU* Conjugate 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minWashing 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 3 min 1 ml/3 x 3 minRTU* Substrate 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minStop Solution 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min

*RTU = Ready-to-use

Directions for washing

- After overnight, 2 hours and 3 hours incubation, carefully remove theadhesive plate sealer.

- The liquid is aspirated from the trough with a pipette, preferentiallyattached to a vacuum aspirator, which contains 5% sodium hypochloritesolution in the waste bottle.The tray is held at an angle to allow all liquid to flow to one side of the

trough (to the uncoated plastic backing part of each strip).- Add 1 ml of diluted wash solution to each trough and agitate for 1 minuteon a shaker or rocker.

- Repeat these steps as many times as indicated in the assay procedure.NOTE:• Do not allow the strips to dry between the washing steps.• Make sure not to damage the surface of the LIA test strips when

aspirating.• Make sure the entire strip is thoroughly washed by complete

submersion in the washing solution.• Adapt the speed of the shaker or rocker when necessary.

Directions for incubation

- All the incubation steps (sample, conjugate, substrate, and sulfuric acidincubation) and also the washing steps should be performed on ashaker or rocker (use rocker only for overnight sample incubation).

- During incubation and washing steps, the strip surface should becompletely submerged, with the membrane side facing upwards.

- The shaker or rocker should allow a reciprocal (to- and- fro) motion of the strips in the trough, and a movement of the liquid over the stripswithout spilling over the trough.




INNOGENETICS® 14

- The speed generated by an orbital or longitudinal shaker or rocker iscritical in achieving even line staining and maximum sensitivity.Recommendations for an orbital shaker :• diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm• recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm• recommended speed for a 24 mm circular motion is 90 rpm.Recommendations for a rocker :• the difference between highest and lowest point should not exceed 80 mm to

avoid spilling of liquid• recommended speed is 34 rpm.

Automated test procedure: Auto-LIA™

The LIA test procedure can easily be automated using the Auto-LIA™automate. This instrument is a walk-away system with automated aspiration,pipetting, and incubation. For more information on the Auto-LIA™, pleasecontact Innogenetics or your local distributor.

Please read Remarks and precautions before performing the test.

Detailed Auto-LIA™ procedures- 16 hours sample incubation Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 960 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 6 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 6 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 6 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 4

14. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP

24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END




- 2 hours sample incubation Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 120 min, shake speed 4

5. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 4

16. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 4

26. ASP27. END

CH1 = Sample DiluentCH2 = Wash SolutionCH4 = ConjugateCH5 = Stop SolutionCH6 = Substrate

- 3 hours sample incubation Auto-LIA™

For the "3 hours sample incubation" protocol the same 27 steps as for thetest procedure "2 hours sample incubation" will be followed, but changes tosteps 4 - 6 - 8 and 10 have to be taken into account. Sample incubation timechanges to 180 minutes for the 3 hours procedure (step 4) and washing after 3 hours sample incubation changes to 3 times 6 minutes (steps 6 - 8 - 10).



Results

Reading

The identity and location of the antigens and controls coated on the strip areas follows:

Figure 1: INNO-LIA™ HCV Score test strip

The intensity of the reaction on the control lines on each strip is used toassign the reactivity ratings for each antigen on that strip:

Intensity of antigen line reaction (R) Rating

Lower than ± R < ± -Equal to ± R = ± ±Higher than ±, but lower or equal to 1+ ± < R = 1+ 1+Higher than 1+ but lower than 3+ 1+ < R < 3+ 2+Equal to 3+ R = 3+ 3+Higher than 3+ R > 3+ 4+

A reactivity rating must be made separately for each strip. To facilitate theinterpretation, a reading card is enclosed. The alignment of the developedstrip with the 3+ control line on the reading card makes the identification of the lines easier.

StreptavidinLevel 3+, anti-human Ig, strong positive

Level 1+, human IgG, moderate positiveLevel +/-, human IgG, weak positive

HCV antigens

C1

C2

E2

NS3

NS4

NS5

I.D.n°

INNOGENETICS® 16



Validation

Check the validity of the positive and the negative control strips and thevalidity of the control levels on each strip before reading the test results.

Validation of the test run:

1. The positive control strip must show a reaction of at least 1+ on C1, C2,NS3 and NS4 antigen line. The E2 and NS5 antigen line may show anegative rating.

2. The negative control strip must show a negative rating (no reaction atall or at least less than control level ± for all the HCV antigen lines).

Validation of a single strip:

1. The control levels 1+ and ± as well as the strong positive control level3+ should be visible.

2. The intensity of the control level 3+ should be greater than that of level1+ and the intensity of the level 1+ should be greater than that of level ±.

3. The control line for anti-streptavidin should have a negative rating.NOTE:• The strip must be completely dried to avoid any misinterpretation

due to faintly visible bands appearing after addition of stop dilution.• Do not place paper on top of the strips as long as they are wet.• Weak control bands can be observed for samples containing high

IgG levels (above the normal IgG range).Interpretation of the results

Extensive evaluations have shown that results may be interpreted as follows:

A sample is NEGATIVE for HCV antibodies:- if all HCV antigen lines have a negative reactivity rating- if only one HCV antigen line has a reactivity of ±, except when the

reactivity is observed for NS3.

A sample is POSITIVE for HCV antibodies:- if at least two HCV antigen lines have a reactivity of ± minimum or higher.

A sample is considered INDETERMINATE for HCV antibodies:- if one HCV antigen line has a reactivity rating of 1+ or higher - if the NS3 line reacts with a reactivity of ± or higher and all other antigen

lines are negative.

Interpretation software: LiRAS™ for Infectious diseasesThe LiRAS™ for infectious diseases software is designed to assist with theinterpretation of the LIA results. Please contact your local distributor to obtainthe latest updated version.




W ARNING:- Do not use the automated interpretation without taking into account the

limitations of the procedure mentioned below.

Limitations of the procedure

- The protocol provided must be strictly followed to obtain optimalperformance of the assay.

- Samples with a single +/- reactivity or higher on NS3 can be indicativefor HCV seroconversion. They are therefore scored as indeterminate.

- If an INDETERMINATE result is obtained, it is recommended to test anadditional patient sample after a few weeks.

- A sample giving a positive reaction on the streptavidin control line maygive cross-reactions with other HCV antigens lines and can not bedetermined as positive for HCV antibodies.

- Anti-HCV antibodies may be undetectable in early infection.- In a hemodialyses setting antibodies may be undetectable.- The use of diluted samples may give erroneous results.- Parameters for assessing liver damage and HCV RNA positivity should

be further investigated in HCV antibody-positive subjects before initiatingtreatment or invasive procedures.

Test performance

Sensitivity

Seroconversion panels/low-titer panelsThe results of the INNO-LIA™ HCV Score using the Auto-LIA™ 2-hour sample incubation procedure and the manual 16-hour sample incubationprocedure were obtained internally on 13 BBI seroconversion panels (PHV904 till 916), on 2 BBI low titer panels (PHV103 and 204), and on theSFTS94 panel. These results were compared with CHIRON® RIBA® HCV3.0 SIA and INNO-LIA™ HCV Ab III update results.

INNO-LIA™ HCV Score using the 2-hour and the 16-hour sample incubationprocedure detected antibodies earlier than CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA in7 panels, and 4 panels became positive at the same time. CHIRON® RIBA®

HCV 3.0 SIA detected antibodies earlier than INNO-LIA™ HCV Score usingboth sample incubation procedures in one panel. One panel did not becomepositive with any of these tests.

The INNO-LIA™ HCV Score using the 2-hour procedure detected antibodiesearlier than INNO-LIA™ HCV Ab III update in 2 panels, and the other 10 panels

became positive at the same time. Using the 16-hour procedure, 4 panelsbecame positive earlier than INNO-LIA™ HCV Ab III update, 7 panels becamepositive at the same time, and one panel became positive later.

INNOGENETICS® 18



On the 40 samples within the 2 BBI low-titer panels, 28 and 32 sampleswere positive on INNO-LIA™ HCV Score using the 2-hour and 16-hour sample incubation procedures, respectively. Thirty-five of these sampleswere positive with CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA, while 34 were positiveusing the INNO-LIA™ HCV Ab III update. All positive samples with

CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA or with INNO-LIA™ HCV HCV Ab III updatewere positive or indeterminate using the INNO-LIA™ HCV Score.

On the 49 samples within the SFTS94 panel, 38, 41, and 40 samples scoredpositive with INNO-LIA™ HCV Score using the 2-hour and the 16-hour sampleincubation procedures, and with INNO-LIA™ HCV Ab III update, respectively.Thirty-one of these samples were found to be positive with the CHIRON®

RIBA® HCV 3.0 SIA.

HCV-positive samples A total of 257 samples, originating from HCV-infected patients and found to bepositive on 2 screening assays and on INNO-LIA™ HCV Ab III update, wereanalyzed internally on the INNO-LIA™ HCV Score using the Auto-LIA™ 2-hour sample incubation procedure. All samples scored positive, with the exception of a single sample which scored indeterminate, resulting in a sensitivity, uponinclusion of the single indeterminate result, of 100% (257/257).

Different genotypesThe INNO-LIA™ HCV Score using the Auto-LIA™ 2-hour sample incubation

procedure was performed internally on 15 samples of genotype 1a, 15 of 1b,15 of genotype 2, 15 of genotype 3a, 15 of genotype 4a, 5 of genotype 4 non-a, and 5 of genotype 5. All samples scored positive, resulting in a sensitivity of 100% (85/85).

Specificity

Blood donors A total of 400 blood donors found to be negative for HCV antibodies were

analyzed internally using the manual 16-hour sample incubation procedure. After initial testing, 377 samples were scored negative, 22 samples scoredindeterminate, and one sample scored positive, resulting in an initial specificity of 94.3% (377/400). The initial positive blood sample scored negative after repeatedtesting in duplicate, resulting in a specificity after re-testing of 94.5% (378/400).

Clinical samplesTwo hundred five clinical samples were tested internally using the manual16-hour sample incubation procedure. One hundred eighty-nine of them

scored negative, 11 were indeterminate, and 5 scored positive. Three of these 5 samples scored negative after repeated testing in duplicate.One of the other 2 samples scored positive after repeated testing on INNO-LIA™ HCV Score and after testing on INNO-LIA™ HCV Ab III update, whilethe other sample scored indeterminate on these assays. Both samples were




negative on Ortho® HCV 3.0 ELISA with Enhanced SAVe and on INNOTEST™HCV Ab IV. One of these 2 samples was tested on CHIRON® RIBA® HCV 3.0SIA as well, and was found to be negative. For this sample set, an initialspecificity of 92.2% (189/205) was obtained, while specificity after repeatedtesting was 93.7% (192/205).

Potentially interfering samplesOne hundred thirty-seven potentially interfering samples were testedinternally using the manual 16-hour sample incubation procedure.One hundred twenty-seven samples turned out to be negative, 9 wereindeterminate, and one scored positive. Upon repeated testing in duplicate,this sample scored positive once, and then indeterminate, while a positiveresult was obtained on INNO-LIA™ HCV Ab III Update. This sample wasfound to be negative on Ortho® HCV 3.0 ELISA with Enhanced SAVe, on

INNOTEST™ HCV Ab IV, and on CHIRON®

RIBA®

HCV 3.0 SIA.On this set of samples, a specificity of 92.7% (127/137) was obtained.

Reproducibility

Two experimenters tested a panel of 13 HCV-positive samples, as well asone positive and one negative control on 3 different lots using the Auto-LIA™2-hour sample incubation procedure while a third experimenter tested thispanel on one of these lots. The use of different strip lots and performance bydifferent experimenters resulted in the same test outcome.

Français

But du test

Le test INNO-LIA™ HCV Score est un test immunoenzymatique sur bandelette= Line Immuno Assay (LIA) destiné à la détection des anticorps dirigés contre levirus de l'Hépatite C dans le sérum ou le plasma humain. Ce test de validationest destiné à être utilisé à titre complémentaire, comme test plus spécifique, sur des échantillons de sérum ou de plasma humains qui se sont révélés positifsdans le cadre d'une procédure de dépistage des anticorps anti-HCV.

Principe du test

INNO-LIA™ HCV Score est un test de 3ème génération de LIA qui utilise desantigènes HCV issus de la région Core, de la région hypervariable E2 (RHV),de la région hélicase NS3 et des régions NS4A, NS4B et NS5A.

Les antigènes sont fixés sous forme de 6 fines bandes sur une bandelette

de nylon adhérant à un support plastique. Par ailleurs, 4 bandes de contrôlesont fixées sur chaque bandelette: anti-streptavidine, Contrôle Positif 3+(anti-Ig humaines), Contrôle Positif 1+ (IgG humaines), et la bande limite ±(IgG humaines).

INNOGENETICS® 20



Le test INNO-LIA™ HCV Score est basé sur le principe d'un testimmunoenzymatique. Un échantillon est incubé dans un compartiment avecune bandelette LIA. Les anticorps anti-HCV éventuellement présents dansl'échantillon vont se lier aux bandes d'antigènes HCV fixées sur labandelette. Ensuite, un conjugué anti-IgG humaines (H+L) d'origine caprine

couplé à la phosphatase alcaline est ajouté et se fixe au complexeantigène/anticorps précédemment formé. L'incubation avec le substrat del'enzyme produit une couleur marron dont l'intensité est proportionnelle à laquantité d'anticorps anti-HCV spécifiques liés aux bandes d'antigènes.Le développement de la coloration est arrêté par addition d'acide sulfurique.

Réactifs

Description, préparation et conditions de conservation

- Maintenus à 2 - 8°C, tous les réactifs, ouverts ou fermés, y compris lesbandelettes, sont stables jusqu'à la date de péremption du kit.Ne pas congeler les réactifs.

- Ramener à température ambiante (18 - 25°C) tous les réactifs environ30 minutes avant le début du test, puis les replacer à 2 - 8°Cimmédiatement après utilisation.

- Une altération de l'apparence physique des composants du kit peutindiquer une instabilité ou une détérioration.

- Après première ouverture du tube contenant les bandelettes, celles-ci,

non utilisées seront stables pour une durée de 16 semaines conservéesdans ce tube d'origine avec le dessicant.

Réactifs fournis:

Composant Quantité Ref. Description

Bandelettes 20 57329 20 bandelettes INNO-LIA™ sensibiliséesavec des antigènes HCV.

Diluant échantillon 30 ml 57304 Tampon phosphate code-coloré (vert)

contenant chlorure de sodium, détergent,stabilisateurs de protéines bovines et 0.3%chloroacetamide comme conservateur.

Conjugué prêt à l'emploi 45 ml 57301 Anti-IgG humaine de chèvre code colorée(rouge) marquée à la phosphatase alcalineen tampon Tris contenant protéinesstabilisatrices, détergent et 0.01% MIT/0.1% CAA comme conservateur.

Contrôle négatif 0.12 ml 57307 Contenant matrice d'origine humaine debase et 0.01% MIT/0.1% CAA comme

conservateur.

Contrôle positif 0.12 ml 57308 Sérum humain inactivé contenant desanticorps anti-HCV et 0.01% MIT/0.1%CAA comme conservateur.




Substrat 45 ml 57302 5-bromo-4-chloro-3-idolyl phosphate/BCIP/NBT prêt à l'emploi nitrobleu tetrazolium en dimethyl

formamide avec 0.01% MIT/0.1% CAAcomme conservateur.

Solution d'arrêt 45 ml 57303 Acide Sulfurique 0.1 mole/l

Solution de lavage 45 ml 57299 Tampon Tris code-coloré (bleu) contenantchlorure de sodium, détergent et bromo-nitro-dioxane 0.02% comme conservateur à diluer au 1/5 en eau distillée avantemploi. La Solution de Lavage diluée eststable 2 semaines conservée à 2 - 8°C.

Plaque d'incubation 2 - 11 compartiments chacune

Adhésifs pour microplaque 5 -

Feuille de résultats 1 Pour la conservation des bandelettes

développées.Carte de lecture 1 Pour l'identification des bandes antigène

réactives.

Materiel necessaire non fourni

- Eau distillée ou desionisée.- Pipettes de précision réglables (10 µl, 20 - 200 µl, 200 - 1000 µl) avec

embouts jetables.- Agitateur (rotatif ou basculant). Voir Directives pour incubation.- Vortex ou équivalent.- Eprouvettes graduées (10, 25, 50, 100 ml).- Pince pour la manipulation des bandelettes.- Minuteur.- En option:

• Sèche cheveux ou incubateur sec à 37°C pour le séchage desbandelettes.

• Pipette à répétition avec récipients jetables pour l'addition de l'acidesulfurique, du conjugué, du substrat et de la solution de lavage.

• Système d'aspiration avec récipient d'évacuation contenant unesolution hypochlorite de sodium 5%.

Consignes de sécurité

- Se référer aux fiches de sécurité du fabricant et à l'étiquetage duproduit pour toute information sur des composants potentiellementdangereux.

INNOGENETICS® 22



R43, S24-37Irritant! (Xi) Eviter le contact avec la peau. Peut causer des irritations par

contact avec la peau. Porter des gants de protection.Contient 2-chloroacétamide: Diluant échantillon, Conjugué prêt à l'emploi,Substrat BCIP/NBT prêt à l'emploi, Contrôle négatif et Contrôle positif.

- Les échantillons, le Contrôle positif et le Contrôle négatif doivent toujoursêtre manipulés comme potentiellement infectieux.

- Le Contrôle positif a été retrouvé négatif pour les anticorps HCV etHbsAg. Le Contrôle négatif a été retrouvé négatif pour les anticorpsHIV-1/HIV-2, HCV et HbsAg. Aucune méthode de test peut offrir une

garantie absolue que les produits dérivés du sang ne sont pas capablesde transmettre des agents infectieux.Tout constituant dérivé du sang, ainsi que tout matériel biologique, doit doncêtre considéré comme potentiellement infectieux et devra être manipuléavec les précautions d'usage. Seul le personnel qualifié doit être autorisé àréaliser le test. Tous les dérivés sanguins et matériels biologiques doiventêtre éliminés selon les procédures de sécurité en vigueur:• Autoclave au moins 15 min à 121°C.• Incinération des matériels jetables.

• Mélanger les déchets liquides avec de l'hypochlorite de sodium àune concentration finale d'environ 1%. Laisser en contact une nuitavant l'évacuation. ATTENTION: Les liquides contenant de l'acidedoivent être neutralisés avant ajout d'hypochlorite de sodium.

- L'utilisation d'un équipement pour protection du personnel est nécessaire:gants et écrans lors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.

- Les déchets doivent être éliminés selon le règlement du laboratoire, et laréglementation en vigueur pour l'environnement doit être suivie.

- Ne pas aspirer et éliminer la solution d'arrêt dans le récipient d'évacuation

contenant l'hypochlorite de sodium.

Echantillons (recueil et manipulation)

- Réaliser le test INNO-LIA™ HCV Score avec des échantillons desérum ou de plasma humain prélevé sur citrate, héparine ou EDTA.

- Séparer le sérum ou le plasma du caillot ou des cellules sanguines par centrifugation avant conservation.

- Conserver les échantillons entre 2 - 8°C.Pour une conservation au-delà

d'une semaine, congeler à -20°C ou plus bas.- Ne pas utiliser d'échantillons chauffés.- Des cycles de congélation/décongélation répétés (plus de 3) peuvent

entraîner des résultats erronés.




Remarques et précautions

- Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption.- Ne pas mélanger les réactifs de n° de lot différents.- S'assurer que le volume d'échantillon et les temps de lavage sont

corrects au regard de la procédure choisie.- Eviter toute contamination microbienne des réactifs.- S'assurer de l'homogénéité des échantillons et des contrôles avant usage.- Ne pas toucher la bandelette en dehors de la partie plastifiée.- Utiliser un embout neuf pour chaque échantillon.- Placer les bandelettes dans les compartiments face sensibilisée orientée

vers le haut.- Toutes les étapes sont conduites sur un agitateur rotatif ou basculant.

(Réserver l'agitateur basculant uniquement à l'étape d'incubation de

nuit de l'échantillon).- L'agitation des solutions par-dessus la bandelette est un paramètrecritique pour optimiser la sensibilité et homogénéiser la coloration.La bandelette doit être complètement immergée.

- Couvrir les compartiments avec un adhésif pour microplaque afin d'éviter l'assèchement des bandelettes durant l'étape d'incubation de nuit.

- Tenir les bandelettes neuves ou développées éloignées de toute sourcede lumière intense et de chaleur.

- Utilisation par des professionnels.

- Les bandelettes et les compartiments ne sont pas réutilisables.- Découper les bandelettes peut entraîner l'interprétation erronée desrésultats.

Procédure

Lire Remarques et précautions avant de débuter le test.

- Incubation des échantillons sur 16 heures

1. Prendre la quantité requise de compartiments, tenant en compte quepour chaque série un contrôle positif et négatif doivent être effectués.Identifier chaque compartiment pour les contrôles et les échantillons,et les placer dans le support.

2. Ajouter 1 ml de Diluant échantillon à chaque compartiment.3. Ajouter 10 µl d'échantillon ou de Contrôle au compartiment identifié

approprié.4. Retirer la quantité requise de bandelettes LIA de tube et placer une

bandelette par compartiment à l'aide d'une pince côté membrane

orienté vers le haut. LA BANDELETTE DOIT ETRE COMPLETEMENTIMMERGEE.

INNOGENETICS® 24



5. Recouvrir les compartiments d'un adhésif (voir Remarques etprécautions). Incuber les échantillons sous agitation (voir Directivespour incubation) pendant UNE NUIT (16 ± 2 h) à température ambiante(18 - 25°C). En plaçant le support sur un agitateur (voir Directives pour incubation) et agiter.

NOTE:• Retirez l'adhésif avec précaution afin d'éviter toute contamination

croisée.6. Laver chaque bandelette 3 fois (5 minutes) avec 1 ml de solution de

lavage (voir Directives de lavage).7. Ajouter 1 ml de Conjugué à chaque compartiment.8. Incuber sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante

(18 - 25°C).9. Laver chaque bandelette 3 fois (5 minutes) avec 1 ml de solution de

lavage (voir Directives de lavage).10. Ajouter 1 ml de Substrat à chaque compartiment.11. Incuber sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante

(18 - 25°C).12. Aspirer. Ajouter 1 ml de Solution d'arret à chaque compartiment.13. Incuber sous agitation pendant 10 - 30 minutes à température ambiante

(18 - 25°C).14. Aspirer la Solution d'arret.15. Retirer les bandelettes des compartiments à l'aide d'une pince et les

placer sur du papier absorbant. Les résultats peuvent être interprétésdès que les bandelettes sont complètement sèches. Afin d'accélérer leprocessus de séchage, placez les bandelettes dans un incubateur secà 37°C pendant 30 minutes ou utiliser un sèche-cheveux pendantune minute. Les bandelettes développées gardent leur coloration sielles sont conservées à l'obscurité.

- Incubation des échantillons sur 2 heures ou 3 heures

Pour la procédure d'incubation des échantillons sur 2 ou 3 heures, on appliquerales 15 étapes précédemment décrites dans “Incubation des échantillons sur 16heures” en apportant des modifications aux étapes 3, 5, 6 et 9. Le volume deséchantillons et des Controles passe de 10 - 20 µl (étape 3) et la duréed'incubation des échantillons passe à 2 ou 3 heures (étape 5).L'étape de Lavage après l'incubation des échantillons passe à 3 x 10 min pour laprocédure sur 2 heures et à 3 x 6 min pour la procédure sur 3 heures (étape 6).Enfin, la seconde étape de Lavage est 3 x 3 min pour les 2 procédures sur 2 et 3heures.




Un résumé des procédures mettant en évidence les différences (en gras)est proposé dans le tableau suivant:

Incubation Incubation Incubationdes échantillons des échantillons des échantillons

sur 16 heures sur 2 heures sur 3 heuresDiluant échantillon 1 ml 1 ml 1 mlEchantillons 10 µl 20 µl 20 µlControles 10 µl 20 µl 20 µlBandelettes LIA 16 heures ± 2 heures 2 heures 3 heuresLavage 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 10 min 1 ml/3 x 6 minConjugué PAE* 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minLavage 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 3 min 1 ml/3 x 3 minSubstrat PAE* 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minSolution d'arrêt 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min

*PAE = Prêt A l'Emploi

Directives de lavage

- A l'issue de l'étape d'incubation des échantillons (nuit, 2 heures ou3 heures), retirer l'adhésif de la plaque avec précaution.

- Aspirer le liquide de chaque compartiment de la plaque à l'aide d'unepipette, de préférence branchée sur une pompe à vide et reliée à unrécipient d'évacuation contenant de l'hypochlorite de sodium 5%.Incliner la plaque et aspirer le liquide à l'angle du compartiment (cotéextrémité plastique de la bandelette).

- Ajouter 1 ml de Solution de lavage diluée à chaque barquette et laisser agiter 5 minutes sur un agitateur.

- Répéter cette étape le nombre de fois indiqué dans la procédure.NOTE:• Ne pas laisser les bandelettes s'assécher durant ces étapes.• Ne pas endommager la surface de la bandelette durant l'aspiration.• S'assurer que la bandelette est entièrement lavée par immersion

complète dans la solution.• Réajuster la vitesse de l'agitation si nécessaire.

Directives pour incubation

- Toutes les étapes (Echantillons, Conjugué, Substrat, Solution d'arrêt etégalement Lavage) doivent être conduites sur un agitateur rotatif oubasculant. (Réserver l'agitateur basculant uniquement à l'étaped'incubation de nuit de l'échantillon).

- Au cours des phases de lavage et d'incubation, la surface de la

bandelette doit être complètement immergée, face membranesensibilisée orientée vers le haut.

- L'agitateur doit permettre un mouvement réciproque de va-et-vient de labandelette dans le compartiment et du liquide par-dessus la bandeletteen évitant tout débordement.

INNOGENETICS® 26



- La vitesse d'agitation générée par l'agitateur orbital, linéaire ou basculantest un paramètre critique pour optimiser la sensibilité et homogénéiser lacoloration.Recommandations pour un agitateur orbital:• le diamètre du mouvement circulaire doit être égal ou supérieur à 13 mm

• la vitesse recommandée, pour un mouvement circulaire de 13 mm, est de 160 rpm• La vitesse recommandée, pour un mouvement circulaire de 24 mm, est de 90 rpm.Recommandations pour un agitateur basculant:• la différence entre le point le plus haut et le point le plus bas ne doit pas

dépasser 80 mm afin d'éviter tout débordement du liquide• la vitesse recommandée est de 34 rpm.

Procédure automatisée: Auto-LIA™

La procédure LIA se prête bien à l'automatisation. L' Auto-LIA™ prendtotalement en charge les étapes d'aspiration, de pipetage et d'incubation.Pour plus d'information et pour les programmes spécifiques sur Auto-LIA™,contacter Innogenetics ou votre distributeur.

Lire Remarques et précautions avant de débuter le test.

Procédure Auto-LIA™ détaillée- Programme Auto-LIA™ pour incubation des échantillons sur 16 heures

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 960 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 6 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 6 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 6 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 4

23. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END




- Programme Auto-LIA™ pour incubation des échantillons sur 2 heures

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 120 min, shake speed 4

5. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 4

16. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos : end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos : end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 4

26. ASP27. END

CH1 = Diluant EchantillonCH2 = Solution de LavageCH4 = ConjuguéCH5 = Solution d'ArrêtCH6 = Substrat

- Programme Auto-LIA™ pour incubation des échantillons sur 3 heures

Pour la procédure d'incubation des échantillons sur 3 heures, on appliquerales 27 étapes précédemment décrites dans “Programme Auto-LIA™ pour incubation des échantillons sur 2 heures” en apportant des modificationsaux étapes 4, 6, 8 et 10. La durée d'incubation des échantillons passe à180 minutes pour la procédure en 3 heures (étape 4) et les lavages aprèscette étape d'incubation de 3 heures passe à 3 x 6 min (étapes 6 - 8 et 10).

Résultats

Lecture

L'identité et la localisation des antigènes et des contrôles fixés sur labandelette sont les suivantes: voir Figure 1 page 16 .

INNOGENETICS® 28



Un score de réactivité est attribué aux bandes antigéniques par comparaisonde leurs intensités avec celles des bandes contrôles de chaque bandelette.

Intensité des bandes d'antigène (R) Score

Inférieur à ± R < ± -

Egale à ± R = ± ±Supérieure à ± et inférieure ou égale à 1+ ± < R = 1+ 1+Supérieure à 1+ mais inférieure à 3+ 1+ < R < 3+ 2+Egale à 3+ R = 3+ 3+Supérieure à 3+ R > 3+ 4+

Le score de réactivité doit être établi séparément pour chaque bandelette.Une carte de lecture est fournie pour faciliter l'interprétation.L'alignement de la bandelette développée avec la bande contrôle 3+ de lacarte de lecture facilite l'identification des bandes.

Validation

Vérifier la validité des bandelettes de Contrôles positif et négatif ainsi que lavalidité des Contrôles de niveaux sur chaque bandelette avant d'interpréter les résultats du test.

Validation de la série:

1. La bandelette Contrôle positif doit présenter un score au moins égal à

1+ pour les bandes C1, C2, NS3 et NS4. Les bandes NS5 et E2peuvent être négatives.

2. Toutes les bandes d'antigènes HCV de la bandelette Contrôle négatif doivent être négatives (pas de réactivité du tout ou, au plus, réactivitéd'intensité inférieure au niveau de la bande contrôle ±).

Validation d'une bandelette:

1. Les bandes contrôles déterminant les niveaux ±, 1+ et 3+ doivent êtrevisibles sur toutes les bandelettes.

2. L'intensité de la bande contrôle 3+ doit être supérieure à celle ducontrôle 1+, elle-même supérieure à celle du niveau ±.

3. La bande contrôle anti-streptavidine doit présenter un score négatif.NOTE:• La bandelette doit être complètement sèche pour éviter toute

erreur d'interprétation due à l'apparition de bandes fantômes aprèsaddition de Solution d'arrêt.

• Ne pas placer de papier par-dessus les bandelettes tant qu'elles nesont pas sèches.

• Des bandes contrôles faiblement réactives peuvent être observéesen présence d'échantillons contenant de forts taux d'IgG (supérieursà la limite haute normale).




Interprétation des résultats

De nombreuses évaluations ont montré que les résultats doivent êtreinterprétés de la façon suivante:

Un échantillon est considéré NÉGATIF en anticorps anti-HCV:- si toutes les bandes antigéniques HCV présentent un score de réactiviténégatif

- si une seule bande antigénique HCV présente un score de réactivité ±,excepté si cette réactivité est observée pour la bande NS3.

Un échantillon est considéré POSITIF en anticorps anti-HCV:- si au moins 2 bandes antigéniques HCV présentent un score de

réactivité égal à ± ou supérieur.

Un échantillon est considéré INDÉTERMINÉ en anticorps anti-HCV:- si une seule bande antigénique HCV présente un score de réactivité

égal à 1+ ou supérieur - si la bande NS3 présente un score de réactivité égal à ± ou supérieur

et que toutes les autres bandes sont négatives.

Logiciel d'interprétation: LiRAS™ Maladies infectieuses

Le logiciel LiRAS™ Maladies infectieuses est conçu pour aider à l'interprétationdes résultats du LIA. Contacter votre distributeur pour obtenir sa dernière version.

ATTENTION:- Ne pas utiliser l'interprétation automatisée sans tenir compte des limites

du test mentionnées ci-dessous.

Limites du test

- Le protocole fourni doit être strictement suivi afin d'obtenir des

performances optimales.- Une réactivité unique NS3 ± ou supérieure peut être indicative d'uneséroconversion. De tels échantillons seront classés comme indéterminés.

- En cas de résultat INDETERMINE, il est recommandé de tester unéchantillon du même patient prélevé quelques semaines plus tard.

- Un échantillon présentant une réactivité de la bande contrôle streptavidinepeut également présenter des réactivités croisées avec les autres bandesantigéniques HCV et ne peut pas être étiqueté HCV positif.

- Les anticorps anti-HCV peuvent être indétectables durant la phase

précoce de l'infection.- Les anticorps peuvent être indétectables dans un contexte d'hémodialyse.- L'utilisation d'échantillons dilués peut conduire à des résultats erronés.

INNOGENETICS® 30



- Des paramètres mesurant l'atteinte hépatique et l'ARN HCV devrontêtre mis en œuvre chez les sujets anti-HCV positifs avant touteinitiation de traitement ou procédures invasives.

Performances

Sensibilité

Panels de séroconversion/Panels de titres basLes résultats ont été obtenus en interne avec INNO-LIA™ HCV Score sur

Auto-LIA™-programme pour incubation des échantillons sur 2 heures- et entechnique manuelle avec incubation des échantillons sur 16 heures, vis à visde 13 panels BBI de séroconversion (PHV904 à 916), de 2 panels BBI de titresbas (PHV103 et 204) et du panel SFTS94. Ces résultats ont été comparés auxrésultats obtenus avec CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA et avec INNO-LIA™

HCV Ab III Update.

INNO-LIA™ HCV Score -procédure d'incubation 2 heures et 16 heures-a détecté les anticorps anti-HCV plus tôt que RIBA 3.0 pour 7 panels. 4 panelsont présenté une positivité en même temps. CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA adétecté les anticorps anti-HCV plus tôt que INNO-LIA™ HCV Score (pour les2 procédures d'incubation) pour 1 panel. Un panel n'a donné aucune réactivitépar aucun des 2 tests.

INNO-LIA™ HCV Score -procédure d'incubation sur 2 heures- a détecté lesanticorps anti-HCV plus tôt que INNO-LIA™ HCV Ab III Update pour 2 panels,10 autres panels devenant positifs par les 2 tests en même temps.

Avec la procédure d'incubation sur 16 heures, 4 panels sont devenus positifsplus tôt qu'avec INNO-LIA™ HCV Ab III Update, 7 panels sont devenuspositifs en même temps et 1 panel est devenu positif plus tard.

Des 40 échantillons des 2 panels BBI de titres bas, 28 et 32 échantillonsrespectivement ont été positifs avec INNO-LIA™ HCV Score -procédured'incubation 2 heures et 16 heures-. 35 de ces échantillons étaient positifsavec CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA tandis que 34 l'étaient avec INNO-LIA™HCV Ab III Update. Tous les échantillons positifs avec CHIRON® RIBA® HCV3.0 SIA ou INNO-LIA™ HCV Ab III Update ont été trouvés positifs ouindéterminés avec INNO-LIA™ HCV Score.

Des 49 échantillons du panel SFTS94, 38, 41 et 40 respectivement ont étépositifs avec INNO-LIA™ HCV Score -procédure d'incubation 2 heures-, -procédure d'incubation 16 heures- et INNO-LIA™ HCV Ab III Update. 31 de

ces échantillons ont été trouvés positifs avec CHIRON

®

RIBA

®

HCV 3.0 SIA.




Echantillons HCV positifs257 échantillons provenant de patients atteints d'hépatite C trouvés positifsavec deux tests de dépistage et avec INNO-LIA™ HCV Ab III Update ont étéanalysés en interne en utilisant INNO-LIA™ HCV Score sur Auto-LIA™ -programme d'incubation des échantillons sur 2 heures-. Tous les échantillons

ont été classés positifs à l'exception d'un seul, classé indéterminé, résultant enune sensibilité, si l'on inclut l'unique résultat indéterminé, de 100% (257/257).

Génotypes différentsLe test INNO-LIA™ HCV Score sur Auto-LIA™ -programme d'incubation deséchantillons sur 2 heures- a été effectué sur 15 échantillons de génotype 1a,15 échantillons de génotype 1b, 15 échantillons de génotype 2, 15 échantillonsde génotype 3a, 15 échantillons de génotype 4a, 5 échantillons de génotype 4non-a et 5 échantillons de génotype 5. Tous les échantillons ont été correctement

identifiés comme positifs résultant en une sensibilité de 100% (85/85).

Spécificité

Donneurs de sang400 échantillons de donneurs de sang trouvés HCV négatifs ont été testésen interne avec INNO-LIA™ HCV Score -procédure d'incubation 16 heures-en technique manuelle. A l'issue du test initial, 377 échantillons ont étérendus négatifs, 22 indéterminés et 1 positif, résultant en une spécificité

initiale de 94,3% (377/400). A l'issue du test de répétabilité en duplicate, l'échantillon trouvé initialementpositif a été finalement retrouvé négatif résultant en une spécificité aprèsrépétabilité de 94,5% (378/400).

Echantillons cliniques205 échantillons cliniques ont été testés en interne avec INNO-LIA™ HCVScore -procédure d'incubation 16 heures- en technique manuelle. 195 ont ététrouvés négatifs, 11 indéterminés et 5 positifs. 3 de ces 5 échantillons ont été

retrouvés négatifs lors du test de répétabilité en duplicate. Parmi les 2 autreséchantillons, 1 a été retrouvé positif lors du test de répétabilité en duplicateavec INNO-LIA™ HCV Score et après test avec INNO-LIA™ HCV Ab IIIUpdate tandis que l'autre a été retrouvé indéterminé avec ces 2 tests.Chacun de ces 2 échantillons étaient négatifs avec Ortho® HCV 3.0 ELISA withEnhanced SAVe et INNOTEST™ HCV Ab IV. Un de ces échantillons a ététesté avec CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA et trouvé négatif. Pour cette séried'échantillons, on a obtenu une spécificité initiale de 92,2% (189/205) et unespécificité après répétabilité de 93,7% (192/205).

INNOGENETICS® 32



Réactions croisées potentielles137 échantillons pouvant présenter des réactivités croisées ont été testésen interne avec INNO-LIA™ HCV Score -procédure d'incubation 16 heures-en technique manuelle. 127 échantillons ont été trouvés négatifs,9 indéterminés et 1 positif. Après test de répétabilité en duplicate cet

échantillon a été retrouvé positif d'une part et indéterminé d'autre part,tandis qu'il était trouvé positif avec INNO-LIA™ HCV Ab III Update.Cet échantillon a été trouvé négatif avec Ortho® HCV 3.0 ELISA withEnhanced SAVe, INNOTEST™ HCV Ab IV et CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA.Pour cette série d'échantillons, on a obtenu une spécificité de 92,7% (127/137).

Reproductibilité

2 expérimentateurs ont testé un panel de 13 échantillons HCV positif ainsi qu'unContrôle Négatif et un Contrôle Positif avec 3 lots différents de INNO-LIA™ HCVScore, sur Auto-LIA™-programme d'incubation des échantillons sur 2 heures-.Un troisième expérimentateur a testé ce panel sur un seul des lots.Les différents lots de bandelette testés et interprétés par différents manipulateursont conduit aux mêmes résultats.

Deutsch

Beabsichtigter Verwendungszweck

INNO-LIA™ HCV Score ist ein Line-Immunblot-Assay (LIA) zur Bestätigungder Präsenz von Antikörpern gegen das humane Hepatitis-C-Virus inhumanem Serum oder Plasma. Der Test dient als Bestätigungstest für Proben, die mit einem anti-HCV-Screeningtest als positiv befundet wurden.

Funktionsweise des Tests

INNO-LIA™ HCV Score ist ein Line-Immunoassay der dritten Generation.Er verwendet HCV-Antigene aus der Core-Region, der hypervariablen Region E2(HVR), der Helicase-Region NS3 und den Regionen NS4A, NS4B, und NS5A.

Die Antigene sind als 6 diskrete Banden auf einen Nylonstreifen mitKunststoffverstärkung aufgetragen. Zusätzlich befinden sich auf jedemStreifen 4 Kontrollbanden: eine Streptavidin-Kontrolle, eine Bande mit starker 3+-Positivkontrolle (anti-humanes Ig), eine Bande mit 1+-Positivkontrolle(humanes IgG) und eine ± -Cutoff-Bande (humanes IgG).

Die Nachweistechnik des INNO-LIA™ HCV Score beruht auf dem Prinzipeines Enzymimmunoassays. Die Probe wird zusammen mit dem LIA-

Teststreifen in einer Wanne inkubiert. Wenn in der Probe HCV-Antikörper vorhanden sind, binden diese an die HCV-Antigen-Banden auf demTeststreifen. Anschließend wird ein affinitätsgereinigtes Konjugat aus mitalkalischer Phosphatase markiertem Ziege-anti-Human IgG (H+L)zugegeben, das mit diesen spezifischen HCV Antigen-Antikörper-Komplexen




reagiert, der sich gegebenenfalls zuvor gebildet hat. Bei Inkubation mit demEnzymsubstrat bildet sich eine kastanienbraune Farbe, deren Intensität in jeder Bande der HCV-spezifischen Antikörpermenge in der Probe proportional ist(Abb. 1). Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt.

ReagenzienBeschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit

- Bei einer Lagerung zwischen 2 - 8°C sind alle Testreagenzien, ob nungeöffnet oder ungeöffnet, bis zum auf der Verpackung angegebenenVerfallsdatum haltbar. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren oder nach dem angegebenen Verfallsdatum verwendet werden.

- Alle Reagenzien und der Beutel mit den Teststreifen müssen auf Raumtemperatur (18 - 25°C) gebracht werden, das heißt, sie müssen

ca. 30 Min. vor Gebrauch aus dem Kühlschrank entnommen werdenund anschließend sofort wieder gekühlt (2 - 8°C) werden.

- Jede Veränderung des Aussehens von Kitbestandteilen kann bedeuten,dass die entsprechende Komponente sich zersetzt hat und nicht weiter verwendet werden kann.

- Die Teststreifen müssen zusammen mit dem Trockenmittel in denOriginalgefäßen bleiben; für die Lagerung müssen diese Gefäße wieder verschlossen werden. Unter diesen Bedingungen sind die Streifen bei2 - 8°C 16 Wochen haltbar.

Jede Packung enthält:

Kitbestandteil Menge Ref. Beschreibung

Teststreifen 20 57329 20 mit INNO-LIA™ HCV Antigen Antigenbeschichtete Teststreifen.

Probenverdünner 30 ml 57304 Farbkodierter (grün) Phosphatpuffer mitNatriumchlorid, Detergens, Rinderproteinals Stabilisator und 0,3% Chloracetamid(CAA) als Konservierungsmittel.

Gebrauchsfertiges Konjugat 45 ml 57301 Farbkodiertes (rot), mit alkalischer Phosphatase markiertes Ziege-anti-Human IgG in Trispuffer mitRinderprotein als Stabilisator, Detergensund 0,01% Methylisothiazolon (MIT)/0,1% Chloracetamid (CAA) alsKonservierungsmittel.

Negativkontrolle 0.12 ml 57307 Grundmatrix humanem Ursprungs mit0,01% Methylisothiazolon (MIT)/

0,1% Chloracetamid (CAA) alsKonservierungsmittel.

INNOGENETICS® 34



Positivkontrolle 0.12 ml 57308 Inaktiviertes Humanserum mit Antikörpern gegen HCV und 0,01%MIT/0,1% Chloracetamid (CAA) alsKonservierungsmittel.

Gebrauchsfertiges 45 ml 57302 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/BCIP/NBT-Substrat Nitroblau-Tetrazolium in Dimethylformamid,

mit 0,01% Methylisothiazolon (MIT)/0,1% Chloracetamid (CAA) alsKonservierungsmittel.

Stopplösung 45 ml 57303 0,1 mol/l Schwefelsäure.

Waschlösung 45 ml 57299 Farbkodierter (blau) Trispuffer mitNatriumchlorid, Detergens und 0,02%Bromnitrodioxan als Konservierungsmittel,vor Verwendung 1% mit destilliertemWasser verdünnen. Die verdünnte

Waschlösung ist bei 2 - 8°C 2 Wochenstabil.

Inkubationswannen 2 - Mit je 11 Teststreifen.

Klebefolien 5 -

Protokollbogen 1 - Zur Aufbewahrung der entwickeltenTeststreifen.

Interpretationsvorlage 1 - Zur Identifikation reaktiver Antigenbanden.

Zusätzlich benötigte Materialien

- Destilliertes oder deionisiertes Wasser.- Präzisionspipetten (mit Einmalspitzen) für 10 µl, 20 - 200 µl und

200 - 1000 µl.- Orbitalschüttler oder Wippschüttler (siehe Hinweise zur Inkubation).- Vortex-Mischer oder ähnliches.- Graduierte Messzylinder (10 ml, 25 ml, 50 ml und 100 ml).- Laborwecker.

- Pinzette zur Manipulation der Teststreifen.- Optional:• Heißluftventilator (Fön) oder Wärmeschrank (37°C).• Repetierpipette und Einmalgefäße für Schwefelsäure, Konjugat,

Substrat und Waschlösung.• Vakuumpumpensystem mit Abfallflasche, gefüllt mit 5%-igem

Natriumhypochlorit.

Sicherheitshinweise und Entsorgung

- Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers und dieProduktkennzeichnung bezüglich gefährlicher Substanzen.




R43, S24-37Reizend! (Xi) Berührung mit der Haut vermeiden. Sensibilisierung durch

Hautkontakt möglich. Geeignete Schutzhandschuhe tragen.Gilt für 2-Chloracetamid in Probenverdünner, BCIP/NBT Substrat,Negativkontrolle und Positivkontrolle.

- Die Proben, Positivkontrollen und Negativkontrollen müssen stets alspotentiell infektiös behandelt werden.

- Die Positivkontrolle wurde mit negativem Ergebnis auf Antikörper gegenHCV und HbsAg überprüft. Die Negativkontrolle wurde met negativemErgebnis auf HbsAg und Antikörper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV

überprüft. Mit keiner Testmethode kann absolute Sicherheit gewährleistetwerden, dass aus menschlichem Blut gewonnene Produkte keineinfektiösen Keime enthalten.Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personalangewendet werden. Blut und biologische Materialien müssen inÜbereinstimmung mit den entsprechenden Sicherheitsbestimmungenentsorgt werden.• Mindestens 15 Minuten bei 121°C autoklavieren.• Einwegmaterialien verbrennen.

• Flüssigabfall mit Natriumhypochlorit mischen. sodass dieEndkonzentration von Natriumhypochlorit bei etwa 1% liegt und vor Entsorgung über Nacht stehen lassen.

ACHTUNG: Säurehaltigen Flüssigabfall vor Zugabe vonNatriumhypochlorit neutralisieren.

- Bei der Arbeit mit potentiell gefährlichen oder infektiösen Materialiengeeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.

- Bei Beseitigung der Chemikalien sind die entsprechenden Gesetze bzw.Verordnungen der EG-Mitgliedsländer, der Bundesrepublik Deutschland

und der Bundesländer sowie hausinterne Vorschriften zu beachten.

Herstellung der Proben

- Der INNO-LIA™ HCV Score Test ist für Proben aus humanem Serumoder Plasma in Röhrchen mit Citrat, Heparin oder EDTA als Antikoagulansgeeignet.

- Vor der Lagerung müssen die Proben zentrifugiert werden, um unlöslicheBestandteile abzutrennen.

- Proben bei 2 - 8°C lagern. Sollen die Proben länger als eine Wochegelagert werden, müssen sie in Aliquots bei -20°C eingefroren werden.- Keine hitzeinaktivierten Proben verwenden.- Wiederholtes (mehr als dreimaliges) Auftauen und Einfrieren der Proben

ist zu vermeiden.

INNOGENETICS® 36



Hinweise und Vorsichtmaßnahmen

- Verwenden Sie den Kit nicht nach Überschreitung des Verfallsdatums.- Verwenden Sie keine Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen

Chargennummern.

- Halten Sie die angegebenen Proben Volumina und Waschzeitengenau ein.- Die Proben dürfen nicht mikrobiell kontaminiert sein.- Vor der Verwendung müssen Proben und Kontrollen sorgfältig durchmischt

werden.- Streifen nicht auf der Membranseite, sondern nur auf der

kunststoffverstärkten Rückseite berühren. Berühren Sie die Streifennicht mit bloßen Händen; verwenden Sie eine saubere Pinzette.

- Für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden.

- Die Teststreifen müssen mit der membranbeschichteten Seite nachoben in die Inkubationswanne gelegt werden.- Alle Inkubationsschritte müssen auf einem Orbitalschüttler oder

Wippschüttler durchgeführt werden. Einen Wippschüttler nur für Inkubationen über Nacht verwenden.

- Die Schüttelamplitude ist ein entscheidender Faktor, um maximaleEmpfindlichkeit und gleichmäßige Färbung zu erzielen. Dazu müssendie Streifen vollständig in die Lösungen eintauchen, und die Flüssigkeitmuss sich gleichmäßig über die Streifen hin- und herbewegen.

- Versiegeln Sie die Inkubationswannen bei Inkubationen über Nacht miteiner Klebefolie, um Austrocknen zu vermeiden.- Unbenutzte und entwickelte Teststreifen sind hitze- und lichtempfindlich

und müssen deshalb kühl und im Dunkeln aufbewahrt werden.- Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal

angewendet werden.- Inkubationswannen und Teststreifen nicht wiederverwenden.- Teststreifen nicht zerschneiden. Eine richtige Interpretation der Ergebnisse

ist nur bei Verwendung vollständiger Teststreifen möglich.

Arbeitsablauf

Machen Sie sich vor Testbeginn mit dem Kapitel Hinweise undVorsichtmaßnahmen vertraut.

- Probeninkubation - 16 Stunden

1. Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl an Inkubationswannen vor.Sie benötigen zusätzlich zu den Wannen für die Proben zwei weitere

Wannen für Positiv- und Negativkontrolle.Beschriften Sie die Wannen, und setzen Sie sie in den Halter ein.2. Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Probenverdünner .3. Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 10 µl Probe oder Kontrolle.




4. Nehmen Sie für jede Probe und jede Kontrolle je einen Teststreifen ausdem Behälter. Legen Sie je einen Streifen in eine Inkubationswanne.Die Teststreifen müssen mit der membranbeschichteten (markierten)Seite nach oben in die Inkubationswanne gelegt werden. Sie dürfen nur mit einer Pinzette berührt werden.

DIE STREIFEN MÜSSEN VOLLSTÄNDIG IN DIE FLÜSSIGKEITEINTAUCHEN.

5. Decken Sie die Inkubationswannen mit einem Klebestreifen ab (sieheKapitel Hinweise und Vorsichtmaßnahmen). Stellen Sie den Halter mit denInkubationswannen während der Inkubation auf einen Orbitalschüttler oder Wippschüttler (siehe Kapitel Hinweise zur Inkubation) und schüttelnSie ÜBER NACHT (16 ± 2 Std.) bei Raumtemperatur (18 - 25°C).HINWEIS:• Entfernen Sie die Klebefolie vorsichtig, um Kreuzkontamination zu

vermeiden.6. Waschen Sie jeden Teststreifen dreimal (je 5 Minuten) mit 1 ml

Waschlösung (siehe Kapitel Waschanleitung).7. Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Konjugatlösung.8. Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen während der

Konjugat-Inkubation auf einen Orbitalschüttler oder Wippschüttler undinkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25°C).

9. Waschen Sie jeden Teststreifen dreimal (je 5 Minuten) mit 1 mlWaschlösung (siehe Kapitel Waschanleitung).

10. Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Substratlösung.11. Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen während der Substrat-

Inkubation auf einen Orbitalschüttler oder Wippschüttler und inkubieren Sie30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25°C).

12. Saugen Sie die Flüssigkeit aus den Wannen ab. Pipettieren Sie in jedeInkubationswanne 1 ml Stopplösung.

13. Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen während der Inkubationmit Stopplösung auf einen Orbitalschüttler oder Wippschüttler undinkubieren Sie 10 - 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25°C).

14. Saugen Sie die Stopplösung ab.15. Nehmen Sie die Streifen mit einer Pinzette aus der Inkubationswanne

heraus, und legen Sie sie mit einer Pinzette mit der Membranseite nachoben auf Fließpapier. Interpretieren Sie die Ergebnisse erst dann, wenndie Streifen vollständig getrocknet sind. Zum schnelleren Trocknenkönnen die Streifen 30 Minuten in einem Trockenschrank bei 37°C oder mit einem Föhn getrocknet werden. Bewahren Sie die entwickeltenStreifen im Dunkeln auf.

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- Probeninkubation - 2 bzw. 3 Stunden

Es ist auch möglich, die Probeninkubation mit leichten Änderungen in 2 oder 3 Stunden durchzuführen. Grundsätzlich verläuft die 2- bzw. 3-stündigeProbeninkubation genauso wie die 16-stündige Probeninkubation.In folgenden Schritten müssen Änderungen vorgenommen werden:

3 - Probenvolumen (auch Kontrollen): 20 µl (statt 10 µl).5 - Inkubationszeit: 2 bzw. 3 Stunden (statt 16 Stunden).6 - Waschen: dreimal je 10 Minuten [2 Stunden] bzw. 6 Minuten [3 Stunden]

(statt 5 Minuten).9 - Waschen: dreimal je 3 Minuten (statt 5 Minuten).

Insgesamt werden bei den Inkubationen folgende Inkubationszeiten undVolumina verwendet (Unterschiede sind fett gedruckt):

16 Stunden 2 Stunden 3 StundenInkubationszeit Inkubationszeit Inkubationszeit

Probenverdünner 1 ml 1 ml 1 mlProben 10 µl 20 µl 20 µlKontrollen 10 µl 20 µl 20 µlInkubationszeit 16 ± 2 Stunden 2 Stunden 3 Stundender Teststreifen

Waschen 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 10 min 1 ml/3 x 6 minKonjugat 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minWaschen 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 3 min 1 ml/3 x 3 minSubstrat 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minStopplösung 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min

Waschen

- Entfernen Sie nach der Inkubation die Klebefolie.- Saugen Sie die Flüssigkeit in den Wannen mit einer Pipette ab, die

möglichst mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. In der Abfallflaschesollte sich 5%-ige Natriumhypochloritlösung befinden.

Halten Sie die Wanne schräg, sodass alle Flüssigkeit auf eine Seitefließt (und zwar zu der Seite, auf der sich die unbeschichteteKunststoffverstärkung der Streifen befindet).

- Geben Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Waschlösung, und schüttelnSie die Wannen 1 Minute auf einem Orbitalschüttler oder Wippschüttler.

- Wiederholen Sie diesen Schritt so oft, wie es in der Testvorschriftangegeben ist.HINWEIS:• Achten Sie darauf, dass die Streifen zwischen den einzelnen

Waschschritten nicht austrocknen.• Achten Sie darauf, dass Sie beim Absaugen der Flüssigkeit nichtdie Oberfläche der Streifen beschädigen.

• Achten Sie darauf, dass der Streifen vollständig in die Waschlösungeintaucht. Nur so wird der Streifen optimal gewaschen.




• Stellen Sie nötigenfalls die Geschwindigkeit des Schüttlers nach.

Inkubation

- Alle Inkubationsschritte (Proben-, Konjugat-, Substrat- undSchwefelsäureinkubation) müssen auf einem Schüttler durchgeführtwerden. Für die 16-Stunden-Inkubation muss ein Wippschüttler verwendet werden.

- Während der Inkubations- und Waschschritte müssen die Teststreifenvollständig benetzt sein. Die Membranseite muss nach oben weisen.

- Der Schüttler muss eine Hin- und Herbewegung der Streifen in denTestwannen ermöglichen. Dabei muss sich die Flüssigkeit über dieTeststreifen hinweg bewegen, ohne aus den Wannen zu spritzen.

- Die Geschwindigkeit des Schüttlers ist entscheidend für eine maximaleSensitivität und eine gleichmäßige Farbreaktion.Empfohlene Einstellungen

Orbitalschüttler:• Schwingungsdurchmesser: mindestens 13 mm• Empfohlene Geschwindigkeit: 160 Umin-1 bei einem

Schwingungsdurchmesser von 13 mm• Empfohlene Geschwindigkeit: 90 Umin-1 bei einem Schwingungsdurchmesser

von 24 mm.Wippschüttler:• Die Auslenkung des Wippschüttlers sollte nicht mehr als 80 mm betragen, um

ein Verschütten der Flüssigkeit zu vermeiden

• Empfohlene Schüttelgeschwindigkeit: 34 Umin-1.

Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LIA™

Die Testprozedur des INNO-LIA™ Tests ist hervorragend für eine Automatisierung geeignet. Daher wurde ein automatisches Analysengerät,das Auto-LIA™, entwickelt, das in der Lage ist, die Arbeitschritte Aspirieren,Pipettieren und Inkubation vollständig zu automatisieren.Das Auto-LIA™ kann ohne Überwachung arbeiten.

Wenn Sie weitere Informationen über das Auto-LiPA wünschen, setzen Siesich bitte mit der deutschen Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.

Machen Sie sich vor Testbeginn mit dem Kapitel Hinweise undVorsichtmaßnahmen vertraut.

Ausführliche Auto-LIA™ Verfahren- Auto-LIA™ - 16 Stunden Inkubation

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 960 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 6 min, shake speed 4

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7. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 6 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 6 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 4

23. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END

- Auto-LIA™ - 2 Stunden Inkubation

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE

4. INC 120 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END




CH1 = Probenverdünner CH2 = WaschlösungCH4 = KonjugatCH5 = StopplösungCH6 = Substrat

- Auto-LIA™ - 2 Stunden Inkubation

Wird die Probeninkubation 3 Stunden durchgeführt. müssen im Vergleich zur 2-Stunden-Inkubation in den folgenden Schritten Änderungen vorgenommenwerden:4 - Inkubationszeit: 3 Stunden (statt 2 Stunden).6 + 8 + 10- Waschen: dreimal je 6 Minuten.

Ergebnisse

Ablesen der ErgebnisseDie Antigene und Kontrollen sind in folgender Reihenfolge auf den Streifenaufgetragen: siehe Abbildung 1 Seite 16 .

Die Farbintensität der Kontrolllinien auf jedem Streifen wird mit den reaktivenBanden verglichen. Dabei wird die Stärke der Banden wie folgt beurteilt:

Reaktionsintensität der Antigenbande (R) Bewertung

Geringer als ± R < ± -

Genau ± R = ± ±Stärker als ±, aber geringer als bzw. gleich 1+ ± < R = 1+ 1+Stärker als 1+, aber geringer als 3+ 1+ < R < 3+ 2+Genau 3+ R = 3+ 3+Stärker als 3+ R > 3+ 4+

Die Reaktivität muss für alle Teststreifen getrennt bewertet werden.Zur Erleichterung der Interpretation ist dem Testkit eine Interpretationshilfebeigefügt.

Zur einfacheren Identifikation der einzelnen Banden können die Teststreifenan die 3+-Kontrollbande der Interpretationshilfe angelegt werden.

Validierung

Bevor der Test abgelesen wird, müssen die Validität der positiven und negativenKontrollstreifen und die Reaktionen der Kontrollen auf den einzelnen Teststreifenbeurteilt werden.

Validierung des Test-Laufs:

1. Auf dem Positivkontrollstreifen müssen die Antigenbanden C1, C2, NS3und NS4 mindestens eine Farbstärke von 1+ haben. Die AntigenbandenE2 und NS5 können negativ sein.

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2. Auf dem Negativkontrollstreifen dürfen die Antigenbandennegativ sein,d.h. keine Farbreaktion zeigen, die stärker oder genau so stark wie dieder ±-Kontrolle ist.

Validierung eines einzelnen Streifens:

1. Die Kontrollen 1+, ± und die stark positive Kontrolle 3+ müssen sichtbar sein.2. Die Intensität der Kontrolle 3+ muss größer als die der Kontrolle 1+ sein,

und die Intensität der Kontrolle 1+ muss größer als die der Kontrolle ± sein.3. Die anti-Streptavidin-Bande muss negativ sein.

HINWEIS:• Die Teststreifen müssen vor der Interpretation vollständig trocken

sein, um Fehlinterpretationen zu vermeiden, weil nach der Zugabevon Stopplösung schwache Banden auftreten können.

• Legen Sie kein Papier auf die Membranoberfläche, solange sie

nicht vollständig getrocknet ist.• Bei Proben mit IgG-Konzentrationen oberhalb des normalen

Bereichs können die Kontrollbanden schwach gefärbt sein.

Interpretation der Ergebnisse

Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurde die Interpretation der Ergebnisse wie folgt festgelegt:

Eine Probe wird als NEGATIV für HCV-Antikörper beurteilt:- wenn alle HCV-Antigenbanden negativ zu bewerten sind- wenn nur eine einzige HCV-Antigenbande eine Reaktivität von ± aufweist,

es sei denn, dass es sich um die NS3-Bande handelt.

Eine Probe wird als POSITIV für HCV-Antikörper beurteilt:- wenn mindestens zwei HCV-Antigenbanden eine Reaktivität von

mindestens ± aufweisen.

Eine Probe wird als FRAGLICH beurteilt:- wenn eine HCV-Antigenbande eine Reaktivität von 1+ oder größer aufweist.- wenn die NS3-Bande eine Reaktivität von ± oder größer hat, während

alle anderen Antigenbanden ein negatives Ergebnis aufweisen.

Interpretationssoftware: LiRAS™ für Infektionskrankheiten

Das LiRAS™-Softwarepaket für Infektionskrankheiten ist zur Unterstützungder Interpretation der LIA-Ergebnisse bestimmt.Um die jeweils aktuellste Version zu bestellen, setzen Sie sich bitte mit der

deutschen Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.




ACHTUNG:- Verwenden Sie nicht die automatisierte Interpretation ohne die unten

beschriebene Limitierung des Verfahrens zu beachten.

Einschränkungen des Verfahrens

- Um ein optimales Testergebnis zu erzielen, muss das beschriebeneTestprotokoll genau eingehalten werden.

- Proben, bei denen lediglich die NS3-Bande eine Reaktivität von ± oder größer aufweist, können unter Umständen eine HCV-Serokonversionaufweisen. Sie sind daher als fraglich zu interpretieren.

- Wenn das Testergebnis FRAGLICH ausfiel, wird eine erneute Testungeiner Probe des Patienten nach einigen Wochen empfohlen.

- Eine Probe, bei der die Streptavidin-Kontrolllinie eine positive Reaktionanzeigt, kann Kreuzreaktionen mit anderen HCV-Antigen-Bandenverursachen und kann daher nicht als HCV-positiv gewertet werden.

- In frühen Phasen der Infektion sind Anti-HCV Antikörper möglicherweisenicht nachweisbar.

- Bei Hämodialysepatienten sind Anti-HCV Antikörper möglicherweisenicht nachweisbar

- Die Verwendung verdünnter Proben kann zu falschen Ergebnissen führen.- Vor Einleitung einer Behandlung oder invasiver Maßnahmen sollten

Parameter zur Bewertung von Leberschäden und das Vorhandensein

von HCV-RNA bestimmt werden.Leistungsfähigkeit des Tests

Sensitivität

Serokonversions- und Niedrigtiter-PanelsIntern mit dem Test INNO-LIA™ HCV Score gewonnene Ergebnisse mit Auto-LIA™, 2 Stunden Inkubationszeit, und dem manuellen Verfahren, 16 StundenInkubationszeit, an 13 BBI-Serokonversions-Panels (PHV 904 - 916), 2 BBI-

Niedrigtiter-Panels (PHV103 und 204) und dem SFTS94 Panel wurden mitCHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA und INNO-LIA™ HCV Ab III verglichen.

Mit der 2-Stunden- und der 16-Stunden-Methode wies INNO-LIA™ HCVScore bei 7 Panels Antikörper früher als CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIAnach, während der Nachweis bei 4 Panels zur selben Zeit positiv wurde.CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA wies bei einem Panel die die Antikörper früher als INNO-LIA™ HCV Score, 2 Stunden und 16 Stunden, nach.Bei einem Panel gelang mit keinem der beiden Tests ein Nachweis.

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Mit der 2-Stunden-Methode wies INNO-LIA™ HCV Score bei 2 Panels Antikörper früher als INNO-LIA™ HCV Ab III update nach, während der Nachweis bei 10Panels zur gleichen Zeit positiv wurde. Mit der 16-Stunden-Methode gelang der Nachweis mit INNO-LIA™ HCV Score bei 4 Panels früher. Bei 7 Panels wurdendie Proben zur selben Zeit positiv, und bei einem Panel später.

Die zwei 2 BBI-Niedrigtiter-Panels enthalten 40 Proben, von denen jeweils 28bzw. 32 Proben mit INNO-LIA™ HCV Score, 2-Stunden- bzw.16-Stunden-Methode, als positiv befundet wurden. 35 dieser Proben wurden mitCHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA als positiv bestimmt, 34 wurden mit INNO-LIA™ HCV Ab III update als positiv bestimmt. Alle Proben, die mit CHIRON®

RIBA® HCV 3.0 SIA oder INNO-LIA™ HCV HCV Ab III update als positivbefundet wurden, waren mit INNO-LIA™ HCV Score positiv oder fraglich.

Von den 49 Proben des SFTS94-Panels waren 38 (INNO-LIA™ HCV Score,2-Stunden-Inkubation), 41 (INNO-LIA™ HCV Score, 16-Stunden-Inkubation)und 40 Proben (INNO-LIA™ HCV Ab III update) positiv. 31 dieser Probenwurden mit CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA als positiv befundet.

HCV-positive ProbenInsgesamt wurden intern 257 Proben von HCV-infizierten Patienten, diezuvor mit 2 Screening-Assays und INNO-LIA™ HCV Ab III update als positivbefundet wurden, mit INNO-LIA™ HCV Score ( Auto-LIA™ 2-Stunden-Inkubation) untersucht. Bis auf eine fragliche Probe wurde alle Proben als

positiv befundet. Daraus ergibt sich bei Einschluss der fraglichen Probe eineSensitivität von 100% (257/257).

Unterschiedliche GenotypenIntern wurden folgende Genotypen mit INNO-LIA™ HCV Score ( Auto-LIA™2-Stunden-Inkubation) untersucht: 1a (15 Proben), 1b (15 Proben), 2 (15Proben), 3a (15 Proben), 4a (15 Proben), 4 non-a (5 Proben), 5 (5 Proben).Bei allen Proben fiel das Ergebnis positiv aus. Daraus ergibt sich eineSensitivität von 100% (85/85).

Spezifität

Blutspender 400 als negativ bewertete Blutspenderproben wurden intern analysiert (manuell,16-Stunden-Inkubation). Beim Ersttest waren 377 Proben negativ, 22 fraglichund eine positiv. Daraus ergibt sich eine Spezifität von 94,3% (377/400).Bei einem Wiederholungstest (Doppelbestimmung) wurde die zuerst als positivermittelte Probe negativ befundet; die Spezifität lag nun bei 94,5% (378/400).




Klinische Proben205 klinische Proben wurden intern getestet (manuell, 16-Stunden-Inkubation),davon 189 mit negativem, 11 mit fraglichem und 5 mit positivem Ergebnis.3 der 5 positiven Proben wurden bei Neutestung als Doppelbestimmungen alsnegativ befundet. Eine der zwei positiven Proben zeigte bei der

Wiederholungsbestimmung und auch bei INNO-LIA™ HCV Ab III update einpositives Ergebnis. die andere Probe wurde mit beiden Tests als fraglichbefundet. Bei Ortho® HCV 3.0 ELISA mit Enhanced SAVe und INNOTEST™HCV Ab IV war das Ergebnis negativ. Eine der beiden Proben wurde auch mitCHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA getestet, ebenfalls mit negativem Ergebnis.Die aus dieser Probenreihe ermittelte Spezifität liegt bei Ersttestung bei92,2% (189/205) und im Wiederholungstest bei 93,7% (192/205).

Proben mit potentiell zu erwartenden Wechselwirkungen

137 Proben mit potentiell zu erwartenden Wechselwirkungen wurden interngetestet (manuell, 16-Stunden-Inkubation): 127 Proben waren negativ, 9 fraglich,1 Probe war positiv. Bei Neutestung als Doppelbestimmung wurde einmal einpositives und einmal ein fragliches Ergebnis erhalten. Mit INNO-LIA™ HCV Ab IIIUpdate wurde mit dieser Probe ein positives Ergebnis erhalten. Bei Testung mitOrtho® HCV 3.0 ELISA mit Enhanced SAVe, INNOTEST™ HCV Ab IV undCHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA war die Probe negativ.Die aus dieser Probenreihe ermittelte Spezifität liegt bei 92,7% (127/137).

Reproduzierbarkeit Zwei Laboranten untersuchten ein Panel mit 13 HCV-positiven Probensowie drei verschiedene Chargen der Positiv- und Negativkontrolle mit Auto-LIA™, 2-Stunden Inkubation. Ein dritter Laborant testete das Panel mit einer der Chargen. Trotz unterschiedlicher Chargen erhielten alle drei Laborantenidentische Ergebnisse.

Italiano

Uso previstoINNO-LIA™ HCV Score è un test immunoblot su striscia (Line Immuno Assay),per la determinazione di anticorpi diretti contro il virus dell'epatite C umana insiero o plasma umani. Il suo uso è previsto come test supplementare sucampioni di siero o plasma umani trovati reattivi utilizzando una procedura discreening per anti-HCV.

Principio del test

INNO-LIA™ HCV Score è un immunoblot su striscia di 3° generazione cheincorpora antigeni HCV derivati dalla regione del core, dalla regioneipervariabile E2 (HVR), dalla regione elicasi, dalle regioni NS3, NS4A,NS4B, e NS5A.

INNOGENETICS® 46



Gli antigeni sono stati immobilizzati in sei bande su strisce di nylon adesead un supporto plastico. In aggiunta sono fissate su ogni striscia quattrobande di controllo: la banda di controllo della streptavidina, un controllopositivo 3+ (anti-Ig umane), un controllo positivo 1+ (IgG umane), e unabanda cut-off ± (IgG umane).

INNO-LIA™ HCV Score è basato sul principio di un test immunoenzimatico.Un campione diluito è incubato in una vaschetta insieme ad una striscia LIA.Se presenti nel campione, gli anticorpi HCV si legheranno alle bandeantigeniche HCV presenti sulla striscia. Successivamente viene aggiunto unconiugato, purificato per affinità, di fosfatasi alcalina legata ad anti IgGumane di capra (H+L) che reagisce con i complessi specifici HCV antigene/anticorpo, se precedentemente formati. L'incubazione con l'enzima substratoproduce un colore marrone, la cui intensità è proporzionale alla quantità di

anticorpi HCV-specifici catturati dal campione su ogni banda specifica (Fig. 1).Lo sviluppo del colore viene bloccato con acido solforico.

Reagenti

Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione

raccomandate

- Se lasciati a 2 - 8°C, tutti i reagenti, aperti o non aperti, sono stabili finoalla data di scadenza. Non congelare i reagenti.

- Tutti i reagenti e il tubo di plastica contenente le strisce devono essereportati a temperatura ambiente (18 - 25°C) approssimativamente30 minuti prima dell'uso e riposti nel frigorifero (2 - 8°C) immediatamentedopo l'uso.

- Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicareinstabilità o deterioramento.

- Dopo l'apertura del tubo originale contenente le strisce, ogni strisciainutilizzata sarà stabile per 16 settimane se conservata a 2 - 8°C neltubo originale chiuso con essiccante.

Reagenti forniti:

Componenti Quantità Rif. Descrizione

Strisce 20 57329 Contenente 20 strisce INNO-LIA™ HCVsensibilizzate.

Diluente del campione 30 ml 57304 Tampone fosfato colorato (verde)contenente cloruro di sodio, detergenti,proteine bovine stabilizzatrici e 0.3% di

cloroacetammide (CAA) comeconservante.




Coniugato pronto all'uso 45 ml 57301 Reattivo colorato (rosso) contenenteanti IgG umane di capra legate confosfatasi alcalina in tampone Tris,proteine bovine stabilizzatrici, detergentie 0.01% di metilisotiazolone (MIT)/0.1% CAA come conservante.

Controllo negativo 0.12 ml 57307 Contenente matrice di base di origineumana con 0.01% MIT/0.1% CAA comeconservante.

Controllo positivo 0.12 ml 57308 Contenente siero umano inattivato positivoper anticorpi diretti contro HCV, con 0.01%MIT/0.1% CAA come conservante.

Substrato BCIP/NBT 45 ml 57302 Contenente 5-bromo-4-cloro-3-indolilpronto all'uso fosfato/nitroblu di tetrazolio in dimetil

formammide, con 0.01% MIT/0.1% CAA

come conservante.Soluzione di stop 45 ml 57303 Contenente 0.1 mol/l di acido solforico.

Soluzione di lavaggio 45 ml 57299 Tampone Tris colorato (blu) contenentecloruro di sodio, detergente e 0.02%bromo-nitro-diossano come conservante,da diluire 5x in acqua distillata.La soluzione diluita è stabile per2 settimane se conservata a 2 - 8°C.

Vassoio di incubazione 2 - Contenente 11 vaschette ciascuno.

Pellicole adesive 5 -Foglio di report dei dati 1 - Per la conservazione delle strisce

sviluppate.

Carta di lettura 1 - Per l'identificazione delle bandeantigeniche reattive.

Materiali richiesti ma non forniti

- Acqua distillata o deionizzata.

- Pipette di precisione (con puntali monouso) capaci di dispensare 10 µl,20 - 200 µl, e 200 - 1000 µl, rispettivamente.- Agitatore orbitale o basculante (vedi Indicazioni per l'incubazione).- Vortex o equivalente.- Cilindri graduati: 10, 25, 50 e 100 ml.- Pinzette per la manipolazione delle strisce.- Timer.- Opzionale:

• riscaldatore ad aria (asciugacapelli) o incubatore a secco a 37°C

• pipetta a ripetizione e provette monouso per l'aggiunta di acidosolforico, coniugato, substrato e soluzione di lavaggio• aspiratore a vuoto che contenga ipoclorito di sodio al 5% nella

bottiglia di scarico.

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Sicurezza e ambiente

- Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza e alle etichettesul prodotto per informazioni relative a composti potenzialmentepericolosi.

R43, S24-37Irritante! (Xi) Evitare il contatto con la pelle. Può causare sensibilizzazioneper contatto con la pelle. Indossare guanti monouso.Contiene 2-Cloroacetammide: Diluente del campione, Coniugato prontoall'uso, Substrato pronto all'uso BCIP/NBT e Controllo negativo.

- Campioni, Controllo positivo e Controllo negativo devono sempreessere maneggiati come potenzialmente infetti.- Il Controllo positivo è stato trovato negativo per anti-HCV e HbsAg.

Il Controlle negativo è stato trovato negativo per anti-HIV-1/HIV-2,anti-HCV e HbsAg. Nessun metodo di indagine può offrire la completasicurezza che i prodotti derivati dal sangue non trasmettano agentiinfettanti.Per questo motivo tutti i componenti del sangue e i materiali biologicidevono essere considerati come potenzialmente infetti e maneggiati

come tali. La procedura deve essere eseguita solo da personaleadeguatamente addestrato. Tutti i componenti del sangue e i materialibiologici devono essere smaltiti in accordo con le procedure disicurezza standardizzate.• Autoclavare per almeno 15 minuti a 121°C.• Incenerire il materiale monouso.• Miscelare i liquidi di scarico con ipoclorito di sodio in modo che la

concentrazione finale di sodio ipoclorito sia di ± 1%. Lasciare riposaretutta la notte prima di smaltire. ATTENZIONE: Neutralizzare il liquido di

scarico che contiene acido prima di aggiungere ipoclorito di sodio.- E' necessario l'uso di dispositivi di protezione personale: guanti e

occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti infetti o pericolosi.- I rifiuti devono essere smaltiti in accordo con le linee guida disposte

dalle istituzioni. Si osservino inoltre le leggi ambientali statali e locali.- Non scaricare la Soluzione di stop in flaconi che contengano ipoclorito

di sodio.

Campioni (raccolta e trattamento)

- INNO-LIA™ HCV Score può essere eseguito su siero umano o plasmaconservato in provette contenenti citrato, eparina o EDTA comeanticoagulanti.




- Prima della conservazione il siero o il plasma devono essere separatidai coaguli o dalle cellule del sangue mediante centrifugazione.

- Conservare i campioni a 2 - 8°C. Per conservazioni più lunghe di unasettimana, congelare a -20°C o temperature inferiori.

- Non usare campioni trattati al calore.

- Il congelamento e scongelamento ripetuto dei campioni (più di 3 volte)può produrre risultati errati.

Note e precauzioni

- Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.- Non miscelare i reagenti con diversi numeri di lotto.- Assicurarsi che vengano usati volumi corretti di campione e

numeri corretti di lavaggio necessari per la procedura del test.- Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.- Assicurarsi che i campioni e i controlli siano omogenei prima dell'utilizzo.- Non toccare la membrana della striscia. Manipolare sempre le strisce

tramite il supporto plastico.- Usare un nuovo puntale per ogni campione.- Assicurarsi che le strisce siano posizionate nelle vaschette con il lato

della membrana rivolto verso l'alto.- Tutti i passaggi di incubazione devono essere eseguiti utilizzando un

agitatore orbitale o basculante (utilizzare l'agitatore basculante solo per

l'incubazione overnight). Ai fini del raggiungimento della colorazione delle bande e della massimasensibilità è importante il movimento delle soluzioni al di sopra dellestrisce. Durante l'agitazione la superficie della striscia deve esserecompletamente immersa.

- Coprire i vassoi con una pellicola adesiva per evitare che le strisce siasciughino durante l'incubazione notturna.

- Le strisce inutilizzate e sviluppate devono essere tenute lontano dallaluce e dal calore.

- Il kit deve essere utilizzato solo da personale addestrato alle pratiche dilaboratorio.- Il riutilizzo delle strisce o delle vaschette può portare a risultati errati.- Tagliare le strisce può portare a risultati errati.

Procedura del test

Leggere Note e precauzioni prima di eseguire il test.

- Incubazione del campione per 16 ore

1. Utilizzare la quantità richiesta di vaschette, tenendo presente chedevono essere aggiunti ad ogni seduta un Controllo positivo e unControllo negativo.Identificare le vaschette come controlli e campioni, e porli nel vassoio.

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2. Aggiungere 1 ml di Diluente del campione ad ogni vaschetta.3. Aggiungere 10 µl di appropriato campione o controllo alla rispettiva

vaschetta siglata.4. Rimuovere la quantità richiesta di strisce LIA dal loro contenitore,

e aggiungere una striscia ad ogni vaschetta del test. La striscia viene

posizionata nella vaschetta, utilizzando delle pinzette, con il latomembrana rivolto verso l'alto.LA STRISCIA DEVE ESSERE COMPLETAMENTE IMMERSA.

5. Coprire le vaschette con una pellicola adesiva (vedi Note eprecauzioni). Incubare i campioni ponendo il vassoio su un agitatoreorbitale o basculante (vedi Indicazioni per l'incubazione) e agitareOVERNIGHT (16 ± 2 h) a temperatura ambiente (18 - 25°C).NOTA:• Rimuovere con attenzione la pellicola adesiva per evitare cross-

contaminazione.6. Lavare ogni striscia 3 volte (5 minuti) con 1 ml di Soluzione di lavaggio

(vedi Indicazioni per il lavaggio).7. Aggiungere 1 ml di Soluzione coniugato ad ogni vaschetta.8. Incubare con il coniugato ponendo il vassoio su un agitatore orbitale o

basculante e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente (18 - 25°C).9. Lavare ogni striscia 3 volte (5 minuti) con 1 ml di Soluzione di lavaggio

(vedi Indicazioni per il lavaggio).10. Aggiungere 1 ml di Soluzione substrato ad ogni vaschetta.

11. Incubare con il substrato ponendo il vassoio su di un agitatore orbitale obasculante, e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente (18 - 25°C).

12. Aspirare il liquido. Aggiungere 1 ml di Soluzione di stop ad ogni vaschetta.13. Incubare con la soluzione di stop ponendo il vassoio su di un agitatore

orbitale o basculante e agitare per 10 - 30 minuti a temperatura ambiente(18 - 25°C).

14. Aspirare la Soluzione di stop.15. Rimuovere le strisce dalle vaschette e porle, mediante l'aiuto di pinzette,

con la membrana rivolta verso l'alto su di un foglio di carta assorbente. Appena le strisce si sono completamente asciugate, si possonointerpretare i risultati. Per accelerare il processo di asciugatura, porre lestrisce in un incubatore a secco a 37°C per 30 minuti oppure utilizzare unasciugacapelli per 1 minuto. Le strisce sviluppate manterranno il lorocolore se conservate al buio.

- Incubazione del campione per 2 e 3 ore

Per il protocollo "incubazione del campione per 2 e 3 ore" viene seguita la

stessa procedura di 15 passaggi del protocollo "incubazione del campione per 16 ore", ma va tenuto presente che cambiano i passaggi 3 - 5 - 6 e 9. Il volumedei campioni e dei controlli aumenta da 10 - 20 µl (passaggio 3) e il tempo diincubazione del campione cambia a 2 o 3 ore (passaggio 5). I lavaggi dopol'incubazione del campione cambiano, per la procedura di 2 ore a 3 volte per




10 minuti, e per la procedura di 3 ore a 3 volte per 6 minuti (passaggio 6);infine il secondo lavaggio è di 3 volte per 3 minuti per l'incubazione delcampione di 2 e 3 ore.

Tabella con il sommario delle procedure del test e rilevazione delle differenze

(grassetto):

Incubazione del Incubazione del Incubazione delcampione di 16 ore campione di 2 ore campione di 3 ore

Diluente del campione 1 ml 1 ml 1 mlCampione 10 µl 20 µl 20 µlControlli 10 µl 20 µl 20 µlStrisce LIA 16 ore ± 2 ore 2 ore 3 oreLavaggio 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 10 min 1 ml/3 x 6 minConiugato pronto all'uso 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minLavaggio 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 3 min 1 ml/3 x 3 minSubstrato pronto all'uso 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minSoluzione di Stop 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min

Indicazioni per il lavaggio

- Dopo incubazione overnight, di 2 ore o di 3 ore, rimuovere con attenzionela pellicola adesiva.

- Aspirare il liquido dalla vaschetta con una pipetta, preferibilmentecollegata ad un aspiratore a vuoto, che contenga nella bottiglia di

scarico una soluzione al 5% di ipoclorito di sodio.Inclinare il vassoio per permettere a tutto il liquido di portarsi ad unangolo della vaschetta (dal lato del supporto di plastica della striscia)

- Aggiungere 1 ml di soluzione di lavaggio diluita ad ogni vaschetta eagitare per 1 minuto su di un agitatore orbitale o basculante.

- Ripetere questi passaggi tante volte quanto indicato nella procedura del test.NOTA:• Non lasciare asciugare le strisce durante i passaggi di lavaggio.• Assicurarsi di non danneggiare la superficie delle strisce mentre si

aspira.• Assicurarsi che l'intera striscia sia ben lavata mediante completa

immersione nella soluzione di lavaggio.• Adattare la velocità dell'agitatore quando necessario.

Indicazioni per l'incubazione

- Tutti i passaggi di incubazione (incubazione del campione, coniugato,substrato e acido solforico) così come i passaggi di lavaggio devono

essere eseguiti su un agitatore orbitale o basculante (utilizzarel'agitatore basculante solo per l'incubazione overnight).- Durante l'incubazione e i passaggi di lavaggio, la superficie della striscia

deve essere completamente immersa, con il lato membrana rivolto versol'alto.

INNOGENETICS® 52



- Gli agitatori orbitali o basculanti devono permettere un movimento reciproco(avanti e indietro) della striscia nella vaschetta, e il movimento del liquidosulla striscia senza permettere la fuoriuscita del liquido dalla vaschetta.

- La velocità generata dall'agitatore orbitale o basculante è critica per ilraggiungimento della colorazione di ogni striscia e per il raggiungimento

della massima sensibilità.Raccomandazioni per un agitatore orbitale:• Il diametro del movimento circolare deve essere uguale o superiore a 13 mm• La velocità raccomandata per un movimento circolare di 13 mm è 160 rpm• La velocità raccomandata per un movimento circolare di 24 mm è di 90 rpm.Raccomandazioni per un agitatore basculante:• La differenza tra il punto più alto e quello più basso non deve superare gli 80 mm,

per evitare la fuoriuscita di liquido• La velocità raccomandata è di 34 rpm.

Procedura automatica del test: Auto-LIA™La procedura LIA può facilmente essere automatizzata utilizzando lo strumento

Auto-LIA™. Questo strumento è un sistema "walk-away" con aspirazioneautomatica, dispensazione e incubazione. Per maggiori informazioni eprotocolli specifici su Auto-LIA™, si prega di contattare il vostro distributorelocale Innogenetics.

Si prega di leggere il paragrafo Note e precauzioni prima di eseguire il test.

Procedura di Auto-LIA™ in dettaglio- Incubazione del campione di 16 ore su Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 960 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 6 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

8. INC 6 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 6 min, shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

19. INC 3 min, shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP




24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END

- Incubazione del campione di 2 ore su Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, shake speed 43. PAUSE4. INC 120 min, shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min, shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min, shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min, shake speed 4

11. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, shake speed 420. ASP

21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, shake speed 426. ASP27. END

CH1 = Diluente del campioneCH2 = Soluzione di lavaggio

CH4 = ConiugatoCH5 = Soluzione di stopCH6 = Substrato

- Incubazione del campione di 3 ore su Auto-LIA™

Per il protocollo di "incubazione del campione di 3 ore" vengono eseguiti glistessi 27 passaggi per la procedura del test "incubazione del campione di2 ore" eccetto per i cambiamenti dei passaggi 4 - 6 - 8 e 10. Il tempo diincubazione del campione cambia a 180 minuti per la procedura di 3 ore

(passaggio 4) e il lavaggio dopo 3 ore di incubazione del campione cambiaa 3 volte per 6 minuti (passaggi 6 - 8 - 10).

INNOGENETICS® 54



Risultati

Lettura

L'identità e la localizzazione degli antigeni e dei controlli immobilizzati sullastriscia sono i seguenti: vedere Figura 1 pagina 16.

L'intensità della reazione sulle bande di controllo di ciascuna striscia vieneutilizzata per assegnare il valore di reattività per ogni antigene su ogni striscia:

Intensità della reazione della banda antigenica (R) Valore

Minore di ± R < ± -Uguale a ± R = ± ±Maggiore di ±, ma minore o uguale a 1+ ± < R ≤ 1+ 1+Maggiore di 1+ ma minore di 3+ 1+ < R < 3+ 2+

Uguale a 3+ R = 3+ 3+Maggiore di 3+ R > 3+ 4+

Il valore di reattività deve essere fatto separatamente per ogni striscia.Per facilitare l'interpretazione è inclusa una carta di lettura.L'allineamento della striscia sviluppata con la banda di controllo 3+ permettepiù facilmente l'identificazione delle bande.

Validazione

Controllare la validità delle strisce del controllo positivo e negativo e la validitàdei livelli di controllo su ogni striscia prima della lettura dei risultati del test.

Validazione della seduta:

1. La striscia del controllo positivo deve mostrare una reattività di almeno1+ sulle bande antigeniche C1, C2, NS3 e NS4. L'antigene E2 e NS5possono mostrare un valore negativo.

2. La striscia di controllo negativo deve mostrare un valore negativo(nessuna reazione o al di sotto del livello di controllo ± per tutte lebande antigeniche HCV).

Validazione di una singola striscia:

1. I livelli di controllo 1+ e ± e la forte banda di controllo positiva 3+ devonoessere visibili.

2. L'intensità del valore di controllo 3+ deve essere maggiore di quella dellabanda di valore 1+ e l'intensità del valore 1+ deve essere maggiore diquella del livello ±.

3. La banda di controllo per anti-streptavidina deve avere valore negativo.




NOTE:• La striscia deve essere completamente asciugata per evitare qualsiasi

erronea interpretazione dovuta a deboli bande che appaiono dopol'aggiunta della soluzione di stop.

• Non porre carta sulla superficie della striscia fintanto che è umida.

• Deboli bande di controllo possono essere osservate per campioni checontengono alti livelli di IgG (al di sopra del normale intervallo IgG).

Interpretazione dei risultati

Numerose valutazioni hanno mostrato che i risultati possono essere interpretaticome segue:

Un campione è NEGATIVO per anticorpi anti-HCV:- se tutte le bande antigeniche HCV hanno un valore di reattività negativo- se solo una delle bande antigeniche HCV mostra la reattività ±, eccetto

quando la reattività viene osservata per NS3.

Un campione è POSITIVO per anticorpi anti-HCV:- se almeno due bande antigeniche HCV mostrano una reattività minima

di ± o maggiore.

Un campione è considerato INDETERMINATO per anticorpi anti-HCV:

- se una banda antigenica HCV mostra una reattività di 1+ o maggiore- se la banda NS3 reagisce con un valore ± o maggiore e tutte le altrebande antigeniche sono negative.

Software di interpretazione: LiRAS™ per malattie infettive

Il software LiRAS™ per malattie infettive è predisposto per il supportonell'interpretazione dei risultati LIA. Si prega di contattare il vostro distributorelocale per ottenere la versione aggiornata.

ATTENZIONE:- Non utilizzare l'interpretazione automatica senza prendere in considerazione

i limiti della procedura descritte nel paragrafo successivo.

Limiti della procedura

- Il protocollo fornito deve essere scrupolosamente seguito per ottenereun'ottima performance del test.

- I campioni con una singola reattività +/- o più alta sull' NS3 possono

essere indicativi di una sieroconversione per HCV. Essi devono dunqueessere classificati come indeterminati.- Se si ottiene un risultato INDETERMINATO si raccomanda di testare un

ulteriore campione del paziente dopo qualche settimana.

INNOGENETICS® 56



- Un campione che mostri una reazione positiva sulla banda di controllodella streptavidina può causare cross-reazioni con altre bande antigenicheHCV e non può essere identificato come positivo per anticorpi anti-HCV.

- Anticorpi anti-HCV possono non essere determinabili in infezioni precoci.- Nel caso di emodialisi gli anticorpi possono essere non rilevabili.

- L'uso di campioni diluiti può portare a risultati errati.- I parametri per l'individuazione del danno epatico e la ricerca di positività

per HCV RNA devono essere successivamente investigati nei soggettianti-HCV positivi prima dell'inizio di un trattamento o di procedure invasive.

Performance del test

Sensibilità

Pannelli di sieroconversione/pannelli a basso titolo

I risultati di INNO-LIA™ HCV Score, utilizzando Auto-LIA™ con procedura diincubazione di 2 ore e procedura manuale di incubazione di 16 ore sonostati ottenuti internamente su 13 pannelli di sieroconversione BBI (da PHV904 a 916), su 2 pannelli BBI a basso titolo (PHV103 e 204), e sul pannelloSFTS94. Questi risultati sono stati comparati con i risultati di CHIRON®

RIBA® HCV 3.0 SIA e INNO-LIA™ HCV Ab III update.

INNO-LIA™ HCV Score utilizzando procedure di incubazione del campionedi 2 ore e di 16 ore ha individuato positività in anticipo rispetto a CHIRON ®

RIBA®

HCV 3.0 SIA in 7 pannelli, e 4 pannelli sono diventati positivi nellostesso tempo. CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA ha individuato anticorpi primadi INNO-LIA™ HCV Score, utilizzando entrambe le procedure di incubazionedel campione, in un pannello. Un pannello non ha mostrato positività connessuno di questi test.

INNO-LIA™ HCV Score con procedura di incubazione di 2 ore ha individuatoanticorpi più precocemente di INNO-LIA™ HCV Ab III update in 2 pannelli,e gli altri 10 pannelli sono diventati positivi nello stesso tempo. Utilizzando la

procedura con incubazione di 16 ore, 4 pannelli sono stati rilevati positiviprima che con INNO-LIA™ HCV Ab III update, 7 pannelli sono divenutipositivi nello stesso tempo, e un pannello è divenuto positivo più tardi.

Su 40 campioni appartenenti a 2 pannelli BBI a basso titolo, 28 e 32 campionisono risultati positivi con INNO-LIA™ HCV Score utilizzando rispettivamentela procedura di 2 e 16 ore di incubazione del campione. Trentacinque di questicampioni sono risultati positivi con CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA, mentre 34risultavano positivi utilizzando INNO-LIA™ HCV Ab III update. Tutti i campioni

positivi con CHIRON

®

RIBA

®

HCV 3.0 SIA o con INNO-LIA™ HCV Ab IIIupdate erano positivi o indeterminati utilizzando INNO-LIA™ HCV Score.




Su 49 campioni appartenenti al pannello SFTS94, 38, 41, e 40 campionisono risultati positivi rispettivamente con INNO-LIA™ HCV Score usando2 e 16 ore di incubazione del campione, e con INNO-LIA™ HCV Ab III update.Trentuno di questi campioni sono risultati essere positivi con CHIRON® RIBA®

HCV 3.0 SIA.

Campioni HCV-positiviUn totale di 257 campioni, originanti da pazienti HCV infetti e trovati esserepositivi a due test di screening e ad INNO-LIA™ HCV Ab III update, sonostati analizzati internamente con INNO-LIA™ HCV Score utilizzando Auto-LIA™ e la procedura di incubazione del campione di 2 ore. Tutti i campionisono risultati positivi ad eccezione di un singolo campione risultatoindeterminato, raggiungendo in tal modo una sensibilità, includendo ilsingolo risultato indeterminato, del 100% (257/257).

Differenti genotipiINNO-LIA™ HCV Score utilizzando Auto-LIA™ con procedura di incubazionedel campione di 2 ore è stato eseguito internamente su 15 campioni digenotipo 1a, 15 di 1b, 15 di genotipo 2, 15 di genotipo 3a, 15 di genotipo 4a,5 di genotipo 4 non-a, e 5 di genotipo 5. Tutti i campioni sono risultati positivi,dando una sensibilità del 100% (85/85).

Specificità

Donatori di sangueUn totale di 400 donatori di sangue risultati negativi per anticorpi anti-HCV èstato analizzato internamente utilizzando la procedura manuale di incubazionedel campione di 16 ore. Dopo il test iniziale, 377 campioni sono risultati negativi,22 campioni indeterminati, e un campione positivo, dando una specificità inizialedi 94.3% (377/400). Il campione inizialmente risultato positivo, dopo un testeffettuato in doppio ha dato risultato negativo, portando ad una specificità doporipetizione del 94.5% (378/400).

Campioni cliniciDuecentocinque campioni clinici sono stati testati internamente utilizzando laprocedura manuale, con incubazione del campione di 16 ore.Centoottantanove di essi sono risultati negativi, 11 indeterminati, e 5 positivi.Tre di questi 5 campioni sono risultati negativi dopo avere ripetuto il test induplicato. Uno degli altri 2 campioni è risultato positivo dopo la ripetizionedel test con INNO-LIA™ HCV Score e dopo il test con INNO-LIA™ HCV AbIII update, mentre l'altro campione è risultato indeterminato su questi test.Entrambi i campioni erano negativi con Ortho® HCV 3.0 ELISA con

Enhanced SAVe e con INNOTEST™ HCV Ab IV. Uno di questi duecampioni è stato testato con CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA, ed è risultatonegativo. Per questo set di campioni, è stata ottenuta una specificità inizialedel 92.2% (189/205), mentre dopo la ripetizione del test del 93.7% (192/205).

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Campioni potenzialmente interferentiCentotrentasette campioni potenzialmente interferenti sono stati testatiinternamente utilizzando la procedura manuale di incubazione del campione di16 ore. Centoventisette campioni sono risultati essere negativi, 9 indeterminati,e uno positivo. Dopo avere ripetuto il test in duplicato, questo campione è

risultato una volta positivo e poi indeterminato, mentre è stato ottenuto unrisultato positivo con INNO-LIA™ HCV Ab III Update. Questo campione èrisultato essere negativo con Ortho® HCV 3.0 ELISA con Enhanced SAVe, conINNOTEST™ HCV Ab IV, e con CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA. Su questo setdi campioni è stata ottenuta una specificità del 92.7% (127/137).

Riproducibilità

Due sperimentatori hanno testato un pannello di 13 campioni anti-HCV positivi,un controllo positivo e un controllo negativo, con 3 differenti lotti, utilizzando

Auto-LIA™ con procedura di incubazione del campione di 2 ore, mentre unterzo sperimentatore ha testato questo pannello con uno di questi lotti.L'uso di differenti lotti di strisce e la performance di diversi operatori ha portatoagli stessi risultati.

Español

Finalidad de uso

El INNO-LIA™ HCV Score es un inmunoensayo en tira (LIA) para ladetección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C humano en suero oplasma humanos. Está destinado a utilizarse como un ensayocomplementario en muestras de suero o plasma humano que resultaronreactivos utilizando un procedimiento de cribaje anti-VHC.

Principio del ensayo

El INNO-LIA™ HCV Score es un inmunoensayo en tira de 3a generación queincorpora antígenos de VHC derivados de la región principal, de la región

hipervariable (RHV) E2, de la región helicasa NS3 y de las regiones NS4A,NS4B y NS5A.

Se basa en una tira de nylon con soporte de plástico, recubierta con losantígenos mencionados, en forma de 6 bandas. Además, en cada tira haycuatro bandas de control: una banda de control de estreptavidina, controlpositivo 3+ (anti-Ig humano), control positivo 1+ (IgG humano) y banda decorte ± (IgG humano).

El INNO-LIA™ HCV Score está basado en el mismo principio que uninmunoensayo enzimático. Se incuba una muestra en una cubeta con la tira deensayo del LIA. Si están presentes en la muestra, los anticuerpos anti-VHC seunirán a las bandas de antígeno de la tira. Posteriormente, se añade unconjugado (H+L) anti-IgG humano de cabra marcado con fosfatasa alcalina




purificada, que reacciona con complejos antígeno-anticuerpo de VHCespecíficos, siempre y cuando se hayan formado previamente. La incubacióncon el sustrato enzimático produce una coloración marrón oscuro, cuyaintensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico de VHCcapturado en una banda determinada (Fig. 1). El revelado colorimétrico se

detiene con ácido sulfúrico.

Reactivos

Descripción, preparación para el uso y condiciones de almacenamiento

recomendadas

- Si se mantienen a una temperatura de 2 - 8°C, todos los reactivos,abiertos o sin abrir, son estables hasta su fecha de caducidad.No congele los reactivos.

- Todos los reactivos, así como el tubo de plástico que contiene las tirasde ensayo, deben sacarse de la nevera aproximadamente 30 minutosantes de su uso para que alcancen la temperatura ambiente (18 - 30°C);tras su uso, deben devolverse inmediatamente al refrigerador (2 - 8°C).

- Las alteraciones de la apariencia física de los reactivos pueden ser signos de inestabilidad o deterioro.

- Una vez abierto el tubo original que contiene las tiras, las tiras que no sehayan utilizado son estables durante 16 semanas si se almacenan a unatemperatura de 2 - 8°C con desecante en el envase original cerrado.

Reactivos suministrados:

Componente Cantidad Ref. Descripción

Tiras 20 57329 Contiene 20 tiras reactivas INNO-LIA™recubiertas de antígeno de VHC.

Diluyente de la muestra 30 ml 57304 Contiene tampón fosfato con código decolor (verde) que contiene a su vezcloruro sódico, detergente,estabilizadores de proteína bovina y0,3% de cloroacetamida (CAA) comoconservante.

Conjugado listo 45 ml 57301 Contiene anticuerpos de cabrapara usar anti-IgG humano con código de color

(rojo) marcado con fosfatasa alcalinaen tampón Tris que contiene a su vezestabilizadores bovinos, detergente y0,01% de metilisotiazolona (MIT)/0,1%de CAA como conservante.

Control negativo 0,12 ml 57307 Contiene matriz base de origenhumanem con 0,01% de MIT/0,1% deCAA como conservante.

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Control positivo 0,12 ml 57308 Contiene suero humano inactivadopositivo para anticuerpos de VHC con0,01% de MIT/0,1% de CAA comoconservante.

Sustrato BCIP/NBT 45 ml 57302 Contiene 5-bromo-4-cloro-3-listo para usar indoilfosfato/nitroazul de tetrazolio en

dimetilformamida, con 0,01% deMIT/0,1% de CAA como conservante.

Solución de parada 45 ml 57303 Contiene 0,1 mol/l de ácido sulfúrico.

Solución de lavado 45 ml 57299 Contiene tampón Tris con código decolor (azul) que a su vez contienecloruro sódico, detergente y 0,02% debromo-nitro-dioxano como conservante,y debe diluirse 5 veces en aguadestilada. La solución de lavado diluida

es estable durante 2 semanas si semantiene a una temperatura de 2 - 8°C.

Bandeja de incubación 2 - Con 11 cubetas cada una.

Hojas adhesivas 5 -

Hoja de resultados 1 - Para el almacenamiento de las tirasreveladas.

Tarjeta de lectura 1 - Para identificación de las bandas deantígeno reactivas.

Materiales necesarios que no se suministran

- Agua destilada o desionizada.- Pipetas de precisión, con punta desechable, de una capacidad de 10 µl,

20 - 200 µl, y 200 - 1.000 µl, respectivamente.- Agitador orbital (ver Instrucciones para la incubación).- Agitador de tipo vórtex o equivalente.- Probetas graduadas: 10, 25, 50 y 100 ml.- Pinzas para la manipulación de las tiras.

- Cronómetro.- Opcional:• ventilador de aire caliente (secador de pelo) o estufa a 37°C• una pipeta repetitiva con jeringas desechables para la adición de

ácido sulfúrico, conjugado, sustrato y solución de lavado• aspirador al vacío que contenga una solución al 5% de hipoclorito

sódico en un frasco desechable.

Seguridad y medio ambiente

- Consulte la hoja de datos de seguridad y la etiqueta del productopara obtener información acerca de componentes potencialmentepeligrosos.




R43, S24-37Irritante (Xi) Evite el contacto con la piel. Puede causar sensibilización por

contacto con la piel. Utilice guantes apropiados.Contiene 2-cloroacetamida: diluyente de la muestra, conjugado listo parausar, sustrato BCIP/NBT listo para usar y control negativo.

- Las muestras, el Control positivo y el Control negativo debenmanipularse siempre como productos potencialmente infecciosos.

- El Control positivo ha dado negativo a anticuerpos anti-VHC y HbsAg.El Control negativo ha dado negativo a anticuerpos anti-VIH-1/VIH-2,anti-VHC y HbsAg. Ningún método de ensayo puede ofrecer una

garantía absoluta de que la sangre y hemoderivados no transmitanagentes infecciosos.Por lo tanto, todos los componentes de la sangre y los materialesbiológicos deben considerarse como potencialmente infecciosos ymanipularse como tales. El procedimiento del ensayo sólo debellevarse a cabo por personal debidamente capacitado. Todos loscomponentes sanguíneos y los materiales biológicos deben desecharsesegún los procedimientos de seguridad establecidos.• Esterilice en autoclave durante al menos 15 minutos a 121°C.

• Incinere el material desechable.• Mezcle los residuos líquidos con hipoclorito sódico de forma que la

concentración final sea de ± 1% de hipoclorito sódico. Deje reposar toda la noche antes de llevar a cabo su eliminación.PRECAUCIÓN: Neutralice los residuos líquidos que contengan ácidoantes de añadir el hipoclorito sódico.

- Es imprescindible el uso de equipo protector personal: lleve siempreguantes y gafas de seguridad cuando manipule agentes peligrosos oinfecciosos.

- Los residuos deben manipularse con arreglo a las normas de eliminaciónde residuos de la institución. Asimismo, cumpla todas las normasmedioambientales nacionales, autonómicas y locales.

- No tire la solución de parada en un bidón de residuos que contengahipoclorito sódico.

Muestra (recogida y manejo)

- El INNO-LIA™ HCV Score puede llevarse a cabo en suero o plasma

humano recogido en tubos que contengan citrato, heparina o EDTAcomo anticoagulantes.- Para poder almacenar el suero o el plasma, debe separarlos antes de los

coágulos sanguíneos o las células sanguíneas mediante centrifugación.

INNOGENETICS® 62



- Almacene las muestras a una temperatura de 2 - 8°C. Para almacenarlasdurante más de una semana, congélelas en alícuotas a -20°C o menos.

- No utilice ninguna muestra tratada térmicamente.- Las muestras que se hayan congelado y descongelado en repetidas

ocasiones (más de 3 veces) pueden producir resultados erróneos.

Observaciones y precauciones

- No utilice el kit después de su fecha de caducidad.- No mezcle reactivos de diferente número de lote.- Asegúrese de que se utilizan los volúmenes de muestra y los tiempos

de lavado adecuados para el procedimiento de ensayo necesario.- Evite la contaminación microbiana de los reactivos.- Asegúrese de que las muestras y los controles estén homogeneizados

antes usarlos.- No toque la membrana de la tira. Sujete siempre las tiras por el soporte

de plástico.- Utilice una punta de pipeta nueva por cada muestra.- Asegúrese de colocar las tiras de ensayo en las cubetas con las

membranas hacia arriba.- En todos los pasos de incubación debe utilizarse un agitador orbital o

de balanceo (utilice el agitador de balanceo sólo para las incubacionesde muestras durante la noche).

Es importante agitar las soluciones por encima de las tiras para lograr una tinción uniforme y la máxima sensibilidad. Mientras agite la solución,mantenga la superficie de la tira completamente sumergida.

- Cubra las cubetas con la hoja adhesiva para evitar que las tiras sesequen durante la incubación de la muestra durante toda la noche.

- Mantenga alejados de la luz y el calor fuertes las tiras reveladas que nose utilicen.

- El kit sólo debe ser utilizado por personal experimentado en prácticasde laboratorio clínico.

- El uso repetido de las cubetas de ensayo puede provocar resultadoserróneos.- Si recorta las tiras se puede producir una interpretación errónea de los

resultados.

Procedimiento del ensayo

Antes de iniciar el ensayo, lea el apartado Observaciones y precauciones.

- Incubación de muestra durante 16 horas

1. Utilice la cantidad necesaria de cubetas de ensayo, teniendo en cuentaque para cada ensayo se debe utilizar un control positivo y un controlnegativo.




Identifique las cubetas de ensayo como controles y muestras y colóquelasen la bandeja.

2. Añada 1 ml de Diluyente de muestra a cada cubeta de ensayo paramuestras.

3. Añada 10 µl de la muestra o del control en la cubeta convenientemente

marcada.4. Coja la cantidad necesaria de tiras de ensayo LIA, y añada una tira a

cada cubeta de ensayo. Coloque con las pinzas la tira de ensayo con lamembrana hacia arriba dentro de la cubeta.LA TIRA DEBE QUEDAR TOTALMENTE SUMERGIDA.

5. Cubra las cubetas con la hoja adhesiva (ver apartado sobreObservaciones y precauciones). Incube las muestras colocando labandeja en un agitador orbital o de balanceo (consulte el apartadoInstrucciones para la incubación) DURANTE TODA LA NOCHE (16 ± 2 h)

a temperatura ambiente (18 - 25°C).NOTA:• Retire los selladores adhesivos con cuidado a fin de evitar

contaminaciones cruzadas.6. Lave cada tira de ensayo 3 veces (5 minutos) con 1 ml de solución

de lavado (ver Instrucciones de lavado).7. Añada 1 ml de solución de conjugado a cada cubeta de ensayo.8. Incube con el conjugado colocando la bandeja de ensayo en el agitador

durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25°C).

9. Lave cada tira de ensayo 3 veces (5 minutos) con 1 ml de soluciónde lavado (ver Instrucciones de lavado).

10. Añada 1 ml de solución del sustrato a cada cubeta de ensayo.11. Incube con el sustrato colocando la bandeja de ensayo en el agitador y

agite durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25°C).12. Aspire el líquido. Añada 1 ml de solución de parada a cada cubeta.13. Incube con la solución de parada colocando la cubeta de ensayo en el

agitador de 10 - 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25°C).14. Aspire la solución de parada.15. Retire las tiras de las cubetaes de ensayo y colóquelas con la

membrana hacia arriba en papel absorbente con la ayuda de las pinzas.Tan pronto como las tiras se hayan secado totalmente, se pueden leer los resultados. Para acelerar el proceso de secado, coloque las tiras enuna estufa de 37°C durante 30 minutos o utilice un secador de pelodurante 1 minuto. Las tiras reveladas retienen su color si se almacenanen condiciones de oscuridad.

INNOGENETICS® 64



- Incubación de muestra durante 2 o 3 horas

Durante el protocolo de "incubación de muestra durante 2 horas o 3 horas"deben seguirse los mismos 15 pasos del protocolo de ensayo "incubación demuestra durante 16 horas", aunque deben tenerse en cuenta ciertos cambiosen los pasos 3, 5, 6 y 9. El volumen para las muestras y controles aumentará de

10 - 20 µl (paso 3) y el tiempo de incubación de la muestra cambia a 2 o 3 horas(paso 5). El lavado que tiene lugar tras la incubación de la muestra pasa a serde 3 veces 10 minutos para el protocolo de 2 horas y de 3 veces 6 minutos parael protocolo de 3 horas (paso 6); finalmente, el segundo lavado es de 3 veces3 minutos para los protocolos de incubación de muestra durante 2 o 3 horas.

En la siguiente tabla se muestra el resumen de los procedimientos deensayo con las diferencias resaltadas (negrita):

Incubación de Incubación de Incubación demuestra durante muestra durante muestra durante

16 horas 2 horas 3 horas

Diluyente de la muestra 1 ml 1 ml 1 mlMuestra 10 µl 20 µl 20 µlControles 10 µl 20 µl 20 µlTiras de ensayo LIA 16 horas ± 2 horas 2 horas 3 horasLavado 1 ml/3 x 5 min. 1 ml/3 x 10 min. 1 ml/3 x 6 min.Conjugado LPU* 1 ml/30 min. 1 ml/30 min. 1 ml/30 min.Lavado 1 ml/3 x 5 min. 1 ml/3 x 3 min. 1 ml/3 x 3 min.Sustrato LPU* 1 ml/30 min. 1 ml/30 min. 1 ml/30 min.Solución de parada 1 ml/10 - 30 min. 1 ml/10 - 30 min. 1 ml/10 - 30 min.

*LPU = listo para usar

Instrucciones para el lavado

- Tras el proceso de incubación de toda la noche, 2 horas o 3 horas, retirecon cuidado la hoja adhesiva.

- Aspire el líquido de la cubeta con ayuda de una pipeta, preferiblemente

acoplada a un aspirador de vacío que contenga una solución al 5% dehipoclorito sódico en el bidón de residuos.La bandeja se coloca en un ángulo que permita que todo el líquidofluya hacia un lado de la cubeta (hacia la parte del soporte de plásticorecubierto de cada tira).

- Añada 1 ml de solución de lavado diluida a cada cubeta y agite durante1 minuto en un agitador orbital o de balanceo.

- Repita estos pasos tantas veces como se indique en el procedimientode ensayo.

NOTA:• No permita que las tiras se sequen entre las distintas fases de

lavado.




• Asegúrese de que no se deteriore la superficie de las tiras deensayo LIA cuando realice la aspiración.

• Asegúrese de lavar la tira sumergiéndola totalmente en la soluciónde lavado.

• Modifique la velocidad de agitación o balanceo cuando sea necesario.

Instrucciones para la incubación

- Todos los pasos de incubación (de la muestra, del conjugado, delsustrato y la incubación con ácido sulfúrico), así como los pasos delavado, deben llevarse a cabo en un agitador orbital o de balanceo(utilice el agitador de balanceo sólo para las incubaciones demuestras durante la noche).

- Durante la incubación y el lavado, la superficie de la tira debe quedar completamente sumergida, con la membrana hacia arriba.

- El agitador debe permitir el movimiento de vaivén de las tiras en la cubeta,y del líquido por encima de las tiras sin que se derrame de la cubeta.

- La velocidad que genera un agitador orbital o longitudinal es fundamentalpara lograr una tinción uniforme en las bandas y la máxima sensibilidad.Recomendaciones para el uso de un agitador orbital :• el diámetro del movimiento circular debe ser igual o superior a 13 mm• un movimiento circular de 13 mm a una velocidad recomendada de 160 rpm• un movimiento circular de 24 mm a una velocidad recomendada de 90 rpm.Recomendaciones para el uso de un agitador de balanceo:

• la diferencia entre el punto más alto y el más bajo no debe ser superior a 80 mmpara evitar el derrame del líquido

• una velocidad recomendada de 34 rpm.

Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LIA™

El ensayo LIA puede automatizarse fácilmente utilizando el aparato Auto-LIA™.Este instrumento es un sistema autónomo con aspiración, pipeteado eincubación automatizados. Para más información y para obtener los protocolosespecíficos del Auto-LIA™, rogamos contacte con Innogenetics o con su

distribuidor local.

Antes de iniciar el ensayo, lea el apartado Observaciones y precauciones.

Procedimientos detallados de inmunoensayo en línea (LIA) automático- Incubación de muestra durante 16 horas con Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min., shake speed 43. PAUSE4. INC 960 min., shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 6 min., shake speed 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 6 min., shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

INNOGENETICS® 66



10. INC 6 min., shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min., shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min., shake speed 4

16. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min., shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min., shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min.; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min., shake speed 4

26. ASP27. END

- Incubación de muestra durante 2 horas con Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min., shake speed 43. PAUSE4. INC 120 min., shake speed 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min., shake speed 4

7. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min., shake speed 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min., shake speed 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min., shake speed 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min., shake speed 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

17. INC 3 min., shake speed 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min., shake speed 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min.; shake speed 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min., shake speed 426. ASP27. END

CH1 = Diluyente de la muestraCH2 = Solución de lavadoCH4 = ConjugadoCH5 = Solución de paradaCH6 = Sustrato




- Incubación de muestra durante 3 horas con Auto-LIA™

Durante el protocolo de "incubación de muestra durante 3 horas" debenseguirse los mismos 27 pasos que en el protocolo de ensayo "incubación demuestra durante 2 horas", aunque deben tenerse en cuenta ciertos cambios enlos pasos 4, 6, 8 y 10. El tiempo de incubación de la muestra pasa a ser de

180 minutos para el protocolo de 3 horas (paso 4) y el lavado tras la incubaciónde la muestra durante 3 horas pasa a ser de 3 veces 6 minutos (pasos 6 - 8 - 10).

Resultados

Lectura

La naturaleza y ubicación de los antígenos y los controles de la tira seestablecen de la forma siguiente: ver Figura 1 página 16.

La intensidad de la reacción de las bandas de control en cada tira se utilizapara asignar los índices de reactividad a cada antígeno presente en dicha tira:

Intensidad de la reacción de las bandas de antígeno (R) Puntuación

Inferior a ± R < ± -Igual a ± R = ± ±Superior a ±, pero menor o igual a 1+ ± < R = 1+ 1+Mayor que 1+ pero menor que 3+ 1+ < R < 3+ 2+Igual a 3+ R = 3+ 3+

Mayor que 3+ R > 3+ 4+

La clasificación de la reactividad debe hacerse para cada tira de forma separada.Para facilitar la interpretación, se adjunta una plantilla de identificación.Las bandas se identifican más fácilmente si se alinea la tira revelada con labanda de control 3+ de la plantilla de identificación.

Validación

Compruebe la validez de las tiras del control positivo y del control negativoy la validez de los niveles de control de cada tira antes de realizar la lecturade los resultados del ensayo.

Validación del ensayo:1. La tira de control positivo debe mostrar una reacción de al menos 1+ en

las bandas de antígeno C1, C2, NS3 y NS4. Las bandas de antígeno E2y NS5 pueden tener un valor negativo.

2. La tira del control negativo debe mostrar una puntuación negativa

(ninguna reacción o al menos menor que la del nivel de control ± paratodas las bandas de antígeno de VHC).

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Limitaciones del procedimiento

- Debe cumplirse al pie de la letra el protocolo indicado a fin de obtener el rendimiento óptimo del ensayo.

- Las muestras con una banda NS3 +/- o superior pueden indicar una

seroconversión para VHC. Por tanto, se las clasifica como indeterminadas.- En caso de que se obtenga un resultado INDETERMINADO, serecomienda analizar otra muestra del paciente después de algunassemanas.

- Una muestra con reacción positiva en la banda de control de estreptavidinapuede dar reacciones cruzadas con otros antígenos de VHC y no puedeser interpretada como positiva para anticuerpos de VHC.

- En la fase temprana de la infección, es posible que no se detecten losanticuerpos contra el VHC.

- En el contexto de la hemodiálisis los anticuerpos pueden ser indetectables.- La utilización de muestras diluidas puede producir resultados erróneos.- Es necesario investigar con mayor profundidad los parámetros para

evaluar el deterioro del hígado y confirmar la positividad del ARN parael VHC en sujetos anti-VHC positivos antes de iniciar el tratamiento olos procedimientos invasivos.

Eficacia del ensayo

Sensibilidad

Paneles de seroconversión/paneles de bajo títuloLos resultados del INNO-LIA™ HCV Score, utilizando el protocolo deincubación de muestra durante 2 horas con Auto-LIA™ y el protocolo manualde incubación de muestra durante 16 horas, se obtuvieron internamente con13 paneles de seroconversión BBI (PHV 904 a 916), 2 paneles de bajo títuloBBI (PHV103 y 204), y el panel SFTS94. Estos resultados se compararoncon los resultados del CHIRON® RIBA® VHC 3.0 SIA y del INNO-LIA™ VHC

Ab III Update.

El INNO-LIA™ HCV Score, utilizando los protocolos de incubación demuestra durante 2 horas y 16 horas, detectó los anticuerpos antes que elCHIRON® RIBA® VHC 3.0 SIA en 7 paneles, mientras que 4 panelesresultaron positivos al mismo tiempo. El CHIRON® RIBA® VHC 3.0 SIAdetectó los anticuerpos antes que el INNO-LIA™ HCV Score cuando seusaron ambos protocolos de incubación de muestra en un panel. Un panel noresultó positivo con ninguno de estos ensayos.

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resultó negativa tras la repetición del ensayo por duplicado, lo que suponeuna especificidad tras el nuevo ensayo del 94,5% (378/400).

Muestras clínicasSe probaron internamente 205 muestras clínicas utilizando el protocolo de

incubación de muestra durante 16 horas. De ellas, 189 fueron negativas,11 fueron indeterminadas y 5 resultaron positivas. Tras la repetición delensayo por duplicado, 3 de estas 5 muestras resultaron negativas. Una de lasotras 2 muestras resultó positiva tras la repetición del ensayo en INNO-LIA™HCV Score y tras el ensayo en INNO-LIA™ VHC Ab III Update, mientras quela otra muestra resultó indeterminada en estos ensayos. Ambas muestrasfueron negativas en el Ortho® VHC 3.0 ELISA con Enhanced SAVe y en elINNOTEST™ VHC Ab IV. Una de estas 2 muestras fue probada también enel CHIRON® RIBA® VHC 3.0 SIA y resultó negativa. Para este conjunto de

muestras se obtuvo una especificidad inicial del 92,2% (189/205), mientrasque la especificidad tras la repetición del ensayo fue del 93,7% (192/205).

Muestras potencialmente interferentesSe probaron internamente 137 muestras potencialmente interferentesutilizando el protocolo de incubación de muestra durante 16 horas. De ellas,127 resultaron negativas, 9 fueron indeterminadas y 1 resultó positiva.Tras la repetición del ensayo por duplicado, esta muestra resultó positivauna vez e indeterminada a continuación, mientras que se obtuvo un

resultado positivo con el INNO-LIA™ VHC Ab III Update. Esta muestraresultó negativa en el Ortho® VHC 3.0 ELISA con Enhanced SAVe, en elINNOTEST™ VHC Ab IV y en el CHIRON® RIBA® VHC 3.0 SIA. En esteconjunto de muestras se obtuvo una especificidad del 92,7% (127/137).

Reproducibilidad

Dos investigadores probaron un panel de 13 muestras VHC-positivas, asícomo un control positivo y uno negativo, en 3 lotes diferentes utilizando elprotocolo de incubación de muestra durante 2 horas con Auto-LIA™.

Mientras tanto, un tercer investigador probó este panel en uno de estoslotes. El uso de diferentes lotes de tiras y con ejecuciones por parte dediferentes investigadores dieron lugar al mismo resultado de ensayo.

Português

Utilização

O INNO-LIA™ HCV Score é um imunoensaio em linha (LIA) para detectar anticorpos para o vírus da hepatite C humana em soro ou plasma humano.

Deve ser utilizado como teste suplementar em amostras de soro ou plasmahumano que tenham sido reactivas com um procedimento de despiste anti-HIV.

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Princípio do teste

O INNO-LIA™ HCV Score é um imunoensaio em linha de terceira geração,que incorpora antigénios HCV derivados da região nuclear, a região E2hipervariável (HVR), a região NS3 helicase, as regiões NS4A, NS4B, e NS5A.

Os antigénios estão impregnados em 6 bandas distintas numa tira de nylonsobre um suporte de plástico. Além disso, foram impregnadas quatro bandas decontrolo em cada tira: banda de controlo de streptavidina, banda de controlopositivo 3+ (Ig anti-humana), banda de controlo positivo 1+ (IgG humana) ebanda cut-off ± (IgG humana).

O INNO-LIA™ HCV Score baseia-se no princípio de um imunoensaioenzimático. A amostra de teste é incubada numa cavidade juntamente com atira de teste LIA. Se existirem na amostra, os anticorpos HCV ligam-se às

bandas de antigénio de HCV da tira. Subsequentemente, é adicionado umconjugado de purificado de IgG anti-humana de cabra marcada com fosfatasealcalina (H+L), que reage com complexos antigénio/anticorpo específicos deHCV, se formados previamente. A incubação com o substrato enzimáticoproduz uma cor acastanhada, cuja intensidade é proporcional à quantidadede anticorpo específico de HCV capturada da amostra em cada uma dasbandas (Fig. 1). O desenvolvimento da cor é parado com ácido sulfúrico.

Reagentes

Descrição, preparação para utilização e condições recomendadas de

conservação

- Todos os reagentes, abertos ou fechados, permanecem estáveis até àdata de validade, se os mantiver a uma temperatura entre 2 - 8°C.Não congele os reagentes.

- Todos os reagentes e o tubo de plástico com as tiras de teste devematingir a temperatura ambiente (de 18 - 25°C) cerca de 30 minutos antesda utilização e ser recolocados no frio (de 2 - 8°C) imediatamente após autilização.

- Alterações na aparência física dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou deterioração.

- Depois de abrir o tubo original com as tiras, qualquer tira não utilizadapermanece estável durante 16 semanas, desde que conservada a umatemperatura de 2 - 8ºC no tubo original fechado com dessecador.




Reagentes fornecidos:

Componente Quantidade Ref. Descrição

Tiras 20 57329 20 tiras de teste impregnadas de antigénioINNO-LIA™ HCV.

Diluente da amostra 30 ml 57304 Tampão de fosfato com código de cores (verde)com cloreto de sódio, detergente, estabilizadoresde proteínas bovinas e 0,3% de clorocetamida(CAA) como conservante.

Conjugado 45 ml 57301 IgG anti-humana de cabra com códigopronto a utilizar de cores (vermelho) marcada com fosfatase

alcalina em tampão Tris com estabilizadoresde proteínas bovinas, detergente e 0,01% deMIT/0,1% de CAA como conservante.

Controlo negativo 0,12 ml 57307 Matriz de base de origem humana com 0,01%

de MIT/0,1% de CAA como conservante.

Controlo positivo 0,12 ml 57308 Soro humano inactivo positivo para anticorpospara HCV com 0,01% de MIT/0,1% de CAAcomo conservante.

Substrato BCIP/NBT 45 ml 57302 BCIP/NBT em dimetilformamida com 0,01% depronto a utilizar MIT/0,1% de CAA como conservante.

Solução de paragem 45 ml 57303 0,1 mol/l de ácido sulfúrico.

Solução de lavagem 45 ml 57299 Tampão Tris com código de cores (azul) comcloreto de sódio, detergente e 0,02% debromonitrodioxane como conservante, a diluir 5x em água destilada. A solução de lavagemdiluída permanece estável durante 2 semanas,se a mantiver a uma temperatura entre 2 - 8ºC.

Tabuleiro de teste 2 - Com 11 cavidades cada.

Selantes adesivos 5 -

Folha de relatório de dados 1 Para guardar fitas processadas.

Cartão de leitura 1 Para identificar bandas de antigénios

reactivos.

Material necessário não fornecido

- Água destilada ou desionizada.- Pipetas de precisão (com ponta descartável), capazes de fornecerem

10 µl, 20 - 200 µl, e 200 - 1000 µl, respectivamente.- Agitador orbital ou oscilador (ver Instruções de incubação).- Agitador de vórtice ou equivalente.- Provetas graduadas: 10, 25, 50 e 100 ml.

- Pinças para manipulação das tiras.- Cronómetro.- Opcional:

• ventoinha de ar quente (secador de cabelo) ou incubador seco a 37ºC.

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• pipeta de repetição juntamente com frascos descartáveis para aadição de ácido sulfúrico, conjugado, substrato e solução de lavagem.

• aspirador de vácuo com uma solução de 5% de hipoclorito desódio numa garrafa de resíduos.

Segurança e ambiente- Consulte as folhas de dados de segurança e o rótulo do produto

para obter mais informações sobre os componentes potencialmenteperigosos.

R43, S24-37Irritante! (Xi) Evite o contacto com a pele. Pode causar sensibilização por contacto com a pele. Utilize luvas de protecção adequadas.Contém 2-cloroacetamida: Diluente da amostra, conjugado pronto autilizar, substrato BCIP/NBT pronto a utilizar e controlo negativo.

- As amostras e os Controlos negativos e positivos deverão ser sempremanuseados como sendo potencialmente infecciosos.

- O Controlo positivo foi determinado como sendo negativo para anti-HCVe HBsAg. O Controlo negativo foi determinado como sendo negativopara anti-HIV-1/HIV-2, anti-HCV e HBsAg. Nenhum método de testepode no entanto assegurar que os produtos sanguíneos não poderãotransmitir agentes infecciosos. As amostras devem sempre ser manipuladas como potencialmente infecciosas.Todos os componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados em conformidade. O procedimento de teste deve ser realizadoapenas por pessoal com a formação e as qualificações adequadas. Todasos componentes sanguíneos e materiais biológicos devem ser eliminados

em conformidade com os procedimentos de segurança estabelecidos.• Realize uma autoclavagem durante pelo menos 15 minutos a 121°C.• Incinere o material descartável.• Misture os resíduos líquidos com hipoclorito de sódio para que a

concentração final seja de ± 1% hipoclorito de sódio.Deixe em repouso durante a noite antes de eliminar.CUIDADO: Neutralize o líquido residual que contenha ácido antes deadicionar o hipoclorito de sódio.

- Utilize equipamento de protecção pessoal: luvas e óculos de segurança

quando manipular agentes perigosos ou infecciosos.- Os resíduos devem ser manipulados de acordo com as directivas deeliminação de resíduos da instituição. Deve cumprir todos osregulamentos ambientais, federais, locais e nacionais.




Procedimento do teste

Leia atentamente Limites e precauções antes de realizar o teste.

- incubação de amostra de 16 horas

1. Utilize a quantidade necessária de cavidades de teste, tendo ematenção que, para cada série de testes, deve realizar um controlopositivo e um controlo negativo.Identifique as cavidades de teste como controlos e amostras e coloque-as no tabuleiro.

2. Adicione 1 ml de diluente da amostra a cada cavidade de teste comamostra.

3. Adicione 10 µl da amostra ou do controlo à cavidade devidamenterotulada.

4. Remova a quantidade necessária de tiras de teste LIA do recipiente ecoloque uma tira em cada uma das cavidades de teste. A tira de teste écolocada com o lado da membrana virado para cima na cavidade comuma pinça.

A TIRA DEVE FICAR COMPLETAMENTE SUBMERSA.5. Cubra as cavidades com um selante adesivo (ver Limites e precauções).

Incube as amostras, colocando o tabuleiro num agitador ou oscilador (ver Instruções de incubação), e agite DE UM DIA PARA O OUTRO (16 ± 2 h)à temperatura ambiente (de 18 - 25°C).

NOTA:• Remova cuidadosamente os selantes adesivos para evitar

contaminação cruzada.6. Lave cada tira de teste 3 vezes (5 minutos) com 1 ml de solução de

lavagem (ver Instruções de lavagem).7. Adicione 1 ml de solução de conjugado a cada cavidade de teste.8. Incube com o conjugado, colocando o tabuleiro de teste no agitador ou

oscilador, e agite durante 30 minutos à temperatura ambiente (de 18 - 25°C).9. Lave cada tira de teste 3 vezes (5 minutos) com 1 ml de solução de

lavagem (ver Instruções de lavagem).10. Adicione 1 ml de solução de substrato a cada cavidade de teste.11. Incube com o substrato, colocando o tabuleiro de teste no agitador ou

oscilador, e agite durante 30 minutos à temperatura ambiente (de 18 - 25°C).12. Aspire o líquido. Adicione 1 ml de solução de paragem a cada cavidade.13. Incube com a solução de paragem, colocando a cavidade teste no

agitador ou oscilador, e agite durante 10 - 30 minutos à temperaturaambiente (de 18 - 25°C).

14. Aspire a solução de paragem.15. Retire as tiras das cavidades de teste e coloque-as, com o lado da

membrana virado para cima, sobre papel absorvente com uma pinça.Quando as tiras secarem completamente, pode interpretar os resultados.Para acelerar o processo de secagem, coloque as tiras numa estufa a




37°C durante 30 minutos ou utilize uma ventoinha de ar quente durante1 minuto. As tiras processadas mantêm a cor desde que sejamconservadas num local escuro.

- incubação de amostra de 2 e 3 horas

O protocolo da "incubação de amostra de 2 e 3 horas" deve seguir os15 passos do procedimento de teste da "incubação de amostra de 16 horas",mas deve ter em conta as alterações aos passos 3, 5, 6 e 9. O volume daamostra para controlos e amostras aumenta de 10 para 20 µl (passo 3) e otempo de incubação da amostra muda para 2 e 3 horas (passo 5). A lavagemdepois da incubação da amostra muda para o procedimento de 2 horas para3 vezes 10 minutos e para o procedimento de 3 horas para 3 vezes 6 minutos(passo 6); a segunda lavagem é 3 vezes 3 minutos para a incubação deamostra de 2 e 3 horas.

Resumo dos procedimentos de teste com as diferenças realçadas (negrito)fornecidas na tabela seguinte:

incubação incubação incubaçãode amostra de amostra de amostrade 16 horas de 2 horas de 3 horas

Diluente da amostra 1 ml 1 ml 1 ml Amostra 10 µl 20 µl 20 µlControlos 10 µl 20 µl 20 µlTiras de teste LIA 16 horas ± 2 horas 2 horas 3 horasLavagem 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 10 min 1 ml/3 x 6 minConjugado RTU* 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minLavagem 1 ml/3 x 5 min 1 ml/3 x 3 min 1 ml/3 x 3 minSubstrato RTU* 1 ml/30 min 1 ml/30 min 1 ml/30 minSolução de paragem 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min 1 ml/10 - 30 min

*RTU = Ready-to-use = pronto a utilizar

Instruções de lavagem

- Depois da incubação nocturna, 2 e 3 horas, remova cuidadosamente oselante adesivo.

- O líquido é aspirado da cavidade com uma pipeta, de preferêncialigada a um aspirador de vácuo, que contém uma solução a 5% dehipoclorito de sódio, para uma garrafa de resíduos.O tabuleiro é mantido num ângulo que permite que o líquido escorrapara um lado da cavidade (para a parte do suporte de plástico nãoimpregnada de cada tira).

- Adicione 1 ml de solução de lavagem diluída a cada cavidade e agitenum agitador ou oscilador durante 1 minuto.

- Repita estes passos tantas vezes quantas as indicadas no procedimentode teste.

INNOGENETICS® 78



NOTA:• Não permita que as tiras sequem entre os passos de lavagem.• Certifique-se de que não danifica a superfície das tiras de teste

LIA durante a aspiração.• Certifique-se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submersão

completa na solução de lavagem.• Adapte a velocidade do agitador ou oscilador, quando necessário.

Instruções de incubação

- Todos os passos de incubação (amostra, conjugado, substrato e ácidosulfúrico) e também os passos de lavagem devem ser realizados numagitador ou oscilador (utilize o oscilador para a incubação de amostranocturna).

- A superfície da tira deve estar completamente submersa com o lado damembrana virado para cima durante os passos de incubação e delavagem.

- O agitador ou oscilador deve permitir um movimento recíproco (devaivém) das tiras na cavidade e um movimento do líquido sobre astiras sem transbordar da cavidade.

- A velocidade gerada por um agitador orbital ou longitudinal, ou por umoscilador é crítica para a obtenção de uma linha de coloração homogéneae da sensibilidade máxima.Recomendações para um agitador orbital:

• o diâmetro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm• a velocidade recomendada para um movimento circular de 13mm é de 160 rpm• a velocidade recomendada para um movimento circular de 24mm é de 90 rpm.Recomendações para um oscilador:

• a diferença entre o ponto mais alto e o mais baixo não deve exceder 80 mmpara evitar derrame do líquido

• a velocidade recomendada é de 34 rpm.

Procedimento de teste automatizado: Auto-LIA™

O procedimento de teste LIA pode ser facilmente automatizado com o Auto-LIA™. Este instrumento é um sistema de passagem com aspiração,pipetagem e incubação automáticas. Para mais informações sobre o

Auto-LIA™, contacte a Innogenetics ou o distribuidor local.

Leia atentamente Limites e precauções antes de realizar o teste.

Procedimentos detalhados do Auto-LIA™:- incubação de amostra de 16 horas Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, velocidade de agitação 43. PAUSE4. INC 960 min, velocidade de agitação 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl




6. INC 6 min, velocidade de agitação 47. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 6 min, velocidade de agitação 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 6 min, velocidade de agitação 411. ASP

12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, velocidade de agitação 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, velocidade de agitação 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, velocidade de agitação 418. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, velocidade de agitação 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl

22. INC 30 min, velocidade de agitação 423. ASP24. DISP CH5 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl25. INC 20 min, velocidade de agitação 426. ASP27. END

CH1 = Diluente da amostraCH2 = Solução de lavagemCH4 = ConjugadoCH5 = Solução de paragemCH6 = Substrato

- incubação de amostra de 2 horas Auto-LIA™

1. DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl2. INC 1 min, velocidade de agitação 43. PAUSE4. INC 120 min, velocidade de agitação 45. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl6. INC 10 min, velocidade de agitação 4

7. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl8. INC 10 min, velocidade de agitação 49. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl10. INC 10 min, velocidade de agitação 411. ASP12. DISP CH4 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl13. INC 30 min, velocidade de agitação 414. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl15. INC 3 min, velocidade de agitação 416. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl17. INC 3 min, velocidade de agitação 4

18. WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl19. INC 3 min, velocidade de agitação 420. ASP21. DISP CH6 Stpos: 1 Endpos: end 1000 µl22. INC 30 min, velocidade de agitação 4

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Software de interpretação: LiRAS™ para doenças infecciosas

O LiRAS™ para software de doenças infecciosas foi concebido para ajudar na interpretação dos resultados da LIA. Para obter a versão actualizadamais recente, contacte o distribuidor local.

AVISO:- Não utilize a interpretação automatizada sem ter em conta a limitação

do procedimento mencionados em seguida.

Limites do procedimento

- O protocolo fornecido deve ser rigorosamente seguido para obter umdesempenho óptimo do teste.

- Amostras com uma única reactividade +/- ou superior em NS3 podem

indicar seroconversão para HCV. No entanto, são classificadas comoindeterminadas.

- Se obtiver um resultado INDETERMINADO, recomendamos que testeuma amostra adicional do doente após algumas semanas.

- Uma amostra que dê uma reacção positiva na linha de controlo destreptavidina pode dar reacções cruzadas com outras linhas de antigénioHIV e não pode ser determinada como positiva para anticorpos HCV.

- Os anticorpos anti-HCV podem ser indetectáveis numa infecção recente.- Os anticorpos podem ser indetectáveis numa definição de hemodiálise.

- A utilização das amostras diluídas pode dar resultados incorrectos.Os parâmetros para avaliar os danos do fígado e a positividade doHCV RNA devem ser investigados em indivíduos com anticorpos HCVpositivos antes de iniciar tratamento ou procedimentos invasivos.

Desempenho do teste

Sensibilidade

Painéis de seroconversão/painéis de baixo títuloOs resultados do INNO-LIA™ HCV Score com o procedimento de incubaçãode amostra de 2 horas Auto-LIA™ e o procedimento manual de incubação deamostra de 16 horas foram obtidos internamente em 13 painéisseroconversão BBI (PHV 904 - 916), 2 painéis de baixo título BBI (PHV103 e204) e no painel SFTS94. Estes resultados foram com os resultadosactualizados do CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA e do INNO-LIA™ HCV Ab III.

O INNO-LIA™ HCV Score com o procedimento de incubação de amostra de

2 horas e 16 horas detectou anticorpos mais cedo do que o CHIRON

®

RIBA

®

HCV 3.0 SIA em 7 painéis e 4 painéis ficaram positivos em simultâneo.O CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA detectou anticorpos mais cedo do que oINNO-LIA™ HCV Score com ambos os procedimentos de incubação deamostra num painel. Um painel não ficou positivo em nenhum destes testes.




O INNO-LIA™ HCV Score com o procedimento de 2 horas detectou anticorposmais cedo do que o INNO-LIA™ HCV Ab III Update em 2 painéis e os outros10 painéis ficaram positivos em simultâneo. Com o procedimento de 16 horas,4 painéis ficaram positivos mais cedo do que no INNO-LIA™ HCV Ab IIIUpdate, 7 painéis ficaram positivos em simultâneo e um painel ficou positivo

posteriormente.

Nas 40 amostras nos 2 painéis de baixo título BBI, 28 e 32 amostras forampositivas no INNO-LIA™ HCV Score com os procedimentos de incubação deamostras de 2 e 16 horas, respectivamente. Trinta cinco destas amostrasforam positivas com o CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA, enquanto 34 forampositivas com o INNO-LIA™ HCV Ab III Update. Todas as amostras positivascom o CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA ou o INNO-LIA™ HCV Ab III Updateforam positivas ou indeterminadas com o INNO-LIA™ HCV Score.

Nas 49 amostras no SFTS94, 38, 41 e 40 amostras foram positivas com oINNO-LIA™ HCV Score com os procedimentos de incubação de amostrasde 2 e 16 horas e com o INNO-LIA™ HCV Ab III Update, respectivamente.Trinta e uma destas amostras tiveram resultados positivos com o CHIRON®

RIBA® HCV 3.0 SIA.

Amostras HCV positivasUm total de 257 amostras, originárias de doentes infectados com HCV e

com resultados positivos em 2 ensaios de despiste e no INNO-LIA™ HCV Ab III Update, foram analisadas no INNO-LIA™ HCV Score com oprocedimento de incubação de amostra de 2 horas Auto-LIA™. Todas asamostras tiveram resultados positivos, excepto uma amostra com resultadoindeterminado, resultando numa sensibilidade, incluindo o resultadoindeterminado, de 100% (257/257).

Genótipos diferentesO INNO-LIA™ HCV Score com o procedimentos de incubação de amostrade 2 horas Auto-LIA™ foi realizado internamente em 15 amostras degenótipo 1a, 15 de 1b, 15 de 2, 15 de 3a, 15 de 4a, 5 de 4 não a e 5 de 5.Todas as amostras tiveram resultados positivos, resultando numasensibilidade de 100% (85/85).

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Especificidade

Dadores de sangue

Foram analisadas 400 amostras de dadores de sangue negativas paraanticorpos HCV internamente com procedimento manual de incubação de

amostras de 16 horas. Depois do teste inicial, 377 amostras foram negativas,22 amostras indeterminadas e 1 amostra positiva, resultando numaespecificidade inicial de 94,3% (377/400). A amostra de sangue positivainicial teve um resultado negativo depois da repetição do teste em duplicado,resultando numa especificidade depois do teste de 94,5% (378/400).

Amostras clínicasForam testadas duzentas e cinco amostras clínicas internamente com oprocedimento manual de incubação de amostra de 16 horas. Cento e

oitenta e nove amostras foram negativas, 11 indeterminadas e 5 positivas.Três destas 5 amostras tiveram resultados negativos depois da repetição doteste em duplicado. Uma das outras 2 amostras positivas tiveramresultados positivos depois da repetição do teste no INNO-LIA™ HCVScore e no INNO-LIA™ HCV Ab III Update, enquanto a outra amostra teveum resultado indeterminado nestes ensaios. Ambas as amostras foramnegativas no Ortho® HCV 3.0 ELISA com Enhanced SAVe e noINNOTEST™ HCV Ab IV. Uma destas 2 amostras foi testada no CHIRON®

RIBA® HCV 3.0 SIA e teve um resultado negativo. Para este conjunto de

amostras, foi obtida uma especificidade de 92,2% (189/205), enquanto aespecificidade depois da repetição do teste foi 93,7% (192/205).

Amostras potencialmente interferentesForam testadas cento e trinta e sete amostras potencialmente interferentesinternamente com o procedimento manual de incubação de amostra de16 horas. Cento e vinte e sete amostras foram negativas, 9 indeterminadase 1 positiva. Depois de repetir o teste em duplicado, esta amostra teve umresultado positivo e, em seguida, indeterminado, enquanto um resultado

positivo foi obtido no INNO-LIA™ HCV Ab III Update. Esta amostra teve umresultado negativo no Ortho® HCV 3.0 ELISA com Enhanced SAVe,INNOTEST™ HCV Ab IV e no CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIA. Nesteconjunto de amostras, foi obtida uma especificidade de 92,7% (127/137).

Reprodutibilidade

Dois técnicos testaram um painel de 13 amostras de HCV positivo, umcontrolo positivo e um controlo negativo em 3 lotes diferentes com o

procedimento de incubação de amostra de 2 horas Auto-LIA™ enquanto umterceiro técnico experimentou este painel num destes lotes. A utilização dediferentes lotes de tiras e o desempenho de diferentes técnicos resultaramno mesmo resultado de teste.


inno-lia hcv score

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