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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
“CAPACIDAD OXIDANTE DE LA SANGRE DE PACIENTES
CON DIABETES TIPO 2 SOBRE LA INSULINA RECOMBINANTE HUMANA”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN EN MEDICINA
PRESENTA:
M. en C. DANIEL HÉCTOR MONTES CORTÉS
DIRECTORES DE TESIS
D. en C. IVONNE MARÍA OLIVARES CORICHI
MÉXICO, D. F., MAYO 2010
AGRADECIMIENTOS.
A la Doctora Ivonne María Olivares Corichi.
Gracias por haber creido en mí, es una realidad la finalización de este trabajo,
y reconozco que fue debido a tu constancia, sabiduria, guía, fé y paciencia. Deseando
que no sea el último proyecto de investigación donde se trabaje en equipo. Soy
afortunado en haberte tenido como directora de este proyecto.
ERES MUY VALIOSA DRA. CORICHI .
A mi madre.
Josefina Cortés Núñez. Gracias por ser mi pilar, guía, y ejemplo demostrado a través de tu amor y consejos, que
día con día me otorgabas. Gracias por haberme dado la vida, Dios te bendiga y recuerda que
te AMO madre ¡Nunca lo olvides! …….............., gracias por ser MI AMIGA Y MADRE.
A mi esposa:
Dra. María del Pilar Cruz Domínguez.
Este año 2010 cumplimos 11 años de haber iniciado esta relación, siendo los últimos 5 años los más bellos, te afirmo que la más valiosa y acertada decisión en mi vida es haberme casado contigo. Este logro también es tuyo, gracias por ser la DOCTORA, INVESTIGADORA, ESPOSA, AMIGA, AMANTE y MADRE de nuestros bebes: ERES UNA GRAN MUJER. Estoy seguro que continuemos creciendo por muchos años.
A mis hijos:
Te Amo Cariño.
Ian Dennis Montes Cruz. Y Nathan Zander Montes Cruz
El haber finalizado este proyecto amigo Ian es debido en parte a la gracia de tu amor, tus sonrisas, tu alegría, a tu inocencia. Sabes me gusta ser tu papa, y te recuerdo que te quiero de aquí hasta el Planeta 51. Mientras que tu amigo Nathan ahora que tienes 2 años de edad continúa regalándome esos abrazos y besos angelicales todos los días. Te amo Nathan, aunque tú me quieras COPITO. Estoy seguro que son y serán dos hombres triunfadores y exitosos.
Gracias Dios, por haberme bendecido con estos dos TITANES
A mis hermanos.
Susana, Alberto, Mariana y Pedro.
Por compartir conmigo los buenos y malos momentos de mi vida y por los lazos de amor que nos unen aún más que la sangre. En especial a ustedes hermanas (Susana y Maya), por el apoyo que me han brindado y el amor incondicional que le han regalado a Ian y Nathan.
A los Pacientes:
Gracias a todos los pacientes que participaron y colaboraron para el desarrollo del presente estudio de investigación médica. Recordar que su aportación está encaminado a mejorar la atención médica en la enfermedad.
ÍNDICE Glosario.
Relación de Figuras.
Relación de Tablas.
Resumen.
Abstract. I. INTRODUCCIÓN. ...........................................................................................................................1
I.1. Clasificación de diabetes. ............................................................................................................1
I.2. Otros tipos de diabetes. ...............................................................................................................2
I.3. Diagnóstico de diabetes. .............................................................................................................4
I.4. Diabetes tipo 2 (DT2). .................................................................................................................4
I.5. Fisiopatología de la diabetes tipo 2. ............................................................................................5
I.6. Resistencia a la insulina. .............................................................................................................5
I.7. Especies Reactivas de Oxígeno y Nitrógeno. .............................................................................6
I.7.a. Anión Superóxido (O2•−
I.7.b. Peróxido de hidrógeno (H
).
...........................................................................................................6
2O2
I.7.c. Radical hidroxilo (HO
).
.................................................................................................7 •
I.7.d. Oxido Nítrico (NO
). .............................................................................................................8 •
I.8. Defensas Antioxidantes. ............................................................................................................10
). ..................................................................................................................8
I.8.a. Antioxidantes enzimáticos. .....................................................................................................10
* Superóxido dismutasas (SOD). .....................................................................................................10
* Catalasa (CAT). ............................................................................................................................11
* Glutatión peroxidasa (GSH-Px). ....................................................................................................11
I.8.b. Antioxidantes no enzimáticos. ................................................................................................11
* Vitamina E (α tocoferol). ...............................................................................................................12
* Vitamina C (ácido ascórbico). .......................................................................................................12
* β-caroteno. ....................................................................................................................................13
* Glutatión reducido (GSH). .............................................................................................................13
I.9. Estrés oxidativo en diabetes. .....................................................................................................15
I.9.a. Daño de las ERO en diabetes. ...............................................................................................15
I.9.b. Sistema antioxidante en diabetes. ..........................................................................................16
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. .....................................................................................19
III. JUSTIFICACIÓN. .......................................................................................................................19
IV. HIPÓTESIS. ...............................................................................................................................20
V. OBJETIVOS. ...............................................................................................................................20
V.1. Objetivo General. .....................................................................................................................20
V.2. Objetivo Particulares. ...............................................................................................................20
VI. MATERIALES Y MÉTODOS. ...................................................................................................21
VI.1. Tipo de Estudio. ......................................................................................................................21
VI.2. Tamaño de la Muestra. ...........................................................................................................21
VI.3. Criterios de selección. .............................................................................................................21
VI.4. Reactivos. ...............................................................................................................................22
VI.5. Diseño Experimental. ..............................................................................................................23
VI.5.a. Flujograma Experimental. ....................................................................................................24
VI.6. Técnicas del Primer Objetivo. .................................................................................................24
VI.6.a. Obtención del plasma de pacientes con DT2 y voluntarios sanos (control). .......................24
VI.6.b. Determinación de los Compuestos Reactivos al Ácido Tiobarbitúrico (MDA) en plasma. ..25
VI.6.c. Reducción de Nitro-azul de tetrazolio en plasma. ................................................................25
VI.6.d. Cuantificación de Ditirosinas en plasma. .............................................................................25
VI.6.e. Determinación de Carbonilos en plasma. ............................................................................26
VI.7. Técnicas del Segundo Objetivo. .............................................................................................26
VI.7.a. Oxidación de insulina humana recombinante modificada por el estrés oxidativo presente en
sangre de pacientes con DT2 y voluntarios sanos (control). ...........................................................26
VI.7.b. Reducción del Nitro-azul de tetrazolio por Insulina. .............................................................27
VI.7.c. Cuantificación de Ditirosinas en Insulina. .............................................................................27
VI.7.d. Determinación de Carbonilos en Insulina. ...........................................................................27
VI.8. Técnicas del Tercer Objetivo. .................................................................................................28
VI.8.a. Evaluación de la actividad biológica de la Insulina (Efecto hipoglucemiante en rata),
modificada por el estrés oxidativo presente en sangre de pacientes con diabetes tipo 2 y
voluntarios sanos (control). .............................................................................................................28
VI.9. Medición de hierro libre en plasma. ........................................................................................29
VII. RESULTADOS. ........................................................................................................................30
VIII. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. .....................................................................39
IX. CONCLUSIONES. .....................................................................................................................43
X. SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTUROS. ......................................................................43
XI. BIBLIOGRAFÍA. ........................................................................................................................45
Glosario ADA American Diabetes Association. IMC Índice de masa corporal. CAT Catalasa. CCl3 Triclorometilo. ●
DM Diabetes Mellitus. DMID Diabetes Mellitus Insulino-dependiente. DMNID Diabetes Mellitus No Insulino-dependiente. DNPH 2,4-Dinitrofenilhidrazina. DT1 Diabetes tipo 1. DT2 Diabetes tipo 2. ERON Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. FPG Glucosa plasmática en ayunas (fasting plasma glucosa). DMG Diabetes mellitus gravídica. GSH Glutatión reducido. GSSG Glutatión oxidado. GSH-Px Glutatión peroxidasa. GLUT-4 Transportador de glucosa 4. HDL Lipoproteína de alta densidad. HO Radical hidroxilo. •
HOBr Ácido bromoso. HOCl Ácido hipocloroso. H2O Peróxido de hidrógeno. 2
IFG Trastorno de la glu-cosa en ayunas (impaired fasting glucose). IGT Trastorno de tolerancia a la glucosa (impaired glucose tolerante). LDL Lipoproteínas de baja densidad. MODY Diabetes de tipo adulto de comienzo en la juventud. NBT Nitroazul de tetrazolio. NO Óxido nítrico. •
O2 Anión superóxido. •−
O Ozono. 3
ONOO− Peroxinitrito. S Radical tiilo. ●
SOD Superóxido dismutasa. TBA Ácido tiobarbitúrico (TTCA
hiobarbithuric acid). Ácido tricloroacético (
UI Trichloroacetic acid).
Unidades internacionales. VS Voluntarios sanos.
Relación de Figuras. Figuras de los Resultados:
Figura 1. Consumo de Glucosa.
Figura 2A. Proteínas dentro y fuera de membrana.
Figura 2B. Formazán dentro y fuera de membrana.
Figura 2C. Ditirosinas dentro y fuera de membrana.
Figura 2D. Carbonilos dentro y fuera de membrana.
Figura 3. Formazán en Insulina.
Figura 4. Ditirosinas en Insulina.
Figura 5. Carbonilos en Insulina.
Figura 6A. Efecto Hipoglucemiante.
Figura 6B. Pendientes de Consumo Glucosa
Relación de Tablas.
Tabla 1. Espectro de la homeostasia de la glucosa y la diabetes.
Tabla 2. Clasificación etiológica de la diabetes mellitus.
Tabla 3. Criterios diagnósticos de la diabetes mellitus.
Tabla 4. Factores de riesgo para diabetes tipo 2.
Tabla 5. Características Clínicas Basales.
Tabla 6. Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in
vitro- de acuerdo a co-morbilidad.
Tabla 7. Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in
vitro agrupados por glucemia basal. Tabla 8. Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in
vitro concentrados por genero.
Tabla 9. Marcadores de estrés oxidativo en plasma antes y después de la incubación in
vitro.
Tabla 10. Hierro Libre en Plasma.
RESUMEN
Antecedentes:
El estrés oxidativo es un estado metabólico que se presenta cuando hay un
desequilibrio entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes, pudiendo
generar potencial daño al tejido: En la diabetes tipo 2 (DT2) se ha descrito la presencia de
estrés oxidativo como uno de los mecanismo causales de las complicaciones agudas (Crisis
hiperglucemia: Estado de hiperglucemia hiperosmolar y cetoacidosis diabética) y crónicas
(retinopatía, nefropatía y neuropatía) de la enfermedad. Nuestro objetivo fue determinar in
vitro si la capacidad oxidante de la sangre entera de pacientes con diabetes tipo 2, modifica
la función de la insulina recombinante humana.
Métodos:
Se obtuvo 10 ml de sangre periférica de 60 pacientes con DT2 no controlados
(hiperglucemia > 300 mg/dL) y de 41 voluntarios sanos (VS), la muestra se depositó en un
tubo de vidrio con citrato de sodio a 14 mM, 2 ml se utilizaron para obtener los valores
basales de malondialdehído, formazán, ditirosinas y carbonilos. En una bolsa membrana-
tubular de diálisis (3,500 daltones) se agregó 30 UI (300 µl) de insulina, la cual se sumergió
dentro del tubo que contenía los 8 ml de la sangre entera restante incubándose por 4 horas a
37 °C, cada 15 minutos se mezcló para evitar la separación del paquete celular y plasma,
además se cuantifico el hierro libre en plasma de forma automatizada. Transcurrido el
período de incubación se cuantificaron los marcadores de estrés oxidante (formazán,
ditirosinas y grupos carbonilo) tanto en plasma como en la insulina recolectada. Nuestro
control positivo fue insulina expuesta a una reacción de tipo Fenton (H2O2 5 µM +
Cu2SO4
Resultados:
4 µM) en lugar de sangre. Por último, se evaluó la función biológica de la insulina
oxidada, inyectando 0.3 UI intraperitoneal en ratas Wistar y se monitorizó la concentración
de glucosa en los primeros 50 minutos.
Se demostró la presencia de estrés oxidativo en plasma de pacientes con DT2,
después de las cuatro horas de incubación a 37 °C se obtuvo una viabilidad celular del 90%
y una concentración de glucosa 41.4 ± 5.1 mg / dL, los valores en los bio-marcadores de
estrés oxidativo en ambos grupos se incrementaron: En el grupo control, el
malondialdehído la formación de formazán y el total de carbonilos se incrementaron en 54,
97 y 25 % respectivamente; mientras que en el grupo de diabéticos el malondialdehído, el
formazán, las ditirosinas y los carbonilos totales, los valores en plasma se incrementaron a
447, 389, 20 y 19 %, respectivamente. Cabe mencionar que se analizaron los valores de
estrés oxidativo por subgrupos (sin complicaciones aparentemente, con algún proceso
infeccioso y con nefropatía) no existiendo diferencias entre éstos por lo que fueron
agrupados en un solo grupo (DT2) y con ello; los valores fueron significativamente (p <
0.001) mayores que los reportados en el grupo de voluntarios sanos. No hubo diferencias
significativas en la concentración de hierro libre en plasma pre y post-incubación de VS
(59.20 ± 34.82 --- 69.80 ± 37.45 Fe++ µl / dL, respectivamente) y en pacientes con DT2
(58.50 ± 29.27 --- 64.00 ± 29.58 Fe++ µl / dL, respectivamente). La incubación de insulina
en sangre entera de pacientes con DT2 indujo cambios estructurales en ésta (p < 0.001) al
detectar concentraciones más altas de formazán (160 ± 3.6 vs 66.08 ± 3.48 nmoles / mg),
ditirosinas (1.48 ± 0.1 vs 0.39 ± 0.04 pmol / mg) y carbonilos (8.22 ± 0.38 vs 5.2 ± 0.48
nmol osazone / mg) que la similar incubación con sangre entera de VS. La insulina
incubada en sangre entera de pacientes con DT2 mostró significativamente (p < 0.001)
menos actividad que la insulina incubada en sangre entera de VS (81.83 ± 4.02 vs 74.33 ±
6.56 mg / dL) a partir de los 20 minutos de haber sido administrada en la rata.
Conclusiones:
Este estudio demuestra que la incubación de insulina en sangre entera de pacientes
con DT2 no controlados, induce cambios oxidativos en la hormona y concomitante
disminución significante en su actividad biológica.
Key words: Insulina humana recombinante, estrés oxidativo, malondialdehído, formazán,
ditirosinas y carbonilos.
Abstract
Background
The oxidative stress is a metabolic state that it is presented when there is an
imbalance between the production of free radicals and antioxidants defenses, and it can lead
to potential tissue damage: In the type 2 diabetes (DT2) the presence of stress oxidative has
been described as one of the causal mechanism of the acute complications (Hyperglycemic
crises: Diabetic ketoacidosis and hyperglycemic hyperosmolar state) and chronic
(retinophaty, nephropaty and neurophaty) of the illness. Our objective was to determine in
vitro if the oxidizer capacity of the blood of patient with type 2 diabetes, it modifies the
function of the human recombinant insulin.
Methods
10 ml blood was obtained of 60 patients' with not controlled DT2 (hyperglycemia >
300 mg / dL) and of 41 healthy volunteers (VS), the sample was deposited in a glass tube
with sodium of citrate to 14 mM, 2 ml was used to obtain the basal values of
malondialdehyde, formazan, dityrosines, carbonyls. In a membrane-tubular bag of dialysis
(3,500 daltons) 30 UI was added (300 µl) of insulin, which submerged inside the tube that
contained the 8 ml of the remaining whole blood being incubated by 4 hours to 37 °C,
every 15 minutes mixed to avoid the separation of the plasma and cellular package, also
quantifies the free iron in plasma in an automated way. Past the period of incubation the
markers of estrés oxidizer were quantified (formazan, dityrosines, and carbonyls groups) as
much in plasma as in the gathered insulin. Our positive control was exposed insulin to a
type reaction Fenton (H2O2 5 µM + Cu2SO4 4 µM) instead of blood. Lastly, the biological
function of the oxidizer insulin was evaluated, 0.3 UI intra-peritoneal injecting in rats
Wistar and the concentration of glucose was monitored in the first 50 minutes.
Results
The presence of oxidative stress was demonstrated in plasma of patient with DT2,
after the four hours of incubation to 37 °C was obtained a cellular viability of 90% and a
concentration of glucose 41.4 ± 5.1 mg / dL, the values in the bio-markers of stress
oxidative in both groups were increased: In the group control, the malondialdehyde the
formazan formation and the carbonyls total were increased in 54, 97 and 25%, respectively;
while in the group of diabetics the malondialdehyde, formazan, dityrosines and the total
carbonyls, the values in plasma were increased at 447, 389, 20 and 19%, respectively. It is
necessary to mention that the values of oxidative stress were analyzed by subgroups
(without complications, with some infectious process and with nephropathy) not existing
differences among these, for what they were contained in a single group (DT2) and with it;
the values were significantly bigger (p <0.001) than those reported in the group of healthy
volunteers. There were not significant differences in the concentration of free iron in
plasma pre and post-incubation of VS (59.20 ± 34.82--- 69.80 ± 37.45 Fe++ µl / dL,
respectively) and in patient with DT2 (58.50 ± 29.27--- 64.00 ± 29.58 Fe++ µl / dL,
respectively). The incubation of insulin in whole blood of patient with DT2 induced
structural changes in this (p <0.001) when detecting higher concentrations of formazan
(160 ± 3.6 vs 66.08 ± 3.48 nmoles / mg), dytirosines (1.48 ± 0.1 vs 0.39 ± 0.04 pmol / mg)
and carbonyls (8.22 ± 0.38 vs 5.2 ± 0.48 nmol osazone / mg) that the similar incubation
with whole blood of VS. The insulin incubated in whole blood of patient with DT2 showed
significantly (p <0.001) less activity than the insulin incubated in whole blood of VS (81.83
± 4.02 vs 74.33 ± 6.56 mg / dL) starting from the 20 minutes of having been administered
in the rat.
Conclusions
This study demonstrates that the incubation of insulin in whole blood of patient with
not controlled DT2, induces oxidative changes in the hormone and concomitant significant
decrease in its biological activity.
Key words
Human insulin, diabetes, oxidative stress, malondialdehyde, formazan, dityrosines,
carbonyls.
1
I. INTRODUCCION
La diabetes mellitus (DM) comprende un grupo de trastornos metabólicos frecuentes que
comparten el fenotipo de la hiperglucemia. Existen diferentes tipos de diabetes debidos a una
compleja interacción entre factores genéticos y ambientales. Dependiendo de la causa de la
DM, los factores que contribuyen a la hiperglucemia pueden ser descenso en la secreción de
insulina, decremento del consumo de glucosa o aumento de la producción de ésta. El trastorno
de la regulación metabólica que acompaña a la DM provoca alteraciones fisiopatológicas
secundarias en la mayoría de los organos y sistemas del cuerpo humano, siendo una pesada
carga para el individuo que padece la enfermedad como para el sistema sanitario. En la
actualidad hay más de 190 millones de personas con diabetes en todo el mundo: Los
pronósticos indican que esta cifra crecerá hasta alcanzar los 330 millones en el año 2025 (Federación Mexicana de Diabetes). En México la diabetes representa uno de los problemas de salud
pública, ya que hasta 1995 ocupó el décimo lugar a nivel mundial con casi 4 millones de
enfermos (Landeros, 2000). La población en México de personas con diabetes fluctúa entre los 6.5 y
los 10 millones (prevalencia nacional de 10.7% en personas entre 20 y 69 años). De este gran
total, 2 millones de personas no han sido diagnosticadas (Arredondo & Zúñiga, 2004).
I.1. Clasificación de la Diabetes.
La DM se clasifica con base en el proceso fisiopatológico que culmina en hiperglucemia,
(tabla 1). Las dos categorías de la DM se designan tipo 1 y tipo 2 (tabla 2). La Diabetes tipo 1A
(DT1A) es resultado de la destrucción autoinmunitaria de las células beta, que ocasiona
deficiencia de insulina. Los individuos con DM de tipo 1B carecen de inmunomarcadores
indicadores de un proceso autoinmunitario destructivo de las células beta pancreáticas. Sin
embargo, desarrollan deficiencia de insulina por mecanismos no identificados y son propensos
a padecer cetosis. Son relativamente pocos los pacientes con diabetes tipo 1B (DT1B)
idiopática y muchos de ellos son de ascendencia afroamericana o asiática (American Diabetes
Association, 2006)
.
2
Tabla 1. Espectro de la homeostasia de la glucosa y la diabetes. El espectro que va desde la tolerancia normal a la glucosa hasta la diabetes tipo 1, tipo 2 y otros tipos específicos de diabetes se muestra de izquierda a derecha. En la mayoría de los tipos, el individuo atraviesa fases que van desde tolerancia normal a la glucosa, pasando por alteración de la tolerancia a la glucosa hasta diabetes manifiesta. Las flechas indican que en algunos tipos de diabetes las variaciones en la tolerancia a la glucosa pueden ser bi-direccionales. Por ejemplo, los individuos con diabetes de tipo 2 pueden volver la categoría de alteración de la tolerancia a la glucosa con la pérdida de peso; en la diabetes gravídica, la diabetes puede pasar a una alteración de la tolerancia a la glucosa o incluso a tolerancia normal a la glucosa después del parto. La glucosa plasmática en ayunas (FPG) y la glucosa plasmática (plasma glucose, PG) a las 2 h de una sobrecarga de glucosa en los distintos grupos de tolerancia a la glucosa se muestran en la parte inferior de la figura. Estos valores no son válidos para el diagnóstico de diabetes gravídica. Algunos tipos de diabetes pueden no requerir insulina para la supervivencia, de ahí la línea discontinua. En la figura se usan las unidades acostumbradas.
I.2. Otros tipos de diabetes
Otras causas de DM son defectos genéticos específicos de la secreción o acción de la
insulina, alteraciones metabólicas que trastornan la secreción de insulina y múltiples situaciones
que alteran la tolerancia a la glucosa (tabla 2) (Kasper et al., 2006)
Diabetes gravídica
.
Durante el embarazo se puede desarrollar y descubrir por primera vez intolerancia a la
glucosa. La resistencia a la insulina relacionada con alteraciones metabólicas al final del
embarazo aumenta las necesidades de insulina y puede provocar hiperglucemia o intolerancia a
la glucosa. La incidencia de la diabetes gestacional en México es del 4 -11 % de la población
obstétrica mexicana aproximadamente. En el puerperio de la diabetes gestacional, la mayoría
de las pacientes evolucionan a DT2 y en menor frecuencia a DT1, intolerancia a la glucosa y
aproximadamente de un 25 - 30% se recupera de éste trastorno metabólico sin desarrollar a
futuro diabetes (Forsbach et al., 1998).
3
Tabla 2. Clasificación etiológica de la diabetes mellitus I. Diabetes tipo 1 (destrucción de las células beta, que habitualmente provoca déficit absoluto de insulina)
A. Inmunitaria
B. Idiomática
II. Diabetes tipo 2 (varía entre resistencia a la insulina predominante con déficit relativo de insulina y defecto secretor de insulina predominante con resistencia a la insulina)
III. Otros tipos específicos de diabetes
A. Defectos genéticos de la función de las células beta caracterizados por mutaciones en:
1. Factor de transcripción nuclear del hepatocito (HNF) 4 (MODY 1)
2. Glucocinasa (MODY 2)
3. HNF-1 (MODY 3)
4. Factor promotor de insulina (IPF) 1 (MODY 4)
5. HNF-1 (MODY 5)
6. NeuroD1 (MODY 6)
7. DNA mitocondrial
8. Conversión de proinsulina o insulina
B. Defectos genéticos en la acción de la insulina
1. Resistencia a la insulina de tipo A
2. Leprecaunismo
3. Síndrome de Rabson-Mendenhall
4. Síndromes de lipodistrofia
C. Enfermedades del páncreas exocrino: pancreatitis, pancreatectomía, neoplasia, fibrosis quística, hemocromatosis, pancreatopatía fibrocalculosa
D. Endocrinopatías: acromegalia, síndrome de Cushing, glucagonoma, feocromocitoma, hipertiroidismo, somatostatinoma, aldosteronoma
E. Inducida por fármacos o agentes químicos: Vacor, pentamidina, ácido nicotínico, glucocorticoides, hormona tiroidea, diazóxido, agonistas adrenérgicos beta, tiazidas, fenitoína, interferón alfa, inhibidores de proteasa, clozapina, antiadrenérgicos beta
F. Infecciones: rubéola congénita, citomegalovirus, virus coxsackie
G. Formas infrecuentes de diabetes inmunitaria: síndrome del "hombre rígido", anticuerpos contra el receptor de insulina
H. Otros síndromes genéticos que a veces se asocian a diabetes: síndrome de Down, síndrome de Klinefelter, síndrome de Turner, síndrome de Wolfram, ataxia de Friedreich, corea de Huntington, síndrome de Laurence-Moon-Biedl, distrofia miotónica, porfiria, síndrome de Prader-Willi
IV. Diabetes gravídica (GDM)
Abreviatura: MODY; diabetes de tipo adulto de comienzo en la juventud.
4
I.3. Diagnóstico de diabetes El National Diabetes Data Group y la Organización Mundial de la Salud han propuesto
criterios diagnósticos para la DM (tabla 3) basados en las siguientes premisas: (American Diabetes
Association, 2002)
Tabla 3. Criterios diagnósticos de la diabetes mellitus
.
Síntomas de diabetes más concentración de glucosa sanguínea al azar ≥ 11.1 mmol/L (200 mg/100 ml) o bien
Glucosa plasmática en ayunas ≥ 7.0 mmol/L (126 mg/100 ml)b
Glucosa plasmática a las 2 h ≥ 11.1 mmol/L (200 mg/100 ml) durante una prueba de tolerancia a la glucosa
o bien
Se define como "al azar" la extracción sin tener en cuenta el tiempo transcurrido desde la última toma de alimento.
Se define como "ayunas" la ausencia de ingestión calórica durante al menos 8 horas.
Esta prueba debe realizarse con una carga de glucosa que contenga el equivalente a 75 g de glucosa anhidra disuelta en agua; no se recomienda en la práctica clínica sistemática.
Nota: En ausencia de hiperglucemia inequívoca y descompensación metabólica aguda, deberán confirmarse estos criterios mediante repetición de estos estudios en un día distinto.
La American Diabetes Association (ADA) recomienda investigar a todos los individuos
mayores de 45 años de edad cada tres años, y hacerlo con todos los que tienen factores
adicionales de riesgo (tabla 4) a edad más temprana con el fin de determinar un diagnóstico
temprano de diabetes (American Diabetes Association, 2006).
Tabla 4. Factores de riesgo para diabetes tipo 2
Antecedentes familiares de diabetes (p. ej., progenitor o hermano con diabetes de tipo 2) Obesidad (BMI ≥ 25 kg/m2). Inactividad física habitual. Raza o etnicidad (p. ej., afroestadounidense, hispanoestadounidense, amerindio, ascendencia asiática, isleño del Pacífico). IFG o IGT previamente identificados. Antecedentes de GDM o nacimiento de un niño que pesa > 4 kg. Hipertensión (presión arterial ≥ 140/90 mmHg). Concentración de colesterol de HDL ≤ 35 mg/100 ml (0.90 mmol/L), concentración de triglic éridos ≥ 250
mg/100 ml (2.82 mmol/L) o ambas cosas. Síndrome de ovario poliquístico o acantosis nigricans. Antecedentes de enfermedad vascular. Nota: BMI, índice de masa corporal; IFG, trastorno de la glucosa en ayunas; IGT, trastorno de la tolerancia a la glucosa; GDM, diabetes mellitus gestacional; HDL, lipoproteína de alta densidad.
I.4. Diabetes tipo 2 (DT2)
La Diabetes tipo 2 (DT2) define a un grupo heterogéneo de trastornos que se
caracterizan por grados variables de resistencia a la insulina, trastornos de la secreción de ésta
5
y aumento de la producción de glucosa. La DT2 es precedida por un período de homeostasis
anormal de la glucosa clasificado como trastorno de la glucosa en ayunas (impaired fasting
glucose, IFG) o trastorno de tolerancia a la glucosa (impaired glucose tolerance, IGT) (Kasper et al.,
2006)
I.5. Fisiopatología de la diabetes tipo 2
.
La DT2 se caracteriza por tres alteraciones fisiopatológicas: trastorno de la secreción de
insulina, resistencia periférica a ésta y producción hepática excesiva de glucosa. La obesidad,
en especial la visceral o central (como es evidente en el índice cintura-cadera), es muy
frecuente en esta forma de diabetes. Los adipositos secretan cierto número de productos
biológicos (leptina, factor de necrosis tumoral alfa, ácidos grasos libres y adiponectina) los
cuales modulan la secreción y acción de la insulina. A medida que avanzan la resistencia a la
insulina, paralelamente se desarrolla un estado de hiperinsulinemia compensadora, los islotes
pancreáticos se tornan incapaces de mantener el estado de hiperinsulinismo, desarrollando
entonces intolerancia a la glucosa, caracterizado por grandes elevaciones de la glucemia
posprandial; y cuando declina todavía más la secreción de insulina entonces aumenta la
producción hepática de glucosa, apareciendo la diabetes como tal, manifestada con
hiperglucemia en ayuno asociado a falla en las células beta (Kahn, 2001).
I.6. Resistencia a la Insulina La capacidad disminuida de la insulina para actuar con eficacia sobre tejidos diana
periféricos (en particular el músculo y el hígado) son aspectos sobresalientes de la DT2 y
resultado de la combinación de susceptibilidad genética y obesidad. La resistencia es relativa,
porque los niveles supra-normales de insulina circulante normalizarán la glucemia plasmática.
Las curvas dosis respuesta de la insulina muestran un desplazamiento hacia la derecha, que
indica menor sensibilidad, y una respuesta máxima reducida, que refleja disminución global del
empleo de glucosa (30 a 60% inferior al de sujetos normales). La resistencia a la acción de la
insulina altera la utilización de glucosa por los tejidos sensibles a insulina y aumenta la
producción hepática de glucosa; ambos efectos contribuyen a la hiperglucemia de la diabetes.
El aumento en la producción hepática de glucosa es responsable predominantemente de los
elevados niveles de FPG, mientras que el decremento de la utilización periférica de glucosa
produce hiperglucemia posprandial. En el músculo esquelético existe un trastorno mayor del
uso no oxidativo de la glucosa (formación de glucógeno) que del metabolismo oxidativo de la
glucosa por la glucólisis. La utilización de la glucosa por los tejidos independientes de la
insulina no está alterada en la DT2 (Kasper et al., 2006).
6
Todavía no se ha desentrañado el mecanismo molecular preciso de la resistencia a la
insulina en la DT2. Los niveles del receptor de la insulina y de la actividad de la tirosina cinasa
de están disminuidos, pero lo más probable es que estas alteraciones sean secundarias a la
hiperinsulinemia y no a un defecto primario. Por tanto, se cree que en la resistencia a la insulina
el factor predominante son los defectos posteriores al receptor (Virkamaki et al., 1999)
.
Otra teoría planteada recientemente, propone que las Especies Reactivas de Oxígeno
(ERO) puede contribuir a la patogénesis de la DT2, siendo las concentraciones elevadas de
ácidos grasos libres y la hiperglucemia los detonantes de tal estrés. Dichas ERO incluye a
radicales libres de oxígeno los cuales son todas aquellas especies atómicas o moleculares que
contiene uno ó más electrones no pareados; y ciertos agentes oxidantes (ERO) pueden ser
convertidos en radicales, algunas ejemplos son: ácido hipocloroso (HOCl), ácido bromoso
(HOBr), ozono (O3), peroxinitrito (ONOO−), peroxido de hidrógeno (H2O2). En otras palabras,
todos los radicales libres de oxígeno son ERO, pero no todas las ERO son radicales libres de
oxígeno, sin embargo; todos se forman por la reducción incompleta del oxígeno molecular. A
continuación se mencionan las ERON y los antioxidantes más estudiados.
I.7. Especies Reactivas de Oxígeno y Nitrógeno (ERON)
I.7.a. Anión superóxido (O2•−)
Cuando una molécula de oxígeno acepta un electrón, se convierte en un radical con
carga negativa, o sea el anión superóxido. Parte de estos radicales se producen durante las
reacciones de varias moléculas directamente con el oxígeno, por ejemplo: la adrenalina, la
dopamina, el tetrahidrofolato, los citocromos, etc. El O2•− también es producido por las células
del sistema inmune durante la descarga respiratoria de los procesos fagocíticos (neutrófilos,
monocitos, macrófagos, eosinófilos) como parte del mecanismo empleado para destruir
organismos extraños, generalmente bacterias, a través de un complejo enzimático denominado
NADPH oxidasa (Cohen et al., 1988). Este mecanismo es esencial durante la erradicación de las
infecciones, aunque en ocasiones una activación excesiva de los fagocitos puede producir daño
tisular, como sucede en la artritis reumatoide y en la colitis inflamatoria. Por otro lado,
numerosas enzimas localizadas en el citosol, mitocondria y peroxisomas, así como en la
membrana plasmática, generan RL durante su ciclo catalítico. La xantina oxidasa, genera O2•−
al reducir O2 a H2O durante el catabolismo de las bases púricas (Desco et al., 2002). La mayor parte
de los RL producidos por la mitocondria provienen de la autoxidación de la coenzima Q
semireducida (ubisemiquinona) en la cadena de transporte de electrones localizada en la
membrana interna (Sohal et al.,1989).
7
I.7.b. Peróxido de hidrógeno (H2O2)
Estrictamente, el H2O2 no es un radical libre porque no posee electrones no pareados.
La vida media del H2O2 depende de la presencia o ausencia de las enzimas encargadas de
removerlo del medio como la Catalasa o la Glutatión peroxidasa. Se forma por la dismutación
del O2•− (1), reacción intracelular catalizada por la enzima Superóxido Dismutasa, o puede
formarse también en medio acuoso, donde el O2•− se dismuta de manera espontánea
generando H2O2 y oxígeno (Bannister & Rotilio, 1987).
2O2•− + 2H+ ----→ H2O2 + O2 (1)
El H2O2 es un agente que puede difundir a través de las membranas celulares al espacio
extracelular, donde existen pocos mecanismos de defensa antioxidante y ahí puede participar
en la formación del radical hidroxilo. A pesar de no ser en sí un radical, tiene una importancia
vital, ya que en presencia de metales de transición como Cu+ o Fe2+ da lugar a la reacción
Fenton (Koppenol, 2001) con la producción del radical hidroxilo (HO•) (2).
H2O2 + Fe2+ ----→ Fe3+ + OH¯ + HO• (2)
Haber y Weiss (1934) describen que el HO• en presencia de H2O2 forma O2•−, y que este anión
superóxido ante un exceso de peróxido de hidrógeno, da lugar a la generación de una cantidad
adicional de radical hidroxilo según las siguientes reacciones: (3 y 4):
HO• + H2O2 H2O + O2•− + H+ (3)
O2•− + H+ + H2O2 O2 + HO• + H2O (4)
El conjunto de las reacciones descritas, constituye el ciclo de Haber-Weiss.
La coexistencia del O2•− y del H2O2, en un medio biológico que inevitablemente contiene hierro o
cobre, es muy peligrosa, ya que el radical HO• formado, es un oxidante muy reactivo que
interacciona con todas las biomoléculas, a velocidades sólo limitadas por su difusión (Yu, 1994).
8
I.7.c. Radical hidroxilo (HO•)
Tiene una vida media de 1X10-9s, su radio promedio de acción es de 30 Å y puede
generarse por la ruptura del enlace oxígeno-oxígeno del H2O2. También se puede formar como
ya se mencionó, al estar presentes el radical O2•− y el H2O2 en un medio biológico que contiene
hierro o cobre. El HO• puede interactuar a una velocidad muy alta con las moléculas biológicas:
carbohidratos, aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, formando entre otros productos,
radicales libres de aquellas moléculas con las que reaccionó (Janssen, 1993).
Este radical también se produce por las radiaciones electromagnéticas, ya sean naturales,
como las radiaciones cósmicas o del gas radón, o bien de otras fuentes creadas por el hombre.
Las radiaciones con baja longitud de onda (X, γ, etc) pueden romper el agua y generar radicales
HO•.
Por otra parte, el O2•− puede reaccionar con el óxido nítrico (NO•) que es un RL libre de
nitrógeno, generando el peroxinitrito (ONOO−) el cual se protona y genera una molécula de
radical hidroxilo y una de bióxido de nitrógeno (5).
O2•− + NO• ---------→ONOO− + H+ ---------→HO• + NO2 (5)
Las células no cuentan con sistemas enzimáticos que puedan utilizar al radical hidroxilo como
sustrato; más bien tienen mecanismos enzimáticos para prevenir su formación.
I.7.d Óxido nítrico (NO•)
Los monóxidos del nitrógeno pueden existir en tres formas, dependiendo el estado de
óxido-reducción del nitrógeno: el catión nitrosonio (NO+), el óxido nítrico (NO•) y el anión
nitroxilo (NO−). Su bio-síntesis esta catalizada por la enzima de óxido nítrico sintasa (L-arginina,
NADPH y oxígeno como sustratos, sí como FAD FMN, grupo hem y tetrahidrobiopterina como
cofactores. Los productos de la reacción son citrulina, óxido nítrico y agua. El nitrógeno del NO•
es aportado por uno de los nitrógenos del grupo guanidino de L-arginina. El mecanismo
involucra dos reacciones secuenciales del tipo de las mono-oxigenasas. En la primera reacción,
un átomo del oxígeno molecular aparece en el intermediario N – hidroxi-L-arginina y otro, en el
agua; en la segunda reacción, los átomos de una segunda molécula de oxígeno se distribuyen
en la citrulina y en la segunda molécula de agua. Las óxido nítrico sintasas son enzimas que se
han clasificado de acuerdo al tejido del cual se aislaron y caracterizaron. De esta manera, se
reconoce a la isoforma neuronal (nNos), endotelial (eNOS) de macrófago (macNOS) y la
hepática.
9
La primera acción descrita del óxido nítrico está relacionada con su efecto sobre el flujo
sanguíneo y la presión arterial. La reacción del NO• con el grupo hem de la guanilil ciclasa
soluble, en las células del músculo liso vascular, incrementa la concentración de GMP cíclico y
provoca vasorelajación (Moncada et al., 1991). Esta relajación es más intensa en arterias que en
venas; encontrándose disminuida en las arterias coronarias con aterosclerosis al igual que en
pacientes con hipertensión arterial sistémica y en pacientes con diabetes, lo cual sugiere una
inapropiada generación o inactivación del NO• en estos padecimientos. Se ha comprobado que
la inhalación NO• revierte la hipertensión arterial pulmonar, relajando la vasculatura de áreas
específicas, facilitando la ventilación. A nivel de corazón tiene efecto tanto cronotrópico como
inotrópico negativo. A nivel plaquetario, inhibe la agregación plaquetaria mediante un
mecanismo dependiente de GMP cíclico, las plaquetas por sí mismas generan óxido nítrico, lo
que podría tener relación con su mecanismo de activación. También funciona como
neurotransmisor en el sistema nervioso central y periférico. Se han localizado grupos
neuronales con óxido nítrico sintasas en el cerebro, pero no se ha podido determinar con
certeza su función. Existen neuronas con actividad de NOS localizadas en el plexo mioentérico
y en todo el tracto gastrointestinal. La despolarización de las neuronas del plexo mioentérico
provoca relajación del músculo liso asociada a la perístalsis. El bloqueo de esta acción con
inhibidores de la óxido nítrico sintasa indica que el óxido nítrico es el neurotransmisor del
intestino.
En el proceso de la erección peneana, el óxido nítrico actúa como neurotrasmisor y como un
potente vasorelajador. Los nervios del plexo pélvico sintetizan y liberan NO• dentro del corpus
cavernosum. En respuesta el músculo liso se relaja, lo que permite que en la corpa se acumule
sangre, se hinche y se produzca la erección.
La óxido nítrico sintasa de macrófagos puede producir una elevada cantidad de óxido
nítrico. Éste es capaz de matar o inhibir el crecimiento de varios agentes patógenos y también
de células tumorales e incluso linfocitos. Existe evidencia de la posible participación del NO• en
el proceso inflamatorio agudo y crónico. El tratamiento con inhibidores de la NOS reduce la
inflamación aguda en animales de experimentación, mientras que la L-arginina agudiza el
proceso inflamatorio. También se han detectado altas concentraciones de nitritos en plasma y
líquido sinovial en pacientes con artritis reumatoide y osteoartritis.
Estos son algunas ERON causantes de daño oxidativo, afortunadamente existe un sistema
regulador en el organismo, donde su función es atenuar o atrapar dichas ERON y con ello
disminuir la lesión en tejidos y órganos denominando sistema antioxidante.
10
I.8. DEFENSAS ANTIOXIDANTES Los antioxidantes son donadores de electrones capaces de evitar una reacción en
cadena de oxido-reducción y se clasifican de diferentes maneras, de las cuales la más
utilizada es la que establece las diferencias de acuerdo con la estructura química y función
biológica, dividiéndolos en enzimáticos y no enzimáticos.
I.8.a. Antioxidantes enzimáticos
Las defensas antioxidantes consisten primeramente en evitar la reducción univalente del
oxígeno mediante sistemas enzimáticos capaces de efectuar la reducción tetravalente
consecutiva sin liberar los intermediarios. Esto lo logra, con una gran eficiencia, el sistema
citocromo-oxidasa, el cual reduce más del 90% del oxígeno en el organismo humano.
En segundo lugar están algunas enzimas especializadas como la superóxido dismutasa (SOD),
la catalasa (CAT) y la glutatión peroxidasa (GSH-Px) entre otras.
* Superóxido dismutasas (SOD) Las isomorfas de SOD son metaloenzimas que catalizan la dismutación del anión
superóxido para producir oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno según la reacción 6.
SOD 2 O2
●¯ + 2 H+ -----------------------→ H2O2 + O2 (6) En mamíferos se han identificado tres isomorfas de la SOD y las tres son de genes
diferentes (Ho et al., 1991). Una contiene Cu y Zn (CuZnSOD) (Marklund,1982) y se localiza
principalmente en citoplasma de eucariotes, la SOD que contiene Mn (MnSOD) se encuentra
principalmente en mitocondria, y la extracelular (EC-SOD) que también contiene cobre y zinc en
su sitio activo. Del 90-99% de la EC-SOD se localiza en la matriz extracelular (Marklund et al., 1982).
Las isomorfas que contienen cobre, catalizan la dismutación del anión superóxido a
través de la reducción-oxidación alternativa del cobre y la que contiene manganeso, cambia su
estado de oxidación al interaccionar con O2•− (Tainer et al 1983).
La SOD no es realmente una enzima destoxificante, ya que el producto de su actividad, el H2O2,
es un agente tóxico. Sin embargo, la dismutación del O2•− es el primer paso de la cascada
enzimática que conduce a la inactivación completa del O2•− formado. El segundo paso, depende
de la catalasa.
11
* Catalasa (CAT)
Esta enzima antioxidante cataliza la transformación de H2O2 en agua. En mamíferos esta
enzima está presente en hígado y riñón en altas concentraciones, y en bajas en tejido conectivo (Nakashima et al., 1989). En la mayoría de las células se ha localizado en el citosol, mitocondrias y
organitos subcelulares como los peroxisomas. En los eritrocitos la enzima existe en una forma
soluble (Aebi, 1982) y cataliza la siguiente reacción:
Catalasa H2O2 + H2O2 ----------------------------→ 2H2O + O2 (7)
* Glutatión peroxidasa (GSH-Px) Las peroxidasas son otras enzimas que catalizan la reducción de H2O2 por diversos
donadores de electrones. Se han identificado hasta ahora cuatro tipos de GSH-Px (glutatión:
H2O2 oxidoreductasa, EC 1.11.1.9) dependientes de selenio: 1) la citosólica (cGSH-Px), es la
más abundante selenoproteína en la rata y está presente virtualmente en todos los tejidos (Hill et
al., 1992). La cGSH-Px tiene la función de almacenamiento del elemento traza (selenio) cuando las
concentraciones H2O2 son bajas y de antioxidante bajo condiciones donde hay relativamente
grandes cantidades de H2O2 o hidroperóxidos de lípidos que son producidos en el citosol (Burk,
1991); 2) la plasmática (plGSH-Px), es la responsable de toda la actividad peroxidasa en el
plasma (Takahashi et al., 1987; Chu et al., 1992) y se cree que juega un papel clave en el sistema de defensa
antioxidante del plasma (Maddipati & Marnett, 1987), 3) la gastrointestinal (glGSH-Px), el ARNm para
glGSH-Px se ha encontrado en hígado de humano y colon pero no en otros tejidos; en ratas el
ARNm se ha detectado solo en el tracto gastrointestinal (Chu et al., 1993,1995). La localización de esta
isomorfa de glutatión peroxidasa, sugiere que juega un papel en la protección contra los efectos
adversos de los hidroperóxidos de la dieta, y 4) la de fosfolípidos (PLGSH-Px), es abundante en
los testículos y puede ser regulada por gonadotropinas (Roveri et al., 1992). También tiene un sitio de
fosforilación, el cual puede tener un papel en la regulación de la actividad de la enzima (Brigelius-
Flohé et al.,1994; Schuckelt et al.,1991).
Las cuatro isomorfas catalizan la oxidación del glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado
(GSSG), el cual, a su vez, es reducido por la enzima glutatión reductasa en presencia de
NADPH, impidiendo así que se agoten las reservas de GSH.
I.8.b. Antioxidantes no enzimáticos Además de las enzimas mencionadas, hay un gran número de compuestos que poseen
propiedades antioxidantes. El glutatión en su forma reducida (GSH), algunos minerales como
12
selenio, zinc y cobre, o vitaminas como riboflavina, ácido ascórbico (vitamina C) y α-tocoferol
(vitamina E), carotenos, bilirrubina entre otros, son esenciales para la defensa contra el daño
oxidativo debido a que actúan como cofactores de las enzimas antioxidantes o como
atrapadores de radicales libres endógenos (Krinsky, 1992)
* Vitamina E (α-tocoferol)
.
Conformada por cuatro tocoferoles, de los cuales el más importante es el α-tocoferol. Es
el principal antioxidante liposoluble y se encuentra tanto en el plasma vinculado con los lípidos
circulantes como en todas las membranas celulares. La concentración plasmática de la vitamina
E depende de la cantidad aportada por los lípidos circulantes (perfil lipídico) de cada persona.
La vitamina E protege contra la lipoperoxidación, al actuar de manera directa con varios
radicales entre los que se incluyen: el HO●, el radical peroxilo, el triclorometilo CCl3● (radical
producido a partir del tetracloruro de carbono), así como el anión superóxido. El singulete
también reacciona con el α-tocoferol a pesar de tener una vida media breve. La vitamina E,
representa un mecanismo antioxidante eficiente en contra del daño a membranas celulares,
inducido por las ERO, ya que se incorpora como constituyente y estabilizador de la estructura
de la membrana celular. Es efectiva como agente antioxidante convirtiendo al HO● y a los
radicales lipo-peroxilo en moléculas menos reactivas. La molécula de α-tocoferol es muy
eficiente como agente interruptor de la cadena de peroxidación, debido a la formación del
radical tocoferoxilo (α-T●) que es relativamente estable y no reacciona con lípidos. Esta
reactividad limitada, es debida a la estabilidad por resonancia que le confiere su anillo
aromático, disminuyendo la reactividad del electrón no pareado (radical libre); sin embargo es
suficientemente estable como para detener la cadena de reacción de radicales libres, donando
su electrón. Recupera su forma estable, al ser reducido por ascorbato y posiblemente por la
actividad externa redox de las moléculas que constituyen el par ascorbato-glutatión-SH de la
membrana (Krinsky, 1992).
* Vitamina C (ácido ascórbico)
Se localiza intra y extracelularmente. Es en una molécula hidrosoluble, que se encuentra
disponible en todos los compartimientos del organismo; y puede participar como agente
estabilizador del radical libre al funcionar como reductor mono-electrónico (scavenger) de los
radicales O2● ▬ y HO●, modificando su estado redox al formar el radical libre semi-
deshidroascorbato, que es subsecuentemente oxidado a deshidro-ascorbato por la reducción e
inactivación de otro anión superóxido. La reducción del deshidroascorbato se lleva a cabo
13
mediante dos reacciones sucesivas que involucran la participación del glutatión-SH (reducido),
formando el radical tiilo (S●) en el glutation (figura 2). Este radical (S●) también puede inactivar a
varios agentes oxidantes. El deshidroascorbato es reducido a ascorbato nuevamente en una
reacción que involucra a una reductasa dependiente de glutatión reducido (GSH), que queda en
su forma oxidada (GSSG). El ciclo del glutatión es considerado como uno de los procesos
esenciales en la defensa antioxidante del organismo, y es uno de los procesos afectados en el
estrés oxidante. La vitamina C suprime la inactivación de antiproteasas por oxidantes
generados por el sistema haluro-mieloperoxidasa del neutrófilo, y ejerce una inactivación dosis-
dependiente de los oxidantes extracelulares liberados por el neutrófilo. La vitamina C contribuye
a la regeneración de la forma activa del α -tocoferol unido a membrana y que está oxidado,
permitiendo que permanezca su función como interruptora de la lipoperoxidación. A pesar de
las características antes mencionadas la vitamina C no es considerada como el antioxidante
ideal debido a que puede presentar propiedades pro-oxidantes; ya que es probablemente el
único agente reductor de la célula que en presencia de O2● ▬ (a quien reduce formando H2O2)
es capaz de reducir Fe3+ a Fe2+ que a su vez puede reaccionar con H2O2 dando lugar por medio
de la reacción de Fenton, al radical más reactivo que es el HO● (Krinsky, 1992). Para que esta
reacción se lleve al cabo se requieren dos condiciones; una es la disposición de Fe en los
tejidos y en circulación, debido a la hemólisis o a la ingestión de hierro como suplemento
alimenticio (poli-vitamínicos). El otro factor es la automedicación de vitamina C en individuos
cuya dieta ya cumpla con los requerimientos diarios establecidos.
* β-caroteno
El β-caroteno es un pigmento insoluble en agua presente prácticamente en todas las
plantas y algas; el cual constituye el precursor más importante de la vitamina A. Es la molécula
que reacciona más eficazmente con el Singulete de oxígeno y se localiza en membranas. Sin
embargo, la vitamina A no interacciona con el singulete de oxígeno y carece de actividad para la
depuración de los radicales libres (Krinsky, 1992).
* Glutatión reducido (GSH) El gamma-L-glutamil-L-cisteinilglicina, es un tripéptido conocido como glutatión, su
localización es intracelular y está presente en animales, plantas y bacterias y es muy probable
que sea el péptido más abundante. El residuo N-terminal del ácido glutámico recibe el nombre
de gamma-glutamilo porque en la formación del enlace peptídico interviene el grupo R γ -COOH
en vez del α-COOH.
14
Aproximadamente el 90% de los compuestos no proteicos que contienen ―SH en los
tejidos de los mamíferos está integrado por glutatión. En otras palabras, puede considerarse
que el GSH es una forma de almacenamiento de cisteína. Además, es una manera en que las
células pueden explotar la función ―SH haciendo que el glutation actúe como agente reductor.
Cuando lo hace de ese modo, la forma ―SH reducida (GSH), del tripéptido se convie rte en una
forma oxidada (GSSG) que consta de dos cadenas glu-cis-gli ligadas por un enlace disulfuro
intercatenario (―S―S―) y este proceso es reversible.
La conversión de GSH ↔ GSSG in vivo está relacionada con dos funciones importantes
del glutatión: una es protectora y la otra es regeneradora. Para realizar su función protectora, el
GSH actúa como inactivador de agentes oxidantes como el H2O2, el HO y O2¯, así como RL
orgánicos. La función regeneradora es importante para ciertas proteínas que contienen grupos
―SH, las cuales se oxidan a puentes ―S―S― durante el funcionamiento normal de dichas
proteínas. En tales casos, un fenómeno esencial es la recuperación de la forma ―SH reducida
de la proteína, función de la cual se encarga el GSH. En este proceso se requiere la enzima
transhidrogenasa de la glutatión-proteína, cuya presencia es necesaria para catalizar la
reacción ―S―S― proteína/GSH; y una vez más se necesita regenerar el GSH a partir de la
GSSG. En estas reacciones los agentes reductores de GSSG son el NADPH y el NADH (Krinsky,
1992; Bohinski, 1998).
Una vez descrito la formación de las ERON y los sistemas de defensa antioxidante en el
organismo, se puede asentar que; cuando los sistemas productores de ERON sobrepasan la
capacidad neutralizante de los sistemas antioxidantes del organismo, se establece un
desequilibrio entre éstos, denominado como estrés oxidativo. Dicho estrés oxidativo se ha
documentado en pacientes con DM. La diabetes se caracteriza por tener concentraciones altas
de glucosa en sangre de forma constante y crónica, dicho exceso de glucosa en sangre puede
propiciar la oxidación de este monosacárido y formar enedioles, los cuales en presencia de
metales de transición genera ERO como en anión superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido
de hidrógeno: A continuación se citan algunas evidencias del daño que puede generar de forma
crónica la hiperglucemia:
* La hiperglucemia induce la sobreproducción de superóxido en la cadena de transporte
de electrones de la mitocondria, lo cual parece ser el primer evento para la activación de otras
vías de producción de ERO como la de los Polioles y la hexosamina, incremento de la
formación de productos terminales de glicación avanzada, y activación de la protein cinasa C (Ceriello, 2003).
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* Nishikawa y colaboradores (2000) concluyeron que las células endoteliales incubadas
en concentraciones altas de glucosa son productoras de radicales libres, y que el transporte de
piruvato derivado de la glicolisis mitocondrial a nivel de complex II (succinato:ubiquinona oxido
reductasa), es uno de los cuatro complejos asociados a la membrana interna en la fosforilación
oxidativa (Nishikawa et al., 2000).
* La activación de la protein cinasa C, debido a la sobreproducción de superóxido,
induce a la síntesis de novo de la enzima NADPH oxidasa, la cual contribuye significativamente
a la producción de más anión superóxido (Hink et al, 2001).
* La hiperglucemia favorece también, a través de la activación de NF-KB, una expresión
incrementada tanto de NADPH y de la sintasa de oxido nítrico inducible (iNOS) con la
consecuente generación incrementada de óxido nítrico (NO•), que al reaccionar con el anión
superóxido forma peroxinitrito, el cual se protona y genera una molécula de radical hidroxilo
(reacción 5) (Spitaler & Graier, 2002).
* La enzima Xantina Oxidasa también esta involucrada en la producción de radicales
libres en la DT1 (Desco et al, 2002). Se ha encontrado incrementada la formación de anión superóxido
en anillos de aorta de conejo diabético, el cual fue inhibido completamente por el alopurinol, un
inhibidor de la xantina oxidasa.
I.9. ESTRÉS OXIDATIVO EN DIABETES
A continuación se mencionan las evidencias científicas del incremento daño oxidativo
generado por las ERO en pacientes con DM asociado a disminución del sistema antioxidante
en éste tipo de población.
I.9.a. Daño de las ERO en Diabetes. Collier y colaboradores demostraron incremento en las concentraciones de sustancias
reactivas al ácido tíobarbiturico (malondialdehido-MDA-) y dienos conjugados en plasma de
pacientes con diabetes tipo 2 con micro-albuminuria (Collier et al., 1992) así como en el contenido de
eritrocitos, lo cual sugiere alteraciones permanentes en la estructura membranal de las células
en la diabetes y un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno en la
circulación (Bono et al., 1987)
Suarez y sus colaboradores, en un modelo in vitro reveló la destrucción de células beta
de islostes de páncreas humano al ser expuestas a la combinación de citocinas (interleucina -
1β, el factor de necrosis tumoral-α y el interferón-γ) e inducir significativamente incremento en la
.
16
concentración tanto de MDA como de nitratos y una reducción significativa en la producción de
insulina (Suarez-Pinzon et al., 1996).
Sakai y colaboradores evidenciaron la producción de especies reactivas de oxígeno a
nivel mitocondrial, con impacto en la supresión de secreción de insulina, al exponer células β de
páncreas a concentraciones altas de glucosa, en un sistema in vitro (Sakai et al., 2003).
Cominacini y colaboradores reportaron susceptibilidad de las lipoproteínas de baja
densidad (LDL) a la oxidación asociado a estrés oxidante en pacientes con diabetes, sugiriendo
que dicha oxidación de las LDL favorece la enfermedad arterial coronaria (Cominacini et al., 1994).
El grupo de investigación de Pennathur, describió que la exposición de radicales libres
del tipo hidroxilo, tirosilo y peroxinitrito sobre las proteínas propicia la modificación química de
aminoácidos en dichas proteínas, al determinar incremento en las concentraciones de orto-
tirosinas, meta-tirosinas, ditirosinas y nitrotirosinas en tejido aórtico de monos con diabetes (Pennathur et al., 2001).
I.9.b. Sistema Antioxidante en Diabetes. Lenzed en 1996, reportó que la expresión de genes de las enzimas antioxidantes
(catalasa, glutatión peroxidasa y la superóxido dismutasa) esta substancialmente reducida en
islotes pancreáticos de ratón comparado con otros tejidos (hígado, riñón, cerebro, pulmón,
músculo esquelético, glándula suprarrenal y pituitaria) (Lenzed et al.,1996), lo cual indica que el tejido
pancreático es susceptible al daño por estrés oxidante.
Se ha descrito que la presencia de hipocatalasemia o acatalasemia (componente
hereditario –sujetos hungaros-) puede ser un factor de riesgo para desarrollar diabetes, debido
a que el incremento del H2O2 no puede ser metabolizado por la cararencia de la catalasa,
contribuyendo a la destrucción progresiva de las células β del pancreas y con ello una
disminución y efectividad de la insulina, dando inicio a la enfermedad (Goth & Eaton 2000).
Kedziora-Kornatowska y colaboradores reportaron en su estudio una disminución de la
actividad enzimatica tanto de la catalasa como de la superóxido dismutasa en el contenido
eritrocitario de pacientes con diabetes comparado con individuos sanos, ésta disminución en la
actividad enzimática antioxidante, esta en relación a la progresiva glicación de proteínas
(enzimas). Aproximadamente el 50% de la SOD en eritrocitos de diabéticos es glicada y con ello
disminución en su actividad (Kedziora-Kornatowska et al., 1998).
Kimura y colabores hallaron una relación entre la concentración de superóxido
dismutasa en suero y la severidad de complicaciones macro-microvasculares. Sugiriendo que
dichas concentraciones de SOD puedan ser marcadores de lesión vascular. Estos posiblemente
17
reflejados en el daño oxidativo inducido por hiperglucemia sobre el endotelio vascular y a la
disminución de la SOD de la pared vascular (Kimura et al., 2003).
El contenido de glutatión en su forma reducida (GSH) es significativamente más bajo en
pacientes con diabetes tipo 2 en comparación con individuos normales (Rizvi y Zaid, 2001).
No solo las enzimas antioxidantes se ven afectadas durante la diabetes. También hay
reportes donde las bajas concentraciones en plasma de vitamina E, están asociadas a un
incremento en la incidencia de diabetes (Salonen et al., 1995), Polidori y colaboradores confirmaron en
su estudio que los pacientes con diabetes tipo 2 presentan niveles bajos de antioxidantes tales
como la vitamina A, E y los betacarotenos; sugiriendo que es debido al incremento en la
producción de radicales libres por la hiperglucemia (Polidori et al,. 2000). Así mismo, también se ha
reportado bajas concentraciones en plasma de minerales como el Zinc (Anetor et al., 2000), Cobre,
Selenio (Reddi & Bollineni 2001) y Manganeso (Thompson et al, 1992) (los cuales actúan como cofactores para
el funcionamiento de las enzimas antioxidantes).
Como ya se mencionó, cuando los sistemas productores de ERO sobrepasan la capacidad
neutralizante de los sistemas de defensa se establece el estado de estrés oxidativo y es
entonces que las ERO pueden reaccionar con diversas biomoléculas de las células, como
ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y proteínas.
La oxidación de proteínas es definida como la modificación covalente de las proteínas
inducida directamente por ERO o indirectamente por reacción con bio-productos del estrés
oxidante. Prácticamente todos los aminoácidos pueden servir como blanco del ataque oxidativo
por las ERO, aunque algunos aminoácidos como la metionina (Vogt, 1995), el triptófano, la
fenilalanina, la tirosina, la cisteina (Prakash et al, 2004), leucina, valina, lisina arginina, prolina y la
histidina (Davies et al, 1987 I; 1987 II; 1987 IV, Stadtman, 1993) son más susceptibles. La modificación de las
cadenas laterales de éstos, puede conducir a la alteración directa de la estructura y la función
de las proteínas (Silvester et al.,1998; Ortega-Camarillo et al., 1999), a la fragmentación química o al incremento
en la susceptibilidad a proteolisis (Stadtman, 1991; Davies et al, 1987 I; Wolff, 1987).
La albúmina es una proteína que se ha descrito como susceptible al daño por RL. Se
tienen evidencias de que los principales residuos de aminoácidos oxidados son el Trp-134, Trp-
214 (formando radicales derivados del triptofano) y Cis-34 (dando lugar a un radical tiílo (RS•)
en la albúmina bovina sérica. La alteración conformacional de la proteína da lugar a la
formación de radicales en sitios adicionales. La formación de los radicales derivados del
triptofano (Dean et al., 1991) y los tiílo permiten la desnaturalización, fragmentación y polimerización
18
de la proteína y hay un incremento en la susceptibilidad de la proteína oxidada a la proteólisis
(Silvester et al.,1998; Davies et al., 1993).
Una proteína más que puede ser alterada por las ERO (HO•) in vitro, tanto en su
estructura como en su función, es la gonadotropina equina, esta alteración fue manifestada
como una pérdida de la ovulación y una disminución en el peso de los ovarios y el útero (Ortega-
Camarillo et al., 1999).
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) son lipoproteínas que se encuentran en el
plasma, que al ser oxidadas juegan un papel fundamental en la formación y progresión
temprana de la lesión aterosclerosa. La LDL oxidadas (LDL-ox) son más aterogénicas que en
su forma nativa. Se ha demostrado la oxidación de la LDL la cual ocurre in vivo, lo que ha
promovido el desarrollo de investigaciones clínicas para discernir el papel que juega en la
progresión de la enfermedad aterosclerosa. Las modificaciones oxidativas sobre la LDL son el
resultado del desbalance entre el incremento oxidante que ocurren in vivo y la reducción de las
defensas antioxidantes. Existe una gran variedad de métodos que han sido desarrollados para
evaluar in vitro la susceptibilidad de la LDL a la oxidación por varios agentes; donde el principio
básico es aislar las lipoproteínas del plasma por medio de su gradiente de densidad a través de
ultracentrifugación y subsecuentemente modificados con estímulos oxidantes. La cinética de la
LDL modificada se ha utilizado como marcador de oxidación de ésta partícula, el cual es medido
a través de la formación de dienos conjugados (Esterbauer et al., 1989), oxisteroles (Jialal et al., 1981) y
substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (Lavy et al., 1991). Los oxidantes utilizados para tal fin
fueron el cobre (Lynch & Frei 1993), hierro (Sato et al., 1990), quelantes de hierro, generadores de radicales
libres, radiaciones ionizantes (Dousset et al., 1990), lipo-oxigenasas (Khun et al., 1994) y peroxidasas (Wieland
et al., 1993).
Se ha demostrado la participación del HO• en la hidroxilación de algunos residuos de
tirosina (y probablemente de fenilalanina), forman derivados reducidos como es el caso del
catecol 3,4- dihidroxifenilalanina (DOPA) (Gieseg et al., 1993) unida a proteína que en presencia de
metales de transición forma ortoquinona, molécula que es capaz de reducir al compuesto nitro-
azul de tetrazolio (NBT), dando como producto al compuesto formazán, el cual es fácilmente
detectado por espectrofotometría. La formación de ditirosinas esta es una forma indirecta de
medir el ataque de los radicales hidroxilo a las tirosinas de una proteína, sin embargo, la
cuantificación de los grupos carbonilos (Dalle-Done et al., 2003) y ditirosinas (Lehrer & Pasman, 1967) han sido
los biomarcadores más utilizados para detectar daño a proteínas por estrés oxidante
19
Las proteínas dañadas por las ERO no deben ser considerados como productos finales,
ya que estás son capaces de dañar otras bio-moléculas, como fue demostrado al exponer al
ácido linoleíco y un polipéptido (Glu-Ala-Tir) a radical-albúmina-sérica bovina, dando como
resultado la formación de dienos conjugados y ditirosinas respectivamente.
Las proteínas también resultan sensibles al ataque por parte de los intermediarios o
productos finales producidos por el daño de los radicales libres sobre los lípidos, como es el
caso del 4 hidroxinonenal (Uchida & Stadtman, 1993; Bestervelt et al., 1995). La histidina, la lisina y la cisteína
resultan particularmente sensibles a este tipo de ataque (Uchida & Stadtman, 1993).
Otro ejemplo de proteína que pueden ser alteradas por las ERO y por productos de
oxidación tanto en su función como estructura es la insulina, hormona polipeptídica que fue
oxidada in vitro en un medio controlado generador de radicales hidroxilo (reacción de Fentón),
en el cual los aminoácidos fenilalaninas se hidroxilaron formando tirosinas, y éstas tirosinas
formadas más las existentes en la molécula de la insulina se hidroxilaron formando
hidroxitirosinas permitiendo la formación de ortoquinonas, las cuales fueron capaces de reducir
al Nitroazul de tetrazolio; así mismo la otra vía que pudo haber tomado las tirosinas fue la
formación de ditirosinas todo ello por efecto de radicales hidroxilo, como lo demostró nuestro
equipo de investigadores (Olivares-Corichi, et al 2005).
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Debido a que algunas cadenas laterales de aminoácidos son susceptibles de ser
modificadas químicamente durante el estrés oxidante, la exposición in vitro de las proteínas a
los sistemas generadores de radicales libres conduce a modificación en la estructura terciaria
que, inducen pérdida de la función biológica, como ya se demostró en la insulina (Olivares-Corichi., et
al 2005a)
. Con este antecedente el planteamiento de problema que propusimos fue : ¿El estrés
oxidativo (capacidad oxidante) presente en la sangre de pacientes con diabetes tipo 2 es capaz
de modificar la estructura química y función la insulina recombinante humana?
III. JUSTIFICACIÓN. Las enfermedades crónica degenerativas del tipo cardiovasculares y metabólicas están
dentro de las primeras causas de muerte en el país, en este rubro de enfermedades sobresale
la Diabetes Mellitus, entidad patológica con comportamiento creciente. En México el último año
de registro estadístico dentro del IMSS la reporto como la 3ª causa de consulta en Medicina
Familiar, 4ª causa de consulta de Especialidades, 8ª causa de consulta en Urgencias y 11ª
20
causa de morbilidad hospitalaria (128,036). Referente a la mortalidad, el porcentaje por
defunciones generales en el grupo de edad de 30-64 años fue:
Año 2000 2001 2002 2003 2004 Tasa 287.2 291.3 308.6 365.0 384
Estos pacientes se caracterizan por tener incrementada la concentración de glucosa en
sangre (hiperglucemia > 126 mg / dl), debido a un déficit en la secreción y acción de la insulina
ó una reducción en la sensibilidad de la insulina por los tejidos (resistencia a la insulina), así
mismo se ha demostrado la reducción de los sistemas antioxidantes asociados a un incremento
en el daño a lípidos (lipoperoxidación) y a proteínas (productos proteicos finales de la
oxidación), a dicho desequilibrio bio-químico en estos pacientes diabéticos se le denomina
estrés oxidante. Es por ello, que el presente trabajo pretende demostrar que la insulina humana
puede ser modificada en su estructura química y función por la capacidad oxidante de la sangre
de pacientes con diabetes tipo 2, ya que la estructura primaria de la insulina, 28 aminoácidos
(de los 51 que la componen) son susceptibles al daño oxidante.
IV. HIPÓTESIS.
El estrés oxidativo (capacidad oxidante) presente en la sangre de pacientes con diabetes tipo 2
modifica la estructura química y función de la insulina recombinante humana.
V. OBJETIVOS V.1. Objetivo General
Determinar in vitro si la capacidad oxidante de la sangre de pacientes con diabetes tipo 2,
modifica la estructura química y función de la insulina recombinante humana.
V.2. Objetivos Particulares
1) Determinar el estado de estrés oxidativo de pacientes con diabetes tipo 2, mediante
marcadores plasmáticos de daño a lípidos y proteínas por radicales libres.
2) Evaluar las modificaciones químicas y estructurales de la insulina recombinante humana
generadas por la capacidad oxidante de la sangre de pacientes con diabetes tipo 2.
21
2
3) Determinar la actividad hipoglucemiante de la insulina, modificada por la capacidad oxidante
de la sangre de diabéticos.
VI. MATERIAL Y MÉTODOS
VI.1. Tipo de Estudio Cuasi-experimental, descriptivo, transversal, comparativo, analítico, abierto.
VI.2. Tamaño de la Muestra Tipo de Muestreo: Probabilístico (aleatorio simple) (Dawson-Sanders & Trapo, 2007).
Aleatorización: Tabla de números aleatorios (Dawson-Sanders & Trapo, 2007).
N= [ ( Zα - Zβ ) σ ] 2
µ1- µ2
N= No. de pacientes.
Zα= .95
Zβ= .10
µ1= 1.0 nmol / ml TBAR (Desco M. et al, 2002).
µ2= 0.4 nmol/ml TBAR.
± DE = 0.3 nmol / ml TBAR (Desco M. et al, 2002).
n = [ (1.96 – (- 1.28) 0.3] 2
1.0 – 0.4
n = 11
Para encontrar diferencias significativas entre los dos grupos se requirió como mínimo
de 11 pacientes por grupo más un 20 % adicional por las posibles pérdidas, 13 pacientes se
requerían para encontrar diferencias significativas, sin embargo; se enrolaron 60 pacientes
diabéticos y 41 voluntarios sanos.
VI.3. Criterios de selección Criterios de inclusión (Grupo DT2):
a) Pacientes con Diabetes tipo 2 (> 2 años de diagnóstico) con hiperglucemia > 300 mg / dl.
b) Cualquier sexo.
2
22
c) Edad de 35 a 60 años.
d) Que acepten entrar al estudio por medio de carta de consentimiento.
e) Pacientes derechohabientes del IMSS.
Criterios de no inclusión (Grupo DT2):
a) Ayuno menor de 8 horas.
b) Ingesta de suplementos con antioxidantes.
c) Co-morbilidad agregada como; Hipertensión arterial sistémica, Síndrome coronario agudo y
Enfermedad pulmonar obstructiva crónica, entre otras.
d) Uso de medicamentos como ácido acetilsalicico, alopurinol, estatinas, glitazonas, inhibidores
de la enzima convertidora de angiotensina.
Criterios de eliminación (Grupo DT2):
a) Datos insuficientes del paciente para la realización del análisis estadístico.
Criterios de inclusión: (Voluntarios Sanos “Grupo Control”):
a) Pacientes sin diabetes y con glucemia < 100 mg / dl.
b) Cualquier sexo.
c) Edad de 35 a 60 años.
d) Que acepten entrar al estudio por medio de carta de consentimiento.
e) Trabajadores de salud IMSS, SSA, IPN (personal de enfermería, médicos e investigadores).
Criterios de no inclusión: (Voluntarios Sanos “Grupo Control”):
a) Ayuno menor de 8 horas.
b) Ingesta de suplementos con antioxidantes.
c) Presencia de enfermedades crónicas: (Hipertensión arterial sistémica, Síndrome coronario
agudo, Enfermedad pulmonar obstructiva crónica, Dislipidemia, Parkinson, entre otras).
d) Tratamiento con ácido acetilsalicico, alopurinol, estatinas, glitazonas, inhibidores de la
enzima convertidora de angiotensina.
Criterios de eliminación: (Voluntarios Sanos “Grupo Control”):
a) Datos insuficientes de los voluntarios sanos para la realización del análisis estadístico.
VI.4. Reactivos Los reactivos utilizados para el proyecto fueron obtenidos de diversos laboratorios, por el
laboratorio Merck fue: el ácido tricloroacético (CCl3COOH), sulfato de magnesio (MgSO4),
23
butilhidroxitolueno (C15H24O), del laboratorio SIGMA el nitroazul de tetrazolium (C40H30Cl2N10O6),
manitol (C6H14O6), 2,4-Dinitrofenilhidrazina (C6H6N4O4), guanidina hidroclorada (CH5N3), glicina
(C2H5NO2), ácido tiobarbitúrico (C4H4N2O2S), citrato de sodio anhídro (Na3C6H5O7 2H2O),.y la
fenilefrina (HOC6H4CH(CH2NHCH3)OH·HCl ), del laboratorio Fermont se adquirió el peróxido de
hidrógeno (H2O2), sulfato cúprico (CuSO4), dicromato de potasio (K2Cr2O7), del laboratorio
Meyer fueron adquiridos el ácido clorhídrico (HCl), ácido sulfúrico (H2SO4), etanol (CH3CH2OH),
mono fosfato de potasio (KH2PO4), fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), mono fosfato de sodio
(NaH2PO4H2O), fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de
sodio (NaOH), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de calcio dihidratado
(CaCl2 2H2O) y urea (NH2CONH2). Humulin*R insulina zinc humana (origen ADN recombinante)
del laboratorio Lilly (C257H383N65O77S6), del laboratório States Unites Biochemical el HEPES
(C8H17N2NaO4S) y el Pentobarbital sódico (C12H12N203) del laboratorio Pfizer.
VI.5. Diseño Experimental
En un modelo in vitro se expuso insulina humana recombinante a la sangre total de
pacientes con diabetes tipo 2 (DT2) con hiperglucemia y en sangre total de voluntarios sanos
(VS). Primero se demostró que la sangre de los pacientes con DT2 se hallaba en estrés
oxidativo, mediante análisis espectrofotométricos. Se cuantificaron compuestos reactivos al
ácido tiobarbitúrico (Malondialdehído -MDA-), se determinó la reducción del nitro azul de
tetrazolio y la concentración de grupos carbonilo; y por fluorometría se analizó la cantidad de
ditirosinas en plasma. Además se evaluó la concentración de hierro libre en plasma.
Posteriormente se evaluaron las modificaciones químicas en la insulina, después de exponerla
a la sangre total de los diabéticos o sanos, determinando la concentración de grupos carbonilo,
ditirosinas y la reducción del NBT (formación de formazán) en ella. Finalmente se determinó la
función biológica hipoglucemiante de la insulina en ratas.
24
Selección de muestra en sala de Emergencias
Toma de muestra de sangre 10 ml
Incubación de Insulina en sangre 4 horas a 37 ºC
Grupo VS n = 41
Grupo DT2 n = 60
Membrana diálisis 3500 Daltons
VI.5.a. Flujograma Experimental
VI.6. Técnicas del primer objetivo VI.6.a. Obtención del plasma de pacientes con DT2 y voluntarios sanos (control) Se obtuvo 10 ml de sangre venosa por vía braquial en pacientes con DT2 con
hiperglucemia > 300 mg / dl y de VS con glucemia < 100 mg / dl, 2 ml de esta muestra se
depositó en un tubo de plástico que contenía como anticoagulante citrato de sodio con una
concentración final de 14 mM, ésta se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos.
2 ml
8 ml
Objetivo 1: Medir el estrés oxidativo basal en plasma: + CRAT + Reducción de NBT + Ditirosinas + Carbonilos + Hierro libre
Objetivo 1: Cuantificar el estrés oxidativo en plasma después de la incubación: + CRAT + Reducción de NBT + Ditirosinas + Carbonilos + Hierro libre
Objetivo 2: Evaluación de insulina modificada, midiendo: + Reducción de NBT + Ditirosinas + Carbonilos
Objetivo 3: Determinar la función biológica de la insulina modificada + Efecto hipoglucemiante en rata Wistar.
25
VI.6.b. Determinación de los Compuestos Reactivos al Ácido Tiobarbitúrico (MDA) en plasma
Del plasma obtenido tanto de pacientes con DT2 y VS, 100 µl de éste se mezclaron con
400 µl de amortiguador Tris pre-set pH 7.2 mM y 1 ml de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0.375%.
Posteriormente se calentó a 90° C durante 15 minutos y se agregó 500 µl de HCl 0.2 N. La
absorbancia obtenidas fueron a 532 nm de longitud de onda a 25° C en un espectrofotómetro
marca GENESYS 10 UV (Termo Electrón Corporation, Madison WI - USA), utilizándose 1,1,3,3-
tetrametoxypropano como estándar, de acuerdo a la técnica descrita por Yagi (Yagi, 1998).
VI.6.c. Reducción de Nitro-azul de Tetrazolio en plasma
Utilizando el método de Gieseg (Gieseg et al., 1993), se mezclaron 10 µl de plasma con 1 ml
NBT 0.28 mM en glicina 2 M pH 10 y se incubó por 45 minutos a 21° C (temperatura ambiente)
protegidos de la luz, se agitaron en un Vortex Gene 2 (Lab Scientific Industries, Bohemia USA)
por 10 segundos cada 15 minutos, obteniéndose las absorbancias a una longitud de onda 530 nm en un espectrofotómetro GENESYS 10 UV (El blanco para calibrar fue NBT 0.28 mM en
glicina 2 M Ph 10).
VI.6.d. Cuantificación de Ditirosinas en plasma Cien microlitros de plasma se mezcló con 1 ml de TCA al 10% en un tubo de ensayo de
plástico, inmediatamente se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos, eliminando el sobrenadante
y secando con papel filtro las paredes del tubo. Se disolvió la pastilla con una varilla de vidrio
agregando 1 ml de etanol / acetato de etilo y se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos. Se
eliminó el sobrenadante y dejó 5 minutos bajo una campana extractora. A continuación se
disolvió la pastilla con una varilla de vidrio agregando 2 ml de Urea 6M en NaHCO3 al 0.1 M pH
9.8 incubandose por 30 minutos a temperatura ambiente, obteniéndose las *absorbancias a 320
nm de excitación y 405 nm de emisión en un Fluorometro TD – 700 (Turner Designs
Instruments. Sunnyvale, CA – USA), usando la técnica descrita por Manlencik (Malencik et al., 1996)
• Se calibró el fluorometro mezclando 5 µl de sulfato de quinina en 245 µl de urea 6M,
resultando una concentración final de 100 µM. De ésta solución se tomó 20 µl y se mezcló
en 1980 µl de urea 6M; el valor reportado en pantalla fue de 500 aproximadamente, con una
lámpara adecuada, 320 nm de excitación y 405 nm de emisión.
26
VI.6.e. Determinación de Carbonilos en plasma
Por medio del método de Dalle-Donne (Dalle-Donne et al., 2003) se cuantificaron los carbonilos
proteicos, del plasma obtenido al tiempo cero (basal) y 4 horas después de la incubación, tanto
de pacientes con diabetes tipo 2 y voluntarios sanos; 100 µl de plasma se mezcló con 1 ml de
2,4-Dinitrofenilhidrazina (DNPH) 10 mM en HCL 2.5 M, mientras que el tubo blanco consistió en
100 µl de plasma mezclado con 1 ml de HCL al 2.5 M Los tubos se incubaron a 23 °C
protegidos de la luz por 1 hora, agitándose en Vortex cada 15 minutos por 10 segundos, una
vez trascurrido el período de incubación se añadió 1 ml de TCA al 20 % y se centrifugó a 3000
rpm por 10 minutos, inmediatamente se decanto el contenido y la pastilla obtenida se volvió a
disolver con una varilla de vidrio con 1 ml de TCA 10 % centrifugando por segunda vez a 3000
rpm por 10 minutos, decantando el sobrenadante y agregando 3 ml de Etanol / Acetato de etilo
con el fin de disolver y lavar la pastilla de proteína para remover los residuos de DNPH, siendo
centrifugada por tercera ocasión a 3000 rpm por 10 minutos, decantando el sobrenadante y
dejando secar por 5 minutos bajo campana extractora. El precipitado final fue disuelto con
ayuda de una varilla de vidrio con 1 ml de Guanidina 6 M e incubado por 10 minutos a 37 °C en
Termoblock, obteniéndose las absorbancias a una longitud de onda 370 nm en un
espectrofotómetro GENESYS 10 UV (Para calibrar se utilizo 1 ml de Guanidina 6 M).
VI.7. Técnicas de segundo objetivo
VI.7.a. Oxidación de insulina humana recombinante modificada por el estrés oxidativo presente en sangre de pacientes con DT2 y voluntarios sanos (control) En una bolsa de diálisis Spectra / Por ® (membrana tubular porosa-molecular 3,500 -
Spectrum Laboratories, Inc. CA. USA.) se agregó 200 µl de insulina nativa + 1800 µl solución
salina 0.9% estéril. Esta bolsa se introdujo en tubo de ensayo que contenía 8 ml de sangre total
de pacientes con diabetes tipo 2 en hiperglucemia (> 200 mg/dl), se tapo y se incubó a 37º C en
un termoblock Thermolyne-Cimarec® 2 (Barnstead Internacional, IOWA – USA) por 4 horas
seguidas, cada 15 minutos se agito el tubo con el fin de mezclar paquete celular y plasma.
Enseguida se saco la bolsa dializante para ser lavada con solución salina 0.9% a temperatura
de 37º C para quitar el excedente de sangre de las paredes de ésta, siendo recolectada la
insulina en un tubo de ensayo seco para ser almacenada en refrigeración a una temperatura de
2 – 8° C hasta su análisis.
27
VI.7.b. Reducción del Nitro-azul de Tetrazolio por Insulina Del volumen obtenido de insulina modificada (oxidada), se calculó el volumen en
microlitros para obtener 0.25 mg de proteína de ésta insulina, aforando a 500 µl con solución
bidestilada, enseguida se agregó y mezcló 500 µl de NBT 0.28 mM en glicina 2 M pH 10. Los
tubos se incubaron por 45 minutos a 21° C y protegidos de la luz, se agitaron en Vortex Gene 2
(Lab Scientific Industries, Bohemia USA) por 10 segundos cada 15 minutos y se obtuvieron las
absorbancias a una longitud de onda 530 nm en un espectrofotómetro GENESYS 10 UV (El
blanco para calibrar fue NBT 0.28 mM en glicina 2 M Ph 10) por el método de Gieseg (Gieseg et al.,
1993).
VI.7.c. Cuantificación de Ditirosinas en Insulina Se calculó el volumen en microlitros para obtener 0.50 mg de proteína de insulina
modificada (oxidada), para aforar a 500 µl con agua bidestilada, posteriormente se mezcló con
500 µl de TCA al 10% 2 ml con Urea 6M en NaHCO3 0.1 M pH 9.8 en un tubo de ensayo de
plástico. Se mezcló y se incubo a temperatura ambiental por 30 minutos, obteniéndose las
*absorbancias a 320 nm de excitación y 405 nm de emisión en un Fluorometro TD – 700
(Turner Designs Instruments. Sunnyvale, CA – USA).
* Se calibró el fluorometro mezclando 5 µl de sulfato de quinina en 245 µl de urea 6M,
resultando una concentración final de 100 µM. De ésta solución se tomó 20 µl y se mezcló en
1980 µl de urea 6M; el valor reportado en pantalla fue de 500 aproximadamente, con una
lámpara adecuada, 320 nm de excitación y 405 nm de emisión, realizado de acuerdo a la
técnica de Malencik (Malencik et al., 1996).
VI.7.d. Determinación de Carbonilos en Insulina
Del volumen obtenido de insulina nativa al tiempo cero (basal) y de insulina modificada
(oxidada) 4 horas después de la incubación, tanto de pacientes con diabetes tipo 2 y voluntarios
sanos, se calculó el volumen en microlitros para obtener 0.25 mg de proteína de esta insulina,
éste volumen se aforó a 400 µl con agua bidestilada agregando y mezclando 1 ml de 2,4-
Dinitrofenilhidrazina (DNPH) 10 mM en HCL 2.5 M, mientras que el tubo blanco consistió en
0.25 mg de proteína de insulina nativa como modificada, éste volumen se aforó a 400 µl con
agua bidestilada agregando y mezclando con 1 ml de HCL al 2.5 M. Los tubos se incubaron a
23 °C protegidos de la luz por 1 hora, agitándose en Vortex cada 15 minutos por 10 segundos,
una vez trascurrido el período de incubación se añadió 1 ml de TCA al 20 % y se centrifugó a
3000 rpm por 10 minutos, inmediatamente se decanto el contenido y la pastilla obtenida se
volvió a disolver con una varilla de vidrio con 1 ml de TCA 10 % centrifugando por segunda vez
28
a 3000 rpm por 10 minutos, decantando el sobrenadante y agregando 3 ml de Etanol / Acetato
de etilo con el fin de disolver y lavar la pastilla de proteína para remover los residuos de DNPH,
siendo centrifugada por tercera ocasión a 3000 rpm por 10 minutos, decantando el
sobrenadante y dejando secar por 5 minutos bajo campana extractora. El precipitado final fue
disuelto con ayuda de una varilla de vidrio con 1 ml de Guanidina 6 M e incubado por 10
minutos a 37 °C en Termoblock, obteniéndose las absorbancias a una longitud de onda 370 nm
en un espectrofotómetro GENESYS 10 UV (Para calibrar se utilizo 1 ml de Guanidina 6 M),
realinzándose de acuerdo a la técnica de Dalle-Donne (Dalle-Donne et al., 2003).
VI.8 Técnicas del Tercer Objetivo
VI.8.a. Evaluación de la actividad biológica de la Insulina (Efecto hipoglucemiante en rata), modificada por el estrés oxidativo presente en sangre de pacientes con diabetes tipo 2 y voluntarios sanos (control)
Se formaron cinco grupos para evaluar el efecto hipoglucemiante en ratas; el primer
grupo se les administró 1 ml de solución salina estéril 0.9% a 37° C, el segundo grupo fue
tratado con 0.3 UI insulina nativa (3 µl de insulina + 997 µl de solución salina estéril 0.9%
previamente calentada a 37° C), el tercer grupo se manejó con insulina oxidada in vitro en un
modelo generador de radicales hidroxilo a través de la reacción de Fentón durante 5 minutos,
dicho modelo consistió en agregar 15 UI (150 µl de insulina humana recombinante + 850 µl de
agua bidestilada) en una bolsa de diálisis Spectra / Por® (membrana tubular porosa-molecular
3,500 - Spectrum Laboratories, Inc. CA. USA.). La bolsa se introdujo en 4 ml de una solución
que contenía 20 µl H2O2 [5 µM] y 80 µl de CuSO4 [4 µM] más 3.9 ml de agua bidestilada, ésta
bolsa se incubó a 37º C por 5 minutos en un Thermolyne-Cimarec® 2 (Barnstead Internacional,
IOWA – USA). Al termino de la incubación se extrajo la bolsa y se lavo con agua bidestilada, la
insulina fue depositada en tubo de ensayo al cual se le agregó y mezcló con 1 ml de TCA al
50% y se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos, una vez desechando el sobrenadante y
limpiando las paredes del tubo del excedente de TCA, la pastilla de proteína se disolvio en 1 ml
de agua bidestilada, el cuarto y quinto grupo de ratas recibieron insulina modificada (oxidada)
por el estrés oxidativo presente en la sangre de voluntarios sanos (control) y pacientes con
diabetes tipo 2 respectivamente; el modelo in vitro consistió en preparar una bolsa diálisis
Spectra / Por® adicionándole 20 UI (200 µl) de insulina nativa + 800 µl de solución salina esteril
al 0.9%, dicha bolsa se deposito en un tubo de ensayo que contenia 8 ml de sangre total de
voluntarios sanos o pacientes con diabetes e incubada a 37° C por 4 horas consecutivas, al
29
termino de la incubación se extrajo la bolsa y se lavo con agua bidestilada con el fin de quitar
los eritroscitos y que éstos al hemolizarse cotaminaran con hierro la muestra, la insulina fue
depositada en un tubo de ensayo el cual se le agregó y mezcló 1 ml de TCA al 50% y se
centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos, una vez desechando el sobrenadante y limpiando las
paredes del tubo del excedente de TCA, la pastilla de proteína se disolvio en 1 ml de agua
bidestilada. Por medio de la técnica de Lowry (Lowry et al., 1951) se determino la cantidad de 0.3 UI
de insulina en volumen y se aforó a 1 ml con solución salina esteril 0.9% previamente calentada
a 37° C para ser administrada intraperitoneal en los animales.
En cada grupo se utilizaron seis ratas Wistar machos con promedio de peso 350 g ± 5 g y de 3
meses de edad en promedio, las cuales fueron manejadas en un cuarto oscuro, a temperatura
de 20° C, con alimento y agua a libre demanda, éstas se anestesiaron por vía intraperitoneal
con pentobarbital sódico Anestesal® (Pfizer, Toluca-México) a dosis de 1 mg / 2.5kg de peso.
Una vez anestesiado el animal se mantuvo en posición ventral sobre una cama previamente
calentada a 30° C, inmediatamente se limpió el vertice de la cola con alcohol al 96% y se realizó
una incisión en ésta, obteniendo una gota de sangre para depositarla en la tira reactiva
conectada a un glucómetro digital Accu-Chek® Sensor (Roche, Mannheim-Germany)
registrando la glucemia basal. A continuación 0.3 UI de insulina (nativa, oxidada por Fenton, y
modificada por el estrés oxidativo de sangre de voluntarios sanos como de pacientes con
diabetes) fueron aforados a 1 ml con solución salina estéril al 0.9% previamente calentada a 37°
C e inyectadas por vía intraperitoneal, efectuando cuatro determinaciones seriadas digitalmente
de la glucemia cada 10 minutos.
VI.9. Medición de hierro libre en plasma Se determinó la concentración de hierro libre en plasma de voluntarios sanos (control) y
pacientes con diabetes tipo 2, antes de las cuatro horas de la incubación de la insulina en
sangre total y posterior a ésta, con la finalidad de evidenciar que la muestra de sangre durante
el proceso de incubación no presentase hemólisis y que la liberación de hierro por parte de la
hemoglobina fuera el causante del daño oxidativo a la insulina. Dicha cuantificación se realizó
en el laboratorio central de la U.M.A.E Hospital General Centro Médico Nacional “La Raza”,
usando un autoanalizador químico de la línea Roche / Hitachi 904 (USA, MA) el principio de la
prueba (colorimétrica) esta basado en la técnica de Mori (Mori et al., 1981).
30
VII. RESULTADOS
De los 115 pacientes elegidos de forma aleatoria consecutivamente, solamente 101
fueron admitidos en el estudio. Diez de ellos fueron excluidos por haber estado ingiriendo
metformin como parte del tratamiento hipoglucemiante para su enfermedad antes de entrar al
estudio, y los cuatro pacientes restantes por haber recibido la mezcla de glibenclamida con
metformin. Los dos grupos fueron estratificados por edad, sexo, índice de masa corporal, no
hallando diferencias entre ambos grupos (tabla 5), como era de esperar se detectó significancia
estadística al comparar la glucemia de ambos grupos (p < 0.001), solamente se incluyeron
pacientes bajo un régimen terapéutico a base de glibenclamida e insulina, por el hecho de que
se ha reportado científicamente que tanto las glitazonas como la metformin tienen efecto
antioxidante.
Características Clínicas Basales
Características Grupo VS Grupo DT2 Valor de p Edad (años) φ 49 ± § 10 φ 53 ± § 5 ‡ NS
Sexo (Hombre / Mujer) 12 / 29 22 / 38 € NS Índice de masa corporal (kg / m2) φ 25 ± § 4 φ 27 ± § 6 ‡ NS
Glucemia (mg / dL) φ 82 ± § 10 φ 352 ± § 20 ‡ < 0.001 Inicio de diabetes tipo 2 (años) ---------- φ 9 ± § 2 ---------- Tratamiento con hipoglucemiantes:
Glibenclamida Insulina
---------- ----------
49 / 60 11 / 60
---------- ----------
Tabla 5. Datos presentados en número de pacientes. φ= Promedio. §= Desviación estándar. ‡= t de student. €= chi cuadrada. n = 41 (VS= Grupo voluntários sanos). n = 60 (DT2 = Grupo Diabetes tipo 2). NS = No significativa.
La tabla 6 muestra los valores en plasma de los marcadores de estrés oxidativo 4 horas
posteriores a la incubación in vitro, clasificándolos en subgrupos; en pacientes sin
complicaciones crónicas, en pacientes con algún grado de daño renal (nefropatía) y en
pacientes con procesos infecciones. Los valores de MDA en los pacientes con nefropatia y con
algún proceso infeccioso fueron menores (22 y 16%) comparado con el grupo de diabéticos sin
complicaciones. Los valores oxidativos relacionados a lesión de proteínas también se
detectaron con niveles altos; la formación de formazán (23.53 ± 13.46 nmol / mg proteína) como
la concentración de carbonilos (1.29.81 ± 0.65 nmol osazonas / mg proteína) fueron mayores en
el grupo de pacientes con nefropatía; mientras que la concentración de ditirosinas (430.50 ±
257.40 pmol / mg proteína) estuvo más incrementado en el grupo de pacientes infectados. No
31
hubo diferencias significativas (NS) al comparar los marcadores de estrés oxidativo de acuerdo
a la co-morbilidad que presentaron los pacientes.
Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in vitro de acuerdo a Co-morbilidad.
Grupo DT2 Biomarcador Sin
Complicación Nefropatía Infección Valor de
p Malondialdehído
(nmol MDA / mg materia orgánica)
φ0.50 ± §0.25 (n = 39)
φ0.39 ± §0.18 (n = 13)
φ0.42 ± §0.17 (n = 30)
Ω NS 0.1930
Formazán (nmol / mg proteína)
φ22.70 ± §11.95 (n = 39)
φ23.53 ± §13.46 (n = 13)
φ23.03 ± §11.85 (n = 30)
Ω NS 0.9766
Ditirosinas (pmol / mg proteína)
φ355.60 ± §176.0
(n = 27)
φ389.30 ± §274.80
(n = 9)
φ430.50 ± §257.40
(n = 21)
Ω NS 0.5238
Carbonilos proteicos (nmol osazonas / mg
proteína)
φ1.19 ± §0.56 (n = 38)
φ1.29.81 ± §0.65 (n = 13)
φ1.09 ± §0.55 (n = 29)
Ω NS 0.5583
Tabla 6. Datos presentados en φ= Promedio. §= Desviación estándar. DT2 = Grupo de diabetes tipo 2. Ω = ANOVA. NS = No significativa.
Se clasificaron los pacientes en tres subgrupos acorde a la concentración inicial de
glucosa en plasma, es decir; en pacientes con glucemia entre 200 – 300 mg / dL, pacientes con
glucemia entre 301 – 400 mg / dL y el tercer grupo con glucemias mayores de 400 mg / dL. El
MDA marcador de lipoperoxidación, se determino en plasma obtenido de la incubación a 37 °C
de la bolsa membrano-porosa que contenía insulina humana recombinante en sangre total de
pacientes con diabetes tipo 2, detectándose menor concentración (9 y 11%) en el grupo con
glucemia de 300 - 400 y en el grupo de glucemia con + 400, respectivamente; comparado con el
grupo con glucemia 200 – 300. La concentración de carbonilos (1.46 ± 0.61 nmol osazonas / mg
proteína) como de formazán (23.20 ± 9.21 nmol / mg proteína) fueron mayores en el grupo con
glucemia 300 – 400, en tanto que la formación de ditirosinas (459.20 ± 216.40 pmol / mg
proteína) se presento en mayores concentraciones en pacientes con glucemias + 400. Al
comparar los subgrupos de acuerdo a la glucemia con ANOVA, no hubo significancia
estadística (NS), como lo muestra la tabla 7.
32
Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in vitro agrupados por glucemia basal.
Grupo DT2 Biomarcador 200 – 300
mg / dL 301 – 400 mg / dL
+ 400 mg / dL
Valor de p
Malondialdehído (nmol MDA / mg materia
orgánica)
φ0.48 ± §0.29 (n = 25)
φ0.44 ± §0.14 (n = 20)
φ0.43 ± §0.23 (n = 12)
Ω NS 0.8080
Formazán (nmol / mg proteína)
φ18.94 ± §9.43 (n = 25)
φ23.20 ± §9.21 (n = 20)
φ21.39 ± §12.05 (n = 13)
Ω NS 0.3655
Ditirosinas (pmol / mg proteína)
φ387.60 ± §277.40
(n = 25)
φ319.40 ± §133.40
(n = 20)
φ459.20 ± §216.40
(n = 12)
Ω NS 0.2321
Carbonilos protéicos (nmol osazonas / mg
proteína)
φ1.11 ± §0.57 (n = 25)
φ1.46 ± §0.61 (n = 18)
φ1.00 ± §0.40 (n = 12)
Ω NS 0.0593
Tabla 7. Datos presentados en φ= Promedio. §= Desviación estándar. DT2 = Grupo de diabetes tipo 2. Ω = ANOVA. NS = No significativa.
La tabla 8 muestra los valores en plasma de los marcadores de estrés oxidativo 4 horas
posteriores a la incubación in vitro, se distribuyeron en subgrupos; de acuerdo al género de los
pacientes. Los valores de MDA en los pacientes masculinos fue 2% ligeramente mayor que en
los pacientes femeninos. La cuantificación de carbonilos en plasma fue 2.5% menor en el grupo
de mujeres comparado con el grupo masculino, al analizar los subgrupos de acuerdo al sexo
con t de student, no hubo significancia estadística (NS). La concentración de formazán en el
grupo femenino fue de 20.49 ± 9.34 nmol / mg proteína mientras que en el grupo masculino fue
de 27.29 ± 14.16 nmol / mg detectándose diferencias significativas (p < 0.05).
Marcadores de estrés oxidativo en plasma 4 horas después de la incubación in vitro concentrados por Genero
Grupo DT2 Biomarcador Femenino Masculino Valor de
p Malondialdehído
(nmol MDA / mg materia orgánica)
φ0.45 ± §0.25 (n = 35)
φ0.46 ± §0.19 (n = 22)
‡ NS 0.8362
Formazán (nmol / mg proteína)
φ20.49 ± §9.34 (n = 25)
φ27.29 ± §14.16 (n = 20)
‡ p<0.05 0.0330
Ditirosinas (pmol / mg proteína)
φ351.50 ± §173.20
(n = 20)
φ299.70 ± §59.63
(n = 17)
‡ NS 0.2486
Carbonilos proteicos (nmol osazonas / mg
proteína)
φ1.19 ± §0.60 (n = 35)
φ1.22 ± §0.52 (n = 20)
‡ NS 0.8398
Tabla 8. Datos presentados en φ= Promedio. §= Desviación estándar. DT2 = Grupo de diabetes tipo 2. ‡= t de student. NS = No significativa.
33
La tabla 9 muestra los valores en plasma de los biomarcadores de estrés oxidativo,
comparando grupo control con pacientes diabéticos. Los valores iniciales (pré-incubación) al
tiempo cero, corresponde a aquellos obtenidos del plasma después de la centrifugación de la
sangre total obtenida por veno-punción de ambos grupos. Los valores de los bio-marcadores
oxidativos relacionados a lesión de proteínas fue significativamente mayor (p < 0.001) en el
grupo de pacientes con diabetes; el total de carbonilos proteicos fue 1.5 veces mayor en el
grupo de diabéticos que en el grupo control (0.99 ± 0.023 ---- 0.65 ± 0.037 nmol de osazonas /
mg proteína, respectivamente); y la formación de ditirosinas se incrementó 2.3 veces más en
diabéticos comparado con grupo control. Después de las cuatro horas de incubación a 37 °C los
valores en los bio-marcadores en ambos grupos se incrementaron: En el grupo control, el
malondialdehído (MDA) la formación de formazán y el total de carbonilos se incrementaron en
54, 97 y 25 % respectivamente; mientras que en el grupo de diabéticos el malondialdehído, el
formazán, las ditirosinas y los carbonilos totales, los valores en plasma se incrementaron a 447,
389, 20 y 19 %, respectivamente. Como se mostró en las tablas 6,7 y 8 los marcadores de
estrés oxidativo en plasma obtenidos de la sangre total de pacientes con diabetes tipo 2
después de las cuatro horas de incubación analizándolos por subgrupos no se evidencio
diferencias entre éstos por lo que fueron agrupados en un solo grupo (DT2) y con ello; los
valores fueron significativamente (p < 0.001) mayores que los reportados en el grupo de
voluntarios sanos.
Marcadores de estrés oxidativo en plasma antes y después de la incubación in vitro. Biomarcador Grupo VS Grupo DT2
0 horas 4 horas 0 hora 4 horas Malondialdehído
(MDA) µM φ6.48 ± §0.63
φ9.99 ± §0.97
(54 %)*
φ6.44 ± §0.32
φ35.22 ± §2.87 ‡p < 0.001
(447 %)* (Formazán nmol / mg proteína)
φ5.17 ± §0.38
φ10.22 ± §0.39
(97 %)*
φ5.56 ± §0.43
φ27.22 ± §1.79 ‡p < 0.001
(389 %)* Ditirosinas
(pmol / mg proteína) φ126.3 ± §12.6
φ126.7 ± §8.04
φ296.8 ± §9.56
φ355.5 ± §29.2 ‡p < 0.001
(20 %)* Carbonilos proteicos
(nmol osazonas / mg proteína) φ0.65 ± §0.037
φ0.81 ± §0.105
(25 %)*
φ0.99 ± §0.023
φ1.18 ± §0.71 ‡p < 0.001
(19 %)* Tabla 9. Datos presentados en φ= Promedio. §= Desviación estándar. ‡= t de student. n = 41 (grupo VS= Voluntarios sanos). n = 60 (grupo DT2 = Diabetes tipo 2). * Incremento en el porcentaje comparando el tiempo cero en el mismo grupo (Voluntarios Sanos vs Voluntarios Sanos y diabéticos vs diabéticos).
34
El motivo por el cual las muestras de sangre entera tanto de pacientes diabéticos como
de voluntarios sanos se incubaron 4 horas a 37 °C, en contacto con la bolsa membrano-porosa
que almacenaba insulina humana recombinante, es debido a que la concentración de la glucosa
fue de 41.4 ± 5.1 mg / dL (figura 1) y con esto se tuvó una viabilidad celular mayor a 90 %
(monitorizando la glucemia en las muestras sanguíneas con un glucómetro digital Accu-Chek®
Sensor (Roche, Mannheim-Germany, y la viabilidad a través del conteo celular por
microscopia); ya que periodos de incubación mayores a las cuatro horas generaban condiciones
de hipoglucemia sostenida.
Consumo de Glucosa
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
Horas
Glu
cem
ia m
g / d
L
Figura 1. Determinación de glucosa en sangre total de voluntarios sanos con intervalos de una hora durante las primeras ocho horas de incubación a 37 °C, n = 11.
Para evaluar que la insulina recombinante humana podía ser modificada por el estrés
oxidativo (grupo control positivo), ésta se incubo in vitro en un medio generador de radicales
hidroxilo a través de la reacción de Fenton; dicha incubación fue a diferentes tiempos (0, 5, 10,
15, 30, 45, 60, 120 y 180 minutos). Primero se demostró que en estos tiempos de incubación la
insulina no se fugaba a través de la membrana-porosa-tubular, ello al cuantificar la proteínas
totales (método de Lowry) en el líquido contenido dentro y fuera de la membrana como lo
muestra la figura 2A. Para revelar que la insulina sufrió cambios bio-químicos (oxidación) por la
exposición a radicales libres se cuantificó el formazan, dentro de la membrana mostrando los
valores a continuación: Basal: 7.46 ± 2.53, 5 minutos: 25.26 ± 14.04, 10 minutos: 33.93 ± 15.45,
15 minutos: 44.80 ± 11.32, 30 minutos: 64.93 ± 24.23, 45 minutos: 81.67 ± 43.72, 60 minutos:
35
93.33 ± 42.95, 120 minutos: 109 ± 44.16 y 180 minutos: 115.70 ± 32.01 nmol / mg proteína
(figura 2B).
Proteínas dentro y fuera de membrana Formazán dentro y fuera de membrana
0 30 60 90 120 150 180
0.0
0.5
1.0
1.5
Dentro de membranaFuera de membrana
n = 4
(A)minutos
mg
pro
teín
a / m
l
0 30 60 90 120 150 180
0
30
60
90
120
Dentro de membranaFuera de membra
n = 4
(B)minutos
nmol
de
Form
azán
/m
g pr
oteí
na
Figura 2A. Cuantificación de proteína (insulina) dentro y fuera de la membrana. Figura 2B. Formación de formazán en insulina nativa incubada in vitro en un medio generador de radicales hidroxilo (reacción de Fenton).
Se determinó la concentración de ditirosinas y carbonilos, dos pruebas que son
especificas de la modificación bio-química de la insulina humana recombinante por los radicales
libres que atravesaron la membrana-porosa y generados por la reacción de Fenton. La
concentración de ditirosinas dentro de la membrana fueron los siguientes: Basal (0 minutos):
0.5708 ± 0.1630; 5 minutos: 1.002 ± 0.3084, 10 minutos: 1.145 ± 0.2112, 15 minutos: 1.299 ±
0.08845, 30 minutos: 2.390 ± 0.7143, 45 minutos: 3.271 ± 0.3859, 60 minutos: 4.947 ± 0.3153,
120 minutos: 6.104 ± 0.4671 y 180 minutos: 7.545 ± 0.7774 nmol / mg proteína (figura 2C).
Mientras que la concentración de carbonilos dentro de la membrana fueron: Basal (0 minutos):
0.1818 ± 0.0230; 5 minutos: 0.4091 ± 0.3105, 10 minutos: 0.7878 ± 0.2099, 15 minutos: 1.636 ±
0.2571, 30 minutos: 2.242 ± 0.8592, 45 minutos: 4.121 ± 0.2777, 60 minutos: 6.302 ± 0.8198,
120 minutos: 12.45 ± 4.987 y 180 minutos: 17.70 ± 5.098 nmol dinitrofenilhidrazonas / mg
proteína (figura 2D).
36
Ditirosinas dentro y fuera de membrana Carbonilos dentro y fuera de membrana
0 30 60 90 120 150 180
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
7.5
Dentro de membranaFuera de membrana
n = 4
(C)minutos
nmol
Diti
rosi
na /
mg
prot
eína
0 30 60 90 120 150 180
0
5
10
15
20Dentro de membranaFuera de membrana
minutos
nmol
Din
itrof
enilh
idra
-zo
nas
/ mg
prot
eína
n = 4
(D)
Figura 2C. Generación de ditirosinas y carbonilos (Figura 2D) dentro y fuera de membrana, a partir de insulina nativa incubada in vitro en un medio generador de radicales hidroxilo (reacción de Fenton).
La figura 3 muestra un incremento significativo (* p < 0.001) de 142 % en la formación
de formazán de la insulina incubada en la plasmas de pacientes con diabetes tipo 2 (160.0 ±
21.07 nmol de formazán / mg proteína) comparado con los valores de 66.08 ± 20.59 nmol / mg
proteína después de la incubación en el grupo de sujetos sanos (pacientes controles). Los
valores control; tanto de insulina nativa (7.46 ± 2.53 nmol / mg proteína) como insulina expuesta
a la reacción de Fenton por 5 minutos (25.26 ± 14.04 nmol / mg proteína) fueron menores que
aquellos reportados en insulina incubada en sangre total por cuatro horas, (* p < 0.05).
Formazán en Insulina
Ins-Nat Ins-VS Ins-DT2 Ins-Fenton
0
50
100
150
200
Grupos
nmol
/ m
g pr
oteín
a
*
* ****
Figura 3. La formación de formazán en la Ins Nat (Insulina Nativa) y por insulina incubada en sangre total de VS
(Voluntarios Sanos), pacientes con diabetes tipo 2 (DT2) y en un medio in vitro generador de radicales hidroxilo
(reacción de Fenton durante 5 minutos). ANOVA * p < 0.001, ** p < 0.01.
37
Significativamente más aductos de ditirosinas fueron formados en la molécula de la
insulina después de la incubación en sangre total de pacientes diabéticos (p < 0.001) que en la
incubación con sangre total de voluntarios sanos. El valor obtenido de ditirosinas después de la
incubación en sangre total de diabéticos fue 1.48 ± 0.62 pmoles / mg proteína, mientras que el
valor hallado de ditirosinas formadas en insulina incubada en sangre total de voluntarios sanos
fue 0.39 ± 0.27 pmoles / mg proteína, como los muestra la figura 4.
Ditirosinas en Insulina
Ins-Nat Ins-VS Ins-DT2 Ins-Fenton
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Grupos
pmol
/ m
g pr
oteí
na * **
Figura 4. Formación de dimeros de tirosina en Ins Nat (Insulina Nativa) y por insulina incubada en sangre total de VS (Voluntarios Sanos), pacientes con diabetes tipo 2 (DT2) y en un medio in vitro generador de radicales hidroxilo (reacción de Fenton por 5 minutos). ANOVA * p < 0.001.
La figura 5 muestra el total de grupos carbonilo formados en la molécula de la insulina
durante la incubación con sangre total de pacientes con diabetes 8.22 ± 0.38 vs 5.2 ± 0.48 nmol
osazonas / mg proteína; el valor obtenido fue 50 % mayor (p < 0.001) comparado con los
valores obtenidos de la incubación con sangre total de voluntarios sanos 5.12 ± 2.73 nmol
osazonas / mg proteína. Casi 10 veces menos grupos carbonilo, fueron formados en la insulina
nativa y en la insulina expuesta a la reacción de Fenton que en la insulina incubada en sangre
total de voluntarios sanos: Los valores de estos controles fueron 0.40 ± 0.158 vs 0.54 ± 0.11
nmol osazonas / mg proteína, respectivamente.
38
Carbonilos en Insulina
Ins-Nat Ins-VS Ins-DT2 Ins-Fenton
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Grupos
nmol
osa
zona
s /
mg
prot
eína
** **
*
Figura 5. Generación significativa de más grupos carbonilo en la molécula de la Ins Nat (Insulina Nativa) y por insulina incubada en sangre total de VS (Voluntarios Sanos), pacientes con diabetes tipo 2 (DT2) y en un medio in vitro generador de radicales hidroxilo (reacción de Fenton por 5 minutos). ANOVA * p < 0.001.
No se detectaron valores altos en la concentración de hierro libre; antes (0 horas) y
después (4 horas) de la incubación de Insulina Humana Recombinante en sangre total de
voluntarios sanos (59.20 ± 34.82 --- 69.80 ± 37.45 Fe++ µg / dL, respectivamente) y en pacientes
con diabetes tipo 2 (58.50 ± 29.27 --- 64.00 ± 29.58 Fe++ µg / dL, respectivamente), los valores
normales fueron entre 65 – 170 µg / dL; utilizando la prueba de t pareada no se encontró
significancia estadística al hacer la comparación intra-grupal, como lo muestra la tabla 10.
Hierro Libre en Plasma
Grupos Antes de incubación 0 hora
Después de incubación 4 horas
Valor de p
Voluntarios Sanos Hierro libre µg / dL
φ59.20 ± §34.82 φ69.80 ± §37.45 NS
Diabetes tipo 2 Hierro libre µg / dL
φ58.50 ± §29.27 φ64.00 ± §29.58 NS
Tabla 10. Determinación de Hierro libre en plasma, antes (0 h) y después (4 h) de la incubación de Insulina Humana Recombinante en sangre total de VS (Voluntarios Sanos) y en pacientes con diabetes tipo 2 (DT2), ‡= t pareada. NS= No significativa.
39
Efecto Hipoglucemiante Pendientes de Consumo Glucosa Figura 6A. Efecto hipoglucemiante de Ins-Nat: Insulina nativa, Sol. Salina: Solución salina y de Ins-DT2: Insulina incubada en sangre total de pacientes con diabetes tipo 2, Ins-VS; Insulina incubada en sangre de voluntarios sanos y en Ins-Fenton: Insulina incubada en un medio generador de radicales libres (reacción de Fenton) en rata. Figura 6B Pendientes del consumo de glucosa en rata.
0 10 20 30 40 50
40
60
80
100
Ins-Nat
Ins-DT2Sol. Salina
Ins-Fenton
Ins-VS
minutos
Glu
cem
ia m
g / d
L
(A)
0 10 20 30 40 50
40
60
80
100
Ins-Nat
Ins-DT2Sol. Salina
Ins-Fenton
Ins-VS
minutos
Glu
cem
ia m
g / d
L
(B)
La figura 6A muestra el efecto reductor de glucemia en rata (hipoglucemia) en la
insulina incubada en sangre total de pacientes con diabetes tipo 2 (DT2), en voluntarios sanos
(VS) o en el medio generador de radicales libres (reacción de Fenton). La insulina incubada en
sangre total de DT2 mostró valores significativamente mayores p < 0.001 (menor eficiencia
biológica) a los 20 minutos (81.83 ± 4.02 vs 74.33 ± 6.56 mg / dL) y a los 50 minutos (68.33 ±
5.09 vs 51.0 ± 3.10 mg / dL) comparado con la insulina incubada en sangre total de VS o en el
medio generador de radicales libres (reacción de Fenton) a los 20 minutos (75 ± 4.98 mg / dL) y
a los 50 minutos 61.33 ± 3.14 mg / dL (p < 0.05). La pendiente del consumo de glucosa se
muestra en la figura 6B, los valores de m fueron: -0.6424 ± 0.05 en la insulina incubada en
sangre total de pacientes DT2, -1.04 ± 0.04 en la insulina nativa, -1.006 ± 0.05365 en la insulina
incubada en sangre total de VS, -0.759 ± 0.06 en la insulina incubada en un medio generador
de radicales libres (reacción de Fenton) y -0.091 ± 0.026 resultado debido a la administración de
solución salina (control) mostrando un valor mayor de m correspondiente a menor o nulo efecto
hipoglucemiante.
VIII. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Una de las pandemias de hoy día es la diabetes, la cual afecta no solo a países
desarrollados sino también a los países subdesarrollados (siendo México uno de éstos). Existe
evidencia in vitro a nivel local (páncreas) de la destrucción de células beta de los islotes
pancreáticos del humano al ser expuestas a la combinación de citocinas (Suarez-Pinzon et al., 1996) y
concentraciones altas de glucosa (Sakai et al., 2003) e inducir incremento en la concentración de
malondialdehído, nitratos y especies reactivas de oxígeno a nivel mitocondrial asociado a una
40
reducción en la producción de insulina: De forma paralela la formación de especies reactivas de
oxígeno a nivel sistémico (plasma) da pie a incremento en las concentraciones de sustancias
reactivas al ácido tiobarbitúrico, dienos conjugados (Collier et al., 1992) y a la modificación química de
proteínas como las lipoproteínas de baja densidad (Pennathur et al., 2001).
El estrés oxidativo, es un estado metabólico que se presenta cuando hay un
desequilibrio entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes, puede generar
potencial daño al tejido: Desafortunadamente dicho estado metabólico no genera signos y
síntomas particulares de este desequilibrio bioquímico en la diabetes, acarreando problemas al
enfermo (ya que no acude al médico para controlar el estrés oxidativo, propiciando mayor
deterioro y progresión de la enfermedad).
La hiperglucemia sostenida y crónica es característica particular de la diabetes tipo 2
(DT2) y generadora de especies reactivas de oxígeno, por lo menos cuatro vías están
involucradas en el daño y perjuicio que la hiperglucemia sostenida induce en los diabéticos: (1)
incrementó en la actividad de los polioles, generando acumulación de sorbitol y fructosa; (2)
aumentó en la formación de productos finales de glicación avanzada; (3) la activación de la
proteina cinasa C y (4) aumentó en el flujo de la vía de hexosaminas (Brownlee M., 2005). Hay muchas
razones para pensar que los estados de hiperglucemia activan todos estos eventos metabólicos
deletéreos a través de un solo proceso; la sobreproducción de superóxido por la cadena de
trasporte de electrones a nivel mitocondrial. Esta teoría (Brownlee M., 2005) parece indicar que la
activación del estrés oxidativo por la hiperglucemia juega un papel principal en la patogénesis
tanto de las complicaciones agudas (Monnier et al., 2006) (Crisis hiperglucemia: Estado de
hiperglucemia hiperosmolar y ceto-acidosis diabética) como complicaciones crónicas
(microangiopatia cardíaca (Kersten et al., 2001), retinopatía (Hartnett et al., 2000), nefropatía (Beisswenger et al.,
2005) y neuropatía (Ziegler et al., 2004)).
El presente trabajo involucró a pacientes con DT2 no controlados ratificado por
hiperglucemia mayor de 300 mg / dL y bajo régimen terapéutico de sulfonilureas o insulina
intermedia (tabla 5), con exclusión de aquellos que estuvieran tratados con biguanidas
(Metformin) y glitazonas (Troglitazona) ya que estos se han reportado con propiedades
antioxidantes (Lida et al., 2003). El estado de estrés oxidativo de pacientes diabéticos sin
complicaciones crónicas (Wolff, 1993), con un proceso infeccioso (Goodyear & Pierce 2002) y con algún
grado de lesión renal (nefropatía diabética) (Vincent et al., 2004) fue corroborado con la detección de
niveles altos de productos oxidativos en plasma de malondialdehído, formazan, ditirosinas y
grupos carbonilo (tablas 6,7,8) y reunidos en un solo grupo al no encontrar diferencias
significativas entre ellos, comparado con niveles menores en plasma de voluntarios sanos (VS)
(tabla 9). Los valores basales incrementados en los bio-marcadores de estrés oxidativo
41
encontrados en los pacientes diabéticos, podría ser explicado por la producción elevada de las
especies reactivas de oxígeno y la disminuida defensa antioxidante (Kedziora-Kornatowska et al., 1998; Rizvi
y Zaid, 2001). Sin embargo, el aumento en la concentración de los bio-marcadores en plasma
después de las cuatro horas de incubación, sugiere un aumento en el estrés oxidativo bajo las
condiciones experimentales in vitro incluso en las condiciones del grupo control, además; los
cambios encontrados en las muestras diabéticas fueron superiores que las muestras de
voluntarios sanos.
Este incremento en la producción de especies reactivas de oxigeno y nitrogeno que
forma parte del estado metabólico de los pacientes con diabetes puede causar lesión a
moléculas esenciales como lipidos, proteínas hasta el DNA; como ejemplos se encuentra la
glicación y oxidación (El-Remessy et al., 2003) de varias proteínas como; la hemoglobina (Jarrett et al., 2001),
albumina (Inaba et al., 2007), insulina (Hunter et al., 2003), lipoproteínas de baja densidad (Cominacini et al., 1994) y
proteínas mitocondriales (Turko et al., 2001), entre otras. La importancia biológica de los datos
presentados aquí se relaciona a las modificaciones químicas in vitro que la insulina sufrió
después de la incubación en sangre entera de pacientes diabéticos. Nosotros consideramos
que la sangre es un medio completo de estrés oxidativo sistémico que involucra sistemas
celulares generadores de ROS (neutrófilos, plaquetas y macrófagos) (Heinecke et al., 1993), productos
de lesión oxidativa (Leo et al., 1997) y proteínas modificadas (Carr et al., 2000), asociado a un sistema
antioxidante compuesto de eritrocitos, enzimas y agentes antioxidantes que estan disminuidos (Firoozrai et al., 2007; Rysz et al., 2007).
Las tres evidencias que muestran la modificación química (in vitro) de la insulina humana
recombinante al incubarla en sangre entera de pacientes con DT2 no controlados son: a) El
aumento en la formación de formazán (figura 3) refleja la hidroxilación de los tres residuos del
fenilalanina en la cadena B por el radical hidroxilo, generando tres nuevos residuos de tirosina (Olivares-Corichi., et al 2005a; Olivares-Corichi ., 2005b). Nuevas hidroxilaciones de estas tirosinas y los cuatro
residuos de tirosina existentes en la molécula de la insulina en la posición 14, 19 y 16, 26 en la
cadena A y B, respectivamente; producen grupos catecol (es decir, 3, 4 dihidroxifenilalanina).
En presencia de iones de metal de transición (como cobre o hierro), los grupos del catecol
generan ortoquinonas, las cuales pueden interactuar con el nitroazul de tetrazolium para
generar el formazán (Gieseg et al., 1993).
La segunda prueba que confirma la oxidación de la insulina es la formación de
ditirosinas (figura 4), el cual es otro evento oxidativo donde las ERO juegan un papel
importante. La formación de dimeros de tirosina requiere una oxidación del electrón de la L-
42
tirosina, generando al radical tirosilo. Cuando dos radicales tirosilo interactúa, el principal
producto es el o-o-ditirosina, un compuesto intensamente fluorescente (Heinecke et al., 1993).
La tercera pieza clave que sugiere modificaciones estructurales en la insulina humana,
fue el aumento en los grupos carbonilo libres (figura 5). De hecho, la cuantificación de grupos
carbonilo es considerado como un marcador de daño oxidativo a proteínas, también llamado
estrés carbonilo (Dalle-Donne et al., 2003). La exposición de grupos carbonilo en la insulina
probablemente se generó por modificaciones estructurales como: a) la oxidación de residuos de
los aminoácidos (como lisina, arginina y prolina) (Amici et al., 1989; Uchida et al., 1990), b) por ruptura de los
enlaces peptídicos en la estructura de la proteína (Garrison 1989), c) por el rompimiento de los
puentes de hidrógeno en la estructura secundaria de la proteína, d) por las reacciones
secundarias (formación de aductos) de alguna cadena lateral de residuos del aminoácido con
productos de lipoperoxidación como 4-hidroxi-2-nonenal y acroleina (Friguet et al., 1994; Medina-Navarro et
al., 2007) y e) por reacciones con carbohidratos reductores (glicosilación) o sus productos de
oxidación (Mullarkey et al., 1990; Miyata 2002).
La actividad de la insulina se demostró reducida, evaluando su efecto hipoglucemiante
en ratas. La insulina modificada por sangre entera de diabéticos es menos eficaz que la insulina
nativa o que la insulina incubada en sangre entera de voluntarios sanos. En las incubaciones
del grupo control con la reacción de Fenton (figuras 2B, 2C, 2D), menos modificaciones fueron
inducidas en la molécula de insulina comparada con aquellos inducidos por la incubación con
sangre de DP. Los valores calculados de las pendientes del efecto del hipoglucemiante de
insulina en las ratas muestra una disminución lenta de la concentración de glucosa en sangre
en ratas que se les administró insulina incubada en sangre de diabéticos o en insulina incubada
con la reacción del fenton (control positivo). Esto sugiere que las modificaciones en la insulina
son causadas por radicales libres producidos in vitro, los cuales fueron suficientes para
disminuir su función (figura 6A, 6B).
Todos estos cambios en la molécula de la insulina no fueron debidos a la liberación de
hierro de la hemoglobina como consecuencia de la hemolisis durante el proceso de incubación
con la sangre de diabéticos como de voluntarios sanos (tabla 10).
En este trabajo, nosotros hemos demostrado por primera vez que la incubación de
insulina con sangre de pacientes diabéticos causa una reducción en la actividad de insulina.
Esto es posible si la sangre es considerada como un completo sistema oxidativo que contiene
generadores de ROS (leucocitos y plaquetas) (Leo et al., 1997), productos de lipoperoxidación,
concentración altas de glucosa, proteínas modificadas y la presencia de un sistema antioxidante
reducido (enzimas eritrocitarias y agentes antioxidante) (Kedziora-Kornatowska et al., 1998; Kimura et al., 2003;
Polidori et al., 2000; Anetor et al., 2002; Rizvi y Zaid, 2001).
43
IX. CONCLUSIONES
En conclusión, el equipo de trabajo desarrollo un modelo experimetal que es novedoso y
factible a desarrollar, que sirve para exponer a la insulina a sustancias (radicales libres,
partículas oxidantes) que se encuentran en un tejido (sangre entera) los cuales son capaces de
modificar la estructura de la hormona.
Ratificamos que los pacientes con diabetes tipo 2 no controlados se encuentran bajo
estrés oxidativo, al comprobar niveles altos de productos de lipoperoxidación (malondialdehído)
y de marcadores de oxidación proteíca (formazán, ditirosinas y carbonilos) en plasma de sangre
periférica.
Demostramos la modificación química de la insulina, al encontrar concentraciones
elevadas de formazán, ditirosinas y grupos carbonilos, cuando la hormona se incubó en sangre
entera de pacientes diabéticos no controlados y en estado de estrés oxidativo.
De manera experimetal (in vitro) evidenciamos el efecto de un medio de estrés oxidativo
(sangre entera de diabéticos no controlados), la cual modificó la actividad biológica de la
insulina humana recombinante, al revelar reducción en el efecto hipoglucemiante.
X. SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTURO
Este trabajo efectivamente evidencio la modificación química de la insulina y la perdida
parcial de su actividad por el estrés oxidativo presente en la sangre de diabéticos, pero es
necesario el desarrollo de investigación a futuro sobre el mecanismo intrinseco de lesión
molecular que sufre la hormona, es decir; evaluar si las modificaciones que sufre la hormona es
debido a que ésta se polimeriza a tavés de la formación de ditirosinas entre dos o más
moléculas de insulina con la implementación de la electroforesis en gel no denaturalizante:
También el analizar si el daño es causado por productos de lipoperoxidación (MDA, 4-hidroxi 2-
nonenal, acroleína), por la nitración de residuos de tirosina o por la glicación de la hormona.
44
Con el mismo modelo desarrollado, evaluar un grupo de diabéticos no controlados que
reciba previamente un suplemento antioxidante, a otro grupo con diabetes y que esten
controlados metabólicamente y un tercer grupo al cual se le agregue a la insulina humana
recombinante un antioxidante (vitamina C, E, piridoxamina) dentro de la bolsa membrano
tubular a incubar en sangre de diabéticos, para determinar si es eficaz la terapia antioxidante in
vivo o in vitro como scavenger de radicales libres y con ello inhibir el daño a la insulina.
Hubiese sido ideal evaluar el efecto de agregación plaquetaria en plaquetas de humano
así como el efecto vasorelajador en anillos de aorta de rata, utilizando la insulina oxidada por la
incubación en la sangre entera de pacientes diabéticos, desafortunadamente la infraestructura y
condiciones financieras del laboratorio de experimentación no propicio un medio satisfactorio
para su realización.
Finalmente, sugerimos que las estrategias a seguir para reducir el estrés oxidante y el
daño a bio-moléculas (insulina) en los pacientes con diabetes es: a) El control de la glucemia (Ceriello et al., 2007) resultando en una producción menor de ERO y consecuentemente en moléculas
oxidativas y b) mejorar la capacidad antioxidante del paciente (Boosalis 2008) con antioxidantes del
tipo piridoxamina, fármaco que ha demostrado ser un potente scavenger de dicarbonilos y de
inhibir la glicación proteica (Chetyrkin et al., 2008; Amarnath et al., 2004).
45
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