instituto federal catarinense pró-reitoria de pesquisa, pós...
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INSTITUTO FEDERAL CATARINENSE
Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação
Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal
Dissertação
Insumos para teste rápido para diagnóstico de agentes causadores da mastite bovina
Henrique Larsen Brunow Ventura
Araquari, 2019
Henrique Larsen Brunow Ventura
Insumos para teste rápido para diagnóstico de agentes causadores da mastite bovina
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal do
Instituto Federal Catarinense, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em
Ciências (área de concentração: Produção e Sanidade Animal).
Orientador: Breno Castello Branco Beirão
Coorientadores:
Luiz Felipe Caron
Lea Chapaval
Max Ingberman
Celso Fávaro Junior
Araquari, 2019
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Henrique Larsen Brunow Ventura
Insumos para teste rápido para diagnóstico de mastite bovina
Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências, Curso de Pós-Graduação Produção e Sanidade Animal, Pró-reitoria de Pesquisa,
Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense.
Data da Defesa: 23/07/2019
Banca examinadora:
Prof. Dr. Breno Castello Branco Beirão (Orientador)
Doutor em Genômica Animal e Resistência a Doenças pelo Instituto Roslin de Edimburgo
Prof. Dr. Diogenes Dezen
Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Dra. Josir Laine Aparecida Veschi
Doutora em Medicina Veterinária pela Universidade Estadual de São Paulo - Julio de
Mesquita Filho
Prof. Dra. Elizabeth Schwegler (Suplente)
Doutor em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal de Pelotas
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Dedicatória
Aos meus pais e à minha madrinha, que jamais mediram esforços ao me apoiar e me
auxiliar na busca pelo aprimoramento pessoal e profissional. Às minhas filhas, a quem
também desejo que sigam a parcela boa dos meus exemplos de vida.
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Agradecimentos
Atingir mais um fechamento de ciclo na vida leva o estado anímico a ser tomado por
um grande senso de gratidão. Antes de tudo, a Deus, por toda a vida privilegiada que levo,
que me proporciona gozar de plena saúde e ter condições de poder subir mais um degrau
nos objetivos de vida.
E, neste momento, agradeço inicialmente a toda minha família por todo o apoio dado
para que eu chegasse até aqui. Desde os meus pais, que foram fundamentais não só no
incentivo do exemplo, do afeto e das palavras, mas até mesmo financeiramente quando foi
necessário; até a minha esposa Ana Clara que, mesmo tendo uma rotina igualmente (ou até
mais) pesada, conseguiu dar seqüência ao andamento do cotidiano familiar e aturou minhas
viagens, minhas noites em claro e até certa dose de mau humor diante das incertezas que
ocorrem pontualmente em um período como esse e, acima de tudo, foi uma fonte
inestimável de inspiração pela luta, perseverança e carinho que sempre demonstrou.
Sou muito grato ao meu orientador Breno, que tem exercido este papel de forma
irretocável, direcionando com assertividade e serenidade as ações e passando tranquilidade
e compreensão com minhas eventuais falhas ao longo de todo esse tempo. Agradeço
também ao grande mestre Luiz Felipe Caron, a quem admiro imensamente desde minha
graduação, por ter me recomendado buscar a instituição para nova tentativa de mestrado.
Muito obrigado, também, à toda a equipe do laboratório Imunova pelo suporte na
rotina dos experimentos. Todos foram muito especiais e acolheram muito bem minha
presença em meio à atribulada rotina laboratorial.
Friso um grande agradecimento ao médico veterinário Marquito, do laboratório
LabVet, pelo grande auxílio prestado a este trabalho.
E agradeço muito a minha chefia e meus colegas da Prefeitura de São José dos
Pinhais, representados aqui pelos amigos Ricardo e Soriane, que compreenderam meus
momentos de ausência e permitiram que eu pudesse realizar todas as etapas necessárias
neste mestrado.
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Resumo
VENTURA, Henrique. Insumos para teste rápido para diagnóstico de agentes causadores da mastite bovina. 2019. 64f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitora de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Araquari, 2019.
Leite e seus derivados são alimentos essenciais para a população mundial e sua produção pode ser afetada pela mastite, cujo diagnóstico permite direcionar o saneamento dos animais do rebanho. O diagnóstico definitivo se dá por meio da cultura e do isolamento das bactérias no leite. A utilidade do método é limitada por fatores como elevado tempo de processamento e custo, bem como sensibilidade e especificidade variáveis entre os laboratórios. Este método tem caráter qualitativo e, ainda que definitivo, pode ser alterado por fatores que tornam dúbios os resultados. Os testes atuais utilizados no campo também apresentam falsos negativos. É importante um método que apresente diagnóstico rápido com boa sensibilidade e especificidade, a baixo custo de produção e sem interpretações subjetivas. Propõe-se para isso um kit de anticorpos policlonais IgY extraídos da gema de ovos de galinhas previamente imunizadas com patógenos responsáveis pela mastite. Antígenos para este teste foram desenvolvidos após cultura a partir de leite de animais suspeitos. Foram realizados cultivos bacterianos a partir de amostras de leite de fêmeas bovinas suspeitas de mastite. O gênero bacteriano identificado pela técnica microbiológica foi confirmado por sequenciamento do gene do RNA 16S. As bactérias foram inativadas e inoculadas em galinhas poedeiras em fase de produção. O soro das aves foi coletado e triado contra as respectivas bactérias em provas de aglutinação, IDGA e ELISA. Quando constatado potencial de aplicabilidade, os ovos correspondentes foram utilizados para extração de IgY e testados por ELISA de competição. No ELISA, o soro anti Staphylococcus aureus apresentou reação específica contra a bactéria em questão em testes comparativos com outros agentes. Os anticorpos policlonais contra S. aureus foram purificados da gema dos ovos e testados por prova de ELISA de competição em amostras de campo. A curva padrão do teste foi realizada com concentrações conhecidas de S. aureus. Os limites de linearidade do padrão ficaram entre 15 e 50 ng/100µl de extrato bacteriano. Constatou-se que os IgY anti S. aureus são insumos confiáveis para serem utilizados no desenvolvimento de um kit protótipo de diagnóstico de mastite bovina.
Palavras-chave: Anticorpos policlonais; bovinocultura leiteira; controle leiteiro; mastite; teste rápido.
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Abstract
VENTURA, Henrique. Reagents for point-of-care test for causing agents of bovine mastitis. 2017. 64f. Dissertation (Master degree in Science) - Curso de Pós-Graduação em Produção e Sanidade Animal, Pró-reitoria de Pesquisa, Pós-Graduação e Inovação, Instituto Federal Catarinense, Araquari, 2019.
Milk and its products are invaluable sources of nutrients, but their production may be affected by mastitis. Therefore, mastitis detection is crucial for resolution of this problem in dairy cattle herds. Definitive diagnosis is reached through milk bacterial isolation. The limitations of this technique are in the delayed response, high costs and variable results between laboratories. Microbiology is qualitative and although considered definitive, may be affected by variables that can make results confusing. Currently used on-farm tests may also result on false negatives. Therefore, the development of an improved, rapid and low-cost method with better specificity and sensivity, might be important. The goal of the project was to create a kit with polyclonal IgY antibodies obtained from yolks of hen eggs previously immunized against mastitis pathogens. This test was developed from bacteria isolated from milk of mastitis-suspected cows, followed by production of antibodies against these agents and verification of the diagnostics parameters, comparing with reference methods. Milk bacteria were cultivated in vitro. Genera of the isolated bacteria were confirmed by sequencing the RNA 16S gene. Inactivated agents were inoculated in hens on egg production stage. The hen sera was collected and screened against each bacteria through agglutination test, AGID and Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). When potential applicability was found, the corresponding eggs were used for IgY extraction and competition ELISA. Anti-S. aureus sera was specific against this pathogen in a comparison test. Polyclonal antibodies against S. aureus were extracted from egg yolk and tested by competition ELISA in raw milk samples. The standard control of the test showed a linear response between 15 and 50 ng/100µl. Therefore, the anti-S. aureus IgY might be reliable reagents for the development of a prototype kit.
Keywords: Polyclonal antibodies, dairy cattle, dairy control, mastitis, point-of-care.
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Lista de Figuras
Figura 1 Disposição das amostras na aglutinação bacteriana em lâminas................. 25
Figura 2 Layout das lâminas utilizadas na imunodifusão em ágar-gel........................ 26
Figura 3 Absorbâncias do teste de ELISA realizado em placa com anticorpos IgY
séricos sensibilizada com S. aureus............................................................... 35
Figura 4 Absorbâncias da placa de ELISA testada para soros anti S. aureus e S.
uberis. Placa sensibilizada com S. aureus e S. uberis. As barras mostram a
média e o desvio padrão................................................................................ 36
Figura 5 Absorbâncias dos testes de ELISA com anticorpos IgY recém purificados
das gemas de aves imunizadas com S. aureus. Placa sensibilizada com S.
aureus. As barras mostram a média e o desvio-padrão................................ 37
Figura 6 Curva padrão da segunda placa de ELISA de competição com amostras de
campo conforme absorbância. A presença de concentrações
progressivamente maiores de lisado de S. aureus inibiu a reação de
ligação do IgY com a bactéria adsorvida na placa, como esperado. Essa
curva padrão foi usada para estimar a quantidade de S. aureus nas
amostras de campo. Resultados apresentados como ng de
bactéria/amostra (50 µl)................................................................................ 38
Figura 7 Quantificação de bactérias para conferência em pontos com a curva
padrão em matriz de caseína 1%. A adição de S. uberis levou a reatividade
cruzada, embora abaixo daquele visto com S. aureus. Isso indica que a
reação é específica. Amostras positivas para S. aureus precisam
apresentar sinal maior do que aquele visto com S. uberis............................. 39
Figura 8 Gráfico da curva padrão do teste para amostras sem detergente Tween
0,05%. Abaixo, quantificação de bactérias nas amostras seguindo a curva.. 40
Figura 9 Gráfico da curva padrão do teste para amostras com detergente Tween
0,05%. Abaixo, quantificação de bactérias nas amostras seguindo a curva.. 41
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Lista de Tabelas
Tabela 1 Leitura da cultura das amostras em diferentes meios............................ 31
Tabela 2 Resultados dos testes bioquímicos das bactérias selecionadas.............. 32
Tabela 3 Correspondência entre identificação das aves e das amostras,
associada à identificação prévia e identificação após sequenciamento
do gene ribossomal 16S..................................................................... 33
Tabela 4 Resultados das leituras do teste de aglutinação bacteriana................... 33
Tabela 5 Leitura das provas de IDGA...................................................................... 34
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Lista de Abreviaturas e Siglas
BSA Albumina sérica bovina
CEUA Comitê de ética de uso de animais em pesquisa
ELISA Sigla em inglês para o Ensaio enzimático de imunoadsorção (Enzyme-
linked Immunosorbent Assay)
g Sigla para representação da unidade de gramas
IDGA Teste de Imunodifusão em Gel de Ágar
ml Sigla para representação da unidade de mililitros
µl Sigla de representação para a unidade de microlitros
ng Sigla de representação para unidade de nanogramas
PBS Solução-tampão salina à base de fosfato de sódio e cloreto de sódio
(sigla em inglês para Phosphate Buffered Saline)
PBS-T Tampão de lavagem, composto por solução de PBS e detergente de
Tween
PUC-PR Pontifícia Universidade Católica do Paraná
SCA-UFPR Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná
SCB-UFPR Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná
SisGen Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do
Conhecimento Tradicional Associado
TMB Solução de Tetrametilbencidina, utilizada para liberação dos
cromógenos presentes nos anticorpos secundários e,
Consequentemente, revelação das reações antígeno-anticorpo
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SUMÁRIO
1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE .......................................................... 12
2 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 15
2.1 Geral ..................................................................................................................................... 15
2.2 Específicos ............................................................................................................................ 15
3 INSUMOS PARA TESTE RÁPIDO PARA DIAGNÓSTICO DE MASTITE BOVINA ............................... 16
3.1 Introdução ............................................................................................................................ 16
3.1.1 Mastite ........................................................................................................ 16
3.1.2 Bactérias dos gêneros Staphylococcus e Streptoccus ................................. 17
3.1.3 Métodos diagnósticos de mastite ............................................................... 17
3.1.4 Anticorpos IgY ............................................................................................. 19
3.2 Material e Métodos .............................................................................................................. 20
3.2.1 Metodologia geral ....................................................................................... 20
3.2.2 Locais de realização do experimento .......................................................... 20
3.2.3 Animais utilizados ....................................................................................... 21
3.2.4 Coleta de material e isolamento bacteriano............................................... 21
3.2.5 Confirmação dos isolamentos ..................................................................... 22
3.2.6 Armazenamento das cepas ......................................................................... 23
3.2.7 Imunização das Galinhas ............................................................................. 23
3.2.8 Coleta de ovos para extração de IgY da gema ............................................ 24
3.2.9 Teste dos anticorpos IgY de soro ................................................................ 24
3.2.10 Aglutinação bacteriana em lâmina ........................................................... 24
3.2.11 IDGA .......................................................................................................... 25
3.2.12 Fragmentação e padronização das bactérias para os testes .................... 26
3.2.13 Quantificação proteica por método de Bradford ..................................... 26
3.2.14 ELISA .......................................................................................................... 27
3.2.15 Purificação de IgY da gema ....................................................................... 29
3.2.16 Teste de efetividade de IgY da gema ........................................................ 29
3.2.17 ELISA de Competição................................................................................. 30
11
3.3 Resultados ............................................................................................................................ 31
3.3.1 Cultura bacteriana, identificação das cepas e imunização das galinhas .... 31
3.3.2 Aglutinação bacteriana em lâminas de microscopia .................................. 33
3.3.3 IDGA ............................................................................................................ 34
3.3.4 ELISA ............................................................................................................ 34
3.3.5 Teste de ELISA com IgY da gema e comparação com IgY sérico ................. 36
3.3.6 ELISA de Competição com IgY em amostras de leite .................................. 37
3.4 Discussão .............................................................................................................................. 42
3.4.1 Isolamento bacteriano e uso de bactérias já isoladas ................................ 42
3.4.2 Sequenciamento do gene ribossomal 16S .................................................. 43
3.4.3 Aglutinação bacteriana em lâminas de microscopia .................................. 43
3.4.4 IDGA ............................................................................................................ 44
3.4.5 ELISA ............................................................................................................ 45
3.4.6 ELISA dos anticorpos IgY purificados da gema ............................................ 46
3.5 Conclusões............................................................................................................................ 48
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................................. 49
5 REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 50
6 ANEXOS ........................................................................................................................................ 54
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1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA E ESTADO DA ARTE
Leite e seus derivados são produtos alimentícios essenciais para a maioria da
população mundial e sua produção pode ser diretamente afetada pela mastite (De Vliegher
et al., 2012). Obter o diagnóstico desta doença permite direcionar a adoção de medidas de
saneamento do rebanho (Langoni et al., 2009).
A mastite bovina é causada, dentre uma série de grupos de bactérias, principalmente
por Staphylococcus spp. e S. aureus, Streptococcus spp., Streptococcus dysgalactiae e
Streptococcus agalactiae e Corynebacterium bovis (Krewer et al., 2013; Kaczorek et al., 2017)
e pode ser classificada em clínica (com sinais de alteração das glândulas mamárias e do leite)
e subclínica (sem sinais clínicos aparentes) – Acosta et al., 2016. O diagnóstico definitivo da
enfermidade e destes agentes se dá através da cultura e do isolamento das bactérias no
leite. Langoni et al. (2009) encontraram sensibilidade diagnóstica do método de 61,2%
utilizando centrifugação prévia, 82,3% realizando pré-incubação e 64,6% utilizando
congelamento prévio das amostras. Bradley et al. (2007) encontraram 26,5% de falsos-
negativos para cultura bacteriana. Tal fato prejudica a efetividade do diagnóstico e posterga
ações corretivas por parte do médico veterinário e do proprietário dos animais (Langoni et
al., 2009). O método tem caráter qualitativo e, embora considerado definitivo, pode sofrer
interferências de fatores como contaminação externa, ausência pontual do agente na
amostra e erros no ágar, tornando dúbios os resultados (Uhler, 2009).
A mastite subclínica pode ser diagnosticada através da detecção ou dimensionamento
da reação inflamatória decorrente da infecção. Para isso, pode ser realizado o California
Mastitis Test (CMT) a campo, teste em que é estimada a proporção de células somáticas no
leite em resposta a agentes patológicos na glândula mamária (com a desvantagem de tratar-
se de teste com caráter de interpretação subjetiva) ou a Contagem de Células Somáticas
(CCS) em citômetro de fluxo em laboratório (Fagan et al., 2008), com a desvantagem do
tempo entre coleta, envio e processamento, além do custo relativamente alto (Uhler, 2009).
Além da CCS, outro teste usado como referência para diagnóstico de mastite é o
ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) (Kano et al., 2016), que também demanda
tempo de envio até o laboratório e retorno de resultado. Pesa também contra o diagnóstico
por ELISA a subjetividade no apontamento das linhas de corte para atribuição de
positividade ou negatividade (Nielsen et al, 2015).
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Diante dos pontos desfavoráveis encontrados em cada método diagnóstico já
existente, nota-se a necessidade de se estabelecer um diagnóstico rápido com alta
sensibilidade e especificidade, que não dependa de interpretação subjetiva, de preferência
com capacidade de gerar resultados semi-quantitativos. E como envolve a produção de leite,
atividade economicamente relevante, deve-se buscar a redução no custo.
Deste modo, existe a necessidade de se gerar uma tecnologia que atenda esse setor
com baixo custo, comparável ou menor que os testes atuais, mas ao mesmo tempo com
assertividade e agilidade na obtenção de resultados, para que a mastite bovina possa ser
devidamente controlada nos animais dos rebanhos acometidos. O presente trabalho
apresenta a elaboração e validação de reagentes para iniciar a construção de testes rápidos
para o uso a campo para diagnóstico de mastite bovina.
Anticorpos policlonais são relativamente baratos e de fácil produção para realização
de testes clínicos em alta escala (Zhang et al., 2011). O estado da arte apresenta estudos
recentes importantes apontando o uso de anticorpos IgY (extraídos da gema do ovo de
galinhas previamente imunizadas com os agentes-alvo) como reagentes. Shin et al. (2009)
afirmam que a IgY apresentou maior sensibilidade e resultados mais específicos do que a IgG
de coelhos e bovinos. Calzado et al. (2017) também relataram o uso da extração de IgY para
elaboração de reagentes para teste de Coombs que atendem a recomendações
internacionais para tal reagente diagnóstico; também comentaram a importância do
resultado para a discussão sobre métodos alternativos de se obter reagentes para realização
de testes mais baratos e mais rápidos.
Durante a elaboração de reagentes para imunotestes, é necessário que se indique a
especificidade dos anticorpos produzidos. Tal quesito é frequentemente comprovado pelo
método de Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA) (Kano et al., 2016).
O teste de ELISA consiste em uma via de diagnóstico e detecção de proteínas, com
destaque para imunoglobulinas (Engvall e Perlmann, 1971). O método vem sendo utilizado
como técnica para o diagnóstico de mastite causada por alguns agentes (Kano et al., 2016) e
liberação no leite de outros patógenos (Sekiya et al, 2013; Rodolakis et al, 2007). O
funcionamento do teste se dá pela detecção de anticorpos que se ligam a agentes aderidos
diretamente (ELISA direto e indireto) ou indiretamente (ELISA - sanduíche e de competição)
aos poços da placa (Engvall e Perlmann, 1971). Entretanto, há variedades de testes de ELISA
bem-sucedidos utilizando anticorpos IgY (Chen et al., 2018; He et al., 2016).
14
Para a elaboração de uma placa reagente de ELISA, é necessário que se obtenham
antígenos recombinantes ou obtidos diretamente dos agentes-alvo. Visto que o presente
trabalho se dedicou à detecção de bactérias, é possível utilizar antígenos obtidos
diretamente de cultivos desses agentes. Para tal, não pode haver dubiedade na identificação
do alvo sendo utilizado. O uso de técnicas moleculares tem viabilizado a identificação de
uma diversidade expressiva de bactérias. Dentre as técnicas, a análise da sequência genética
do RNA ribossomal (RNAr) permite determinar inequivocamente a classificação de uma
bactéria, bem como a interrelação evolucionária dos microorganismos (Blaut et al., 2002). O
ribossomo de procariotos contém duas subunidades – 50S e 30S. A primeira é composta de
34 proteinas e dois RNAs: 5S e 23S. A segunda é composta por 21 proteínas e um RNA 16S,
que é comumente utilizada para obter-se a filogenia dos procariotos (Blaut et al., 2002).
O gene que codifica o RNA ribossomal possui regiões de consenso presentes em
todas as bactérias e regiões de variabilidade específicas de grupos e espécies. E, dentro
destas regiões de variabilidade, há regiões de hipervariabilidade, que podem ser
extremamente específicas para cepas de uma mesma espécie. Tal particularidade permite a
existência de iniciadores universais (broad range primers) que são então utilizados nas
reações moleculares de identificação dos patógenos (Frank et al., 2008).
Para o desenvolvimento destes insumos de testes rápidos, foram produzidos
anticorpos policlonais a partir da gema de ovos de galinhas previamente imunizadas por
alguns dos principais agentes etiológicos da mastite bovina.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Desenvolver reagentes que sirvam como insumos para uso em futuro protótipo de
teste diagnóstico para mastite bovina, bem como fazer avaliações preliminares desses
reagentes em testes laboratoriais.
2.2 Específicos
2.2.1 Cultivar e identificar bactérias a partir de amostras laboratoriais e de campo;
2.2.2 Imunizar galinhas poedeiras com extratos brutos oriundos das colônias
bacterianas. Obter amostras de soros e purificar IgY a partir das gemas dos ovos das
respectivas galinhas cujo soro apresentou resposta satisfatória e testar a aplicabilidade
destes anticorpos IgY em amostras de leite infectado obtidas de trabalho de campo;
2.2.3 Avaliar a resposta a estes protocolos de imunização e a qualidade dos
anticorpos IgY por meio de provas de aglutinação bacteriana, imunodifusão em gel de ágar
(IDGA) e ELISA usando antígenos conhecidos;
2.2.4 Testar o imunoensaio de seleção escolhido no objetivo específico 3 utilizando
amostras de campo.
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3 INSUMOS PARA TESTE RÁPIDO PARA DIAGNÓSTICO DE MASTITE BOVINA
Autores
Henrique Larsen Brunow Ventura
Breno Castello Branco Beirão
Luiz Felipe Caron
Max Ingberman
Lea Chapaval
Celso Fávaro Junior
3.1 Introdução
3.1.1 Mastite
A mastite bovina pode ser considerada a doença de maior gravidade e importância
em rebanhos leiteiros ao redor do mundo (Viguier et al., 2009). A enfermidade é
caracterizada por inflamação nas glândulas mamárias das fêmeas da espécie bovina (Costa
et al., 2008) e pode ser classificada em “clínica” (com sinais de alteração das glândulas
mamárias e do leite – apresentação de flocos e coágulos, – além de até mesmo sinais
sistêmicos como febre e inapetência) e “subclínica” (sem sinais clínicos aparentes, mas com
possível queda na produção leiteira e com bactérias presentes na secreção láctea) (Acosta et
al., 2016). O prejuízo decorrente da enfermidade pode ser refletido pela redução de até 21%
na produção leiteira e de até 25% na gordura do leite dos animais acometidos (Paul e
Ganguly, 2012).
É causada, dentre vários grupos de bactérias e demais microorganismos,
principalmente pelos gêneros bacterianos Staphylococcus e Streptococcus (Krewer et al.,
2013; Gonzales et al., 2014; Kaczorek et al., 2017).
A ocorrência deste agravo acarreta grandes problemas à atividade leiteira e seu
diagnóstico precoce permite maior eficácia no controle da enfermidade nos rebanhos
(Langoni et al., 2009; De Vliegher et al., 2012; El-Hamid, 2016), assim como o enfrentamento
da mastite é diretamente dependente de um entendimento básico da natureza e da
distribuição de seus agentes etiológicos (Santos et al., 2007).
17
3.1.2 Bactérias dos gêneros Staphylococcus e Streptoccus
As bactérias do gênero Staphylococcus são microorganismos piogênicos, gram-
positivos e catalase-negativos. Sua distribuição é global, cosmopolita e, geralmente, de
caráter comensal, com grande estabilidade no ambiente (Quinn et al., 2005, Trabulsi, 2008).
Suas enzimas hemolisina e coagulase são dois grandes fatores de virulência e estão
presentes nas espécies coagulase-positivas, especialmente S. aureus, que possui grande
incidência no leite dos tanques de expansão em que há casos diagnosticados de mastite
(Quinn et al., 2005; Trabulsi, 2008; Lee et al., 2012) e apresenta papel importante nos casos
de mastite subclínica (Fagundes et al., 2010).
As bactérias do gênero Streptococcus, ao lado das do gênero Staphylococcus, estão
entre as principais causadoras da mastite bovina, por meio de colonização dos ductos
galactóforos (Quinn et al., 2005; Krewer et al., 2013; Gonzales et al., 2014; Kaczorek et al.,
2017).
As espécies enquadradas neste gênero são gram-positivas, anaeróbias facultativas,
imóveis e catalase-negativas (importante fator de diferenciação das bactérias do gênero
Staphylococcus). Também possuem a enzima hemolisina como um fator de virulência, mas
outros fatores também atuam como um diferencial, tais como polissacarídeos de
membrana, hialuronidase, DNAse e estreptoquinase (Quinn et al., 2005).
As espécies S. agalactiae, S. uberis, S. bovis e S. dysgalactiae são, dentro deste
gênero, as mais prevalentes nos animais de rebanhos de bovinos leiteiros (Santos et al.,
2007, Paul e Ganguly, 2014).
3.1.3 Métodos diagnósticos de mastite
O diagnóstico definitivo da enfermidade e destes agentes se dá por meio da cultura e
do isolamento das bactérias no leite, mas é um método que pode apresentar variações de
resultado, principalmente ao se considerar a diferença entre regiões geográficas (Vásquez et
al., 2013). Além disso, a qualidade na obtenção das amostras para análise também se
18
configura como ponto crítico para o sucesso da detecção dos agentes (Guimarães e Langoni,
2011).
Langoni et al. (2009) encontraram sensibilidade diagnóstica para o método de cultura
bacteriana de 61,2%, 82,3% e 64,6%, respectivamente, de acordo com cada etapa de
processamento na primeira amostra do teto afetado. Bradley et al. (2007) encontraram
26,5% de falsos-negativos para cultura bacteriana. Tal fato prejudica a efetividade do
diagnóstico e posterga ações corretivas por parte do médico veterinário e do proprietário
dos animais (Langoni et al., 2009).
Outro teste usado como referência para diagnóstico de mastite é o ELISA (Kano et al.,
2016), que também demanda tempo de envio da amostra até o laboratório e retorno do
resultado. Pesa também contra o diagnóstico por ELISA em larga escala a subjetividade no
apontamento das linhas de corte para atribuição de positividade ou negatividade e o fato de
que diversos kits buscam nas amostras os anticorpos em relação aos agentes, e não
diretamente os agentes causadores da doença (Nielsen et al., 2015).
A mastite subclínica pode ser diagnosticada pela detecção ou dimensionamento da
reação inflamatória decorrente da infecção (Langoni et al., 2009). Para isso, pode ser
realizado o California Mastitis Test (CMT) a campo, teste em que é estimada a proporção de
células imunes e células descamativas no leite em resposta a agentes patológicos na
glândula mamária (Fagan et al., 2008). Porém, é um método de triagem que tem como
desvantagem a interpretação subjetiva e a baixa confirmação do resultado nos testes padrão
ouro (Krewer et al., 2013). A mastite subclínica também pode ser detectada pelo método de
Contagem de Células Somáticas (CCS) em citômetro de fluxo em laboratório (Fagan et al.,
2008), mas este método possui como desvantagens o elevado tempo entre coleta, envio,
processamento e resultado, além do custo relativamente alto (Uhler, 2009).
Provas moleculares de diagnóstico como a PCR (Polymerase Chain Reaction) também
vêm sendo utilizadas, especialmente para detecção de agentes etiológicos de difícil cultivo e
que estão presentes em estado latente nas amostras de leite. Mas, além das desvantagens
de tempo para envio ao laboratório e custo de realização, a técnica é propensa a muitos
resultados falsos positivos (Nielsen et al., 2015).
Monitorar a saúde da glândula mamária dos animais dos rebanhos mostra-se
bastante difícil se não houver métodos diagnósticos confiáveis e de preço acessível. Algumas
técnicas estão sendo desenvolvidas para avaliar a qualidade do leite pela detecção da
19
inflamação da glândula mamária, bem como detecção da infecção e seus agentes
etiológicos. Portanto, mostra-se uma constante necessidade de aprimoramento destes
métodos tanto com relação ao custo, quanto à precisão e praticidade (El-Hamid, 2016).
3.1.4 Anticorpos IgY
As aves têm como uma de suas particularidades no sistema imune os anticorpos IgY.
De estrutura similar à IgG dos mamíferos, estas estruturas humorais de defesa do organismo
são encontradas em grande concentração no plasma sanguíneo e na gema dos ovos (Tizard,
2009).
Supeanu et al. (2019) levantaram a possibilidade de utilizar IgY com fins terapêuticos
contra alguns agentes etiológicos. Anticorpos policlonais são relativamente mais baratos e
de fácil produção também para realização de testes diagnósticos clínicos em alta escala
(Zhang et al., 2011). Aves previamente imunizadas com o agente-alvo fornecem nas suas
gemas anticorpos IgY, que podem ser facilmente extraídos para serem utilizados como
reagentes. Shin et al. (2009) afirmam que o anticorpo IgY apresentou sensibilidade maior e
resultados mais específicos do que a IgG de coelhos e bovinos. Segundo Munhoz et al.
(2014), IgY apresenta maior avidez e maior possibilidade de produção em larga escala em
relação à IgG. Além disso, possui grande aplicabilidade a diversos imunoensaios como
estratégia para a busca de melhorias para a precisão dos testes.
Calzado et al. (2017) também relataram o uso da extração de IgY para produção de
reagentes para teste de Coombs que atendem a recomendações internacionais para tal
reagente diagnóstico; também comentaram a importância do resultado para se obter
reagentes alternativos para realização de testes mais baratos e mais rápidos. Akita & Nakai
(1993), Zhang et al. (2011) e Munhoz et al. (2014) também apontam o uso de IgY como uma
saída alternativa interessante para minimizar o estresse (menor necessidade de punções,
contenções e extração de amostras de órgãos) e o sacrifício de animais em prol da produção
de reagentes. Chen et al., 2018 e He et al., 2016 também relataram o sucesso no uso destes
anticorpos como reagentes para detecção de proteínas em provas de ELISA.
20
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Metodologia geral
Foram utilizadas para a produção de reagentes para os imunoensaios as culturas de
bactérias que mais comumente são as causadoras da mastite bovina, tais como
Staphylococcus sp., S. aureus, Streptococcus sp. e S. uberis. A cultura obtida a partir de
amostras de leite oriundas de campo foi utilizada tanto para imunização de galinhas e
consequente obtenção de anticorpos, quanto para realização dos testes dos anticorpos,
posteriormente. Então a resposta imune a estes patógenos foi avaliada nas dependências do
laboratório Imunova® através de aglutinação, IDGA e ELISA. Os anticorpos presentes nas
amostras de animais responsivos e específicos à imunização foram obtidos também a partir
da gema dos ovos das respectivas aves e testados por ELISA de competição.
3.2.2 Locais de realização do experimento
O experimento foi realizado com amostras de leite de quatro bovinos de duas
propriedades rurais do município de São José dos Pinhais – PR – Brasil. Também foram
utilizadas cepas vivas enviadas pelo laboratório Labvet®, sediado em Carambeí – PR – Brasil,
isoladas de leite de bovinos de propriedades rurais do mesmo município e de municípios
adjacentes.
As galinhas para produção das amostras de soro e ovos para gemas purificadas foram
mantidas em propriedade experimental no município de Curitiba – PR – Brasil.
As amostras de leite para isolamento bacteriano foram processadas no laboratório
privado Imunova®, localizado no município de Curitiba – PR – Brasil, com instalações junto
ao SCB – UFPR e junto ao Parque Tecnológico da PUC-PR.
As amostras de leite para teste dos insumos produzidos foram enviadas pelo
laboratório Labvet® e foram coletadas de bovinos de propriedades rurais de Carambeí – PR –
Brasil e da bacia leiteira dos municípios adjacentes.
Os anticorpos policlonais foram produzidos no laboratório privado Imunova®, onde
também foram realizados os testes do funcionamento destes insumos.
21
3.2.3 Animais utilizados
Foram utilizados, para a coleta de leite, quatro vacas das raças Holandesa e Jersey em
período de lactação, criadas e mantidas nas propriedades de origem descrita no item 3.2.2
para a coleta de amostras de leite suspeito de mastite. Estes animais são mantidos em
criação a pasto com suplementação de ração e silagem de milho.
Para a produção de anticorpos policlonais foram utilizadas seis galinhas (Gallus
gallus) poedeiras da linhagem Isa Brown em fase de postura, mantidas durante todo o
desenvolvimento do protocolo de imunização e coleta de ovos em propriedade experimental
com instalações adequadas de conforto térmico, luminoso e de densidade populacional e
alimentadas ad libitum com ração peletizada para postura da marca Agramulti® (16,5% de
proteína bruta, de 2,8% a 4% de Cálcio, 5% de fibra bruta máxima). Foi utilizada uma galinha
por agente etiológico a ser inoculado.
O experimento teve aprovação da CEUA do SCA-UFPR sob nº 004/2018 em 09 de
março de 2018, conforme Anexo 1.
3.2.4 Coleta de material e isolamento bacteriano
Foram coletadas amostras de leite proveniente de duas propriedades rurais do
município de São José dos Pinhais – PR – Brasil, conforme descrito nos itens 3.2.2 e 3.2.3. As
amostras foram obtidas por ordenha dos bovinos descritos no item 3.2.3. Após rigorosa
higienização das mãos do executor da ordenha, os três primeiros jatos de cada teto foram
descartados e as amostras acondicionadas individualmente em recipientes estéreis. As
amostras foram mantidas sob refrigeração de aproximadamente 4oC e encaminhadas ao
laboratório Imunova®, para serem processadas no mesmo dia. O isolamento bacteriano foi
realizado de acordo com Quinn et al. (2005) em quatro tipos de meios Newprov® diferentes:
Ágar Cled, Ágar DNAse, Ágar-sangue e Ágar MacConkey.
Foram realizadas provas bioquímicas para identificação, quando possível, de gêneros
ou espécies. As provas executadas foram as de coagulase, catalase, hemólise e crescimento
em Ágar MacConkey, também seguindo o protocolo de Quinn et al. (2005).
22
Foram solicitadas, também, a um laboratório de patologia veterinária terceirizado
(Laboratório LabVet®) amostras de S. aureus, S. agalactiae, Streptococcus sp., S. uberis e
Corynebacterium bovis, obtidas também a partir de amostras de campo – decorrentes da
rotina do estabelecimento – em placas de ágar Mueller-Hinton Newprov®. As colônias
previamente identificadas foram novamente semeadas em placas com ágar Sangue e ágar
Mueller-Hinton quando foram recebidas pelo laboratório Imunova®. As placas foram
incubadas em estufa a 37oC por 24 horas, para que as amostras recebidas fossem
armazenadas de modo a serem manipuladas o mínimo possível posteriormente. As colônias
que cresceram foram repicadas em água peptonada Kasvi® e incubadas em estufa a
temperatura de 37oC por 24 horas. Então foram aliquotadas e misturadas com glicerol
Merck® a 10% para congelamento em ultrafreezer a temperatura de – 80oC.
O isolamento e a identificação destas bactérias também se deram por metodologia
adaptada de Quinn et al. (2005).
3.2.5 Confirmação dos isolamentos
Em um laboratório terceirizado de biologia molecular (WemSeq®), foi realizado o
sequenciamento do RNA ribossomal das bactérias isoladas. As amostras aliquotadas foram
semeadas em ágar Mueller-Hinton Newprov®, incubadas a 37oC por 24 horas e enviadas ao
laboratório para a realização do sequenciamento do RNA ribossomal 16S das colônias.
As seqüências obtidas foram alinhadas no software BioEdit® e analisadas no software
Mega® versão 6, em que foram realizadas as devidas correspondências com o banco de
dados BLAST®, que contém os mais diversos genomas já conhecidos.
23
3.2.6 Armazenamento das cepas
As cepas obtidas para uso nos testes ou para imunização das galinhas foram
cultivadas em água peptonada e armazenadas em ultrafreezer à temperatura de -80o C, em
alíquotas adicionadas a 10% com glicerol Merck® estéril.
3.2.7 Imunização das Galinhas
As bactérias isoladas, identificadas e repicadas em água peptonada foram
aliquotadas e inativadas em solução com formaldeído Sigma Aldrich® a 10%. A inativação foi
confirmada por ressemeadura com crescimento negativo das amostras em placas de Ágar
Mueller-Hinton Newprov® e posterior incubação a 37oC por 24 horas. Então realizou-se a
mistura de 0,5 ml da amostra pretendida com 0,5 ml de Adjuvante de Freund Incompleto
Sigma Aldrich® em aparelho de agitação por formação de vórtex.
Cada mistura foi injetada, então, em uma galinha (Gallus gallus) diferente,
totalizando as seis descritas no item 3.2.3, um terço por via intramuscular (no músculo
peitoral), um terço por via subcutânea (sob a pele do pescoço) e um terço por via
intradérmica (na prega da asa). Aproveitando a mesma ocasião de contenção, foi obtido
soro pré-imune a partir do sangue coletado por punção da veia ulnar, visando posterior
comparação da titulação de anticorpos.
O procedimento de imunização foi repetido em cada ave por mais duas vezes com
intervalos de 21 a 27 dias entre cada uma delas. Ao término do protocolo de imunização, foi
novamente coletado sangue para obtenção de soro por centrifugação em centrífuga
Eppendorf® (após cerca de 2 horas de descanso para coagulação e decantação) a 4300 rpm a
20oC por 20 minutos, visando avaliar a resposta ao procedimento.
24
3.2.8 Coleta de ovos para extração de IgY da gema
Uma semana após o último reforço do protocolo vacinal, foram coletados os ovos
colocados por cada ave e armazenados em câmara fria a 4oC. A coleta foi de um ovo por dia,
por ave, por sete dias, contados a partir do sétimo dia após a última imunização.
3.2.9 Teste dos anticorpos IgY de soro
Os anticorpos dos soros obtidos das aves imunizadas foram testados por aglutinação
bacteriana em lâmina, IDGA e ELISA.
3.2.10 Aglutinação bacteriana em lâmina
Cada soro a ser testado teve uma alíquota a ser dividida em 5 diluições seriadas em
PBS de: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16. Em lâminas para microscopia Exacta®, foram colocados dois
focos de colônias de bactérias. Um da espécie bacteriana presente na imunização da ave que
forneceu o soro a ser testado e outro de bactéria não envolvida no protocolo de imunização
daquela ave. Em seguida, pipetaram-se 10 microlitros do soro a ser testado em cada “foco”
da lâmina e espalharam-se na gota as colônias previamente colocadas, de acordo com o que
é representado na Imagem 1. É dado como reagente o soro cujo foco apresenta grumos de
colônias na gota de soro pipetado.
25
Figura 1 – Disposição das amostras na aglutinação bacteriana em lâminas.
3.2.11 IDGA
Com o intuito de ter mais indicativos da qualidade desejada nos soros obtidos das
galinhas, foi realizado, também, o teste de Imunodifusão em Ágar-Gel, técnica imunológica
que indica se os anticorpos em um determinado soro precipitaram em direção a um agente
etiológico solúvel através de uma superfície de ágar-gel. A difusão destes componentes que
resulta em equivalência das concentrações de antígeno e anticorpo apresenta uma linha de
precipitação entre os poços no gel sobre a lâmina.
O preparo da técnica iniciou-se com o preparo do ágar. Diluiu-se gel de ágar Kasvi® à
concentração de 1% em PBS mediante aquecimento em microondas em ciclos de 30
segundos em potência máxima até a completa dissolução. Com o auxílio de uma pipeta
sorológica, a mistura foi aplicada ainda quente sobre lâminas de microscopia Exacta®
(mantidas em mesa nivelada) em temperatura ambiente até a completa solidificação. Assim
que o ágar esfriou e solidificou-se, foram feitos três poços com cerca de 2mm de raio cada,
com distância entre 3mm e 5mm entre eles, com o auxílio de objetos esféricos e de agulha.
No poço central foram adicionados 20µl do soro a ser testado de ave que passou pelo
protocolo de imunização. Em um dos poços extremos da lâmina, foi adicionada solução (em
26
água peptonada) de bactéria (utilizada no protocolo de imunização da ave cujo soro foi o
testado na lâmina) fragmentada por disruptor ultrassônico Unique® conforme descrito no
item 3.2.12 no volume de 20µl. No poço do extremo oposto, foram adicionados 20µl de
solução de bactéria diferente (Acinetobacter sp.) da utilizada no protocolo de imunização da
ave cujo soro foi testado na lâmina. A disposição é representada na Figura 2.
Figura 2 – Layout das lâminas utilizadas na imunodifusão em ágar-gel.
3.2.12 Fragmentação e padronização das bactérias para os testes
Foram repicadas as bactérias isoladas em água peptonada e incubá-las por 24 horas a
37oC até a turvação do meio. Então, cada amostra teve suas bactérias fragmentadas em
disruptor ultrassônico de células em três a cinco ciclos de 15 segundos cada, em potência
máxima. A solução foi centrifugada a 5000 RPM em centrífuga Eppendorf® e o sobrenadante
foi retirado, visando reduzir a interferência da água peptonada na quantificação. O
precipitado foi ressuspendido em solução de PBS utilizando vórtex.
3.2.13 Quantificação proteica por método de Bradford
Como etapa prévia ao teste de ELISA, foi realizada a padronização e quantificação
proteica dos antígenos bacterianos, conforme descrito no item 3.2.12.
27
A quantificação proteica foi realizada por uma adaptação do método de Bradford
(1976) de modo que leitura fosse feita em aparelho leitor de placas. Utilizando como
referência uma solução de BSA Inlab® e água destilada na concentração de 0,93 µg/µl, foi
construída uma curva-padrão pipetando-se volumes diferentes dessa solução em cada poço
da microplaca com 96 poços para volumes iguais de reagente de Bradford. Nos poços
adjacentes, foram pipetadas as proteínas a serem quantificadas, também com reagente de
Bradford. Em seguida, realizou-se a leitura da placa em leitor de placas Epoch® com
comprimento de onda de 595 nm. Com as absorbâncias obtidas, foi realizada a comparação
com a curva-padrão e, consequentemente, a quantificação proteica de cada amostra.
3.2.14 ELISA
Para teste dos anticorpos presentes no soro das aves imunizadas foi realizado o teste
de ELISA. Cada placa de poliestireno com 96 poços MAXISORP® foi sensibilizada com 200 ng/
µl de solução de bactéria lisada (conforme descrito no item 3.2.12), ressuspensa em
aparelho de vórtex Vision®, a confrontar os soros que passaram pelo protocolo de
imunização com agentes patogênicos diferentes. Esta quantia foi pipetada nos poços em
volumes de 50 µl. A placa foi coberta com filme plástico e deixada em geladeira overnight.
Após a etapa de sensibilização, os poços das placas foram vigorosamente esvaziados
e, em seguida, lavados com PBS-T em concentração de 0,05%. Após esta lavagem, os poços
das placas receberam 200 µl de tampão de bloqueio (composto pelo PBS-T a 0,05% e por
BSA Inlab® em concentração de 2%), de modo a minimizar o efeito de ligações inespecíficas
de cada poço aos anticorpos das etapas seguintes, e seguiram para incubação em estufa a
37oC por uma hora.
Foi retirado o tampão de bloqueio e procedida nova lavagem com PBS-T a 0,05%,
para proceder a etapa de pipetagem dos anticorpos primários.
Os anticorpos primários foram aqueles presentes no soro das aves utilizadas para o
protocolo de imunização (soro imune obtido após o protocolo completo e soro pré-imune
obtido das mesmas aves, mas antes da imunização). Inicialmente, a comparação foi realizada
entre soros pré-imunes e soros imunes na mesma placa, em diluições de base 2, para testar
a soroconversão dos animais. Após constatação de especificidade insatisfatória, optou-se
28
por seguir o protocolo com diluições de base 10, de 1: 104 a 1:108. Foram adicionados os
soros pré-imune e imune de acordo com a disposição a ser testada na placa, em duplicata.
Uma linha da placa ficou sem a adição do anticorpo primário para que seja adotada como
“padrão branco” do teste para a leitura. Nas colunas, o soro foi aplicado em diluição (em
solução de PBS) crescente de base 10. Após a adição do anticorpo primário, a placa seguiu
para nova incubação a 37oC, desta vez por duas horas.
Foi procedida, em seguida, a lavagem da placa com solução de lavagem por cinco
minutos com movimentação diagonal lenta em agitador de placas, etapa repetida por mais
cinco vezes, intercalada com batida vigorosa da placa para retirada de eventuais resíduos.
Adicionou-se, então, o anticorpo secundário. No caso, anticorpo anti-chicken-IgG
Sigma-Aldrich®, visando detectar os anticorpos presentes no soro usado como anticorpo
primário. O anticorpo, conjugado com cromógeno, é homogeneizado ao tampão de bloqueio
na diluição de 1:25.000 e tal solução foi aplicada na quantidade de 50 µl por poço testado. A
aplicação foi seguida de nova incubação a 37oC por uma hora.
Seguiu-se então para nova lavagem da placa com 200 µl por poço de PBS-T por cinco
minutos com movimentação diagonal lenta, etapa repetida por mais cinco vezes, intercalada
com batida vigorosa da placa para retirada de eventuais resíduos; e pipetagem de TMB
Thermo Scientific® no volume de 50µl por poço, gerando a reação cromogênica a partir da
enzima HRP aderida ao anticorpo secundário (consequentemente, ligado ao anticorpo
primário aderido ao agente no fundo da placa). A placa permaneceu sob ausência de luz até
a reação atingir o ápice. Quando o padrão branco começou a aparentar alguma positividade,
a reação foi bloqueada com a adição de 50 µl de ácido sulfúrico na concentração 1M por
poço. E, em seguida, a placa foi levada para leitura da absorbância em aparelho de
espectrofotometria computadorizada Epoch® com comprimento de onda de 450nm.
Foram calculados média e desvio padrão das reações representadas pelas
absorbâncias dos poços, comparadas entre os soros imune e pré-imune, bem quanto à
absorbância do padrão branco. Com os resultados deste teste, foram elencados os
anticorpos com potencial para realizar os testes com leite naturalmente contaminado.
29
3.2.15 Purificação de IgY da gema
Após os testes com o soro das galinhas que passaram pelo protocolo de imunização,
procedeu-se a obtenção de IgY dos ovos dos animais que geraram os anticorpos mais
específicos e sensíveis. Para isso, o procedimento de purificação iniciou-se separando a
gema em um tubo tipo falcon de 50ml. Foi adicionada solução de PBS até completar a marca
de 45ml, adicionados 1,58g de tensoativo PEG 6000® e então submeteu-se a mistura em
aparelho de vórtex Vision® por 30 segundos e, na sequência, em agitador orbital por 10
minutos. Em seguida, centrifugou-se a solução à velocidade de 9000 rpm por 30 minutos a
4oC.
Após a primeira centrifugação, o sobrenadante foi filtrado em filtro de papel, e a ele
adicionados mais 3,6g de tensoativo PEG 6000® (aproximando-se da concentração de 12%) e
vortexado novamente por 30 segundos, misturado novamente no agitador orbital por 10
minutos e novamente centrifugado à velocidade de 9000 rpm por 30 minutos a 4oC. Desta
vez, o sobrenadante foi descartado.
O pellet restante foi ressuspendido em 1 ml de solução de PBS e, em seguida,
ressuspendido em 10ml. Então adicionou-se 1,2g de tensoativo PEG 6000®. A mistura foi
novamente vortexada por 30 segundos, misturada em agitador orbital por 10 minutos,
centrifugada à velocidade de 9000 rpm por 30 minutos a 4oC. Descartou-se novamente o
sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet com 1ml de solução de PBS. O material purificado
foi armazenado a -20oC.
3.2.16 Teste de efetividade de IgY da gema
Para confirmação de que as amostras de IgY de gema atingiram a mesma conversão
sérica, foi realizado novo teste de ELISA, conforme descrição anterior, analisando-se em uma
mesma reação os soros e o IgY purificado das gemas como anticorpos primários, em
diluições seriadas de base 10, de 1: 104 a 1:108.
30
3.2.17 ELISA de Competição
Para averiguação da eficácia dos insumos em amostras de campo foi realizado o teste
de ELISA de competição.
As amostras de campo foram obtidas pelo laboratório de patologia veterinária
LabVet, que enviou leite de animais que tiveram isolamento positivo de S. aureus na prova
microbiológica e bioquímica, segundo metodologia de Quinn et al. (2005).
A técnica utilizada substitui os poços da placa de controle negativo por uma curva
padrão de referência. O anticorpo com resultados considerados satisfatórios para seguir a
esta etapa foi o anticorpo anti-S. aureus, de modo que, portanto, a S. aureus fragmentada
conforme descrito no item 3.2.12 foi utilizada para sensibilizar a placa na quantidade de
200ng por poço. Foi realizado um teste inicial utilizando uma solução de caseína Inlab® a 1%
na curva padrão para mimetizar a presença do leite (marca LETTI® semidesnatado A2), que
foi a matriz presente nos demais poços, devido à natureza das amostras. Inicialmente, foram
utilizadas na curva padrão uma duplicata de poços com IgY puro (na matriz de caseína) na
concentração de 1:105, uma duplicata de poços com IgY (na concentração recém-citada e
ainda na matriz de caseína) e 300ng de extrato lisado de Staphylococcus aureus; uma
duplicata com IgY e 700 ng de S. aureus; uma duplicata com IgY e 1000ng de S. aureus; e
uma duplicata com IgY e 1300ng de S. aureus. Nas demais duplicatas foram pipetadas as
amostras de campo a serem testadas, adicionadas de IgY na concentração de 1:105.
O procedimento realizado seguiu quase exatamente os passos da técnica de ELISA
descrita anteriormente. No presente teste, o anticorpo primário foi IgY purificado de gema.
Estes anticorpos foram adicionados após serem conjugados a uma matriz que mimetizasse
as amostras de campo (no caso da curva padrão); o IgY também foi misturado com
quantidades diferentes de proteína bacteriana (S. aureus lisada em disruptor ultrassônico,
conforme também descrito previamente) ou às próprias amostras de campo e levadas a
incubação por 60 minutos (no caso das amostras).
Após nova padronização de acordo com os resultados, a curva padrão de IgY em
titulação de 1:105 foi preparada utilizando leite tipo A como matriz e com quantidades de S.
aureus lisada de 0ng, 5ng, 10ng, 20ng, 36ng e 50ng, com e sem o uso de detergente Tween
VTec® em concentração 0,05%. A leitura das respectivas absorbâncias foi tabulada no
software Microsoft® Excel 2007, em que foi elaborado o gráfico para regressão linear da
31
curva padrão. A partir da equação obtida, foram calculadas as quantidades estimadas de
bactéria nas amostras de leite, de modo a estabelecer o grau de positividade de cada
amostra.
3.3 Resultados
3.3.1 Cultura bacteriana, identificação das cepas e imunização das galinhas
Amostras de leite oriundas de quatro animais de duas propriedades rurais de São
José dos Pinhais. foram cultivadas em diferentes meios para identificação das bactérias
presentes.
Como resultado das culturas bacterianas, foram obtidas as seguintes leituras gerais:
Tabela 1 – Leitura da cultura das amostras em diferentes meios
Amostra DNAse Sangue + Azida McConkey Cled
01 Cresc. s/ halo Crescimento Cresc. s/ halo
02 Cresc. s/ halo Crescimento Cresc. s/ halo
03 Cresc. s/ halo Crescimento Cresc. c/ halo
04 Cresc. c/ halo Crescimento Cresc. c/ halo
As colônias das amostras em questão foram repicadas em “Master Plates” em ágar
Sangue, visando redundância para a sequência do trabalho. Nesta ressemeadura constatou-
se que algumas colônias, diferente do teste anterior, causaram hemólise no meio. Assim
foram selecionadas as seguintes colônias para realizar os testes bioquímicos:
32
Tabela 2 – Resultados dos testes bioquímicos das bactérias selecionadas
Coagulase Catalase Ágar
MacConkey
Controle negativo (Colônia de
ágar MacConkey)
- - +
Am1DNS1 + - -
Am1DNS2 + - -
Am4CLS9 - - -
Am4CLS10 + - -
Am4CLS11 - - -
Am refere-se à amostra de onde a colônia é oriunda nas tabelas 1 a 4 do item 3.3.1, DNS refere-se a
colônia originada de semeadura em ágar DNAse; e CLS refere-se a colônia cultivada em ágar Cled.
Destes testes, identificou-se que as amostras Am1DNS1 e Am4CLS10 poderiam,
diante dos fatores de patogenicidade, ser causadoras de mastite. Estas colônias foram
repicadas em água peptonada, incubadas e congeladas em ultrafreezer.
A estas amostras, juntaram-se as enviadas pelo laboratório de patologia veterinária
LabVet®, que foram igualmente repicadas em água peptonada, incubadas e congeladas em
ultrafreezer. Procedeu-se a confirmação dos isolamentos pelo sequenciamento do gene
ribossomal 16S e foram inoculadas as galinhas (1 ave por cepa) de acordo com o
apresentado na tabela 3:
33
Tabela 3 – Correspondência entre identificação das aves e das amostras, associada à
identificação prévia e à identificação após sequenciamento do gene ribossomal 16S
Número da ave Nome da amostra Ident. Inicial Ident.
Sequenciamento
0288 Am4CLS10 Staphylococcus sp. Staphylococcus sp.
0290 Am1DNS1 Staphylococcus sp. Staphylococcus sp.
0244 B/STRUB S. uberis S. uberis
0282 C/STRAG S. agalactiae S. chromogenes
0298 E/STAAU S. aureus S. aureus
0369 A/STRSP Streptococcus sp. S. uberis
Ñ imun D/STASP Staphylococcus sp. Staphylococcus sp.
Ñ imun F/CORYNE C. bovis Acinetobacter sp.
As amostras foram cadastradas no SisGen sob o acesso nº A4AF0D5.
Os soros obtidos para os passos seguintes de teste para IgY sérico mantiveram como
identificação o número da ave, apenas com a diferenciação entre imune (IM) e pré-imune
(PI).
3.3.2 Aglutinação bacteriana em lâminas de microscopia
Tabela 4 – Resultados das leituras do teste de aglutinação bacteriana
Específico Cruzado Pré imune
Cruzado
Acinetobacter
sp.
Anti S. chromogenes (STRAG) 1:8 Sim 1:2
anti S. uberis (STRSP) 1:8 Sim 0
Anti S. uberis 1:4 Sim 1:2
Anti Staphylococcus sp. Am1DNS1 1:4 Não 1:1
Anti Staphylococcus sp. Am4CLS10 1:8 Não 1:2
Anti S. aureus 1:2 Sim 1:1
34
3.3.3 IDGA
Neste novo teste de triagem, as lâminas com ágar-gel utilizadas tiveram seus
resultados visualizados e analisados de acordo com o seguinte layout descrito na figura 2.
Os resultados observados são apresentados na tabela 5:
Tabela 5 – Leitura das provas de IDGA
1:1esp 1:1 cr 1:2esp 1:2cr 1:4esp 1:4cr 1:8esp 1:8 cr
Anti –
Am1DNS1
(288)
X X* X X* X - - -
Anti –
Am4CLS10
(290)
X X - - - - - -
Anti – STAAU
(298) X - X - - - - -
Anti – STRUB
(244) - - - - - - - -
Anti – STRSP
(369) - X* - - - - - -
Anti – STRAG
(282) - - - - - - - -
Legenda: esp = reação específica; cr = reação cruzada; *houve reação com o soro pré-
imune; - = sem reação observada
3.3.4 ELISA
Os resultados dos testes realizados com diluição dos soros em base 2 apresentaram
incongruências, tais como reação aparentemente progressiva diretamente proporcional às
diluições e proximidade estatística das linhas de corte entre soros imunes e pré-imunes.
35
Deste modo, foi realizado ELISA diluindo os soros em base 10, de 1:10 a 1:1.000.000,
reduzindo o número de amostras de soros testados (soros anti S. aureus e anti S. uberis,
imunes e pré-imunes) em placa sensibilizada com 200ng de S. aureus por poço, do que se
obteve o que se retrata na figura 3:
Figura 3 – Absorbâncias do teste de ELISA realizado em placa com anticorpos IgY
séricos sensibilizada com S. aureus. As barras mostram a média e o desvio padrão.
Levando em consideração este resultado, seguiu-se para novos testes em ELISA de
base 10, desta vez utilizando-se diluições de 1:104 a 1:108.
36
Figura 4 – Absorbâncias da placa de ELISA testada para soros anti S. aureus e S. uberis. Placa
sensibilizada com S. aureus e S. uberis. As barras mostram a média e o desvio padrão.
Os testes indicaram quais inóculos geraram soroconversão significativa após o
protocolo de imunização nas galinhas. Assim, observou-se que o melhor resultado foi para o
soro anti S. aureus, que reagiu uma diluição a mais que o soro pré-imune nos poços
sensibilizados para este agente, enquanto que não houve diferenciação significativa entre as
reações dos anticorpos no teste para anticorpos anti S. uberis, uma vez que, para eles, o
padrão branco reagiu de forma muito semelhante ao observado nos demais poços.
3.3.5 Teste de ELISA com IgY da gema e comparação com IgY sérico
Os anticorpos purificados das gemas foram testados para selecionar quais seriam
utilizados nas etapas seguintes. Do que se obteve como resultado o que se observa na figura
5.
37
Figura 5 – Absorbâncias dos testes de ELISA com anticorpos IgY recém purificados das gemas
de aves imunizadas com S. aureus. Placa sensibilizada com S. aureus. As barras mostram a
média e o desvio-padrão.
Assim comprovou-se presença de IgY anti S. aureus na gema identificada como do dia
30/07 e que ela poderia ser utilizada para os testes subsequentes.
Foi refeito o teste de ELISA com o IgY coletado dos ovos e houve reação satisfatória.
Então, na comparação entre a titulação em ELISA de base 10 com soro contendo IgY da
gema e a titulação com o soro contendo IgY sérico, também se obteve como resultado a
mesma titulação de anticorpos: 1:105, do que conclui-se que os resultados obtidos nas
análises seguinte poderão ser considerados como sequencia dos resultados obtidos até
então.
3.3.6 ELISA de Competição com IgY em amostras de leite
A curva padrão do primeiro teste de ELISA de competição foi preparada em duplicata
em uma placa de ELISA. Para a preparação da curva, IgY puro anti-S. aureus (na matriz de
caseína) na concentração de 1:105 foi bloqueado com concentrações progressivamente
maiores de lisado de S. aureus. Assim, 300 ng, 700 ng, 1000 ng e 1300 ng de extrato lisado
de Staphylococcus aureus foram utilizados para bloquear a ligação do IgY com a bactéria
imobilizada na placa . As amostras de campo – possivelmente contendo S. aureus - foram
38
testadas frente aos anticorpos IgY em titulação de 1:105. Este primeiro teste teve utilidade
de esboçar tendências para adequar as concentrações para um teste subsequente.
Deste modo, em seguida foi feito um reteste destas amostras, desta vez com
alíquotas congeladas de leite. Além disso, uma amostra (amostra 14), foi propositalmente
inoculada com 200 ng de S. uberis, para se verificar se a presença de outras bactérias
interferiria com a detecção de S. aureus nesse ELISA de competição. Um controle foi
também feito contendo apenas caseína 1% com 200ng de S. uberis na presença de IgY anti
S. aureus em titulação de 1:105.
Figura 7 – Curva padrão da segunda placa de ELISA de competição. A presença de
concentrações progressivamente maiores de lisado de S. aureus inibiu a reação de ligação do
IgY com a bactéria adsorvida na placa, como esperado. Essa curva padrão foi usada para
estimar a quantidade de S. aureus nas amostras de campo. Resultados apresentados como
ng de bactéria/amostra (50 µl).
O gráfico representado na figura 6 demonstra uma curva confiável para mensuração
da quantidade de proteína bacteriana. Neste segundo teste padronizado com amostras de
campo – utilizando caseína 1% como matriz para os anticorpos da curva padrão –
apresentou resultado aparentemente negativo para 4 amostras, das 14 testadas. A amostra
em matriz de caseína 1% contendo 200ng de S. uberis ainda apresentou, após leitura da
39
absorbância e a devida correspondência das médias à curva padrão, quantificação de 32 ng
de bactéria, conforme a figura 7 a seguir. Assim, o limiar de detecção do teste é estimado
em > 32 ng/50µl de amostra.
Figura 8 – Quantificação de bactérias para conferência em pontos com a curva padrão em
matriz de caseína 1%. A adição de S. uberis levou a reatividade cruzada, embora abaixo
daquele visto com S. aureus. Isso indica que a reação é específica. Amostras positivas para S.
aureus precisam apresentar sinal maior do que aquele visto com S. uberis.
Considerando a necessidade de se minimizar a interferência de outras bactérias no
teste, foi padronizado um ELISA de competição utilizando poços com e sem Tween (0,05%).
Foi utilizada como matriz para diluição da curva padrão e dos anticorpos a serem conjugados
com as amostras leite semidesnatado tipo A. Foram contaminadas propositalmente algumas
amostras anteriormente já tidas como positivas com 36 ng de S. uberis (aproximando a
quantificação do teste anterior), conforme segue nas Figuras 9 e 10.
40
Figura 8 – Gráfico da curva padrão do teste para amostras sem detergente Tween 0,05%.
Abaixo (B), quantificação de bactérias nas amostras seguindo a curva (A).
A
B
41
Figura 9 – Gráfico da curva padrão do teste para amostras com detergente Tween
0,05%. Abaixo (B), quantificação de bactérias nas amostras seguindo a curva (A).
(A)
(B)
A comparação entre as curvas dos gráficos presentes nas figuras 8 e 9 demonstra que
se, por um lado, a curva padrão preparada sem Tween 0,05% apresentou coeficiente de
correlação mais alto, por outro lado a curva padrão preparada com Tween 0,05% se
apresentou mais confiável, pois teve um bom coeficiente de correlação sem a necessidade
de retirada de pontos outliers. Ademais, a interferência de contaminação proposital da
amostra com S. uberis é reduzida na amostra 7.
42
3.4 Discussão
3.4.1 Isolamento bacteriano e uso de bactérias já isoladas
As colônias das bactérias do gênero Staphylococcus apresentam coloração branca ou
dourada. A enzima catalase está presente em – além de bactérias aeróbias – bactérias
anaeróbias facultativas, dentre as quais encontram-se as do gênero Staphylococcus. As
bactérias do gênero Streptococcus possuem atividade negativa de catalase (Quinn et al.,
2005). Em atividade, esta enzima realiza a lise do peróxido de hidrogênio, liberando
oxigênio, reação visível macroscopicamente pela formação de bolhas.
A patogenicidade estafilocócica é indicada pela atividade positiva de coagulase (assim
que há o contato com o fibrinogênio, é realizada a conversão em fibrina – reação patogênica
que é mimetizada in vitro pela coagulação de plasma de coelho), assim como pela ocorrência
de hemólise em meio de ágar-sangue. Do mesmo modo, a atividade de DNAse é sugestiva de
crescimento de estreptococos (Quinn et al., 2005).
Ainda sem outros recursos para dar mais precisão à identificação no momento, as
colônias isoladas das amostras de campo de São José dos Pinhais selecionadas para
inoculação foram escolhidas devido ao potencial de patogenicidade (beta-hemólise,
coagulase positiva) e, consequentemente, de serem causadoras da mastite bovina. A
caracterização seria confirmada posteriormente no sequenciamento do gene ribossomal
16S.
As colônias provenientes do laboratório de patologia veterinária Labvet®, devido ao
escopo de atuação do estabelecimento, passaram por identificação mais criteriosa. Os testes
Staphclin®, BHI com hipurato e Esculina – os três últimos indisponíveis no momento das
culturas das amostras de leite obtidas a campo – possuem custo maior e conferem maior
precisão aos resultados de identificação. O teste de CAMP tem grande papel na
diferenciação de espécies do gênero Streptococcus (Quinn et al., 2005; Santos et al., 2007;
Trabulsi, 2008) por detectar o complemento da hemólise imediatamente adjacente à linha
de semeadura; assim como o teste Staphclin® confere maior precisão na confirmação e
diferenciação das espécies de Staphylococcus, pois aprimora a prova de aglutinação em látex
ao deixar mais evidente o contraste entre partículas de látex e as possíveis colônias. As
43
provas de BHI com hipurato e de esculina são testes bioquímicos definitivos para
diferenciação de Streptococcus.
3.4.2 Sequenciamento do gene ribossomal 16S
Tanto as colônias isoladas durante o próprio trabalho quanto as provenientes do
laboratório de patologia veterinária Labvet® foram enviadas ao laboratório WemSeq® para
realização do seqüenciamento do gene ribossomal 16S. O laboratório enviou o resultado
correspondente de cada placa, acompanhado da seqüência obtida. Mesmo com o resultado
apontado, foi efetuada a análise própria das seqüências.
As colônias selecionadas do isolamento próprio das amostras de campo de São José
dos Pinhais, embora tenham apresentado prova negativa para catalase, tiveram
correspondência forte com Staphylococcus sp. Este fato pode indicar que a prova de
catalase, ao invés de negativa, tenha sido apenas inconclusiva.
Das colônias provenientes do laboratório de patologia veterinária Labvet®, as
amostras identificadas como Staphylococcus sp., S. aureus e Streptococcus uberis tiveram a
caracterização confirmada no sequenciamento. Por outro lado, as amostras identificadas
como Corynebacterium sp., S. agalactiae e Streptococcus sp. foram caracterizadas no
sequenciamento como Acinetobacter sp., S. chromogenes e S. uberis.
Isso fez com que fosse dada preferência aos resultados obtidos do uso de cepas cuja
identificação no sequenciamento do gene ribossomal 16S tenha sido igual à do isolamento.
3.4.3 Aglutinação bacteriana em lâminas de microscopia
Ainda sem a confirmação da soroconversão em uma técnica de maior robustez, a
triagem do potencial de aproveitamento de cada anticorpo por meio de aglutinação em
lâminas de microscopia demonstrou uma prévia do que viria a ser constatado
posteriormente na prova de ELISA.
Nesta prova o soro imune anti S. aureus, embora tenha apresentado baixa titulação
(1:2), foi reagente às colônias misturadas. Além disso, não apresentou reação cruzada com
44
colônias de culturas até então identificadas como pertencentes a outro gênero ou espécie,
apesar da tendência estrutural dos anticorpos indicada por Tizard (2008). A partir deste
resultado já se passou a considerar este soro como um potencial insumo efetivo para um
protótipo de teste rápido para diagnóstico de mastite bovina, desde que os demais testes
também corroborassem com esta hipótese.
Os soros imunes anti Staphylococcus spp. (originados nas cepas Am1DNS1 e
Am4CLS10) apresentaram resultados diferentes. Os anticorpos originados da inoculação com
a cepa Am4CLS10 apresentaram titulação maior para aglutinação específica (1:8), ao mesmo
tempo em que apresentaram maior reação cruzada (1:2). Os anticorpos provenientes da
inoculação com a cepa Am1DNS1 tiveram menor reação cruzada (apenas no soro puro), mas
demonstraram menor titulação para reação específica (1:4). Ainda que a origem fosse de
duas colônias diferentes, provenientes de duas amostras diferentes de leite, tratava-se do
mesmo gênero bacteriano, conforme constatado no sequenciamento do gene ribossômico
16S. A controvérsia desses resultados sugeria uma inespecificidade que necessitaria ser
confirmada ou refutada em outras provas.
Os soros anti S. uberis demonstraram uma alta titulação para reações específicas (1:4
e 1:8) e uma titulação maior (1:2) para reações cruzadas que a do soro anti S. aureus. A
análise deste resultado sugere uma especificidade pouco aceitável para os anticorpos
presente nestes soros anti-Streptococcus. Porém, assim como nos casos anteriores, as
hipóteses levantadas nesta triagem só poderiam ser fortalecidas em um teste de maior
robustez.
3.4.4 IDGA
O soro anti-STRSP (identificada como S. uberis) teve apenas reação cruzada com a
bactéria diferente da utilizada no protocolo de imunização. Porém, trata-se de um resultado
não significativo, uma vez que houve, também, reação com o soro pré-imune, contrapondo a
sensibilidade constatada a uma especificidade que pode vir a ser ruim em testes mais
robustos. Porém, os achados de Teixeira et al. (2018), em que foi encontrada uma
correspondência de apenas 28,59% entre o IDGA e o protocolo de ELISA utilizado no estudo
em questão, deixaram abertas as possibilidades de resultados diferentes em imunoensaios
45
de maior robustez. Ainda que, neste caso citado, o IDGA tenha se mostrado mais sensível
que o ELISA.
Os soros anti Staphylococcus sp (Am1DNS1 e Am4CLS10) apresentaram resultados
diferentes. O soro anti Am1DNS1 teve reação específica até a diluição de 1:4. Porém, as
diluições anteriores (1:1 e 1:2), além de também terem apresentado reações cruzadas,
também apresentaram formação de precipitina na região entre as bactérias lisadas o soro
pré-imune. Fato que, de acordo com Hornbeck (2017), indica a ligação entre essas bactérias
e anticorpos quaisquer presentes no soro pré-imune.
Enquanto isso, o soro anti Am4CLS10 teve reação específica e cruzada apenas no
teste com soro puro (1:1). Dada a inespecificidade e a baixa sensibilidade, o resultado não dá
suporte à expectativa de um eventual bom desempenho nos testes.
Por outro lado, o soro anti STAAU (S. aureus) teve reação específica até a diluição 1:2,
sem reação cruzada e sem reação do soro pré-imune. Este resultado, associando, ainda, o
conceito dos achados de Hornbeck (2017), indica bom potencial dos anticorpos policlonais
presentes neste soro, a ser verificado nos demais testes.
O fato de algumas lâminas terem apresentado reação do soro pré-imune não
permitem alçar este teste a um patamar maior que o de triagem para os anticorpos, no caso
de diagnóstico dos agentes causadores da mastite.
3.4.5 ELISA
Os testes realizados com este método foram inicialmente realizados utilizando os
soros na função de anticorpo primário com diluições de base 2. Como houve uma reação
exacerbada em todas as diluições em todos os soros, optou-se por repetir a padronização
com diluições de base 10.
O teste ELISA com base 10 mostrou resultados mais condizentes com a hipótese
esperada de acordo com os parâmetros de Tizard (2008), ainda que com resultados do
anticorpo anti S. uberis muito próximos dos resultados anti S. aureus em placas
sensibilizadas com S. aureus. Porém, esta interferência pode ser explicada por proteínas de
membrana da S. uberis que podem causar reações cruzadas (Quinn et al., 2005). Assim
repetiu-se o ELISA, mas utilizando placas separadas (com sensibilizações específicas) para
46
testar respectivamente os soros anti S. aureus e anti S. uberis, com diluições de base 10 de
1:104 a 1:108 em cada placa.
Nesta repetição constatou-se que os anticorpos IgY séricos presentes no soro anti S.
aureus mostraram-se específicos e reativos até a diluição 1:105. A diferença entre a reação
do soro imune e a do pré-imune é mensurada por meio do cálculo da média e do desvio
padrão obtidos na leitura da absorbância da duplicata e a respectiva comparação com os
mesmos cálculos dos parâmetros citados e adoção de um limiar de detecção (igual à soma da
média com três vezes o desvio padrão das medições das duplicatas). O soro anti S. aureus
apresentou reação significativamente maior (absorbância média de 0,212) na diluição 1:
1:105 que o limiar de detecção do soro pré-imune na mesma diluição (0,1), e maior,
também, que o limiar de detecção do respectivo padrão branco (0,0546). Deste modo,
concluiu-se que o soro da galinha inoculada com S. aureus reagiu especificamente contra o
agente em questão até a diluição 1:105.
Ao mesmo tempo, na placa em que foi testado o soro anti S. uberis, foi observada
uma absorbância muito similar entre todos os poços (sem diferença superior à linha de corte
estabelecida), de modo que conclui-se que os anticorpos IgY séricos policlonais presentes
neste soro em questão não são específicos para uso em um teste diagnóstico no momento.
De posse dessas conclusões condizentes com os princípios do método apontados por
Tizard (2008), apoiadas pelas obtidas nos testes de aglutinação bacteriana e IDGA,
selecionou-se o soro anti S. aureus para obtenção de IgY da gema e teste em amostras de
leite.
3.4.6 ELISA dos anticorpos IgY purificados da gema
Após o processo de purificação dos anticorpos IgY presentes na gema dos ovos
coletados uma semana depois do término dos protocolos de imunização das aves, era
necessário averiguar se estes anticorpos reagiriam contra S. aureus e se teriam a mesma
titulação do IgY sérico.
O purificado da gema selecionada apresentou reação maior que a linha de corte
estabelecida (três vezes o desvio padrão das leituras em duplicata) do padrão branco, e com
47
reação inversamente proporcional ao grau de diluição (Tizard, 2008). Este ponto atende ao
quesito de ligação do anticorpo IgY ao S. aureus presente no fundo da placa.
Na placa em que foi testado, de um lado, o IgY sérico e, do outro, o IgY da gema,
ambos os anticorpos testados apresentaram, em suas respectivas comparações com o
padrão branco, reação até a diluição de 1:105, assim como o teste de ELISA com o IgY sérico.
Este resultado aponta que os testes a serem realizados posteriormente com IgY da gema em
amostras de campo teriam poder de comparação com a reação apresentada nos testes
preliminares com IgY sérico nas amostras de cepa pura.
3.4.7 ELISA de competição com amostras de campo
Com a prova realizada utilizando matriz de caseína a 1%, selecionaram-se as
amostras que se mostravam realmente positivas neste teste, ou seja, as que se
enquadraram dentro da curva padrão estabelecida. O resultado do primeiro teste mostra
que a prova é utilizável para averiguação de amostras positivas e de mensuração proteica,
utilizando-se o conceito de regressão linear adaptado para estimativas (Lopes et al., 2017).
Porém, o índice de correlação da curva padrão (aproximadamente 0,87) e a proporção de
pontos outliers sugeriam uma repetição da prova.
Na repetição do teste, já incluindo S. uberis em algumas amostras para averiguar a
interferência de reações cruzadas, descobriu-se que as amostras positivas – ou seja, com
absorbância estatisticamente menor do que a visualizada nos poços com apenas IgY anti S.
aureus puro –, na extrapolação com os valores da curva, tinham quantificação proteica de
bactérias próxima a 36ng. Assim determinou-se que as contaminações propositais de S.
uberis para o teste seguinte deveriam ser deste valor. Além disso, foi realizado o ajuste das
amostras da curva para conferir maior precisão ao teste, com intervalo menor entre o IgY
puro e o conjugado ao máximo de bactérias da curva.
No último teste, novamente aplicando-se o conceito de regressão linear, constatou-
se que os anticorpos IgY anti S. aureus foram capazes de detectar a positividade das
amostras conhecidamente positivas para este agente. Além disso, foi possível observar que
o uso de detergente Tween tornou a montagem da curva padrão mais fidedigna e, ao
mesmo tempo, foi eficiente para minimizar os efeitos da reação cruzada com S. uberis,
48
permitindo uma melhor correspondência dos pontos referentes à média de cada amostra
com a curva padrão.
3.5 Conclusões
Demonstrou-se que o anticorpo IgY policlonal anti S. aureus desenvolvido mostrou-se
consideravelmente específico na titulação de 1:105 e menos acometido por reações
cruzadas, falsos negativos e eventuais erros de procedimento.
Os resultados entre IgY sérico e IgY da gema são correspondentes, dando
assertividade ao uso da IgY da gema para produção em escala.
Além disso, conclui-se que a utilização do anticorpo anti S. aureus associado ao
Tween na concentração de 0,05% permite leituras fidedignas dos resultados dos
imunoensaios realizados em amostras de campo.
O uso deste anticorpo policlonal, após futura confirmação em maior amostragem,
apresenta-se com grande potencial para ser bem-sucedido como reagente em um teste
protótipo de diagnóstico rápido de mastite bovina.
49
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foi possível cultivar e identificar as bactérias a partir de amostras de campo. Embora
tenha havido dificuldades com a disponibilidade de alguns materiais nas coletas próprias,
considera-se um cultivo bem-sucedido no geral graças à parceria com um laboratório que
dispunha de uma rotina que permitiu a obtenção das cepas desejadas. E, de posse destas
bactérias, foi possível validar também que os extratos bacterianos puros puderam ser
considerados bons alvos para os métodos, uma vez que houve diferença de resultados tendo
como alvos as bactérias do gênero Staphylococcus e Streptococcus.
A soroconversão da ave inoculada com S. aureus também mostrou eficiência no
protocolo de imunização. Lamenta-se que as peculiaridades das bactérias do gênero
Streptococcus não tenham permitido, neste momento, amplificar em resultados ainda
melhores este sucesso do protocolo, pois não se confirma se os resultados não aproveitáveis
dos testes de ELISA são decorrentes de não funcionamento da imunização, de
incompatibilidade do método com anticorpos policlonais ou ainda da constatada
contaminação de algumas alíquotas de cepas cujos resultados foram inutilizados.
Ainda assim, os resultados obtidos nas provas consideradas de triagem no estudo
aparentam ser promissores. No caso do anticorpo IgY validado (anti S. aureus), há coerência
no resultado dos testes triadores com o do ELISA, mais robusto, e, especialmente, com o
resultado obtido nos testes em amostras de campo.
O sucesso do anticorpo IgY anti S. aureus apresentado na detecção pelo imunoensaio
de ELISA de competição das amostras de campo positivas reforça seu potencial de
aplicabilidade e sugere em que condições terá maior eficácia.
Uma continuidade deste estudo com maior amostragem pode avaliar se o reagente
obtido pode conferir bons valores preditivos positivos e negativos nos testes com amostras
de campo. Outros novos estudos podem também testar a aplicação deste reagente em
biossensores e sensores de fluxo lateral, visando dar praticidade a um novo teste. Do mesmo
modo, é possível sugerir também tentativas de desenvolver um anticorpo anti S. aureus
monoclonal, em que pese eventual perda da vantagem da facilidade de produção em larga
escala.
50
5 REFERÊNCIAS
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6 ANEXOS
a) Anexo 1 - Aprovação no conselho de ética
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b) Anexo 2 – Sequências alinhadas para posterior correspondência com plataforma BLAST
c) Anexo 3 – Resultado da análise da sequencia da cepa STAAU com S. aureus na plataforma
BLAST®
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d) Anexo 4 – Aglutinação bacteriana com soros anti S. aureus (STAAU – 298) e anti S. uberis
(STRUB - 369) na diluição 1:2
e) Anexo 5 – Leitura de lâmina de IDGA com soro anti S. aureus nas diluições 1:1 e 1:2. A seta
indica possível ponto de formação de precipitina.