institut de recerca hospital universitari vall d’hebron
TRANSCRIPT
![Page 1: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/1.jpg)
Institut de Recerca
Hospital Universitari Vall d’Hebron
Curs de Proteòmica i
Metabolòmica
25 Marzo 2014
Mª Ángeles Artaza (UAT)
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Desarrollo de un método
![Page 2: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/2.jpg)
• ¿Que queremos medir?
• ¿Como lo vamos a medir?
• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que decimos que estamos midiendo?
![Page 3: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/3.jpg)
Huellametabólica
Análisis espectral de todos los metabolitos pero sin saber que es cada compuesto
![Page 4: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/4.jpg)
Perfil metabólico
Detección, identificación y cuantificación aproximada de un conjunto de compuestosdiana.
![Page 5: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/5.jpg)
Análisis diana
Detección y cuantificaciónprecisa de un metabolito o, frecuentemente, un pequeñogrupo de metabolitosquimicamente similares.
![Page 6: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/6.jpg)
Diseño de un experimento
Gary J. Patti, Oscar Yanes and Gary Siuzdak J. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012 Mar 22;13(4):263-9
![Page 7: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/7.jpg)
Diseño de un experimento
Gary J. Patti, Oscar Yanes and Gary Siuzdak J. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012 Mar 22;13(4):263-9
![Page 8: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/8.jpg)
• ¿Que queremos medir?
• ¿Como lo vamos a medir?
• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que decimos que estamos midiendo?
![Page 9: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/9.jpg)
Desarrollo de un método
Desarrollo de un método
Información del analito/sEstructuraPropiedades químicas
Optimización del métodoDetección (UV,Fluorometría, MS/MS)Separación (cromatografía)
Preparación de un rango apropiado, QCEvaluación de las estrategias de extracción (PP, LLE/SLE, SPE)RecuperaciónEstabilidad de la matrizEstabilidad del extractoEvaluación inicial de carryoverValidación del método
![Page 10: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/10.jpg)
Técnicas
Técnicas que utilizamos en la UCT
Cromatografía líquida de alta resolución
UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)
Espectrometría de masas
MRM (Multiple Reaction Monitoring)
![Page 11: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/11.jpg)
Técnicas.- Cromatografía Líquida
Waste
Bomba Inyector
Detector
Mezclador fase móvil
Fase móvil
C
Fase móvil
D
Horno
![Page 12: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/12.jpg)
Técnicas.- Cromatografía Líquida
Waste
Bomba Inyector
Detector
Mezclador fase móvil
Fase móvil
C
Fase móvil
D
Horno
![Page 13: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/13.jpg)
Técnicas.- Cromatografía Líquida
Waste
Bomba Inyector
Detector
Mezclador fase móvil
Fase móvil
C
Fase móvil
D
Horno
![Page 14: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/14.jpg)
Técnicas.- Cromatografía Líquida
Waste
Bomba Inyector
Detector
Mezclador fase móvil
Fase móvil
C
Fase móvil
D
Horno
![Page 15: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/15.jpg)
Técnicas.- Espectrometria de masas
![Page 16: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/16.jpg)
03-Feb-2010 12:26:43XEVO-TQMS#VBA071Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
5
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC
2.05e9
1.57
1.02
1.80
7.28
2.90
![Page 17: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/17.jpg)
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50
m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6174.85
174.52
131.06
112.70
112.50
112.37
113.04
113.30
114.51
130.33
119.05
147.15
141.41
174.39
158.43
147.35
163.10
164.44
178.99
179.73
249.27
206.62
190.87
180.39
206.29
191.07
205.36
191.41
248.73
235.45226.51
226.31
216.70
221.31
280.16259.21
264.35
284.50
289.64
297.05
298.38
![Page 18: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/18.jpg)
EspectroTIC (SCAN)
![Page 19: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/19.jpg)
Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)
El método más simple de cuantificar analitos con LC-MS es Total Ion Chromatograms (TIC). Los datos se obtienen con el
MS en modo barrido y se procesan los datos una vez adquiridos para reconstruir el perfil de elución de los iones de
interés. Las áreas o las alturas de los picos dan una idea de la abundancia de un analito.
Podemos limitar el rango de adquisición de m/z a los iones de interés (SIM Selected Ion Monitoring), cuanto más estrecho
sea el rango mayor será la sensibilidad pero no se podrá discriminar entre los iones con la misma m/z.
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50
m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6174.85
174.52
131.06
112.70
112.50
112.37
113.04
113.30
114.51
130.33
119.05
147.15
141.41
174.39
158.43
147.35
163.10
164.44
178.99
179.73
249.27
206.62
190.87
180.39
206.29
191.07
205.36
191.41
248.73
235.45226.51
226.31
216.70
221.31
280.16259.21
264.35
284.50
289.64
297.05
298.38
03-Feb-2010 12:26:43XEVO-TQMS#VBA071Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
5
Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC
2.05e9
1.57
1.02
1.80
7.28
2.90
![Page 20: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/20.jpg)
Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)
El modo MRM (Multiple Reaction Monitoring) no es una técnica de barrido. Se utiliza un triple cuadrupolo, el 1º y 3º
se utilizan como filtros de masas estáticos mientras que el 2º cuadrupolo es la celda de colisión que fragmenta el
ion seleccionado en el 1er cuadrupolo.
El par específico de valores m/z del ion precursor y del fragmento seleccionados es lo se llama “transición” 263< 145
Solo deja
pasar el ion
de m/z 263
Solo deja
pasar el ion
“hijo” de m/z
145
![Page 21: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/21.jpg)
Q1 : Selecciónmasa
q2 : ColisiónQ3 : Selección
fragmentoIntroduccion de la muestra
Ionización
x
xx
x
x x
x
x
![Page 22: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/22.jpg)
• ¿Que queremos medir?
• ¿Como lo vamos a medir?
• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que decimos que estamos midiendo?
![Page 23: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/23.jpg)
Validación de un método de HPLC
Validación
Proceso para verificar que un método es adecuado para resolver un problema analítico particular
![Page 24: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/24.jpg)
Validación de un método de HPLC
La validación proporciona una idea de las capacidades y limitaciones que posee un método analítico
¿Porqué es necesario validar un método? Es necesario para tener confiaza en los resultados obtenidos
¿Quien establece los requisitos? Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency(EMA)...
![Page 25: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/25.jpg)
Validación de un método de HPLC
Validación del método
•Exactitud, Trazabilidad•Precisión, Incertidumbre•Sensibilidad•Selectividad•Límites•Robustez
CarryoverEstabilidad en varias series Congelado/descongeladoEstabilidad durante pre y procesadoEstabilidad de larga duraciónRecuperaciónEfecto Matriz
![Page 26: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/26.jpg)
Validación de un método de HPLC
Punto de mayor concentración 200 μg/ml
Punto de menor concentración 1 μg/ml
área
área
nombre
![Page 27: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/27.jpg)
Validación de un método de HPLC : LOD y LQD
Muestra concentración 0 μg/ml
Método de comparación de Señal / RuidoDeterminación:
Se preparan muestras de concentración conocida a bajos niveles, de acuerdo al método en estudio. Se
prepara un blanco, y se mide la señal de las soluciones preparadas.
El límite de cuantificación es la concentración de analito en la que se pueden darcualquiera de las
siguientes situaciones:•Relación señal / ruido es 10:1.
•Relación señal / ruido es al menos 10 y la precisión de menos de 10% (Desviación estándar relativa)
•Relación señal / ruido es mayor de 20 y la precisiónmenor de 5% (Desviación estándar relativa)
![Page 28: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/28.jpg)
Validación de un método de HPLC: linealidad, LOD y LOQ
Límite de detección LOD XLOD=-(YLOD-a)/b
XLOD= 3sa/b
Límite de cuantificación LQDXLQD= 10sa/b
sa= desviación estándar de la ordenada
![Page 29: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/29.jpg)
Validación de un método de HPLC: linealidad, LOD y LOQ
![Page 30: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/30.jpg)
Validación de un método de HPLC: Recuperación
![Page 31: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/31.jpg)
El desarrollo de un método incluye la optimización de cada uno de los pasos
• Separación cromatográfica
• Ionización
• Detección espectrometrica
• Preparación de la muestra
Desarrollo de un método
![Page 32: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/32.jpg)
Preparación de las muestras
Extracción fase sólida
Precipitación
Extracción líquido-líquido
![Page 33: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/33.jpg)
Métodos de extracción
Extracción Líquido-Liquido: Partición en una de dos fases líquidas
Es un clásico.
Suele ser el método de elección para tejidos.
Agitación o vortex con solventes orgánicos.
Los metabolitos polares se extraen con isopropanol, etanol, metanol, acetonitrilo…
Los metabolitos más lipofílicos con cloroformo o etil acetato.
Se modifica el pH para forzar el paso a una u otra fase
Extracción en fase sólida (SPE): Adsorción/partición en un sorbente sólido
Uno de los más utilizados en la extracción de analitos de fluidos biológicos
Gran variedad de fases estacionarias, p.ej. mixtos utilizan múltiples mecanismos de
retención incorporando diferentes ligandos al sorbente, lo que permite, cambiando el
pH, extraer de la misma columna de modo sucesivo las fracciones acidas, básicas y
neutras.
Gran variedad de soportes; columnas discos, placas, extracción online
Inyección directa
Procedimientos de extracción
![Page 34: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/34.jpg)
3Ejemplo práctico
Detección y cuantificación de
Fenilacetilglutamina y Fenilacetato
en orina de ratas
Tratamiento de la
hiperamonemia y la
encepalopatia hepática con
L-ornitina y fenilacetato.
Grup Malalties Hepàtiques:
Marc Oria, Joan Córdoba
Servei de Metabolopaties
![Page 35: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/35.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
![Page 36: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/36.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
04-Feb-2010 14:59:48Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
%
4
Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC
2.43e6
0.93
0.56
1.10
2.22
1.55
FAG
263<145
263<127
FA
135<91
FB
163<91
IS
165<121
![Page 37: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/37.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
04-Feb-2010 14:59:48Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
%
4
Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC
2.43e6
0.93
0.56
1.10
2.22
1.55
FAG
263<145
263<127
FA
135<91
FB
163<91
IS
165<121
![Page 38: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/38.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas
Voltaje de
cono
04-Feb-2010 16:47:18XEVO-TQMS#VBA071Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80
%
1
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80
%
1
Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 2: Daughters of 263ES- TIC
3.00e7
0.93
0.721.04
Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 1: Daughters of 263ES- TIC
3.00e7
0.93
1.05
![Page 39: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/39.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas
Energía de colisión
transición 263 <145
Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50
m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
%
0
100
%
0
100
Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.929) Cm (69:77) 2: Daughters of 263ES- 3.00e5144.95
126.99
126.39
108.96
116.31
127.26
128.12
145.08
145.28
145.41
Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.927) Cm (66:84) 1: Daughters of 263ES- 3.00e5
263.21144.88
144.75
144.41
108.90 127.26
262.41
145.15
145.35
262.28
244.86218.57
263.48
![Page 40: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/40.jpg)
YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74.
En un tubo de 4,5 ml de polipropileno poner
50 µl de orina ultrafiltrada
50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4)
50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico)
1 mL tert-butil metil eter
Agitar 1 min
Centrifugar 1700xg 180 seg
Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno
Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.
Reconstituir en 100µl de fase móvil.
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
![Page 41: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/41.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
04-Feb-2010 14:59:48Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
%
4
Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC
2.43e6
0.93
0.56
1.10
2.22
1.55
FAG
263<145
263<127
FA
135<91
IS
165<121
![Page 42: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/42.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
04-Feb-2010 14:59:48Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2
Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40
%
4
Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC
2.43e6
0.93
0.56
1.10
2.22
1.55
FAG
263<145
263<127
FA
135<91
IS (FAG-d)
268<145
![Page 43: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/43.jpg)
YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74.
En un tubo de 4,5 ml de polipropileno poner
50 µl de orina ultrafiltrada
50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4)
50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico)
1 mL tert-butil metil eter
Agitar 1 min
Centrifugar 1700xg 180 seg
Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno
Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.
Reconstituir en 100µl de fase móvil.
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
Larvea MD. J Inherit Metab Dis. 2010 Aug 7
En un tubo de 1,5 ml de polipropileno poner
100 µl de orina ultrafiltrada y diluida 1:10
100 µl de IS (FAG-d) en metanol
100 µl de metanol para precipitar las proteínas
Vortex 30”
Centrifugar a 1000xg 5min
Transferir el sobrenadante a viales del inyector automático
![Page 44: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/44.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
![Page 45: Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d’Hebron](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081613/62c80b002cb6777e4b510482/html5/thumbnails/45.jpg)
Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas
Compound name: Fenilacetilglutamina 145
Correlation coefficient: r = 0.998920, r^2 = 0.997841
Calibration curve: 1.94349 * x + 1.48257
Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
uM0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
Re
sp
on
se
0
100
200
300
400
500
600
700
Compound name: Fenilacetato
Correlation coefficient: r = 0.995499, r^2 = 0.991019
Calibration curve: 0.141022 * x + -0.161316
Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
Conc0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0