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INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EGAS MONIZ

MESTRADO INTEGRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MECANISMOS MOLECULARES ENVOLVENDO A ALFA-SINUCLEÍNA E A SINFILINA-1

Trabalho submetido por Soraya Barbosa Tayob

para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Trabalho orientado por Professor Doutor Alexandre Quintas

fevereiro de 2014

Mecanismos Moleculares envolvendo a alfa-Sinucleína e a Sinflina-1 na Doença de Parkinson !

! 2!

Agradecimentos

Ao meu orientador, Professor Alexandre Quintas, pela sua disponibilidade, apoio,

compreensão e paciência ao longo da realização deste trabalho. Que sem a sua ajuda

não seria possível terminar esta etapa.

Ao meu querido Pai, porque sem ele nada disto seria possível. Muito obrigado Pai, por

tudo. Por tornares tudo possível. Por fazeres com que fosse possível concluir o Grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas. Obrigado. A um pai extraordinário.

À minha Mãe por todo o apoio. Porque ‘’Quem tem mãe tem tudo’’. Obrigado por seres

a melhor mãe que alguma vez poderia ter desejado.

Ao Luís Timóteo Ramos, pela paciência infindável, pelo apoio, pela força e por

acreditar em mim. Sempre. Espero ter a oportunidade de retribuir todo o apoio.

Aos meus amigos, que me acompanharam durante estes anos. Fizeram com que fossem

uns anos maravilhosos.

‘’Souvent il m'arrivait

Devant mon chevalet

De passer des nuits blanches

Retouchant le dessin’’

Charles Aznavour

!

Resumo

3!

Resumo

A Doença de Parkinson (DP) é a patologia neurodegenerativa mais prevalente logo a

seguir à doença de Alzheimer, afectando 1% dos indivíduos com idades superiores a 60

anos. A DP é caracterizada, clinicamente, por severos sintomas motores incluindo

tremor, rigidez muscular, instabilidade postural e bradicinesia. Uma das principais

características é a presença de Corpos de Lewy associada a uma perda substancial dos

neurónios dopaminérgicos na substância nigra pars compacta.

A DP é uma doença multifactorial de etiologia desconhecida, em que tanto os

factores genéticos como os ambientais têm uma influência notória. Diversos

mecanismos patogénicos podem estar envolvidos na patogénese da DP, incluindo um

aumento excessivo dos níveis de stress oxidativo e disfunções a nível da mitocôndria,

associado à presença de proteínas misfolding e alterações no sistema ubiquitina-

proteassoma assim como no sistema autofagia-lisossoma.

A DP permanece incurável, sendo a farmacoterapia com levodopa a mais eficaz no

controlo da sintomatologia e considerada a terapêutica de primeira linha. Ainda não é

possível abrandar ou parar o processo degenerativo característico da DP através da

terapêutica farmacológica disponível.

A alfa-Sinucleína, uma pequena proteína expressa no cérebro, é um dos principais

componentes dos Corpos de Lewy. A alfa-Sinucleína encontra-se ulfolded no seu estado

nativo e pode ter um papel importante a nível da transmissão sináptica e na fisiologia

dos neurónios dopaminérgicos. Pensa-se que esta proteína está fortemente relacionada

com a patogénese da DP e a toxicidade induzida pela alfa-Sinucleína pode envolver

diversos mecanismos, como a agregação ou interacção com outras proteínas e

moléculas, incluindo a Sinfilina-1.

A Sinfilina-1 é uma proteína citoplasmática que se localiza perto das vesículas

sinápticas e colocaliza-se com a alfa-Sinucleína dentro dos Corpos de Lewy. A

Sinfilina-1 interage tanto in vitro como in vivo com a alfa-Sinucleína promovendo a sua

agregação, o que pode influenciar a formação dos Corpos de Lewy nos neurónios.

Palavras-Chave : alfa-Sinucleína, Sinfilina-1, Doença de Parkinson, Neurodegeneração


! 4!

Abstract

Parkinson’s Diesease is one of the most common neurodegenerative diseases,

affecting 1% of individuals over 60 years old. PD is characterized clinically by severe

motor symptoms including uncontrollable resting tremor, muscular rigidity, postural

instability, and bradykinesia. The pathological hallmarks are the presence of Lewy

bodies and massive lost of dopaminergic neuros in the pars compacta of the substantia

nigra.

PD is a multifactorial disease with unknow etiology, in which both genetic and

environmental factors play importante roles. Various pathogenic mechanisms may be

involved in pathogenesis of PD including abnormally increased oxidative stress and

mitochondrial dysfunction, together with protein misfolding and impairments in the

ubiquitin–proteasome and autophagy-lysosomal systems.

PD remains a uncurable disease, pharmacotherapy with levodopa represents an

effective symptomatic recourse and remains a clinical gold standard treatment for PD,

however, any currently available therapies could slow our stop the degenerative process

in PD brain.

The major component of Lewy body is alpha-synuclein, a small protein which is

widely expressed in the brain. Alpha-sinuclein is natively unfolded protein whitch may

have an important role in sinaptic transmission and dopaminergic neuron physiology.

This protein is thought to be critically implicated in PD pathophysiology and the

mechanism by which alpha-sinuclein induces neuronal cell toxicity may involve

multiple pathways, such as aggregation or interaction with other proteins and molecules,

including synphilin-1.

Synphilin-1 represents a cytoplasmatic protein that localizes close to synaptic

vesicles and colocalizes with alpha-synuclein into Lewy bodies. Synphilin-1 interacts

both in vitro and in vivo with alpha-synuclein promoting its agregation, witch may have

implications for Lewy bodies formation in neural cells.

Keywords : Alpha-synuclein, Synphilin-1, Parkinson’s Disease, Neurodegeneration

Índice Geral

5!

Índice Geral

Agradecimentos

Resumo

Abstract

Índice Geral

Índice De Figuras

Índice De Tabelas

Abreviaturas

1. Introdução

1.1. Doença De Parkinson

1.1.1. Aspectos Históricos

1.1.2. Fisiopatologia

1.1.3. Indutores e Mecanismos da Génese da Doença de Parkinson

1.1.3.1. Stress Oxidativo

1.1.3.2. Disfunção Mitocondrial

1.1.3.3. Disfunção do Sistema Ubiquitina-Proteassoma

1.1.4. Mecanismos Moleculares

1.1.4.1. Factores Ambientais

1.1.4.2. Factores Genéticos

2. Diagnostico e Farmacoterapia na Doença de Parkinson

2.1. Quadro Clínico e Diagnostico da DP

2.2. Terapêutica Farmacológica na Doença de Parkinson

3. Mecanismos Moleculares da Doença de Parkinson Envolvendo a alfa-

Sinucleína e a Sinfilina1

3.1. alfa-Sinucleína

3.1.1. Estrutura e Localização

3.1.2. Funções da alfa-Sinucleína

3.1.3. Envolvimento na doença de Parkinson

3.2. Sinfilina-1

3.2.1. Estrutura e Localização

3.2.2. Funções da Sinfilina-1

3.2.3. Envolvimento na doença de Parkinson

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3.3. Interacção da alfa-Sinucleína com a Sinfilina-1

3.4. Agregação Proteica e a Formação de Corpos de Inclusão : Toxicidade ou

Neuroprotecção?

4. Considerações Finais

5. Referências Bibliográficas

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Índice de Figuras

7!

Índice De Figuras Figura 1 - Anatomia e Fisiologia da DP

Figura 2 - Alterações da Mitocôndria.

Figura 3 - Via da Ubiquitina-Proteassoma

Figura 4 - Mecanismos Neurodegenerativos

Figura 5 - Representação Esquemática do Metabolismo Do MPTP

Figura 6 - Representação Esquemática do Metabolismo Do MPP+.

Figura 7 - Representação Esquemática da Estrutura da α-Syn

Figura 8 - Representação Esquemática do Processo de Agregação da α-Syn

Figura 9 - Proposta de Modelo da Toxicidade da α-Syn

Figura 10 - Visão Esquemática da Sinfilina-1

Figura 11- Representação Esquemática da Sinfilina-1 e da Sinfilina-1A

Figura 12 - Representação Esquemática da Interacção entre a α-Syn e a Sinfilina-1

Figura 13 - Representação Esquemática da Formação de Corpos de Inclusão em

Modelos Celulares da DP

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! 8!

Índice De Tabelas

Tabela 1 - Resumo dos Genes Envolvidos na DP 35!

Tabela 2 - Critérios de Diagnóstico da DP 37!

Tabela 3 - Fármacos Agonistas dos Receptores de Dopamina 41!

Abreviaturas

9!

Abreviaturas !AADC - Descarboxilase Dos Aminoácidos L-Aromáticos Ach- Acetilcolina (do inglês Acetylcholine)

BHE- Barreira Hematoencefálica

cI- Complexo I

CL- Corpos de Lewy

CMA- Autofagia Mediada por Chaperonas (do inglês Chaperone-mediated autophagy

COMT%&%Catecol-O-Metiltransferase%

CTE – Cadeia Transportadora de Electrões

DAT- Transportadores de Dopamina (do inglês dopamine active transporter)

DP- Doença de Parkinson

GPi- Globo Pálido Interno

GSH%&%!Glutationa!(do!inglês!Glutathione)!

GSK3B- Glicogénio Quinase-3-� (do inglês Glycogen synthase kinase 3 beta)

L&dopa%&%Levodopa!

NOS- Óxido Nítrico Sintetase (do inglês nitric oxide synthase)

PP2A%& Proteína Fosfatase 2A%

Pu- Putamên

ROS- Espécies Reactivas de Oxigénio (do inglês Reactive Oxygen Species)

SNC- Sistema Nervoso Central

SNpc- Substância nigra pars compacta

SOD- Superóxido Dismutase

SUP- Sistema Ubiquitina-Proteassoma

Th- Tálamo (do inglês Thalamus)

VMAT- Transportadores Vesiculares de Monoamina (do inglês vesicular monoamine

transporter)

WT%–%Wild-Type1

α-Syn- alfa-Sinucleína (do inglês Alpha-Synuclein)


! 10!

1. Introdução

1.1 Doença De Parkinson

A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurológica crónica e progressiva

associada a uma perda substancial de neurónios dopaminérgicos da substancia nigra

pars compacta (SNpc) e outras alterações complexas que conduzem ao aparecimento

de diversos sintomas motores e não-motores (Perfeito, Cunha-Oliveira, & Rego, 2012).

É a segunda doença neurodegenerativa mais comum, apresentando um risco de 1% após

os 60 anos e que aumenta até 4% após os 80 anos (Dexter & Jenner, 2013; Lau &

Breteler, 2006). Tanto a incidência como a prevalência da doença aumentam com a

idade, contudo, são ligeiramente superiores no sexo masculino (F. J. S. Lee & Liu,

2008).

Na Europa, a prevalência varia desde 65.6/100.000 a 12500/100.00 sendo a

incidência anual de 5/100 000 a 346/100 000 (Pereira, 2011; von Campenhausen et al.,

2005).

!

1.1.1 Aspectos Históricos

Apesar de já ser conhecida previamente na antiga Índia pelo nome de ‘’Kampavata’’,

a Doença de Parkinson foi descrita pela primeira vez numa monografia, em 1817, por

James Parkinson no seu estudo ‘’An Essay on the Shaking Palsy’’ (Corti, Lesage, &

Brice, 2011; Teive, 1998). James Parkinson intitula a efemeridade como ‘’Paralisia

Agitante’’ e caracteriza a doença pela presença de movimentos trémulos involuntários,

com diminuição da força muscular, com tendência para a inclinação do tronco para a

frente e com alteração da marcha, sendo os sentidos e o intelecto não afectados

(Parkinson, 2002; Teive, 1998).

‘’Involuntary tremulous motion, with lessened muscular power, in parts not in

action and even when supported; with a propensity to bend the trunk forwards, and to

pass from a walking to a running pace: the senses and intellects being

uninjured.’’(Parkinson, 1817, 2002)

No entanto, foi Jean-Martin Charcot, considerado o pai da Neurologia, que teve um

contributo extraordinário na definição clínica da Doença de Parkinson. Primariamente,

Introdução

11!

foi Jean-Martin Charcot quem sugeriu a mudança de nome para Doença de Parkinson

em homenagem à descrição clássica de James Parkinson. Por outro lado, Charcot

definiu a presença dos sinais mais comuns da doença: tremor, bradicinesia, rigidez e

dificuldade do equilíbrio. Apresentando os critérios para o diagnóstico diferencial da

doença. Por fim, em 1877, Charcot prescreve a primeira terapêutica para a DP, a

hioscinamida, um percussor dos alcaloides da beladona com propriedades

anticolinérgicas (Teive, 1998).

Em 1888, Gowers publica o livro ‘’Manual of Diseases of the Nervous System’’ onde

descreve a sua experiencia com 80 pacientes com a Doença de Parkinson. Gowers nota

que existe uma predominância masculina na incidência da doença, com idades

compreendidas entre 50-60 anos e observou que cerca de 15% dos seus pacientes tem

uma forte história familiar, referindo pela primeira vez a vertente genética da Doença de

Parkinson (C. Goetz, Chmura, & Lanska, 2001; J.William Langston, 2002; Pearce,

1989).

Brissaud, em 1895, comenta ‘’a lesion of the locus niger could very well be the

anatomical basis of Parkinsons disease’’, referindo o envolvimento do mesencéfalo na

DP (C. Goetz et al., 2001; Pearce, 1989). Contudo foi Trétiakoff, em 1919, quem

confirmou a hipótese de Brissaud ao estudar a substância nigra do cérebro de 54

pacientes dos quais 9 sofriam da Doença de Parkinson. Trétiakoff notou que em todos

os casos com DP havia uma notória diminuição da substância negra mesencefálica

(Parent & Parent, 2010). Trétiakoff também encontrou, no cérebro dos pacientes com

DP, umas inclusões concêntricas no citoplasma dos neurónios da substância negra, aos

quais denominou de Corpos de Lewy (CL) em homenagem a Friedrich Lewy que

descreveu estas inclusões plasmáticas pela primeira vez em 1913 (Parent & Parent,

2010; Pearce, 1989). Por volta de 1953, Greenfield e Bosanquet forneceram a mais

completa análise patológica da DP e das lesões a nível cerebral (C. Goetz et al., 2001;

C. G. Goetz, 2011).

Em 1967, Hoehn e Yahr, descrevem a morbilidade e evolução clínica da doença,

desenvolvendo a escala de Hoehn e Yahr que indica o estado geral do paciente (C. G.

Goetz, 2011). A escala de HY, originalmente, dividia-se em 5 estágios : nos estágios I,

II e III considerava-se que o doente apresentava uma incapacidade de leve a moderada,

enquanto que nos estágios IV e V a incapacidade do doente era classificada como mais

grave (Goulart & Xavier, 2005).


! 12!

O estudo farmacológico e bioquímico da DP começou na época de 1960’s com

Ehringer e Hornykiewicz a documentarem a perda de dopamina no tecido estriado do

cérebro em pacientes com Doença de Parkinson. Pouco tempo depois, Barbeau testa o

tratamento com Levodopa (L-dopa) per os e Birkmater e Hornykiewicz testam,

independentemente, o uso de L-Dopa por via intravenosa (C. G. Goetz, 2011).

Introdução

13!

1.1.2 Fisiopatologia

A Doença de Parkinson é caracterizada por uma diminuição progressiva dos

neurónios da substância nigra pars compacta com a presença de depósitos de proteínas

no citoplasma dos neurónios (CL). Aquando da morte do paciente, a SNpc apresenta

uma perda de cerca de 50-70% comparando com a mesma região em indivíduos

saudáveis (Davie, 2008; Rodrigues & Campos, 2006).

Na fase inicial da doença, estágio 1 e 2, ocorrem alterações a nível do bulbo olfactivo

e da medula oblonga, neste estágio inicial o paciente apresenta-se num estado pré-

sintomático. À medida que a doença progride, a SNpc e outras regiões do cérebro como

o mesencéfalo, o prosencéfalo basal e o neocortex são afectadas, atingindo-se os

estágios 3 e 4 da DP (Davie, 2008).

A perda de células dopaminérgicas conduz directamente a uma diminuição dos

níveis de dopamina na SNpc (Khatri & Chaudhry, 2009). A diminuição de dopamina

leva a uma activação reduzida dos seus receptores provocando uma redução da inibição

da via indirecta e uma diminuição da excitação da via directa. A inibição reduzida da

via indirecta provoca uma inibição excessiva do globus pallidus pars externa, a

desinibição dos gânglios da base e um aumento da excitação dos neurónios do globus

pallidus pars interna e da substância nigra pars compacta, ao passo que a diminuição

da activação da via directa causa uma diminuição da sua influência inibitória sobre o

globus pallidum pars interna e sobre a substância nigra pars compacta (Bartels &

Leenders, 2009; Obeso & Rodriguez-Oroz, 2000). Resultando numa actividade

excessiva do corpo estriado que provoca uma aferência contínua de sinais excitatórios

para o controlo motor córtico-espinhal, o que resulta num desequilíbrio entre o sistema

excitatório e inibitório comprometendo o controlo motor, conduzindo ao aparecimento

das características da DP (Bartels & Leenders, 2009).


! 14!

Figura 1- Anatomia E Fisiologia Da DP. Esquema simplificado dos circuitos neuronais envolvendo o

núcleo da base, o tálamo (Th) e o córtex e as alterações sofridas por estas estruturas na DP. Apenas está

representada a via directa que em, condições normais, (esquerda) facilita os movimentos, contudo, na DP,

encontra-se atenuada (direita). A SNpc fornece os estímulos dopaminérgicos (Input Dopaminérgico) ao

putamên (Pu), o que leva á excitação da via directa. O Pu inibe (vermelho) o globo pálido interno (GPi)

que consequentemente inibe o Th. O Th envia estímulos excitatórios (verde) para o córtex motor. Na DP,

a degeneração da SNpc conduz a uma inibição dos estímulos tálamo-corticais. A via indirecta (não

representada) é inibida pelos estímulos dopaminérgicos e, em condições fisiológicas, reprime os

movimentos, contudo, a actividade desta via encontra-se aumentada na DP. (Adaptado de Shulman, De

Jager, & Feany, 2011)

Como já foi referido anteriormente, a presença de CL, inclusões citoplasmáticas

eosinofílicas com núcleos densos rodeados por filamentos radiados, é característico da

DP. Os CL são formados por diversas proteínas como a ubiquitina e a alfa-Sinucleína

(α-Syn) entre outras, estas podem estar homogeneamente distribuídas ou haver uma

concentração de ubiquitina no centro dos CL e de α-Syn na periferia o que é consistente

com a hipótese de formação de depósitos pela α-Syn (Tatsch, Nitrini, & Neto, 2002).

Os CL são depositados em diferentes partes dos cérebro consoante a progressão da

DP. No estágio inicial da DP as lesões aparecem no núcleo dorsal motor IX/X e na

zona reticular intermediaria, havendo uma extensão das lesões à medida que a doença se

desenvolve acabando por atingir, numa fase mais avançada da DP (estágios 4, 5 e 6) o

neocortex. O estágio 2 da DP acrescenta lesões a nível do núcleo reticular giantocelular

e do complexo coeruleus-subcoeruleus. As lesões na substância nigra pars compacta

relacionam-se com a DP no estágio 3 assim como outras lesões a nível do mesencéfalo.

No estágio 4 as lesões atingem o prosencéfalo, o mesocortex temporal e o alocórtex. O

Introdução

15!

neocortex só é afectado no estágio 5 juntamente com o neocortex pré-frontal. Por fim,

no estágio 6 da DP observam-se lesões a nível do neocortex e nas áreas pré-motoras

associadas as funções sensoriais (Leong, Cappai, Barnham, & Pham, 2009).

Apesar de o papel destas inclusões na patogénese da DP não estar totalmente

esclarecido, a descoberta da α-Syn como um dos compostos principais dos filamentos

radiados nos CL veio alterar o ponto de vista sobre a formação e o papel dos destes nos

processos neurodegenerativos. Levando à formulação de novas prespectivas

fisiopatologicas sobre a progressão da DP e a sua classificação como uma

Sinucleinopatia (Dexter & Jenner, 2013).


! 16!

1.1.3 Indutores e mecanismos da génese da Doença de Parkinson

1.1.3.1 Stress Oxidativo

O stress oxidativo resulta da eliminação insuficiente das espécies reactivas de

oxigénio (ROS) geradas por diversas reacções bioquímicas. Em condições fisiologicas

são eliminadas pelos sistemas antioxidantes intracelulares que podem estar afectados

em condições patogénicas ou com o envelhecimento natural (Gómez-Chavarín, Roldan-

Roldan, Morales-Espinosa, Pérez-Soto, & Torner-Aguilar, 2012).

Os neurónios dopaminérgicos estão especialmente expostos ao stress oxidativo

devido ao metabolismo da dopamina que origina diversas moléculas que actuam como

toxinas endógenas se não forem eliminadas correctamente. A dopamina possui duas

vias de oxidação : (1) Pode sofrer auto-oxidação ao reagir com o oxigénio a pH neutro e

originando espécies dopamina-quinona tóxicas, radicais superóxidos e peroxido de

oxigénio; ou (2) Ser metabolizada pela MAO em DOPAC (um metabolito não tóxico) e

em peroxido de oxigénio (Levy, Malagelada, & Greene, 2009) .

Apesar do superóxido não ser uma molécula altamente reactiva, pode ser convertida

em peroxido de oxigénio pela oxigénio dismutase ou em radicais peroxinitrito na

presença de óxido nítrico. O peroxido de oxigénio por sua vez pode ser convertido em

radicais hidroxilo tóxicos através da Reacção de Fenton que ocorre em presença de

elevados níveis de ferro, cujas concentrações são bastante elevadas na SNpc (Teive &

Menezes, 2003). As ROS provocam alterações funcionais a nível das proteínas, lípidos

e DNA (Levy et al., 2009). Os danos a nível dos lípidos, por sua vez, levam a um

aumento da permeabilidade da membrana a iões, tal como o cálcio que podem vir a

promover a exotoxicidade (Lotharius & Brundin, 2002).

Como a dopamina citoplasmática pode formar espécies reactivas de oxigénio muito

rapidamente, tem de ser sintetizada ou transportada do espaço extracelular para o

interior da célula e armazenada no interior das vesículas sinápticas (Jenner, 2003).

Assim, são várias as circunstâncias que vão levar a um aumento dos níveis de stress

oxidativo e consequentes danos celulares a nível do SNC : (a) O aumento dos níveis de

dopamina; (b) Deficiência em glutationa (GSH) que provoca a diminuição da

capacidade do cérebro para eliminar o peroxido de oxigénio; (c) Um aumento dos

depósitos de ferro; (d) Danos no DNA; (e) Peroxidação dos lípidos (C. Olanow &

Tatton, 1999).

Introdução

17!

Na DP todas as células da SNpc aparentam estar sob um elevado estado de stress

oxidativo (Gómez-Chavarín et al., 2012). De facto, diversos estudos post-mortem em

cérebros de indivíduos com DP revelaram elevados níveis de ferro, GSH diminuída e

danos oxidativos nos lípidos, proteínas e DNA (C. Olanow & Tatton, 1999)

Outra evidência de ocorrência de stress oxidativo na DP, surge aquando dos estudos

sobre o parkinsonismo induzido pelo MPTP, que através da redistribuição de dopamina

no citoplasma, promove o aumento do stress oxidativo (Di Monte, 2001; Lotharius &

Brundin, 2002). Também os pesticidas rotenona e paraquato, demonstraram alterar os

níveis de dopamina no citoplasma e consequente aumento do stress oxidativo (Gómez-

Chavarín et al., 2012). Estes factos sugerem que os factores ambientais podem, também,

estar envolvidos no aumento do stress oxidativo.

Contudo, a origem dos elevados níveis stress oxidativo a que o SNC esta exposto na

DP continua a ser bastante controversa. No entanto, é claro que a acumulação de ferro

no SNC leva a alterações na actividade dos canais de cálcio, altera a proteólise e

provoca alterações a nível da agregação da α-Syn. Todas estas ocorrências enfatizam a

natureza diversa das causas de morte celular na DP e também o contributo do stress

oxidativo nos mecanismos neurodegenerativos (Dexter & Jenner, 2013).

1.1.3.2 Disfunção Mitocondrial

A mitocôndria é um organelo citoplasmático essencial para diversos mecanismos

celulares incluindo a produção de ATP, regulação de ROS, homeostase do cálcio e o

controlo da apoptose (Fujita et al., 2013). Na sua organização estrutural, apresenta duas

membranas, interna e externa, envolvendo uma matriz. Na membrana mitocondrial

interna está localizada a cadeia transportadora de electrões (CTE), constituída por cinco

complexos I-V, onde ocorre a produção de energia através do fluxo de electrões e

consequente fosforilação oxidativa (fonte principal de energia das células eucarióticas)

(Nasseh & Tengan, 2001).

Devido ao processo de fosforilação, as mitocôndrias são a principal fonte celular de

radicais livres, pois este mecanismo ocorrente na CTE promove a formação de espécies

extremamente reactivas, nomeadamente os radicais superóxidos gerados no complexo I

(cI). A inibição deste complexo provoca a depleção de ATP e danifica todos os

mecanismos celulares dependentes de ATP, promovendo a formação de radicais livres e

consequentemente, o aumento do stress oxidativo (Júnior & Aguiar, 2007). Estas


! 18!

espécies reactivas de oxigénio, geradas pela CTE, concomitantemente com os danos nas

membranas celulares, são a causa mais frequente de mutações a nível do DNA

mitocondrial (mtDNA) e provocam também o aumento de proteínas misfolded,

contribuindo para danos a nível do Sistema Ubiquitina-Proteassoma (SUP) (Buneeva &

Medvedev, 2011; Dauer & Przedborski, 2003; Levy et al., 2009)

A disfunção mitocondrial é, assim, caracterizada por (a) Alterações na CTE

resultando num aumento das espécies reactivas de oxigénio e consequente aumento do

stress oxidativo (Hastings, 2009); (b) Produção insuficiente de ATP (Levy et al., 2009);

(c) Activação das caspases (proteínas essenciais na regulação da apoptose) (Levy et al.,

2009).

Na DP, diversas evidências sugerem uma disfunção no complexo I, havendo uma

redução da actividade deste complexo na SNpc (Levy et al., 2009). O recurso a modelos

utilizando DNA mitocondrial de indivíduos com PD esporádica demonstrou uma

reduzida actividade do complexo I, implicando uma procedência de alterações no

mtDNA, contudo, não foram demonstradas alterações consistentes no mtDNA (Dexter

& Jenner, 2013; Gu, Cooper, Taanman, & Schapira, 1998).

Uma outra evidência da disfunção mitocondrial na DP está relacionada com o

MPTP, pois após a administração, este composto vai interferir com a CTE inibindo o

complexo I com uma consequente diminuição dos níveis de ATP e aumento do stress

oxidativo (Dauer & Przedborski, 2003; Koller, Vetere-Overfield, & Gray, 1990). O

mecanismo deste composto será explicado no próximo capítulo. Um outro composto

tóxico relacionado com a disfunção mitocondrial é a rotenona, um pesticida que

também interfere com a CTE (Levy et al., 2009).

A manutenção da homeostase mitocondrial através da mitofagia envolve diversos

factores que controlam diversos processos abrangendo desde a fusão e fissão da

mitocôndria até à mobilidade. Estes processos aparentam estar fortemente relacionados

com as proteínas envolvidas nas formas esporádicas e familiares da DP (Fujita et al.,

2013). Diversas mutações relacionadas com a DP foram associadas com alterações da

função da mitocôndria. Estas mutações podem levar a uma alteração da localização das

proteínas na mitocôndria, anomalias estruturais e funcionais e modificações na CTE

(Dexter & Jenner, 2013).

Deste modo, são várias as proteínas associadas a DP familiar que estão relacionadas

com a mitocôndria, com destaque para a PINK1 e Parkina. A actividade quinase da

PINK1, tendo como alvos as proteínas Parkina, HTR2 e TRAP1, controla o turnover

Introdução

19!

mitocondrial e tem funções de protecção contra o stress oxidativo e, por outro lado, a

mitofagia é impulsionada pela translocação da Parkina do citosol para a mitocôndria

mediada pela PINK1 (Chan et al., 2011; Matsuda, Sato, & Shiba, 2010; Plun-Favreau,

Klupsch, & Moisoi, 2007; Pridgeon, Olzmann, Chin, & Li, 2007). Também a mitofagia

e o controlo transcricional da biogénese da mitocôndria estão dependentes da actividade

da ligase de ubiquitina E3 da Parkina. A Parkina é uma proteína que esta associada à

membrana mitocondrial externa e actua atrasando o swelling mitocondrial e

consequente libertação do citocromo c e activação da caspase 3, a perda desta função

em pacientes com mutações no gene Parkina parece contribuir para a degeneração dos

neurónios dopaminérgicos (Darios, Corti, & Lücking, 2003). Ratinhos knockout para a

Parkina e PINK1 demonstraram uma reduzida função respiratória mitocondrial

concomitantemente com uma morfologia não alterada da mitocôndria e sem sinais de

neurodegeneração, contudo, ambos os animais mutados expressaram elevados níveis de

stress oxidativo (Levy et al., 2009).

Os genes associados à DP familiar parecem estar relacionados, também, com a

produção de ROS pela mitocôndria. A deficiência em PINK1 altera a homeostase do

cálcio e os mecanismos de respiração mitocondrial (Gandhi et al., 2009; Yao et al.,

2011). Consequentemente, a diminuição dos níveis de cálcio e o aumento de ROS

podem alterar a permeabilidade da membrana exterior da mitocôndria conduzindo à

degeneração celular (Gandhi et al., 2009).

Estudos sugerem que as funções da proteína DJ-1 estão associadas ao complexo

PINK1-Parkina na manutenção da função mitocondrial na presença de stress oxidativo

(Thomas et al., 2011). A proteína DJ-1, no seu estado oxidado, parece ter um efeito

protector contra o stress oxidativo enquanto a PINK1 localiza-se na matriz mitocondrial

e desempenha funções de protecção contra a apoptose, efeito que se encontra reduzido

nas mutações associadas à DP (Kim et al., 2005; Petit et al., 2005; Silvestri et al., 2005).

Também a α-Sinucleína parece estar relacionada com a mitocôndria, num estudo

realizado em ratinhos transgénicos, o aumento da expressão de α-Syn comprometeu a

função mitocondrial, aumentado o stress oxidativo e a toxicidade do MPTP (Song,

Shults, Sisk, Rockenstein, & Masliah, 2004).


! 20!

Figura 2 - Alterações Na Mitocôndria. As alterações a nível da mitocôndria são observadas em diversas

doenças neurodegenerativas. Inibidores do complexo I, como o MPTP e a rotenona, causam sintomas

semelhantes aos da DP. Para além disso, proteína envolvidas nas formas familiares da DP, como a

LRRK2, a α-Syn, a Parkina, a DJ-1 e a PINK-1 encontram-se associadas à membrana externa (ME) da

mitocôndria e estão envolvidas na produção de ROS. A HTRA, uma outra proteína que se encontra

mutada na DP familiar, localiza-se no espaço intramembranar (EIM) e pode estar envolvida no

processamento proteólico das proteínas mitocondriais. Mutações nos mecanismos de fissão e fusão

mitocondrial podem causar doenças neurodegenerativas e, de facto, as proteínas PINK-1 e Parkina

parecem estar envolvidas na fissão mitocondrial, para além do seu papel nas funções normais da

mitocôndria. (Adaptado de Knott, Perkins, Schwarzenbacher, & Bossy-Wetzel, 2008)

!!!!!!!!!

Introdução

21!

1.1.3.3 Disfunção do Sistema Ubiquitina-Proteassoma

Em células como os neurónios, os sistemas de degradação de proteínas danificadas

ou misfolded assumem um papel de elevada importância de forma a manter a

homeostase. A disfunção destes sistemas de controlo de qualidade das proteínas, como

o SUP, especialmente na sinapse podem levar a acumulação de proteínas, como a α-

Syn, que por sua vez interferem com as funções sinápticas, o que proporciona a

formação de agregados tóxicos ou a alterações perniciosas no metabolismo energético

(Fujita et al., 2013).

O SUP é essencial para a degradação de proteínas danificadas nas células

eucarióticas (Ross & Pickart, 2004). O mecanismo de degradação de proteínas pelo

SUP é um processo que envolve diversas reacções mediadas por enzimas e através de

moléculas de ubiquitina (Mcnaught, Olanow, Halliwell, Isacson, & Jenner, 2001). A

proteína danificada é identificada e sinalizada por moléculas de ubiquitina, que se ligam

de forma covalente à proteína, para posterior degradação (Betarbet, Sherer, &

Greenamyre, 2005).

Primariamente a ubiquitina é activada, por um mecanismo dependente de ATP, pela

E1 (enzima activadora da ubiquitina), seguidamente a proteína alvo liga-se à enzima E2

(enzimas conjugadoras de ubiquitina), sendo uma reacção catalisada pela enzima E3

(ligase de ubiquitina-proteína), formando um conjugado proteína-ubiquitina que é

posteriormente reconhecido e degradado pelo proteassoma S26 (Figura 3) (Mcnaught et

al., 2001; Pickart & Eddins, 2004).


! 22!

!Figura 3 - Via da Ubiquitina-Proteassoma. Na sequência do processo pela enzima UCH, a ubiquitina é

conjugada com um substrato específico (vermelho) numa cadeia poliubiquitinada. A cadeia

poliubiquitinada direcciona o substrato para o proteassoma S26, constituído por um complexo proteolítico

20S e dois complexos reguladores 19S. A cadeia polipeptidica é desenrolada e mobilizada para dentro do

complexo 20S. O substrato é hidrolisado em pequenos péptidos enquanto a ubiquitina é reciclada. As

enzimas E1, E2 e E3 são respectivamente activadoras da ubiquitina, conjugadoras de ubiquitina e ligases

da ubiquitina. (Adaptado de Ross & Pickart, 2004)

A presença de diversas proteínas nos CL, incluindo a α-Syn, levou à formulação da

hipótese de que o catabolismo das proteínas danificadas ou mutadas poderia estar

alterado, provocando a agregação celular e a morte dos neurónios. O SUP passou, então,

a ser considerado como uma das causas prováveis da fisiopatologia da DP (Dexter &

Jenner, 2013; Onyango, 2008). O envolvimento do SUP na DP é, também, suportado

pela descoberta de mutações nas proteínas Parkina e UCH-L1, pois estas proteínas

funcionam, respectivamente, como ligases no complexo proteína-ubiquitina e possuem

funções de reciclagem da ubiquitina (Dexter & Jenner, 2013).

A primeira indicação do envolvimento do SUP na DP foi a detecção de ubiquitina e

subunidades proteassomais nos CL sugerindo uma disfunção do SUP (Beyer, Domingo-

Sàbat, & Ariza, 2009; Levy et al., 2009). A detecção de uma diminuição da actividade

do proteassoma na SNpc em indivíduos com DP suporta, também o envolvimento do

SUP na DP (Beyer et al., 2009). A actividade proteassomal também diminui com o

envelhecimento natural, especialmente na SNpc, o que pode contribuir para a

vulnerabilidade selectiva da SNpc (Levy et al., 2009).

Introdução

23!

A identificação da mutação no gene Parkina associada à DP suporta o envolvimento

do SUP na DP. A proteína Parkina é uma ligase E3 e as mutações nesta proteína,

relacionadas com a DP, provocam uma diminuição da actividade desta. Por outro lado,

a Parkina também foi identificada nos CL e os níveis de Parkina na forma nitrosilada

estão aumentados na SNpc na DP, o que leva a uma diminuição da actividade desta. In

vitro, foram identificados diversos substratos desta proteína, incluindo a Sinfilina-1 e a

α-Syn, cujas expressões em excesso provoca a morte dos neurónios dopaminérgicos.

Estes mesmos substratos encontram-se em elevadas concentrações na SNpc e/ou nos CL

nas autopsias de indivíduos com DP esporádica (Levy et al., 2009; Mcnaught et al.,

2001).

A olígomerização da α-Syn e a sobre-expressão desta parecem contribuir para a

disfunção do SUP (Onyango, 2008). A sobre-expressão de α-Syn em células PC12

provocou uma inibição da actividade proteassomal, possivelmente pela ligação dos

olígomeros da α-Syn ao próprio proteassoma (Stefanis, Larsen, Rideout, Sulzer, &

Greene, 2001). Por outro lado, a inibição do SUP contribui para a formação de

agregados e acumulação da α-Syn nas inclusões citoplasmáticas (Levy et al., 2009). O

estudo do proteassoma 26S, na DP, revelou alterações na actividade catalítica e na sua

composição na SNpc estando possivelmente associado ao comprometimento da

degradação da α-Syn (Dexter & Jenner, 2013).

A inibição da mitocôndria leva a uma diminuição dos níveis de ATP intracelulares

afectando a degradação proteassomal, um processo dependente de ATP sugerindo que a

interacção entre o SUP e a mitocôndria pode promover os processos neurodegenerativos

nos neurónios dopaminérgicos (Onyango, 2008).


! 24!

!Figura 4 - Mecanismos Neurodegenerativos - Os factores de risco conhecidos da DP incluem os

factores ambientais (verde), factores genéticos (roxo) e factores endógenos (azul). A contribuição destes

factores levam a modificações oxidativas, disfunções da mitocôndria e alterações na degradação de

proteínas que, em conjunto, provocam uma série de eventos moleculares relacionados entre si que estão

subjacentes à neurodegeneração. As interacções entre estes mecanismos devem-se a diversos motivos: (1)

Perturbações na respiração mitocondrial gera espécies reactivas de oxigénio; (2) A sobre-expressão de

SOD têm um efeito protector relativamente a toxinas da mitocôndria; (3) A deficiência ou inibição da

enzima óxido nítrico sintetase (NOS) atenua a toxicidade do MPTP, do paraquato e da rotenona; (4) A

inibição dos sistemas de degradação leva a uma sensibilidade aumentada ao stress oxidativo; (5) A

degradação, ao estar comprometida, provoca uma acumulação de substratos aumentando a probabilidade

de modificações oxidativas; (6) A excessiva produção de espécies reactivas de oxigénio e nitrogénio

modifica as proteínas levando à sua inactivação, crosslinking e agregação; (7) A α-Syn modificada pela

dopamina oxidada impede a autofagia mediada por chaperonas (CMA); (8) Alterações oxidativas levam a

modificações na membrada das proteínas e do lisossoma; (9) O SUP e a CMA não estão aptos para

remover e reparar as proteínas danificadas; (10) As modificações das subunidades do proteassomal,

devido à oxidação, inibem o SUP; (11) A macroautofagia é o principal mecanismo de degradação da

mitocôndria danificada; (12) A inibição do proteassomal aumenta a formação de espécies reactivas na

mitocôndria o que compromete a actividade do complexo I e II. (Adaptado de Malkus, Tsika, &

Ischiropoulos, 2009)

Introdução

25!

1.1.4 Mecanismos Moleculares

Apesar dos esforços para descobrir a etiologia da DP, esta ainda permanece por

desvendar. Embora tenham sido relatados casos de DP relacionados com mutações

genéticas, a maioria das incidências é esporádica na natureza. Pensa-se que a Doença

de Parkinson Idiopática é originada através da associação entre diversos factores de

risco como os factores genéticos, ambientais e o envelhecimento natutal (Chinta et al.,

2013).

1.1.4.1 Factores Ambientais

Diversos estudos neuropatológicos e em modelos animais demonstram que as

neurotoxinas ambientais podem determinar um dano progressivo na SNpc muito antes

do aparecimentos dos sintomas parkinsonianos. A DP, assim como outras doenças

neurológicas relacionadas com a idade, pode ser determinada por exposição a toxinas

ambientais desde a gravidez até a vida adulta. No entanto, os estudos epidemiológicos

mais recentes têm-se direccionado para os factores de risco ambientais presentes na

vida adulta (Logroscino, 2005).

Uma das evidências mais marcantes, relativamente aos factores ambientais

envolvidos na DP, surgiu aquando da observação que o MPTP provocou o

aparecimento de sintomas similares aos característicos da DP, em indivíduos expostos

acidentalmente (J W Langston, Ballard, Tetrud, & Irwin, 1983). Diversos estudos

epidemiológicos têm sugerido que a exposição a pesticidas, e outras toxinas

ambientais, está associado ao desenvolvimento da DP. Através da capacidade destes

compostos de interferir com os processos mitocondriais, interromper o metabolismo

da dopamina e promover a formação de espécies reactivas de oxigénio podem iniciar

uma cascata de eventos pejorativos com capacidade de levar à neurodegeneração

observada na DP (Malkus et al., 2009; C. Olanow & Tatton, 1999)

MPTP

A descoberta, em 1983, que a administração intravenosa de MPTP leva ao

desenvolvimento de sintomas típicos da DP e a descoberta posterior que este induz

danos nas células dopaminérgicas da SNpc levou à suposição que a exposição a certos


! 26!

factores ambientais pode determinar um aumento do risco de vir a desenvolver a DP

(Lau & Breteler, 2006).

O 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) é um produto intermediário da

síntese de MPPP, um análogo da mepiridina (J. Langston, Ballard, Tetrud, & Irwin,

1983). Em 1983, esta toxina foi administrada (acidentalmente) por um grupo de

toxicodependentes (não relacionados entre si) que vieram a desenvolver,

irreversivelmente, sintomas similares aos da Doença de Parkinson, tais como:

bradicinesia, tremor, rigidez e instabilidade postural (C. Goetz et al., 2001; J.

Langston et al., 1983).

Esta pró-toxina (MPTP) é um composto lipossóluvel capaz de atravessar a barreira

hematoencefálica (BHE). Após atravessar a BHE, o MPTP é convertido em MPP+

num processo bifásico. Primariamente, nos neurónios serotoninérgicos e na glia, é

metabolizado pela iMAO-B originando o composto intermediário MPTP+, de

seguida, através de um mecanismo desconhecido forma-se o MPP+, o composto

activo, que por sua vez é posteriormente libertado no espaço extracelular (Przedborski

& Vila, 2001) .

Figura% 5% &% Representação% esquemática% do% metabolismo% do% MPTP.! Após! administração!

sistémica,!o!MPTP!atravessa!a!BHE.!Uma!vez!no!cérebro,!é!convertido!em!MPDP+!pela!MAOTB!e!

depois! em! MPP+! através! de! um! mecanismo,! para! já,! desconhecido.! Seguidamente,! o! MPP+! é!

libertado! no! espaço! extracelular! e! entra! nos! neurónios! dopaminérgicos! através! dos! DAT!

(Adaptado!de!Dauer!&!Przedborski,!2003)!!

Introdução

27!

O MPP+ entra para os neurónios dopaminérgicos através dos transportadores da

dopamina (DAT) para os quais possui elevada afinidade. Uma vez dentro destes, o

MPP+ pode seguir três vias: (1) Ligar-se aos transportadores vesiculares de

monoamina (VMAT), e acumula-se nas vesículas sinaptossomais; (2) Inserir-se na

matriz mitocondrial; ou (3) Permanecer no citosol e interagir com enzimas citosólicas

(Dauer & Przedborski, 2003; Przedborski & Vila, 2001).

!Figura 6 - Representação esquemática do metabolismo do MPP+. Uma vez dentro dos neurónios

dopaminérgicos, o MPP+ pode seguir 3 vias: (1) Inserir-se na matriz mitocondrial (tóxico); (2)

Permanecer no citosol e interagir com enzimas citosólicas (tóxico); (3) ligar-se aos VMAT, e acumula-

se nas vesículas sinaptossomais (protector). Uma vez na mitocôndria, o MPP+ bloqueia o cI da CTE.

(Adaptado de Dauer & Przedborski, 2003)

A acumulação do MPP+ dentro das vesículas parece exercer um efeito

neuroprotector, impedindo o efeito citotóxico, pois evita a interacção deste metabolito

com a matriz mitocondrial (Koller et al., 1990).

Uma vez inserido na matriz mitocondrial, o MPP+ vai interferir com a CTE,

inibindo o cI originado uma diminuição da fosforilação oxidativa. A inibição desta via

provoca uma diminuição dos níveis de ATP encefálicos o que provoca a morte celular

(Dauer & Przedborski, 2003). Outro efeito da inibição do cI será um aumento do


! 28!

stress oxidativo proveniente da formação de ROS, nomeadamente radicais

superóxido, o que também vai contribuir para a morte celular (Koller et al., 1990).

Paraquato e outros Pesticidas

Após a descoberta de uma possível relação entre o MPTP e a DP, foram realizados

vários estudos com o intuito de examinar a associação entre a exposição a factores

ambientais, tais como exposição a herbicidas e pesticidas, actividades agrícolas, vida

rural e o consumo de água provenientes de poços, com o risco acrescido de vir a

adquirir a DP (Lau & Breteler, 2006) .

Apesar da existência de divergências entre os resultados, possivelmente devido a

diferenças na metodologia aplicada e na amostra populacional, existe um padrão

geral. Este padrão sugere que o risco de vir a adquirir a DP encontra-se acrescido em

ambientes rurais, nomeadamente em agricultores, possivelmente devido à maior

exposição a herbicidas e pesticidas (Koller et al., 1990).

O herbicida paraquato é uma toxina com efeitos pejorativos nos neurónios. O

paraquato foi estudado em modelos animais, mais concretamente em ratinhos,

induzindo uma redução da actividade motora e morte celular, especialmente nos

neurónios dopaminérgicos da SNpc (McCormack et al., 2002). Adicionalmente, a

administração sistémica deste composto resulta num aumento da expressão da α-Syn

e consequente formação de agregados, similar às modificações provocadas após a

administração de MPTP (Manning-Bog et al., 2002; Vila et al., 2001). A sobre-

expressão da enzima superóxido dismutase (SOD), em ratinhos e em culturas

celulares, relevou um efeito protector em relação à toxicidade provocada pelo

paraquato, o que evidência o papel do stress oxidativo na neurodegeneração (Clair,

Oberley, & Ho, 1991; Dong et al., 2006; Elroy-stein, Bernstein, & Groner, 1986).

A rotenona é um insecticida inibidor do cI da mitocôndria. É utilizada em ratinhos

com o intuito de produzir o fenótipo da DP, incluindo a degeneração dos neurónios

dopaminérgicos, alterações motoras e a formação de inclusões fibrilares (Betarbet &

Sherer, 2000). Ao contrario do MPTP, a rotenona é altamente lipofílica e,

consequentemente, atravessa as membranas facilmente e entra nas células (Dauer &

Przedborski, 2003). Deste modo, a rotenona poderia ter a capacidade de inibir o cI

através do cérebro, ao atravessar a BHE. De facto, ratinhos sujeitos a uma

administração crónica de rotenona desenvolveram uma degeneração nigral selectiva

com a presença de α-Syn e inclusões similares aos CL, o que salienta a

Introdução

29!

susceptibilidade das células dopaminérgicas a alterações na mitocôndria (Betarbet &

Sherer, 2000).

Têm sido realizados diversos estudos, em diferentes áreas geográficas, na tentativa

de estabelecer uma ligação entre o uso de pesticidas e o risco acrescido de DP. No

entanto, a conclusão generalizada a que se chega é que apesar da DP poder estar

associado ao uso de pesticidas a longo termo, não existe uma associação comprovada

a nenhum componente em particular (Berry, La Vecchia, & Nicotera, 2010).

Tabaco e Café

O risco de vir a adquirir DP decresce cerca de 60% em fumadores e à volta de 30%

em consumidores de café. Considera-se que este efeito neuroprotector se deva à

nicotina e à cafeína respectivamente (Logroscino, 2005).

O tabaco é um dos factores de risco mais estudados e um dos poucos em que se

obteve resultados concretos. Diversos estudos demonstraram um risco inversamente

proporcional entre o consumo de tabaco e a incidência de DP. Assim, têm sido

propostos diversos mecanismos com o intuito de explicar o suposto efeito

neuroprotector do tabaco. As explicações mais plausíveis sugerem o envolvimento da

nicotina, devido às suas propriedades antioxidantes, a capacidade de estimular a

libertação de dopamina e a acção inibidora sobre a iMAO-B, que activa a

neurotoxicidade induzida pelo MPTP (Lau & Breteler, 2006).

Em relação ao consumo de café existem evidências que a cafeína exerce um efeito

protector no sistema dopaminérgicos. Um estudo realizado em 2001 demonstrou que

ratinhos tratados com cafeína antes da exposição ao MPTP sofreram uma perda

inferior de neurónios dopaminérgicos relativamente aos ratinhos sem tratamento

prévio com cafeína. Pensa-se que o efeito neuroprotector da cafeína deve-se à acção

inibitória desta sobre os receptores da adenosina-2 (Logroscino, 2005).


! 30!

1.1.4.2 Factores Genéticos

A DP sempre foi considerada esporádica na natureza, contudo, nas últimas duas

décadas, foram realizados inúmeros estudos genéticos, em diferentes áreas

geográficas, que suportam a existência de uma substancial componente genética na

DP. O primeiro gene a ser relacionado com a DP foi o SNCA, foi identificado numa

família italiana que apresentava uma transmissão autossómica dominante. Deste

então, foram identificados cerca de 18 loci relacionados com a DP (Bekris, Mata, &

Zabetian, 2010).

Principais genes envolvidos na Doença de Parkinson

PARK-1 e PARK-4 : Alfa-Sinucleína

O locus PARK-1, juntamente com o locus PARK-4, contêm o gene SNCA,

localizado no cromossoma 4q21-q23, que codifica para a α-Syn (Bekris et al., 2010).

Até a data foram identificadas cinco mutações missenses : A53T, A30P, E46K, H50G

e G51A, assim como duplicações e triplicações do gene wild-type (WT) (Trinh &

Farrer, 2013). As mutações no gene SNCA são associadas à DP autossómica

dominante de início relativamente precoce e rápida progressão, sendo um fenótipo

mais agressivo e com elevada incidência de demência e danos cognitivos

(Xiromerisiou & Dardiotis, 2010).

A substituição A53T foi a primeira a ser identificada numa família com a forma

autossómica dominante da DP, apresentando um declínio cognitivo e demência. Mais

tarde foram identificadas as substituições A30P e E46K em duas famílias que

apresentavam demência com CL (Bekris et al., 2010). Recentemente foram

identificadas as mutações H50Q e G51A. A primeira foi identificada num caso

esporádico de DP de início precoce e rápida progressão com declínio cognitivo e

motor, enquanto a G51A foi identificada em 4 pacientes com DP de início precoce,

rápida progressão com sintomas piramidais envolvidos (Appel-Cresswell et al., 2013;

Lesage et al., 2013; Proukakis, Dudzik, & Brier, 2013).

Posteriormente, descobriu-se que as duplicações e as triplicações do locus do gene

SNCA podem causar PD autossómica dominante de início precoce. A idade de início

das manifestações da DP parece estar relacionado com o número de copias dos genes

Introdução

31!

(Ikeuchi, Kakita, & Shiga, 2008). No caso dos pacientes que possuem uma duplicação

neste locus, ostentando 3 copias deste gene, tendem a desenvolver DP por volta dos

50 anos, com um fenótipo mais típico, enquanto que os pacientes com triplicações,

produzindo assim 4 copias do gene, desenvolvem a DP mais cedo, por volta dos 30

anos, com tendência a ser acompanhada por demência e CL difusos (Ikeuchi et al.,

2008; Wood-Kaczmar, Gandhi, & Wood, 2006). Pode-se dizer, então, que a expressão

aumentada de α-Syn parece ser tóxica para os neurónios, havendo uma relação dose-

efeito demonstrada pelas diferenças consoante o tipo de mutação (duplicação ou

triplicação) (Wood-Kaczmar et al., 2006).

PARK 2 : Parkina

O Locus PARK 2 localiza-se no cromossoma 6q25.2-q27 e inclui o gene Parkina

que codifica para a proteína com o mesmo nome (Bekris et al., 2010; Corti et al.,

2011). Esta mutação foi originalmente identificada em famílias japonesas com

parkinsonismo juvenil e uma transmissão autossómica recessiva (Farrer, 2006).

A Parkina é uma enzima E3 que actua no processo de ubiquitinação como ligase

ubiquitina-proteina, as mutações desta proteína levam alterações no SUP conduzindo

a uma eliminação insuficiente do substracto e consequente agregação proteica (Corti

et al., 2011)

Clinicamente, este fenótipo manifesta-se muito precocemente, por volta dos 20

anos, mas também é frequente por volta dos 20-35 anos, sendo raro manifestar-se

após os 50 anos (Corti et al., 2011). A progressão da doença é geralmente lenta e

acompanhada de discinesia, distonia e alterações psiquiátricas (Bonifati, 2007).

PARK- 5: UCL-L1

Localizado no cromossoma 4p14, este locus contém o gene UCH-L1

(Hidrolase L1 Ubiquitina Carboxiterminal) (Wirdefeldt, Adami, Cole, Trichopoulos,

& Mandel, 2011). A UCL-L1 é uma enzima neuronal específica e uma das proteínas

mais abundantes no cérebro, esta proteína está envolvida no sistema SUP e foi

detectada em CL presentes nos neurónios dopaminérgicos da SNpc em doenças

neurodegenerativas (Belin & Westerlund, 2008; Bonifati, 2007; Lowe, McDermott,

Landon, Mayer, & Wilkinson, 1990).


! 32!

Foi identificada uma mutação dominante da proteína UCH-L1 (193M) em dois

membros de uma família afectada pela DP hereditária típica com início por volta dos

50 anos (Belin & Westerlund, 2008; Leroy, Boyer, & Polymeropoulos, 1998). Por

outro lado, um polimorfismo na UCH-L1 (S18Y) aparenta ter um efeito protector,

sugerindo uma redução no risco de desenvolver DP esporádica (Zhang et al., 2000).

Liu et al. realizou um estudo em que propõe uma actividade de hidrólase e ligase, em

simultâneo, para a proteína UCH-L1 (Liu, Fallon, Lashuel, Liu, & Lansbury, 2002).

Deste modo, a sobre-expressão da mutação 193M da UCH-L1 provoca uma

acumulação de α-Syn, sendo sugerido, também, que esta acumulação deve-se à

ubiquitinação da α-Syn pela UCH-L1 dimerizada. Contudo, a variante polimórfica

S18Y da UCH-L1 reduz a actividade ligase sem afectar a actividade de hidrólase da

proteína, sendo uma possível explicação para o efeito protector deste polimorfismo

(F. J. S. Lee & Liu, 2008; Liu et al., 2002). No entanto, permanece desconhecida a

relação entre esta proteína e a neurodegeneração na DP familiar assim como o seu

papel na DP esporádica (F. J. S. Lee & Liu, 2008).

PARK-6 – PINK1

O Locus PARK-6 localiza-se no cromossoma 1p35-1p36 e possui o gene PINK1,

que expressa para proteína com o mesmo nome (Corti et al., 2011). Pensa-se que a

proteína-quinase PINK1 actua dentro da mitocôndria o que suporta a hipótese desta

estar relacionada com a disfunção mitocondrial e com o stress oxidativo na

patogénese da DP (Ross & Smith, 2007).

A mutação no gene PINK1 foi identificada pela primeira vez numa família italiana

e apresenta uma transmissão autossómica recessiva da DP, posteriormente foi também

mapeada em oito famílias de diferentes países europeus com uma transmissão

igualmente autossómica recessiva (Vila & Przedborski, 2004). Relativamente ao

fenótipo clínico, apresenta um início precoce em que os primeiros sintomas

manifestam-se por volta da quarta e quinta década de vida. As características clínicas

assemelham-se à DP de início tardio, com uma progressão lenta, boa resposta à L-

Dopa e, em alguns casos, demência e distúrbios psiquiátricos (Bekris, Mata, &

Zabetian, 2010).

Introdução

33!

PARK-7 : DJ-1

Este locus contém o gene DJ-1 e localiza-se no cromossoma 1p36 (Bekris et al.,

2010). A proteína DJ-1 é expressa em diferentes tecidos humanos incluindo no

cérebro, localiza-se no citoplasma, no núcleo e na mitocôndria das células (Ariga et

al., 2013; Vila & Przedborski, 2004). É uma proteína multifuncional assumindo

funções como chaperona, antioxidante, reguladora da transcrição, protease, regulação

da mitocôndria e actua, também, como um sensor de stress sendo a sua expressão

aumentada em situações de stress oxidativo. Devido às suas funções, acima descritas,

esta proteína desempenha uma função de protecção contra a morte celular induzida

pelo stress oxidativo (Ariga et al., 2013; Bekris et al., 2010; Farrer, 2006; Hardy,

Lewis, Revesz, Lees, & Paisan-Ruiz, 2009; Vila & Przedborski, 2004). Pensa-se que

a perda ou redução das funções desta proteína pode desencadear o início de doenças

relacionadas com o stress oxidativo, nomeadamente a DP (Ariga et al., 2013).

O gene DJ-1 foi primariamente identificado como um oncogene (Nagakubo et al.,

1997) e posteriormente Bonifati et al. mapeou duas mutações em dois pacientes com

DP, conduzindo à identificação do DJ-1 como um gene relacionado com a DP

familiar de transmissão autossómica recessiva (Bonifati et al., 2003)

As mutações no gene DJ-1 são responsáveis pela forma autossómica recessiva da

doença e são pouco comuns, sendo responsáveis por 1-2% dos casos de DP com

início precoce (Bonifati, 2007). Relativamente às características clínicas o

conhecimento é limitado, sabe-se que apresenta um início precoce (30-40 anos) e uma

progressão lenta, alguns pacientes manifestam quadros psiquiátricos (Bekris et al.,

2010; Corti et al., 2011).

PARK-8 : LRRK2

O locus PARK8 encontra-se no cromossoma 12p21 e contém o gene que expressa

a proteína LRRK2 tendo sido identificado pela primeira vez numa família japonesa e

apresenta uma transmissão autossómica dominante (Belin & Westerlund, 2008). A

LRRK2 é uma proteína com funções de quinase e GTPase e actua, também, em

múltiplos processos biológicos como: transmissão neuronal, arborização neuronal,

endocitose, autofagia e imunidade(Trinh & Farrer, 2013).

Até aos dias de hoje, as mutações dominantes missense na LRRK2 são a causa

genética mais comum de DP e, de acordo com os estudos disponíveis, são

responsáveis por cerca de 10 % dos casos de DP familiar autossómica dominante


! 34!

(Bonifati, 2007; Kett et al., 2012). Contudo, apesar de já terem sido reportadas

diversas variantes, apenas seis delas são consideradas patogénicas (R1441G, R1441C,

R1441H, Y1699C, G2019S e I2020T) (Bekris et al., 2010). Um aspecto interessante

relativamente a este gene, é o facto da mutação Gly2019Ser apresentar uma

frequência elevada não só em casos de DP familiar como também em casos de DP

esporádicos, em diversas populações, sendo a mutação mais comum (Bekris et al.,

2010; Bonifati, 2007; Hardy et al., 2009).

O fenótipo clínico apresenta elevada analogia com a DP idiopática, o início dos

sintomas ocorre por volta dos 60 anos, contudo, já foram reportados casos de início

precoce e de início tardio, abrangendo idades entre os 20 e os 90 anos (Gasser, 2009;

Ross & Smith, 2007). Os portadores das mutações no gene LRRK2 aparentam ter

uma DP mais benigna visto que é de progressão lenta e apresenta uma boa resposta ao

tratamento com L-Dopa e uma frequência diminuta de demência e outras

complicações psiquiátricas (Bekris et al., 2010; Gasser, 2009; Ross & Smith, 2007).

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Introdução

35!

Tabela 1 – Resumo dos Genes Envolvidos na DP ( Adaptado de Bekris et al., 2010; Corti et al., 2011; Farrer, 2006; Gasser, 2009; Trinh & Farrer, 2013; Vila & Przedborski, 2004; Wirdefeldt et al., 2011)

Locus Cromossoma Gene Herança Fenotipo

PARK-1 PARK-4

4q21-q23 SNCA

Dominante

Início Relativamente precoce Progressão rápida Boa resposta a L-dopa Disfunção cognitiva precoce

PARK-2 6q25.2-q27 Parkina

Recessiva

Início Precoce Juvenil Progressão lenta Distonia e Discinesia

PARK-3 2p13 --

Dominante

Início 50 anos Boa resposta a L-dopa Disfunção cognitiva

PARK-5 4p14 UCHL-1 Dominante

Início 50 anos Tremor inicial antecede a bradicinesia Boa resposta a L-dopa

PARK-6 1p35-p36 PINK1

Recessiva

Início precoce Progressão Lenta Boa resposta a L-dopa Início precoce de discinesias induzidas por fármacos

PARK-7 1p36 DJ-1 Recessiva

Início precoce 30 anos Progressão Lenta Boa resposta a L-dopa Pode ocorrer alterações psiquiátricas

PARK-8 12p12 LRRK2

Dominante

Início 40-50 anos Boa resposta a L-dopa Demência ocasional

PARK-9 1p36

ATP13A2

Recessiva

Início Precoce Progressão rápida Sintomas Piramidais Demência

PARK-10 1p32 -- Dominante PARK-11 2q37.1 GIGYF2 Dominante PARK-12 Xq21-q25 -- -- PARK-13 2p13 OMI/HtrA2 Dominante Início Tardio

PARK-14 22q13.1

PLA2G6

Recessiva Início Precoce Distonia Sintomas piramidais

PARK-15 22q12-q13 FBX07 Recessiva

Início Precoce Sintomas Piramidais

PARK-16 1q32 -- --


! 36!

2. Diagnóstico e Farmacoterapia na Doença de Parkinson

2.1 Quadro Clínico e Diagnóstico da DP

Clinicamente, a DP é definida pela presença de sinais motores cardinais: tremor,

rigidez, bradicinesia e instabilidade postural. Contudo, a ocorrência de sintomas não

motores como insuficiência autónoma, danos cognitivos, depressão, deficiências

olfactivas, psicose e distúrbios do sono são bastante comuns durante o decurso da DP

(Jankovic, 2006; Samii, Jg, & Br, 2004).

O início dos sintomas normalmente é unilateral e dissimulado, havendo uma

progressão lenta mas conservando-se o carácter unilateral. Os primeiros sinais são

vagos, pode haver uma sensação de dor, dormência, fraqueza, dores musculares e

rigidez. Pode ocorrer, como sinal inicial, um tremor num membro, geralmente quando

o doente está em repouso que aumenta com as emoções e desaparece durante o sono

(Guimarães & Alegria, 2004).

O diagnóstico clínico é tipicamente baseado na presença dos sintomas motores

cardinais, a ausência de sintomas atípicos sugestivos de um diagnóstico alternativo e a

resposta ao tratamento com L-Dopa. Os critérios clínicos de diagnóstico mais usados

baseiam-se nos apresentados pela UK PD Society Brain Bank (Tabela 2). Uma das

complicações no diagnóstico da DP é a distinção entre outras síndromes

parkinsonianas, como as Atrofias Multissistémicas e a Paralesia Supranuclear

Progressiva, nos estágios iniciais da doença (Brooks, 2010; Samii et al., 2004).

Diagnóstico e Farmacoterapia na Doença de Parkinson

37!

Tabela 2 - Critérios de Diagnóstico da DP (Adaptado de UK PD Society Brain Bank Clinical Diagnostic Criteria (Hughes, Daniel, Kilford, & Lees, 1992) )

Fase 1: Diagnóstico de sindroma parkinsónica:

¬ Bradicinesia ¬ Mais pelo menos 1 dos seguintes:

• Rigidez muscular • Tremor de repouso a 4-6Hz • Instabilidade postural

Fase 2: Critérios de exclusão de DPI:

• História de AVC’s repetidos com progressão em escada das manifestações parkinsónicas

• História de traumatismos cranianos repetidos • História de encefalite • Crises oculogíricas • Tratamento neuroléptico no início das manifestações • Remissão sustentada • Persistência de manifestações unilaterais após 3 anos de evolução • Paralisia supranuclear do olhar • Sinais cerebelosos • Desenvolvimento precoce de sintomas autonómicos • Desenvolvimento precoce de demência • Sinal de Babinski • Presença de tumor cerebral ou de HPN • Resposta negativa a doses elevadas de L-Dopa (excluída a má absorção) • Exposição ao MPTP

Fase 3: Critérios adicionais que apoiam o diagnóstico de DPI:

• Início unilateral • Tremor de repouso presente • Carácter progressivo • Persistência da assimetria afectando mais o lado de início • Resposta excelente (70 a 100%) à L-Dopa • Movimentos coreicos induzidos pela L-Dopa • Resposta à L-Dopa durante pelo menos 5 anos • Evolução clínica durante mais de 10 anos


! 38!

2.2 Terapêutica Farmacológica na Doença de Parkinson

A terapêutica para a DP é exclusivamente sintomática tendo como principal

objectivo melhorar os sintomas motores e não-motores com o intuito de providenciar

uma melhor qualidade de vida (Brichta, Greengard, & Flajolet, 2013; Ferreira &

Ferreira, 2010; Kulisevsky et al., 2013) .

A escolha da terapêutica incide em objectivos como preservação da função e

capacidade de realizar actividades rotineiras da vida diária, minimização dos efeitos

adversos e contrariar os sintomas não motores como a depressão, distúrbios do sono,

fadiga e alterações cognitivas. Após o diagnóstico da DP, devem ser consideradas as

intervenções farmacológicas e não farmacológicas em simultâneo (J. Chen & Swope,

2007).

Percussores da Dopamina : Levodopa (+ Inibidor da Descarboxilase)

A L-Dopa é o pró-fármaco da dopamina e é considerado a terapêutica mais eficaz

no tratamento sintomático da DP. Recorre-se á utilização do pró-fármaco L-Dopa

visto que a dopamina não atravessa a BHE, ao passo que a L-Dopa atravessa e é

metabolizada no seu interior em dopamina exercendo o efeito terapêutico desejado.

Contudo, ao ser administrada per os, a L-Dopa vai sofrer descarboxilação em

dopamina pela dopa-descarboxílase, a nível periférico, provocando efeitos adversos

não desejáveis e, consequentemente, a biodisponibilidade de L-dopa no local de acção

vai ser muito inferior à necessária para se obter os efeitos terapêuticos pretendidos

(Rodrigues & Campos, 2006).

A principal via de metabolização da L-Dopa, a nível periférico, é através da dopa-

descarboxilase e, em menor escala, pela catecol-o-metiltransferase (Evans & Sung,

2013). Assim, de forma a evitar a metabolização periférica da L-Dopa recorre-se ao

uso de associações com um inibidor da descarboxílase dos aminoácidos como a

Carbidopa ou a Benserazida. Consequentemente, há um aumento da concentração

plasmática da L-Dopa e do tempo de meia-vida concomitante com uma redução os

efeitos adversos periféricos e um aumento da biodisponibilidade de L-Dopa a nível

central pois os inibidores da descarboxilase não atravessam a BHE. A Carbidopa e a

Benserazida impedem a metabolização periférica da L-Dopa por inibição da dopa-

descarboxilase (J. Chen & Swope, 2007; Khatri & Chaudhry, 2009).


39!

Uma vez no SNC, após atravessar a BHE, a L-Dopa é carboxilada em dopamina

pela dopa-descabolixilase e acumula-se nas fendas pré-sinápticas dos neurónios

dopaminérgicos. A L-Dopa é particularmente eficaz no controlo dos sintomas

parkinsoniamos como a bradicinesia, alterações no discurso, tremores e rigidez. No

entanto, a eficácia clínica diminui a longo-prazo o com uso contínuo desta terapêutica

(Khatri & Chaudhry, 2009).

O uso prolongado de L-Dopa pode conduzir ao desenvolvimento de flutuações

motoras (fenómeno de fim de dose) como discinesia e o efeito ‘’on/off’’.

Relativamente à discinesia, o risco aparenta ser acrescido em pacientes com

associações de L-Dopa + Carbidopa. A discinesia tende a desaparecer com a

diminuição da dose, contudo, os sintomas parkinsonianos reaparecem (Rodrigues &

Campos, 2006). No efeito ‘’On/Off’’, os pacientes oscilam entre um estado ligado, em

que a terapêutica é eficaz, e um estado desligado em que não ocorre qualquer efeito

terapêutico e há um reaparecimento dos sintomas da DP (Clarke, 2004). Tem sido

sugerido que com a evolução da doença e a perda progressiva dos neurónios

dopaminérgicos da SNpc, há uma capacidade decrescida de sintetizar dopamina o que

leva a uma perda da eficácia terapêutica da L-Dopa (Rodrigues & Campos, 2006).

Inibidores da COMT

Os fármacos incluídos neste grupo terapêutico são inibidores específicos e

reversíveis da catecol-O-Metiltransferase (COMT), uma enzima que metaboliza a L-

Dopa tanto a nível periférico como central. Desta forma, em concentrações

terapêuticas, impedem a metabolização periférica da L-Dopa em 3-0-Metildopa

aumentando a biodisponibilidade a nível central e, consequentemente, prolongam o

tempo de permanência da dopamina nas fendas sinápticas. Observa-se um aumento da

AUC (área sob a curva) da L-Dopa sem haver um aumento da concentração máxima

plasmática desta (Clarke, 2004; Picon & Beltrame, 2002).

Neste grupo terapêutico estão incluídas duas moléculas: o Entacapone e o

Tolcapone. Porém, devido à ocorrência de hepatotoxicidade com consequências fatais

após a terapêutica com Tolcapone, este foi retirado do mercado Europeu (Clarke,

2004).

A Entacapona, no mercado português, tanto é comercializada em associações

triplas de L-Dopa + Carbidopa + Entacapona como em formulações apenas com a

substância activa Entacapona (Prontuário Terapêutico, 2013). Devido aos seus


! 40!

resultados positivos aquando do aparecimento de flutuações motoras relacionadas

com a terapêutica prolongada com L-Dopa, visto que reduzem o efeito ‘’on/off’’ por

uma diminuição do tempo que o doente permanece no estado off e um aumento do

tempo no estado on, esta associação aparenta ser ideal na terapêutica após o

aparecimentos dos fenómenos de fim de dose (J. Chen & Swope, 2007; Clarke, 2004;

Rodrigues & Campos, 2006).

Agonistas dos receptores da Dopamina

Este grupo farmacológico inclui vários fármacos, dos quais os mais comuns

são:Bromocriptina, Pergolida, Pramipexol, Ropinirol, Mesilato de di-

hidroergocriptina e Cabergolina (Prontuário Terapêutico, 2013). Encontram-se

divididos em derivados ergolínicos (Bromocriptina, Pergolida, Mesilato de di-

hidroergocriptina e Carbegolida) e não-ergolínicos (Ropinirol e Pramipexol) (J. J.

Chen & Swope, 2007; Khatri & Chaudhry, 2009; Prontuário Terapêutico, 2013)

Os Agonistas da Dopamina são uma alternativa terapêutica importante na

farmacoterapia da DP pois, embora apresentem uma eficácia terapêutica inferior à L-

Dopa e estejam associados a uma elevada incidência de efeito adversos, a ocorrência

de flutuações motoras, como a discinesia e o efeito ‘’on/off’’, é menor (Baker et al.,

2009; Hickey & Stacy, 2011).

Estes fármacos possuem diferentes afinidades para os vários receptores da

dopamina o que se pode traduzir em diferentes perfis farmacológicos obtendo-se,

assim, diferentes características antiparkinsonianas e diferentes perfis de segurança

consoante o fármaco. Também os ergolínicos possuem um perfil de segurança inferior

aos não-ergolínicos, no entanto, são ambos efectivos em monoterapia ou como

adjuntos da terapêutica com L-Dopa, em pacientes com flutuações motoras,

diminuindo o tempo off e permitindo reduzir as doses administradas de L-Dopa (no

caso da terapêutica em associação com L-dopa) (Bonuccelli, Del Dotto, & Rascol,

2009; J. Chen & Swope, 2007).

Os fármacos Bromocriptida e Pergolida caíram em desuso por diversas razões: a

Bromocriptida aumenta o risco de fibrose pulmonar e possui uma eficácia inferior

quando comparada com outros agonistas da dopamina. A Pergolida foi retirada do

mercado nos EUA, pela FDA, devido ao risco de desenvolvimento de valvulopatias

cardíacas (J. Chen & Swope, 2007; Khatri & Chaudhry, 2009).

!


41!

Tabela 3 – Fármacos Agonistas dos Receptores de Dopamina (Adaptado de Prontuário Terapêutico, 2013)

Fármaco Características N

ão –

Erg

olín

icos

Pramipexol ( Mirapexin®, Oprymea®)

Maior afinidade para os receptores D3 Pode ser usada como adjuvante da L-Dopa ou em monoterapia Efeito atenuante nas flutuações motoras Efeito neuroprotector Estágios Iniciais e Tardios da DP

Ropinirol (Adartrel® , Dopil®)

Afinidade para os receptores D2 e D3 Pode ser usado como adjuvante da L-Dopa ou em monoterapia Estágios Iniciais e Tardios da DP

Piribedil (Rivastal®) Adjuvante da L-Dopa

Ergo

línic

os

Mesilato de Di-Hidroergocriptina (Striatal®)

Usado em monoterapia Estágios Iniciais da DP

Bromocriptina ( Parlodel® )

Elevada afinidade para os receptores D2 e antagonista parcial dos receptores D1 Pode ser usada como adjuvante da L-Dopa ou em monoterapia Estágios Iniciais e Tardios da DP

Inibidores da I-MAOB

O papel fisiológico da i-MAOB envolve a catalisação do metabolismo de diversos

neurotransmissores, nomeadamente a dopamina. Assim, a principal razão para

recorrer a um inibidor da i-MAO, como terapêutica na DP, baseia-se no facto de

ocorrer um aumento da dopamina a nível do estriado levando a uma melhoria da

actividade dopaminérgica e consequente melhoria dos sintomas motores na DP. Outra

razão será o suposto efeito neuroprotector exercido por este grupo farmacológico,

baseado em evidências que estes fármacos demonstraram actividade antioxidante e

anti-apoptótica em modelos experimentais (J. J. Chen & Swope, 2005; J. Chen &

Swope, 2007; Rodrigues & Campos, 2006).

Incluem-se dois fármacos, indicados para o tratamento da DP, neste grupo

farmacológico : Selegilina e Rasagilina (Prontuário Terapêutico,2013).

A Selegilina é um inibidor irreversível da I-MAO B e, apesar de possuir uma

maior afinidade para a i-MAO B, a sua administração deve ser efectuada em doses

baixas de forma a evitar a inibição da i-MAO A e, por conseguinte, evitar a


! 42!

ocorrência de efeitos adversos (Evans & Sung, 2013). Emprega-se, em monoterapia,

em estágios iniciais da DP e providencia uma melhoria a nível da função motora. Em

estágios mais avançados da DP é usada como adjuvante da L-Dopa e pode

proporcionar um aumento do tempo on em pacientes que apresentam o efeito

‘’on/off’’, contudo, os dados são inconsistentes (J. Chen & Swope, 2007).

A Rasagilina é um inibidor irreversível da I-MAO-B de segunda geração e, tal

como a Selegilina, é efectiva no tratamento da DP inicial, tanto como adjuvante da

L-Dopa como em monoterapia, para controlo das flutuações motoras em estágios

mais avançados da DP. Estudos demonstraram que pacientes que começaram a

terapêutica precocemente obtiveram um menor declínio funcional do que pacientes

cuja terapêutica foi retardada, o que demonstra que um início prematuro da

terapêutica com Rasagilina pode estar associado a melhores resultados a longo prazo

no que diz respeito ao controlo dos sintomas motores (J. J. Chen & Swope, 2005; J.

Chen & Swope, 2007)

Antagonistas dos Receptores Muscarínicos (Anti-colinérgicos)

Os Antagonistas dos Receptores Muscarínicos foram extensamente utilizados antes

da era da L-Dopa no tratamento da DP. Inclui três fármacos: Benzatropina,

Biperideno e Tri-hexifenidilo. Apesar dos níveis de acetilcolina não se alterarem na

DP, a diminuição de dopamina nos estriado leva a uma hiperactividade das células

muscarínicas (Y. Smith, Wichmann, Factor, & DeLong, 2012). Pensa-se, então, que

os antagonistas dos receptores muscarínicos, apesar do seu mecanismo de acção não

estar totalmente esclarecido, compensam a influência dopaminérgica (Clarke, 2004;

Rodrigues & Campos, 2006; Y. Smith et al., 2012)

Os efeitos terapêuticos deste grupo farmacológico são notavelmente inferiores aos

da L-Dopa, contudo, parecem ser efectivos no controlo do tremor e rigidez. Na

prática, o uso destes fármacos é bastante limitado pois não só estão associados a

diversos efeitos adversos, como perda de memória, confusão, alucinações,

xerostomia, como também são mal tolerados pela população idosa. Assim, são

preferencialmente usados no tratamento inicial de pacientes jovens em que predomina

o tremor (Khatri & Chaudhry, 2009; Y. Smith et al., 2012).


43!

Antivíricos – Amantidina

A Amantidina é um antivírico utilizado no tratamento de infecções provocadas

pelo vírus Influenza A. O mecanismo de acção da Amantidina ainda não está

esclarecido mas pensa-se que a sua actividade antiparkinsoniana esteja relacionada

com a inibição da recaptação da dopamina concomitantemente com um aumento da

libertação de dopamina. O tratamento com Amantidina apresenta uma diminuição de

sintomas como a bradicinesia, rigidez e tremor. É usado no tratamento da DP inicial e

como adjuvante da L-Dopa com o intuito de minimizar a discinesia. Contudo, possui

um efeito de curta duração pois a sua eficácia diminui ao longo do tempo (J. Chen &

Swope, 2007; Clarke, 2004; Ferreira & Ferreira, 2010; Khatri & Chaudhry, 2009;

Rodrigues & Campos, 2006; Tsai & Yuan, 2012).

Apomorfina

A Apomorfina é um agonista de curta duração da dopamina usado no tratamento

da DP. Comparado com a L-Dopa tem um rápido início de acção sendo, por

conseguinte, indicado para estados avançados da DP em que predomine o estado off

pois vai alargar o tempo em que o paciente permanece em estado on. A via de

administração mais comum é a subcutânea por perfusão contínua ou por injecção

intermitente em bólus. Os efeitos adversos preeminentes incluem reacções cutâneas e

efeitos neuropsiquiátricos, sendo mais comuns na administração por perfusão

contínua (Clarke, 2004; Khatri & Chaudhry, 2009).

Coenzima Q-10

A Coenzima Q-10 (CoQ10) é um componente da CTE que participa na respiração

aeróbica celular e na produção de ATP. As propriedades antioxidantes desta indicam

que a CoQ10 pode vir a ter uma função importante a nível da farmacoterapia na DP

visto que, a actividade do cI encontra-se reduzida na SNpc dos pacientes com DP.

Como já foi referido anteriormente, esta actividade diminuída leva a uma acumulação

de ROS provocando danos celulares (Santos, Antunes, Santos, & Bianchi, 2009).

Estas observações originaram estudos com o objectivo de verificar se a

administração de CoQ10 poderia atrasar o desenvolvimento da DP. De facto, um

estudo, realizado em 2002, demonstrou que a administração de uma dose diária de

CoQ10 durante seis meses está associado a uma diminuição em 44% do declínio

funcional em pacientes com DP (Shults et al., 2002).


! 44!

3. Mecanismos Moleculares da Doença de Parkinson

Envolvendo a alfa-Sinucleína e a Sinfilina -1

3.1 Alfa-Sinucleína

3.1.1 Estrutura e Localização

A α-Sinucleína foi isolada pela primeira vez através das vesículas colinérgicas do

órgão eléctrico da espécie Torpedo californica, vulgarmente conhecida como raia

eléctrica (Maroteaux, Campanelli, & Scheller, 1988). É uma pequena proteína

constituída por 140 aminoácidos cujo peso molecular ronda os 14 kDa. Está presente

em elevadas concentrações nos terminais pré-sinápticos mas também se encontra na

mitocôndria e nos núcleos das células neuronais do cérebro. A α-Sinucleína é uma

proteína citoplasmática, contudo, estudos realizados recentemente comprovaram a

existência de α-Sinucleína extracelular. (Bellucci, Navarria, Zaltieri, Missale, &

Spano, 2012; Breydo, Wu, & Uversky, 2012; Hashimoto & Masliah, 1999; Pacheco,

Aguayo, & Opazo, 2012; Perfeito & Rego, 2011).

Esta proteína pertence á família das Sinucleínas, que inclui três isoformas

diferentes, descritas como produtos do splicing alternativo. Existe, portanto, a α-Syn,

a β-Sinucleína e a γ-Sinucleína. Estas últimas são, respectivamente, constituídas por

126 e 112 aminoácidos e derivam da deleção do exão 3 e 5 (Bellucci, Navarria, et al.,

2012).

Esta família de proteínas é caracterizada por permanecer num estado nativo

unfolded e por uma ausência de estrutura secundaria típica. Têm elevada plasticidade

conformacional, podendo adquirir diversas conformações estruturais que dependem

fortemente do ambiente fisiológico em que se encontram (Dunker, Silman, Uversky,

& Sussman, 2008; V. N. Uversky, 2007).

A sua estrutura pode ser dividida em três regiões com diferentes características

estruturais :

(1) a região N-terminal inclui as posições de três mutações familiares da DP e é

caracterizada por seis sequências repetidas imperfeitas de 11 resíduos com um motivo

KTKEGV, sabe-se que forma hélices alfa anfipáticas, similares aos domínios de

ligação aos lípidos das apolipoproteinas, o que sugere que uma das funções biológicas

Mecanismos Moleculares envolvendo a alfa-sinucleína e a Sinflina-1 na Doença de Parkinson

45!

da α-Syn pode estar relacionada com ligações à membrana lipídica. Esta região

adopta uma conformação em hélice alfa e possui a capacidade de ligação a

fosfolipidos (Davidson, Jonas, Clayton, & George, 1998; Leong et al., 2009).

(2) a região central (domínio NAC), que inclui os resíduos 61-95, é hidrofóbica

com característica amiloidogénicas e possui as sequências de aminoácidos

necessárias para adquirir uma conformação em folha-beta (Culvenor et al., 1999;

Leong et al., 2009).

(3) a região C-terminal, é rica em resíduos ácidos e prolinas, possui elevada carga

negativa e permanece num estado unfolded (Bellucci, Navarria, et al., 2012; Leong et

al., 2009).

!Figura 7 - Representação esquemática da estrutura da α-Syn. (Adaptado de

http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/jovin/index.php/ResearchSubjects/Alpha-synuclein (2012))

Em certas condições patológicas, a α-Syn pode sofrer alterações na sua estrutura

conformacional com uma consequente agregação e formação de depósitos. Como é o

caso da DP em que ocorre a formação de inclusões intracelulares e neurodegeneração

(Beyer, 2006).

3.1.2 Funções da alfa- Sinucleína

Apesar das funções da α-Syn não estarem totalmente esclarecidas, foram propostas

diversas funções prováveis, incluindo o transporte e libertação vesicular, ligação a

ácidos gordos e regulação fisiológica de certas enzimas, transportadores e

neurotransmissores vesiculares, assim como funções neuroprotectoras (Breydo et al.,

2012). Também diversas linhas de evidência sugerem que esta proteína desempenha


! 46!

um papel importante a nível dos terminais pré-sinápticos relacionados com

processos membranares (Bellucci, Navarria, et al., 2012; George, 2002).

De facto, o envolvimento desta proteína na regulação da apoptose neuronal e

consequente protecção dos neurónios de diversos agentes estimuladores da apoptose

foi comprovada (Da Costa, Ancolio, & Checler, 2000). Um estudo realizado em

ratinhos knockout para todas as Sinucleínas (alfa, beta e gama) revelou uma disfunção

dependente da idade, sugerindo uma contribuição importante destas proteínas a nível

do funcionamento do sistema nervoso a longo prazo, sugerindo que estas proteínas

são importantes para o funcionamento do sistema nervoso a longo prazo (Greten-

Harrison et al., 2010).

A primeira evidência de uma possível função pré-sináptica da α-Syn surgiu

aquando da sua descoberta, como já referido anteriormente, em vesículas colinérgicas

da espécie Torpedo californica (Maroteaux et al., 1988). Em posteriores

investigações, identificou-se esta proteína em placas de amilóide na Doença de

Alzheimer, com elevados níveis de NAC, e análises subsequentes à região NAC da α-

Sinucleína veio comprovar a localização pré-sináptica desta proteína (Iwai, Masliah,

Yoshimoto, & Ge, 1995; Uéda et al., 1993).

A descoberta de expressão de mRNA da α-Syn em regiões do cérebro de pássaros

jovens Mandarins relacionadas com o controlo do canto, onde ocorria um decréscimo

dos níveis desta proteína durante a fase de aquisição do canto, em comparação com

outras regiões do cérebro não envolvidas no canto sugere, também, o envolvimento da

α-Syn na plasticidade sináptica (Clayton & George, 1998).

A supressão do gene da α-Syn em ratinhos levou a um aumento dos níveis de

dopamina no nigrostrial em resposta a estímulos eléctricos, indicando que a α-Syn

está implicada no controlo da actividade sináptica e que actua como um modulador da

transmissão da dopamina. Contudo, a ausência desta proteína não é letal nem afecta a

morfologia do cérebro dos ratinhos, sugerindo um papel não essencial da α-Syn no

desenvolvimento neuronal e/ou a existência de vias compensatórias (Abeliovich et al.,

2000; Cabin et al., 2002).

A α-Syn mostrou regular a produção de dopamina em culturas celulares através da

sua interacção com a tirosina hidroxilase (TH), esta enzima actua como factor

limitante na conversão de tirosina a L-DOPA na via de síntese de dopamina. Assim,

uma expressão excessiva de α-Syn nas células reduz a actividade do promotor da TH,

reduzindo os níveis do mRNA da proteína e consequentemente da proteína em si. Por


47!

outro lado, a α-Syn também se liga à TH, impedindo a sua fosforilação e inibindo a

sua activação através do aumento da actividade da proteína fostatase A2. Consistente

com o papel da α-Syn na regulação da biossíntese da dopamina em culturas celulares,

a redução da actividade da TH foi observada em diversos modelos de ratinhos com

sobre-expressão de α-Syn WT (Venda, Cragg, Buchman, & Wade-Martins, 2010). Foi

também demonstrado, que a α-Syn interage com a descarboxilase dos aminoácidos L-

aromáticos (AADC), uma enzima que catalisa a conversão de L-dopa em dopamina.

A sobre-expressão da α-Syn reduz a actividade da enzima AADC através da

diminuição da fosforilação da enzima (Ozansoy & Başak, 2013; Venda et al., 2010;

Yu et al., 2004)

Nos terminais pré-sinápticos, a α-Syn monomérica existe em equilíbrio entre a sua

forma livre e a sua forma ligada, sendo a fracção ligada a membranas cerca de 15%

(H.-J. Lee, Choi, & Lee, 2002). Esta forte associação com as estruturas vesiculares

levou à formulação da hipótese de que a α-Syn possa regular a libertação e/ou

turnover vesicular e exercer outras funções sinápticas no SNC (Clayton & George,

1998; Davidson et al., 1998; Uéda et al., 1993)..

A interacção da α-Syn com as membranas foi provada recentemente por um estudo

que demonstrou que esta proteína possui a capacidade de inibir a fosfolipase D2, uma

proteína localizada nas membranas plasmáticas e que está envolvida no transporte

membranar, nomeadamente na exocitose, e na produção de ácido fosfastídico,

sugerindo o envolvimento da α-Sinucleína no transporte membranar através de

vesículas (Bellucci, Navarria, et al., 2012; Bendor, Logan, & Edwards, 2013). Para

além disso, os lípidos podem facilitar a incorporação da α-Syn nas membranas assim

como a elongação das fibrilas de α-Sinucleína o que indica que esta proteína pode

estar envolvida na biogénese das membranas sinápticas (Gai et al., 2000). Diversas

outras evidências suportam a hipótese da interacção da α-Syn com as membranas. De

facto, um estudo já mencionado anteriormente, realizado por Abeliovich et al.,

demonstra que a supressão do gene da α-Syn em ratinhos provoca um aumento dos

níveis de dopamina em resposta a estímulos eléctricos, reforça a hipótese de que a α-

Syn está envolvida no controlo da actividade sináptica e que actua como modulador

da transmissão dopaminérgica (Abeliovich et al., 2000). Para além disso, a depleção

de α-Syn, in vitro, resulta numa diminuição das pools distais das vesículas pré-

sinápticas em neurónios do hipocampo (Murphy, Rueter, Trojanowski, & Lee, 2000).

Outro estudo realizado em ratinhos knockout para α-Syn demonstrou uma redução das


! 48!

pools das vesículas sinápticas, implicando que a α-Syn endógena possa regular a

mobilização das vesículas nos terminais nervosos (Cabin et al., 2002)

A α-Syn tem, também, a capacidade de interagir com diversas proteínas sinápticas,

em particular foi provado que esta proteína pode interagir e modular as proteínas da

família Rab, moduladoras essenciais do transporte membranar, exocitose e da

libertação de vesículas sinápticas nas células neuronais (Chua & Tang, 2011; Dalfó,

Barrachina, Rosa, Ambrosio, & Ferrer, 2004; Fukuda, 2008; Gitler et al., 2008). Para

além disso, a α-Sinucleína pode ter a capacidade de modular o transporte vesicular

através da interacção com a proteína receptora 1 da Rab prenilada (H. J. Lee, Kang,

Lee, & Im, 2011). Desta forma, a α-Syn aparenta ter um papel modulador tanto na

mobilização das vesículas sinápticas como no transporte membranar (Bellucci,

Navarria, et al., 2012). Esta hipótese foi confirmada por um estudo em que ratinhos

knockout para α-Syn apresentaram níveis diminuídos do transportador de dopamina

(DAT) assim como uma diminuição no reuptake de dopamina no estrato dorsal em

paralelo com um aumento concomitante de libertação basal de dopamina

(Chadchankar, Ihalainen, Tanila, & Yavich, 2011). É de salientar que a expressão

superficial de DAT depende das proteína SNARE, essenciais para a fusão de

membranas e a exocitose das vesículas sinápticas e cuja função é regulada pela α-Syn

(Burré et al., 2010; R. Chen, Furman, & Gnegy, 2010)

A hipótese da α-Syn desempenhar funções de chaperona foi considerada devido à

sua capacidade de interagir com uma larga variedade de ligandos e proteínas celulares

e à sua estrutura bioquímica. Foi demonstrado que a α-Sinucleína possui elevada

homologia com o chaperona 14-3-3, tanto a nível estrutural como funcional

(Ostrerova et al., 1999). Sabe-se que estas proteínas chaperona controlam a

proliferação celular em mamíferos, regulam a exocitose e a actividade da proteína

quinase C. Levando à hipótese de que a α-Sinucleína possa interagir com os terminais

sinápticos de inúmeras proteínas que regulam a neurotransmissão da dopamina e,

também, actuar como uma proteína chaperona, tendo uma função de protecção celular

(Souza, Giasson, Lee, & Ischiropoulos, 2000; V. N. Uversky, 2007).

Em suma, o papel fisiológico da α-Syn permanece ainda pouco claro. Sabe-se que

é expressa no cérebro e noutros tecidos tal como células hematopoéticas (Miller et al.,

2004). Esta proteína, como referido anteriormente, possui a capacidade de ligação a

lípidos e nos neurónios está associada às vesículas pré-sinápticas e à membrana

plasmática (Jo, McLaurin, Yip, St George-Hyslop, & Fraser, 2000; Withers, George,


49!

Banker, & Clayton, 1997). A associação da α-Syn com as vesículas é modulada pela

actividade sináptica, em que a proteína sofre uma dissociação das vesículas após

estimulação eléctrica dos neurónios (Bellani et al., 2010). Pensa-se que a α-Syn

possui uma função não essencial na sinapse pois ratinhos knockout demonstraram

anomalias na neurotransmissão (Martín, González-García, Milán, Fariñas, & Ceña,

2004).

3.1.3 Envolvimento na doença de Parkinson

O termo sinucleinopatias é empregue para definir um grupo de doenças

neurodegenerativas nas quais se observa uma acumulação de agregados de α-Syn com

um efeito patológico. Nestas doenças a α-Syn forma agregados e depósitos em certas

populações de neurónios e células da glia (Galvin, Lee, & Trojanowski, 2001;

Goedert, 1999).

A α-Syn é uma proteína pré-sináptica relacionada geneticamente e

neuropatologicamente com a DP. Esta proteína pode contribuir para a fisiopatologia

da DP de diversas formas, mas supõe-se que os olígomeros solúveis e as protofibrilas

são as principais espécies tóxicas que provocam alterações na homeostase celular e a

consequente morte neuronal. Além disso, a expressão desta proteína pode exercer,

também, efeitos pejorativos nas células vizinhas, inclusive induzir a formação de

agregados, o que possivelmente contribui para a propagação da doença (Leonidas

Stefanis, 2012).

A identificação, por Uéda et al. em 1993, de elevadas concentrações do fragmento

NAC da proteína α-Syn em placas amilóides características da doença de Alzheimer,

assim como, a descoberta que esta proteína é um dos componentes maioritários nos

CL na DP, formando depósitos de fibrilas amilóides dentro destes, o reconhecimento

de cinco mutações a nível do gene SNCA em casos de DP em famílias europeias e o

facto desta proteína formar depósitos e agregações a nível dos neurónios

dopaminérgicos, levou à suspeita de que esta proteína poderia ter um papel importante

na fisiopatologia das doenças neurodegenerativas, nomeadamente na DP. (Recchia et

al., 2004; Uéda et al., 1993). Actualmente, existe uma elevada quantidade de

evidências experimentais que sustentam o papel da α-Syn na fisiopatologia da DP

(Bisaglia, Mammi, & Bubacco, 2009).


! 50!

Enquanto que as funções fisiológicas da α-Syn continuam a não ser totalmente

claras, o seu papel patológico, provocado por diversas alterações, é mais evidente

(Bisaglia et al., 2009).

A α-Syn, in vitro, agrega-se em fibrilas amilóides similares, morfologicamente e

funcionalmente, às fibrilas amilóides extraídas de CL in vivo, que estão associados a

diversas doenças neurodegenerativas, nomeadamente a DP (Waxman & Giasson,

2009). Considerando que a morte neuronal é uma das características mais vinculativas

da DP, combinado com o evidente papel da α-Syn na fisiopatologia na DP é deduzível

que a α-Syn possa interferir neste processo de morte celular (Cookson, 2009)

Esta acumulação anormal de α-Syn ocorre em estágios precoces do

desenvolvimento da doença e parece afectar diversas zonas do cérebro consoante a

progressão da doença. A acumulação mais generalizada de α-Syn parece estar

subjacente, pelo menos em parte, às deficiências cognitivas e comportamentais na DP

com demência. Os mecanismos subjacentes a estas funções anormais da α-Syn e o

impacto destas na DP ainda não esta totalmente esclarecido, contudo têm sido

sugeridas diversas possibilidades, as quais se encontram descritas nos parágrafos

subsequentes (Vekrellis, Xilouri, Emmanouilidou, Rideout, & Stefanis, 2011).

A formação destas fibrilas envolve uma agregação inicial de α-Syn em pequenos

olígomeros e protofibrilas que sofrem uma posterior elongação originando em fibrilas

maturas (K. a Conway, Harper, & Lansbury, 1998) e pensa-se que é um processo

dependente da nucleação (Leong et al., 2009). A agregação da α-Syn envolve uma

mudança da conformação inicial do monómero desta proteína numa conformação

parcialmente enrolada sendo submetida a diversas auto-associações desfavorecedoras

de forma a formar um núcleo altamente instável durante a fase lag (Waxman &

Giasson, 2009). A formação do núcleo é seguida de uma fase de crescimento, a

elongação, em que este núcleo rapidamente se transforma em fibrilas pela adição de

monómeros (Leong et al., 2009). Supõe-se que estas protofibrilas constituam as

espécies perniciosas da α-Syn, provocando a morte celular através da sua toxicidade

(Beyer et al., 2009).


51!

Figura 8 - Representação Esquemática do Processo de Agregação da α-Syn (Adaptado de Marques

& Outeiro,2012)

A forma monomérica da α-Syn pode, também, sofrer várias alterações,

subjacentes a modificações pós-traducionais e mutações genéticas, que aparentam

estar relacionadas com a formação de espécies patogénicas de α-Syn (Bisaglia et al.,

2009).

A descoberta das mutações a nível do gene SNCA relacionadas com a DP foi

critica na pesquisa da etiologia da DP. Contudo, os mecanismos moleculares através

dos quais estas mutações provocam a DP ainda não estão elucidados na totalidade

(Bisaglia et al., 2009).

Análises detalhadas através do recurso a uma combinação de técnicas de baixa

resolução revelaram que as mutações A30P, E46K e A53T não afectam a estrutura

global da α-Syn, que permanece no seu estado nativo ‘’unfolded’’(V. Uversky &

Eliezer, 2009).

Contudo estudos mais detalhados, revelaram que todas as três mutações alteram a

cinética de agregação da α-Syn. As mutações A53T e E46K aumentam a taxa de

agregação (mas não necessariamente a taxa de fibrilação) ao passo que a mutação

A30P diminui (Choi et al., 2004; K. a Conway et al., 1998; K. A. Conway et al.,

2000). Em comparação com a α-Syn WT, as mutação A53T e A30P promovem a

acumulação de olígomeros prefibrilares enquanto a E46K tem um efeito oposto (K. A.

Conway et al., 2000). Análises à mutação E46K demonstraram que esta leva a

mudanças na conformação da proteína monomérica e forma fibrilas insolúveis in vitro

mais rapidamente que a proteína WT, também a capacidade das protofibrilas, nesta

mutação e na WT, de permeabilizar as vesículas lipídicas foram demonstradas, in

vitro, neste estudo (Fredenburg et al., 2007).


! 52!

A tendência da estrutura secundaria da α-Syn WT permanecer num estado

desarranjado é alterada por duas mutações. A A30P atenua a propensão da região N-

terminal para adoptar conformações helicoidais enquanto que, a mutação A53T possui

uma tendência para formar uma estrutura secundaria regular em torno do local da

mutação (V. Uversky & Eliezer, 2009).

Relativamente à interacção com lípidos, a mutação A53T parece ter um efeito

moderado no impedimento da ligação às membranas enquanto que a mutação A30P

diminui extensivamente a interacção da α-Syn com os lípidos in vitro e in vivo. Já a

mutação E46K aumenta a capacidade de ligação, desta proteína, a lipossomas

carregados negativamente (Choi et al., 2004).

Embora os estudos sobre as mutações genéticas na α-Syn levem a uma maior

compreensão sobre as funções e os mecanismos patológicos desta proteína, estas só

contribuem para uma pequena percentagem dos casos de DP. Na realidade, mais de

90% dos casos de DP são esporádicos e, portanto, caracterizados pela presença de

agregados de α-Syn (Spillantini, Crowther, Jakes, Hasegawa, & Goedert, 1998).

Por esse motivo, o interesse direccionou-se para as alterações que convertem a

α-Syn WT numa espécie patogénica. Já foi demonstrado que a α-Syn WT forma

agregados idênticos aos encontrados em cérebros de pacientes com DP, contudo, a

sua formação ocorre a uma taxa inferior à das espécies mutadas de α-Syn (Serpell,

Berriman, Jakes, Goedert, & Crowther, 2000).

Foram propostas, então, diversas modificações pós-traducionais capazes de

alterar a função da α-Syn e, assim, induzir a formação de agregados de fibrilas. Estão

descritas diversas modificações pós-traducionais que envolvem diferentes processos

resultando, todas elas, em alterações do tamanho, carga, estrutura e conformação das

proteínas, levando a uma alterações das actividades enzimáticas, afinidade de ligação

ou hidrofobicidade. Em suma, conduzem a uma alteração no funcionamento das

proteínas (Beyer, 2006).

A fosforilação é provavelmente a modificação pós-traducional mais

importante. A α-Syn pode sofrer fosforilação a nível do resíduos de serina 129 e 87 e

nos resíduos 125, 133 e 136 localizados na região C-terminal. (Beyer, 2006). Porém, é

a nível do resíduo de serina 129 que a α-Sinucleína se encontra extensivamente

fosforilada em tecidos cerebrais de pacientes com DP e outras doença

neurodegenerativas (Fujiwara et al., 2002).


53!

Apesar da ideia inicial, comprovada por estudos em moscas transgénicas, que a

fosforilação da α-Syn no resíduo de serina 129 leva a um aumento de olígomeros

solúveis desta proteína e da neurotoxicidade, estudos subsequentes obtiveram

resultados contraditórios (Leonidas Stefanis, 2012).

Lee et al. realizou um estudo que demonstra que o aumento da desfosforilação do

resíduo 129 da α-Syn através da proteína fosfatase 2A (PP2A) provocava uma

diminuição da fosforilação da serina 129 e da agregação da α-Syn no cérebro de

ratinhos. Isto é, a PP2A é uma proteína que desfoforiliza o resíduo 129 e a actividade

desta proteína é aumentada aquando da metilação desta. Assim, neste estudo foi

demonstrado que ao aumentar a actividade da PP2A através da metilação, esta vai

aumentar a desfosforilação do residuo serina 129 da α-Sinucleína o que leva a uma

diminuição dos níveis de α-Syn fosforilada e a agregação desta no cérebro de ratinhos

sugerindo um papel prejudicial da fosforilação no processo da doença (K.-W. Lee et

al., 2011).

Contudo, investigadores da Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, em 2013,

ao realizar um estudo em ratos sobre a fosforilação demonstraram que esta pode ter

efeitos positivos. Neste estudo foi injectado no cérebro de ratos neurónios que se

pensa que podem desencadear a doença através de uma expressão excessiva de α-Syn

e a enzima responsável pela fosforilação da α- Syn (PLK2). Como resultado,

observou-se que os ratos sujeitos a estes dois parâmetros – expressão excessiva de α-

Syn e fosforilação – sofreram uma perda em cerca de 70% inferior de neurónios

comparativamente ao grupo de ratos em que apenas estava sujeito a uma expressão

excessiva de α-Syn, consequentemente estes ratinhos desenvolveram menos lesões e

ostentaram menos sintomas parkinsonianos (Ecole Polytechnique Fédérale de

Lausanne, 2013)

O resíduo de serina 87 é outro local de fosforilação da α-Syn, que também se

encontra associado aos CL na sua forma fosforilada, contudo, a significância a nível

patológico ainda não esta esclarecida (Leonidas Stefanis, 2012).

Assim, o papel patológico da fosforilação permanece pouco claro, pois se por um

lado parece acrescer o risco de formação de agregados por outro, segundo descobertas

recentes, pode desempenhar um papel a nível da neuroprotecção.

Tanto a nitração como a oxidação da Α-Syn foram propostas como responsáveis

pela formação de olígomeros (Beyer, 2006). A α-Syn na sua forma nitrada, também

foi detectada nos CL e aparenta promover a formação de agregados de fibrilas


! 54!

(Leonidas Stefanis, 2012). A nitração da α-Syn ocorre nos resíduos de tirosina,

particularmente nos resíduos 125 e 39. A nitração do resíduo 125 leva a uma

dimerização da α-Syn, ao passo que a nitração do resíduo 39 reduz a capacidade de

ligação as vesículas lipídicas, aumentando a capacidade de polimerização (Beyer,

2006). Hodara et al, demonstrou que a α-Syn nitrada não é processada de modo eficaz

pelas protéases intracelulares conduzindo à acumulação desta proteína e a um

aumento da taxa de formação de fibrilas (Hodara et al., 2004). Neste mesmo estudo,

foi demonstrado que as forma monoméricas e diméricas nitradas de α-Syn promovem

a formação de fibrilas, enquanto que, a forma oligomérica nitrada desta proteína

estabiliza como olígomeros estáveis, sugerindo que a nitração tem efeitos complexos

a nível da agregação da α-Syn (Hodara et al., 2004; Leonidas Stefanis, 2012). Numa

analise colectiva, a nitração da α-Sinucleína aparenta reduzir a ligação desta proteína

às vesículas lipídicas, prolongar a meia-vida intracelular e conduzir a formação de

inclusões de α-Syn (Hodara et al., 2004).

Relativamente aos efeitos da oxidação na α-Syn, o stress oxidativo também parece

ter um papel relevante na formação de agregados desta proteína e, talvez, na formação

de olígomeros intermediários tóxicos (Cookson, 2009). Comprovando esta hipótese,

um estudo realizado por Takahashi et al. demonstrou que a α-Syn exposta a FeCl2 têm

maior propensão à formação de olígomeros e espécies de elevado peso molecular,

levando, também, a um aumento da actividade da proteína quinase CK2 (M.

Takahashi et al., 2007). Um outro estudo, revelou que a expressão excessiva de α-Syn

pode induzir uma agregação dependente do ferro (Recchia et al., 2004).

Assim, as modificações pós-traducionais e o stress oxidativo, apesar de serem

mecanismos diferentes, aparentam estar inter-relacionados aquando da sua

contribuição para a agregação da α-Syn (Perfeito & Rego, 2011).

Como foi referido anteriormente, diversos mecanismos induzem a agregação, a

formação de fibrilas e a formação de depósitos da α-Syn, o que leva à questão sobre

qual efeito destas alterações na neurodegeneração.

Toxicidade da alfa-Sinucleína

Diversos modelos foram realizados com o intuito de comprovar a toxicidade da α-

Syn in vivo. Em culturas celulares, tanto em fase estacionária como em fase de

crescimento, o aumento da expressão de α-Sinucleína limitou o crescimento celular.

A toxicidade desta proteína também foi demonstrada na Drosophila, onde foi


55!

reportado uma perda de neurónios, contudo, neste modelo os resultados são

controversos e os efeitos obtidos foram modestos (L. Chen & Feany, 2005). Foi

realizado outro estudo em minhocas C.elegans com o intuito de comprovar a

toxicidade da α-Syn nos neurónios in vivo. Todos estes estudos demonstraram o efeito

nocivo da α-Sinucleína em organismos que esta proteína não está presente em

condições fisiológicas (Breyde et al., 2012)

Os níveis de α-Syn no cérebro depende de um equilíbrio entre as taxas de síntese,

agregação e eliminação. Um desequilíbrio entre estes mecanismos, causado pela

disfunção de uma destas vias, pode resultar em níveis anormais desta proteína que

pode favorecer a formação e/ou acumulação de espécies fibrilares ou oligoméricas, as

quais podem ser tóxicas (Lashuel, Overk, Oueslati, & Masliah, 2013).

Os mecanismos propostos para descrever a toxicidade da α-Syn são agrupados em

três classes : (a) Deformação mecânicas dos compartimentos/mecanismos celulares;

(b) Aumento de funções com efeitos tóxicos; (c) ou perda de funções com efeitos

tóxicos. Não sendo estes mecanismos necessariamente exclusivos, podem actuar de

modo sinérgico (M. C. Bennett, 2005).

O modelo mais aceite para descrever a toxicidade da α-Syn incide sobre a

permeabilização das membranas das células pelos agregados amilóides. Os

olígomeros de α-Syn podem ligar-se às membranas lipídicas e romper a bicamada

lipídica (Auluck, Caraveo, & Lindquist, 2010; B. van Rooijen, 2010; B. D. van

Rooijen, Claessens, & Subramaniam, 2010). Certas formas oligoméricas de α-Syn

mostraram a capacidade de penetrar nas membranas e formar poros (Giehm, Svergun,

Otzen, & Vestergaard, 2011; Volles & Lansbury, 2003). Também foi proposto a

permeabilização da membrana sem a formação de poros (Kayed et al., 2004).

Por outro lado, a disfunção da degradação da α-Syn devido à inibição do

proteassoma pelas espécies agregadas e a produção de ROS, também foi proposto

como um mecanismo possível para a neurotoxicidade dos agregados de α-Syn (M. C.

Bennett, 2005; Brown, 2010). É possível que múltiplas espécies tóxicas de α-

Sinucleína agregada estejam presentes in vivo e que recorram a diferentes

mecanismos de toxicidade. Para além disso, diversos estudos indicam que a

toxicidade da α-Syn pode estar associada à perda de funções (M. C. Bennett, 2005).

Diversas linhas de evidência sugerem que os olígomeros de α-Syn apresentam a

espécie tóxica (V. N. Uversky, 2007). A forma oligoméricas da α-Syn deposita-se no

cérebro de pacientes que apresentam uma triplicação no gene da α-Syn (Miller et al.,


! 56!

2004). Por outro lado, a forma mutante A30P acelera fortemente a oligomerização da

α-Syn o que retarda significativamente a formação de fibrilas maduras (K. A. Conway

et al., 2000; J. Li, Vn, & Al, 2001, 2002). Diversos factos suportam a hipótese da

toxicidade dos olígomeros : (i) em modelos celulares, a toxicidade é geralmente

observada sem que haja agregação da α-Syn, indicando que são as espécies solúveis

que mediam a toxicidade (Xu et al., 2002); (ii) In vitro, a agregação da α-Syn e a

formação de depósitos de fracções insolúveis só é detectada após a morte celular

(Gosavi, Lee, Lee, Patel, & Lee, 2002); (iii) Ratinhos transgénicos que expressam a α-

Syn WT humana desenvolveram inclusões intraneuronais não-fibrilares em diversas

áreas do cérebro, incluindo na SNpc (Masliah et al., 2000); (iv) Ratinhos transgénicos

a expressar a α-Syn WT e a A53T exibiram neurodegeneração fora do SN sem

apresentar inclusões fibrilares (van der Putten et al., 2000); (v) A expressão de α-Syn

no SN de ratos levou a uma toxicidade dopaminérgica selectiva com inclusões não-

fibrilares (Lo Bianco, Schneider, Ridet, Déglon, & Aebischer, 2002); (vi) As

inclusões de α-Syn, em alguns modelos animais, não contêm fibrilas e, para além

disso, as inclusões fibrilares na mosca podem ocorrer sem que haja neurodegeneração

(Auluck & Bonini, 2002; Auluck, Chan, Trojanowski, Lee, & Bonini, 2002); (vii) A

perda de neurónios dopaminérgicos foi mais elevada em ratinhos transgénicos a

expressar olígomeros formados pelas mutações E53K e E57K em comparação com os

ratinhos a expressar fibrilas pela mutação A53T (Winner & Jappelli, 2011).

Com base nestas e outras observações, tem sido sugerido que a formação dos CL

tem um efeito protector na neurodegeneração indicando fortemente que a morte dos

neurónios deve-se à formação de espécies protofibrilares (V. N. Uversky, 2007)

Desta forma, a base molecular da DP aparenta estar fortemente associada à

formação de agregados de α-Syn, esta proteína pode adoptar inúmeras conformações

diferentes e diversos estados de agregação dependendo de vários factores e condições.

Qualquer um dos estados de agregação pode ser tóxico, contudo, acredita-se que a

maior neurotoxicidade deve-se aos olígomeros (Breydo et al., 2012).

É importante ter noção que, apesar da DP ser caracterizada pela acumulação de

depósitos contendo α-Syn, esta doença é multifactorial e cuja patogenia não pode ser

explicada apenas com base na agregação da α-Syn. De facto, a natureza da DP é

bastante complexa e pode ser provocada por diversos factores (M. C. Bennett, 2005).

Contudo, muitos dos factores que promovem a doença estão, directamente ou

indirectamente, relacionados com alterações da α-Syn, assim a analise detalhada das


57!

funções alterações e agregação desta proteína podem fornecer uma base importante

para um futuro desenvolvimento de terapêuticas eficazes (Breydo et al., 2012).

Figura 9 – Proposta de Modelo da Toxicidade da α-Syn - Nas condições fisiológicas normais, a α-

Syn encontra-se num estado nativo unfolded. No entanto, em condições patológicas a α-Syn converte-

se em espécies patogénicas misfolding (dímeros e olígomeros) com tendência a agregar e formar

protofibrilas. Estas estruturas parecem estar relacionadas com a formação de inclusões de α-Syn

semelhantes aos CL e neuritos de Lewy. As alterações genéticas podem acelerar este processo. Os

sistemas celulares que previnem, revertem ou eliminam as proteínas misfolding (chaperonas, SUP,

fagossoma, lisossoma) encontram-se sobrecarregados por estas espécies oligoméricas de α-Syn

(indicado a tracejado). Dados recentes sugerem que a progressão da DP pode estar relacionada com a

transmissão célula a célula das espécies patológicas de α-Syn. Pensa-se que a transmissão de α-Syn

está associada a diversas consequências tóxicas inter-relacionadas. Permanece por esclarecer quais as

espécies de α-Syn que são tóxicas para os neurónios. (Adaptado de Irwin, Lee, & Trojanowski, 2013)

Propagação da alfa-Sinucleína

Nas condições fisiológicas, a α-Syn tem sido considerada uma proteína sináptica

exclusivamente intracelular que se associa às vesículas sinápticas (Iwai et al., 1995).

Todavia, estudos recentes sugerem que os olígomeros da α-Syn podem ser eliminados

dos neurónios através de mecanismos de secreção invulgares. A disseminação da α-

Syn pode envolver diversos mecanismos tais como endocitose, transmissão

transsináptica, penetração directa, através de receptores da membrana ou através

exossomas. Estes agregados de α-Syn extracelular podem ser transferidos de um


! 58!

neurónio para o outro assim como de um neurónio para uma célula da glia (Danzer et

al., 2011; Emmanouilidou et al., 2010; Jao, Hegde, Chen, Haworth, & Langen, 2008;

Tsigelny et al., 2012).

A propagação da α-Syn entre neurónios sugere que esta proteína tem propriedades

similares às proteínas dos priões, as PrPsc (isoforma anormal da proteína do prião). As

PrPsc provocam o enrolamento incorrecto da proteína do prião nativa e consequente

agregação. Estes agregados disseminam-se no cérebro promovendo a

neurodegeneração (Irwin et al., 2013).

Estudos realizados recentemente revelaram que, na autopsia de pacientes com DP

que receberam implantes de tecido cerebral embrionário, os neurónios transplantados

desenvolveram agregados similares aos CL uma década após o transplante,

evidenciando a transmissão da α-Syn (Stefanova et al., 2009). Estas evidências foram

confirmadas por um outro estudo, realizado em ratinhos transgénicos, que sugere que

a ocorrência de transmissão da α-Syn das células neuronais do hospedeiro para as

células neuronais percussoras transplantadas (Desplats et al., 2009). Este mesmo

estudo demonstrou que a transmissão da α-Syn ocorre sem a necessidade de contacto

directo entre as células, insinuando o envolvimento de vias específicas de secreção,

exocitose ou endocitose (Desplats et al., 2009). Para além disso, a α-Syn foi detectada

no líquido cefalorraquidiano, no plasma, na saliva e no parênquima cerebral o que

suporta o envolvimento dos processos de secreção (Devic et al., 2011; El-Agnaf et al.,

2003; Emmanouilidou et al., 2011; Tokuda et al., 2006). Além do mais, a distribuição

dos CL descrita por Braak, pode ser interpretada como mais uma evidência da

disseminação da α-Syn (Bellucci, Zaltieri, et al., 2012; Braak, Ghebremedhin, Rüb,

Bratzke, & Del Tredici, 2004). Contudo são necessários mais estudos in vivo com o

intuito de comprovar esta hipótese.

Também as proteínas misfolding podem favorecer a propagação da α-Syn através

do aumento da associação desta proteína às vesículas (Jang et al., 2010). Foi

demonstrado que a α-Syn WT e a forma mutada A53T ao serem libertadas pelos

neurónios podem provocar uma resposta inflamatória em linhas celulares da microglia

o que leva a sugerir que a α-Syn segregada pode contribuir fortemente para a

neuroinflamação subjacente à DP, que por sua vez pode originar danos neuronais e

sinápticos (Alvarez-Erviti, Couch, Richardson, Cooper, & Wood, 2011).

A propagação pode provocar a agregação da α-Syn nas células receptoras,


59!

contribuindo, deste modo, para o início da disfunção sináptica na DP assim como, a

disseminação da patologia pode estar na origem dos mecanismos tóxicos nas células

receptoras (Bellucci, Zaltieri, et al., 2012). Foi provado recentemente, que as fibrilas

exogéneas de α-Syn têm a capacidade de induzir patologias associadas aos CL,

provocando uma diminuição selectiva das proteínas sinápticas, uma disfunção

progressiva da excitabilidade neuronal e a morte dos neurónios (Volpicelli, Luk, &

Patel, 2011).


! 60!

3.2 Sinfilina-1

3.2.1 Estrutura e Localização

O interesse na Sinfilina-1 surgiu aquando da sua identificação por Engelender et

al. como uma proteína com capacidade de interagir com a α-Syn in vivo (Engelender

et al., 1999). A interacção entre ambas as proteínas foi confirmada por diversos

estudos subsequentes in vivo e in vitro (Kawamata, Mclean, Sharma, & Hyman, 2001;

Wakabayashi, Engelender, Yoshimoto, Ross, & Takahashi, 2000).

Um estudo realizado por Engelender et al. demonstrou que a Sinfilina-1 interage

com a α-Syn e promove a formação de inclusões citoplasmáticas eosinofílicas

semelhantes aos CL presentes na DP (Engelender et al., 1999). Posteriormente,

Wakabayashi et al. identificou a Sinfilina-1 como componente dos CL em indivíduos

com DP sugerindo, assim, que a Sinfilina-1 pode desempenhar um papel na formação

dos CL e na fisiopatologia da DP através da interacção com a α-Syn (Wakabayashi et

al., 2000).

A Sinfilina-1 é uma proteína codificada pelo gene SNCAIP (SNCA Interacting

Protein) localizado no cromossoma 5q23.1-23.3 (Simone Engelender et al., 2000). É

constituída por 919 aminoácidos e possui uma massa molecular variável de 115-140

kDA até 80-90 kDA (Bandopadhyay et al., 2001; Krüger, 2004), contudo, pode ser

encontrada com massas moleculares inferiores, 50 kDA e 65 kDA, em extractos

cerebrais, sugerindo a ocorrência de mecanismos como splicing alternativo ou

modificações pós-traducionais (Krüger, 2004).

Esta proteína é constituída por diversos domínios proteicos incluindo seis

repetições arkyrin-like, o domínio coiled-coil, o domínio de ligação ATP/GTP

(Bandopadhyay et al., 2001; Beyer, 2006) e uma região altamente conservada de

função desconhecida (aminoácidos 612-689) (T. Takahashi et al., 2006). A cadeia de

aminoácidos da Sinfilina-1 aparenta um elevado estado de conservação. Num estudo

realizado por O’Farrell et al. esta proteína apresentou uma homologia de 86% na

cadeia de aminoácidos relativamente à expressa nos ratinhos, esta homologia aumenta

na região central da proteína que contém as repetições ankyrin-like e o domínio coiled

coil atingindo os 96,5%, sugerindo que estas sequências desempenham um papel

essencial na função da Sinfilina-1 (O’Farrell, Pickford, Vink, McGowan, & Cookson,

2002). Os domínios coiled coil e ankyrin-like estão presentes em diversas proteínas


61!

com diferentes funções, contudo, ambos estão relacionados com a interacção proteica

(V. Bennett & Chen, 2001; Burkhard, Stetefeld, & Strelkov, 2001). Desta forma, é

provável que a função da Sinfilina-1 esteja relacionada com a interacção entre

proteínas e a interacção com a α-Syn que, por sua vez, pode estar interligada com a

presença destes domínios (O’Farrell et al., 2002).

A Sinfilina-1 é expressa em diversos tecidos, atingindo níveis mais elevados no

cérebro, coração e placenta (Engelender et al., 1999; Satoh & Kuroda, 2002;

Wakabayashi et al., 2000). Em tecidos não patológicos cerebrais, a Sinfilina-1

apresenta um padrão de distribuição semelhante à α-Syn, sendo expressa com

preponderância a nível dos neurónios, nomeadamente os neurónios Purkinje, nigrais e

piramidais, localizando-se no citoplasma, ocorrendo uma migração gradual para os

terminais pré-sinápticos durante o desenvolvimento (Krüger, 2004; Ribeiro, Carneiro,

Ross, Menezes, & Engelender, 2002; T. Takahashi et al., 2006). Estudos in vitro

comprovaram que a Sinfilina-1 co-imunoprecipita com as vesículas sinápticas,

sugerindo que existe uma associação entre ambas in vivo (Ribeiro et al., 2002).

!

Figura 10 – Visão Esquemática da Sinfilina-1 – Com destaque para os locais de interacção com

diversas proteínas e o elevado estado de conservação entre a Sinfilina-1 humana e a do rato (Adaptado

de Krüger, 2004)

!


! 62!

3.2.2 Funções da Sinfilina-1

Assim como ocorre com a α-Syn, as funções da Sinfilina-1 permanecem pouco

claras. Foi demonstrado, in vitro, que a Sinfilina-1 é fosforilada pela glicogénio

sintetase quinase-3-beta (GSK3B) sugerindo que a Sinfilina-1 pode estar envolvida

nos mecanismos de transdução do sinal e/ou degradação proteica, visto que a

fosforilação está envolvida em diversos mecanismos fisiológicos, incluindo os

referidos anteriormente (Tanji et al., 2003).

Deste modo, especulou-se que a fosforilação da Sinfilina-1 poderia desencadear a

ubiquitinação e degradação desta proteína (Tanji et al., 2003). A identificação da

Sinfilina-1 como substrato da Parkina ubiquitina ligase E3 levou a que se estabelece-

se a possibilidade da Sinfilina-1 estar envolvida na função proteassomal (Chung et al.,

2001; Krüger, 2004). Para além disso, foi descoberto que a Sinfilina-1 também é

ubiquitinada e degradada por outras ligases E3: Dorfina, SIAH-1 e SIAH-2. Que por

sua vez estão todas presentes nos CL em cérebros de pacientes com DP estando,

portanto, relacionadas com os mecanismos neurodegenerativos (Ito et al., 2003; Liani

et al., 2004; Nagano et al., 2003).

A relação da Sinfilina-1 com o proteassoma foi comprovada aquando da

descoberta da interacção da Sinfilina-1 com a proteína S6 ATPase, que actua como

uma subunidade reguladora do proteassoma 19S com funções de degradação de

proteínas ubiquinadas, esta interacção reforça a possibilidade da Sinfilina-1 exercer

um papel fisiológico como moduladora do SUP (Krüger, 2004; F. Marx et al., 2007).

Como foi referido anteriormente, os níveis de Sinfilina-1, durante o

desenvolvimento, estão elevados nos terminais pré-sinápticos, havendo uma co-

imunoprecipitação da Sinfilina-1 com as vesículas sinápticas. Deste modo, foi

proposta a possibilidade da Sinfilina-1 exercer funções sinápticas em associação com

a α-Syn, do mesmo modo, o facto da Sinfilina-1 aparentar uma forte interacção com

as vesículas sinápticas sugere que esta possa interferir com o processo de libertação

da dopamina, contudo, o papel exacto da Sinfilina-1 na libertação da dopamina

permanece pouco claro (Büttner et al., 2010; Krüger, 2004; Nagano et al., 2003;

Ribeiro et al., 2002).

A Sinfilina-1 localiza-se preferencialmente em torno de gotículas lipídicas e a sua

sobre-expressão conduz a formação de inclusões membranares (Takahashi et al.,

2006). Posteriormente, foi confirmada a sua localização preferencial em torno de


63!

gotículas lipídicas num estudo em que se constatou que a Sinfilina-1 forma inclusões

em células de levedura que aparecem, inicialmente, em focos distintos em

endomembranas e gotículas lipídicas (Büttner et al., 2010). Desta forma, foi

confirmada a localização desta proteína em torno de gotículas lipídicas o que

comprova também a associação da Sinfilina-1 às vesículas sinápticas no cérebro. Foi

corroborado, neste mesmo estudo, que a Sinfilina-1 interage com as jangadas

lipídicas, tanto em dímero como em monómero, sendo que o dímero, no caso de ser

uma proteína mutante, pode voltar a ser reduzido (Büttner et al., 2010).

3.2.3 Envolvimento na doença de Parkinson

A hipótese da Sinfilina-1 estar envolvida na fisiopatologia da DP surgiu após a

descoberta da interacção desta proteína com α-Syn. Comprovou-se que a

co-expressão da Sinfilina-1 e da α-Syn, em culturas celulares, leva à formação de

agregados citoplasmáticos semelhantes aos CL (Engelender et al., 1999). Assim como

acontece com a α-Syn, diversos estudos revelaram que a Sinfilina-1 é uma das

proteínas constituintes dos CL em indivíduos com DP e encontra-se em corpos de

inclusão presentes em diversas doenças pertencentes ao grupo das sinucleinopatias

(Bandopadhyay et al., 2005; Murray et al., 2003; Wakabayashi et al., 2002, 2000).

Por outro lado, a descoberta de uma mutação pontual (R621C) no gene da

Sinfilina-1, em dois pacientes germânicos com DP esporádica, veio comprovar o

envolvimento desta proteína na DP (Marx et al., 2003). Para além disso, a Sinfilina-1

é um substrato da Parkina, uma proteína ubiquitina ligase E3, responsável pelas

manifestações autossómicas recessivas de parkinsonismo juvenil e a co-expressão de

ambas as proteínas leva ao aparecimento de inclusões intracelulares ubiquitinadas

semelhantes aos CL (Chung et al., 2001).

Como já foi mencionado anteriormente, existem diversas evidências de disfunções

do SUP na DP. Para além da função proteassomal se encontrar reduzida na SNpc na

DP esporádica, também foram detectadas mutações relacionadas com a DP familiar,

envolvendo proteínas relacionadas com o SUP como a Parkina e a UCL-L1 (Szargel,

Rott, & Engelender, 2008). Apesar da Sinfilina-1 não estar localizada no SUP, possui

a capacidade de interacção com diversas proteínas relacionadas como o SUP (Beyer

et al., 2009) para além de que é ubiquitinada e degradada por este mesmo sistema

(Szargel et al., 2008). A Sinfilina-1 interage com duas subunidades reguladoras do


! 64!

SUP, S6 ATPase e a NUB1 (Beyer et al., 2009). A interacção com a S6 ATPase não

só diminui a actividade proteassomal, como também a co-expressão destas proteínas,

em simultâneo, leva ao aumento da formação de inclusões intracitoplasmáticas. Tanto

a Sinfilina-1 como a S6 ATPase encontram-se presentes nos CL (Marx et al., 2007).

A proteína NUB1 diminui os níveis de Sinfilina-1 em estado estacionário, o que pode

ser indicativo que esta proteína pode estar envolvida na sinalização da Sinfilina-1 para

posterior degradação pelo proteassoma, porém, o mecanismo exacto pelo qual a

NUB1 acelera o processo de degradação da Sinfilina-1 e a identificação das ubiquinas

ligases E3 envolvidas neste mecanismo permanece por investigar (R Szargel et al.,

2008; Tanji et al., 2006).

A Sinfilina-1 interage e é ubiquitinada por diversas ubiquitinas Ligases E3:

Parkina, Dorfina, SIAH-1 e SIAH-2 (Chung et al., 2001; Ito et al., 2003; Liani et al.,

2004; Nagano et al., 2003). Relativamente à sua interacção com a Parkina, sabe-se

que a co-expressão de ambas leva à formação de inclusões intracelulares

ubiquitinadas que se assemelham aos CL, contudo, a Parkina não leva à degradação

da Sinfilina-1 (Chung et al., 2001; Ross & Pickart, 2004; R Szargel et al., 2008)

Quanto à SIAH-1 e SIAH-2, ambas promovem a degradação da Sinfilina-1 (Liani

et al., 2004). Contudo, a incapacidade do proteassoma de degradar a Sinfilina-1

ubiquitinada pela SIAH promove a formação de inclusões de Sinfilina-1. Tendo em

conta que a ubiquitinação da Sinfilina-1 é essencial para a formação de inclusões, a

forma mutada da Sinfilina-1, inábil de ser ubiquinada pela SIAH, não se agrega em

corpos de inclusão (Liani et al., 2004). Este conjunto de informação, juntamente com

o facto que a Sinfilina-1 isolada dos CL encontrar-se monoubiquitinada, sugerem que

a ubiquinação pode representar um evento primário na formação de inclusões na DP

(Szargel et al., 2008).

A fosforilação é uma modificação pós-traducional com capacidade de modular a

ubiquitinação de diversas proteínas (Hershko & Ciechanover, 1998). Como já foi

mencionado anteriormente, a α-Syn presente nos CL encontra-se não só fosforilada

como também monoubiquitinada sugerindo, não só um envolvimento de ambos os

mecanismos na DP, como também uma possível co-relação entre ambos (Anderson et

al., 2006; M. Hasegawa et al., 2002)

Diversas quinases fosforilam a Sinfinlina-1 in vivo e alteram a sua tendência a

agregar. A caseína quinase II fosforiliza a Sinfilina-1 diminuindo a interacção desta

com a α-Syn e a formação de inclusões. Contudo a ubiquitinação da Sinfilina-1 não


65!

sofre alterações (Avraham, Szargel, Eyal, Rott, & Engelender, 2005; G. Lee et al.,

2004). O que implica que a formação de inclusões de Sinfilina-1 possa depender de

outros factores para além da ubiquitinação, como a fosforilação e a interacção com a

α-Syn (Szargel et al., 2008).

Existem diversas evidências indicativas que certas proteínas quinases, como a

GSK3B e a Cdk5, modulam a neurodegeneração de neurónios dopaminérgicos em

modelos farmacológicos da DP (G. Chen et al., 2004; P. D. Smith et al., 2003). Foi

demonstrado que a Sinfilina-1 endógena é fosforilada pela GSK3B levando a uma

diminuição da ubiquitinação da Sinfilina-1 e da formação de inclusões. Ao passo que,

ao inibir a fosforilação da Sinfilina-1 pela GSK3B, ocorre um aumento significativo

de formação de inclusões de Sinfilina-1 (Avraham et al., 2005). Estes resultados

reforçam a hipótese de a ubiquitinação da Sinfilina-1 ser importante para a agregação

desta proteína, contudo, de um modo dependente da fosforilação (Szargel et al.,

2008).

In vivo, a Parkina é fosforilada pela proteína Cdk5, levando a uma diminuição da

autoubiquitinação e da capacidade de ubiquitinar a Sinfilina-1 (Avraham, Rott, Liani,

Szargel, & Engelender, 2007). Por outro lado, a forma mutante da Parkina, S131A, é

mais efectiva na ubiquitinação da Sinfilina-1 e promove uma maior formação de

corpos de inclusão. Confirma-se, deste modo, o envolvimento da Parkina na formação

de inclusões de Sinfilina-1 (Avraham et al., 2005; R Szargel et al., 2008).

Pode-se concluir que a ubiquitinação da Sinfilina-1 é modulada por diversas

proteínas quinases, podendo contribuir fortemente para a formação dos CL na DP (R

Szargel et al., 2008)

Inúmeros estudos evidenciam a ocorrência de elevados níveis de stress oxidativo

na DP, podendo contribuir de forma significativa para a neurodegeneração ocorrente

na DP (Dexter & Jenner, 2013; A. Xie, Yu, & Xu, 2010). Foi realizado um estudo

para observar a influência da Sinfilina-1 na expressão da SOD. A SOD é uma enzima

antioxidante de elevada importância, estudos in vitro e in vivo demonstraram os

efeitos neuroprotectores da SOD e, para além disso, a expressão reduzida de SOD

pode estar envolvida na patogénese da DP (Boll, Alcaraz-Zubeldia, Montes, & Rios,

2008; A. Xie et al., 2010). Os resultados obtidos demonstraram uma elevada

expressão de Sinfilina-1 na SNpc e uma significativa diminuição da expressão de

SOD, o que corrobora estudos realizados previamente (Krygowska-Wajs et al., 2008;

A. Xie et al., 2010). Estes resultados são indicativos que a Sinfilina-1 pode influenciar


! 66!

a patogénese da DP através da diminuição dos níveis de SOD que, consequentemente,

leva a um aumento de ROS e dos níveis de stress oxidativo (A. Xie et al., 2010).

Um estudo realizado por Li et al., demonstrou que a superexpressão da Sinfilina-1

diminuiu o tempo de duplicação celular e aumentou o desenvolvimento de neuritos e,

também, diminuiu significativamente a morte celular induzida pela rotenona. Estes

resultados, indicam que a Sinfilina-1 apresenta efeitos neurotrófico, in vitro, e que

pode desempenhar um papel protector na fisiopatologia da DP (X. Li et al., 2010).

Sinfilina R621C

A mutação no gene da Sinfilina-1 foi identificada pela primeira vez em dois

pacientes germânicos com DP esporádica e, aparentemente, não relacionados. Foi

decifrada uma transição de Citosina para uma Tirosina na posição 1861 na sequência

codificante, levando a uma substituição de uma Arginina por uma Cisteina na posição

621 da cadeia de aminoácidos (Marx et al., 2003).

Ao ser analisada, a mutação R621C revelou diminuir a viabilidade das células em

comparação com a Sinfilina-1 WT, apresentando uma maior susceptibilidade a

estímulos apoptóticos e ao stress oxidativo (X. Li et al., 2010; F. P. Marx et al., 2003).

Num estudo realizado por Krenz et al. em ratinhos, ambas as formas mutadas e WT

levaram à formação de inclusões e à degeneração de neurónios dopaminérgicos na

SNpc , contudo, a Sinfilina R621C induziu uma maior formação de agregados do que

a WT em ratinhos transgénicos A30P α-Syn, o que é consistente com o facto da

mutação R621C ser um factor de susceptibilidade para a DP (Krenz, Falkenburger,

Gerhardt, Drinkut, & Schulz, 2009).

Sinfilina-1A

A Sinfilina-1A é uma isoforma da Sinfilina-1 resultante do splicing alternativo,

esta variante tem um codão inicial diferente da Sinfilina-1, não apresentando os

primeiros 394 aminoácidos do codão inicial da Sinfilina-1 e contém 28 aminoácidos

adicionais na região N-terminal e 51 aminoácidos adicionais na região C-terminal

(Szargel et al., 2008).

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67!

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Figura 11 - Representação Esquemática da Sinfilina-1 e da Sinfilina-1A (Adaptado de R Szargel et

al., 2008)

A Sinfilina-1A apresenta elevada toxicidade celular e encontra-se presente nos CL

na DP. Esta proteína mostra uma propensão para agregar espontaneamente nas células

dopaminérgicas humanas, e tem a capacidade de agregação sem que haja inibição da

actividade proteassomal, ao passo que a Sinfilina-1 apenas forma agregados quando

há inibição do sistema proteassomal (Eyal & Engelender, 2006; Eyal et al., 2006).

Esta proteína interage tanto com a Sinfilina-1 como com a α-Syn, tendo a

capacidade de recrutar ambas as proteínas para dentro de corpos de inclusão (Szargel

et al., 2008). A capacidade da Sinfilina-1A de recrutar a α-Syn e a acumular dentro de

inclusões sugere um função neuroprotectora dos corpos de inclusão contra a

toxicidade da Sinflina-1A (Szargel et al., 2008). A percentagem exacta de Sinfilina-

1A nos CL não é conhecida, contudo, o facto de interagir tanto com a Sinfilina-1

como com a α-Syn sugere que esta proteína possa estar envolvida na formação dos

CL (Eyal & Engelender, 2006; Szargel et al., 2008). Para além disso, devido à sua

neurotoxicidade intrínseca, mudanças na força de interacção entre a Sinfilina-1A e a

α-Syn podem não só influenciar a formação de CL como também a morte de

neurónios dopaminérgicos (Beyer et al., 2009; Eyal et al., 2006).

A Sinfilina-1A actua, também, como reguladora da SIAH, diminuindo a actividade

da ubiquitina ligase E3 SIAH. Esta proteína também diminui a monoubiquitinação da

α-Syn promovida pela SIAH assim como a formação de inclusões de α-Syn. Por outro

lado, a SIAH ubiquitina a Sinfilina-1A e aumenta a formação de inclusões mas não

promove a sua degradação. Estes dados sugerem que a Sinfilina-1A tem a capacidade

de regular a actividade da SIAH, com implicações na regulação da

monoubiquitinação e agregação da α-Syn (Szargel et al., 2009).


! 68!

3.3 Interacção da alfa-Sinucleína com a Sinfilina-1

Como mencionado anteriormente, a α-Syn interage, in vivo, com a Sinfilina-1

(Engelender et al., 1999). Já foi relatado que diversas porções da Sinfilina-1

interagem com a α-Syn, contudo, o local exacto em que as proteínas interagem entre

si e efeito que esta interacção desempenha na formação dos CL permanece

controverso (Xie et al., 2010). Se por um lado existem estudos onde é referido que a

interacção entre ambas as proteínas apenas envolve a região N-terminal da α-Syn e a

região central da Sinfilina-1 (Engelender et al., 1999; Neystat, Rzhetskaya,

Kholodilov, & Burke, 2002). Por outro lado, estudos realizados através de métodos

diferentes referem que a região C-terminal da α-Syn e a região N ou C-terminal da

Sinfilina-1 estão envolvidas na interacção entre as proteínas (Kawamata et al., 2001;

Ribeiro et al., 2002).

No entanto, o modelo mais aceite actualmente foi proposto por Xie et al.. Este

modelo sugere que a interacção entre ambas a proteínas ocorre através do domínio

central coiled-coil da Sinfilina-1 e a região N-terminal da α-Syn (Xie et al., 2010)

Este modelo, representado na figura 11, propõe que a Sinfilina-1 forma um dímero

anti-paralelo através do domínio central coiled coil, apresentando duas interfaces

opostas do mesmo domínio coiled coil para a ligação à α-Syn. Deste modo, duas

moléculas de α-Syn ligam-se através da região N-terminal às hélices coiled coil da

Sinfilina-1 (Xie et al., 2010). A região N-terminal da α-Syn, parece ser beneficiada ao

ligar-se aos domínios coiled coil, tornando-se mais compacta e estruturada. Esta

Figura 12 - Representação Esquemática da Interacção entre a α-Syn e a Sinfilina-1 (Adaptado de

Xie et al., 2010)


69!

interacção pode permitir à Sinfilina-1 um recrutamento eficaz da α-Syn e, deste modo,

estimular a acumulação desta proteína nas células (Xie et al., 2010)

A interacção entre ambas as proteínas pode ter um impacto elevado na agregação e

formação de inclusões celulares. A sobre-expressão de Sinfilina-1 leva à formação de

inclusões citoplasmáticas, ao passo que a sobre-expressão da α-Syn WT, por si só,

não é suficiente para a formação destas inclusões (Hasegawa et al., 2004; Ito et al.,

2003; O’Farrell et al., 2002; Xie et al., 2010)

Um estudo realizado pro Hernández-Vargas et al., demonstrou que quando a

Sinfilina-1 e a α-Syn são expressas de modo independente em neurónios

dopaminérgicos, é observado um aumento de toxicidade destas proteínas. Contudo, a

co-expressão de ambas reverte os fenótipos, estes dados sugerem que um

desequilíbrio na concentração de ambas as proteínas é altamente prejudicial para os

neurónios dopaminérgicos (Hernández-Vargas et al., 2011).

Em resumo, a interacção específica entre ambas as proteínas promove

significativamente a formação e acumulação de inclusões citoplasmáticas, que muito

provavelmente incluem α-Syn na sua composição. A investigação da interacção entre

a Sinfilina-1 e a α-Syn permite adquirir um maior conhecimento sobre o mecanismo

de formação destas inclusões nas células e a sobre o seu impacto na DP e outras

doenças neurodegenerativas (Xie et al., 2010).


! 70!

3.4 Agregação proteica e a formação de corpos de inclusão : Toxicidade

ou Neuroprotecção?

Em diversas doenças neurodegenerativas, incluindo a DP, ocorrem interacções

proteicas não comuns no SNC e em todas estas doenças, estão presentes depósitos de

agregados proteicos no cérebro dos pacientes. A agregação proteica pode dever-se a

diversos factores, como mutações, ou pode não estar relacionado com mecanismos

genéticos e ser desencadeado por factores ambientais ou pelo envelhecimento (Ross

& Margolis, 2005).

Apesar dos corpos de inclusão serem características patológicas das doenças

neurodegenerativas, existe uma elevada controvérsia em relação ao papel que a

agregação proteica desempenha no desenvolvimento da doença. As conformações

anormais das proteínas e a agregação são características comuns destas doenças, e

existem diversas linhas de evidência que relacionam a agregação com a toxicidade

celular (Ross & Poirier, 2005). Contudo, ainda não foram identificados os factores

que promovem a formação dos CL nem a sua função na fisiopatologia da DP, não

sendo claro se promovem ou inibem a toxicidade celular (Beyer et al., 2009).

Se por um lado os corpos de inclusão aparentam ser prejudiciais para as células na

medida em que o número de CL está relacionado com a severidade dos sintomas

clínicos na demência com CL (Tanaka et al., 2004) por outro lado, podem estar

relacionados com mecanismos protectores através do sequestro de espécies tóxicas,

considerando que os neurónios com CL em cérebros afectados aparentam estar mais

saudáveis que os neurónios vizinhos (Tompkins & Hill, 1997). Para além disso,

estudos post-mortem em idosos assintomáticos apresentaram muitas vezes CL

(Tanaka et al., 2004). Adicionalmente, apesar das doenças que envolvem a presença

de CL apresentarem uma vasta perda dos neurónios dopaminérgicos, uma elevada

percentagem de neurónios sobreviventes possuem inclusões intracelulares sob a forma

de CL, indicando que estas inclusões tem um efeito protector para a célula em relação

as proteínas misfolded ou disfuncionais (Beyer et al., 2009). Apesar da realização de

diversas pesquisas, a presença de corpos de inclusão relaciona-se fracamente com

outros marcadores de neurodegeneração. Incluindo na DP, em que existe uma baixa

correlação entre a presença dos CL e a neurodegeneração na SNpc (Tompkins & Hill,

1997).


71!

Como já foi mencionado anteriormente, a Sinfilina-1A possui a capacidade de se

agregar numa larga percentagem de células sem que haja inibição proteassomal,

apresentando uma elevada toxicidade celular (Eyal et al., 2006). A sobre-expressão da

Sinfilina-1A provoca uma diminuição dos processos neuronais e aumenta a morte

celular. Para além disso a Sinfilina-1A forma agregados e acumula-se, contudo, a

formação de corpos de inclusão só ocorre quando existe inibição proteassomal, o que

sugere que a acumulação de proteínas ubiquitinadas é necessária para a agregação da

Sinflina-1A em corpos de inclusão. Para além disso, os neurónios que contém corpos

de inclusão de Sinfilina-1A exibem uma redução da morte celular e uma diminuição

dos processos neuronais, indicando que a formação deste corpos de inclusão tem um

efeito protector contra a toxicidade da Sinfilina-1A (Eyal & Engelender, 2006).

Considerando que as inclusões de Sinfilina-1A recrutam a Sinfilina-1, a formação

das inclusões semelhantes aos CL pode envolver a interacção de ambas as proteínas,

possivelmente mediada pelos domínios arkyrin-like de ambas (Eyal et al., 2006). Para

além disso, o facto da Sinflina-1A também interagir com a α-Syn, e ter a capacidade

de a recrutar para dentro dos corpos de inclusão nos neurónios, indica que o modelo

de agregação da Sinflina-1A pode ser relevante no estudo da DP (Eyal & Engelender,

2006).

A Sinfilina-1 aumenta fortemente a toxicidade da α-Syn em culturas celulares

(Szargel et al., 2008). É de interesse realçar que células que apresentam corpos de

inclusão de Sinfilina-1 e α-Syn são relativamente poupadas, implicando que as

inclusões tem um papel citoprotectivo (Tanaka et al., 2004). Concordantes com esta

hipótese, diversos estudos sugerem que as inclusões de α-Syn, formadas por uma

sobre-expressão de Sinfilina-1, representam agregossomas que podem ser eliminados

da célula por autofagia, sendo assim considerados citoprotectivos (Büttner et al.,

2010; Ralph et al., 2005; W. W. Smith et al., 2010; Zaarur, Meriin, Gabai, &

Sherman, 2008).

Por outro lado, as inclusões formadas principalmente por α-Syn monoubiquitinada

são tóxicas para a célula, o que pode estar relacionado com a natureza amorfa dos

agregados de α-Syn monoubiquitinada (Rott et al., 2008). De facto, acredita-se que as

formas olígomericas ou protofibrilares são as espécies tóxicas de α-Syn (Caughey &

Lansbury, 2003). Nos CL os agregados proteicos amorfos localizam-se no centro

enquanto que as fibrilas se encontram na periferia, o que sugere fortemente que os CL


! 72!

podem apresentar toxicidade para as células nos seus estágios iniciais de formação

(Baba et al., 1998; Simone Engelender, 2008).

É interessante a possibilidade de, apesar das inclusões que contém principalmente

α-Syn monoubiquitinada serem tóxicas para a célula, a co-agragação com outras

proteínas relacionadas com a DP, como as isoformas da Sinfilina-1A, poderem

contrariar esta toxicidade. Deste modo, é possível que os CL tenham a capacidade de

promover tanto a neurotoxicidade como ter um efeito protector, consoante a sua fase

de maturação (Simone Engelender, 2008)

!Figura 13 - Representação Esquemática da Formação de Corpos de Inclusão em Modelos

Celulares da DP. (Adaptado de Engelender, 2008)

Desta forma, as inclusões citoplasmáticas podem estar relacionadas com um

processo activo de protecção contra as proteínas misfolding ao isola-las. Podendo a

sua formação não resultar apenas da acumulação de proteínas misfolding, e dever-se a

uma medida defensiva de forma a remover espécies tóxicas (Dauer & Przedborski,

2003; Ross & Pickart, 2004; R Szargel et al., 2008)

Devido à tendência de agregação das proteínas e as consequências referidas

anteriormente, as células exibem diversos mecanismos protectores contra as proteínas

misfolding. A primeira linha de defesa é efetuada pelos chaperonas moleculares.

Outro mecanismo envolve, como já mencionado diversas vezes anteriormente, a


73!

degradação pelo proteassoma (Berke & Paulson, 2003; Ross & Pickart, 2004). O facto

de haver diversas mutações, na DP familiar, em proteínas que se encontram

fortemente relacionadas com o SUP, sublinha a relevância deste na DP (Rogers,

Paine, Bedford, & Layfield, 2010; Ross & Poirier, 2005). Por fim, existe o

mecanismo de defesa que envolve a autofagia, no qual diversas proteínas

citoplasmáticas são degradadas por via do lisossoma. A autofagia mediada por

chaperonas pode ser activada pelo stress oxidativo e está envolvida na degradação da

α-Syn (Cuervo, Stefanis, Fredenburg, Lansbury, & Sulzer, 2004).

Por fim, existe uma ultima linha de defesa, em que a célula pode sequestrar

agregados através do transporte mediado pelos microtúbulos e recolhe-los num único

local citoplasmático perto do centríolo (Johnston, Ward, & Kopito, 1998; Ross &

Poirier, 2005). Este processo leva à formação de corpos de inclusão que apresentam

elevada similaridade com os CL (Iwata et al., 2005; Johnston et al., 1998; C. W.

Olanow, Perl, Demartino, & Mcnaught, 2004). Para além disso, os CL contém y-

tubilina e pericentrina, marcadores do centrossoma, enzimas activadoras da

ubiquitina, activadores do proteassoma, assim como, marcadores da autofagia

apresentando, também, elementos do citoesqueleto. Considerando a sua composição,

os CL representam muito provavelmente o produto final de um processo celular

activo (Ross & Poirier, 2005).

Relativamente aos mecanismos de toxicidade, já foram propostas diversas

hipóteses como a inibição do proteassoma pelas proteínas misfolding.

Interessantemente, forma mutante da α-Syn provoca a inibição do proteassoma. Este

facto é de especial interesse, pois uma exposição sistemática a inibidores do

proteassoma provocou uma síndrome com características semelhantes à DP em ratos,

acompanhado de perda de neurónios dopaminérgicos na SNpc, diminuição dos

terminais de dopamina no estriado e uma disfunção progressiva do movimento com

resposta à terapêutica com agonistas da dopamina (McNaught, Perl, Brownell, &

Olanow, 2004). Uma outra possibilidade recai sobre alterações na autofagia

provocada por proteínas alteradas, como é o caso da forma mutante da α-Syn que

prejudica a autofagia mediada por chaperonas (Massey, Kiffin, & Cuervo, 2004). Por

outro lado, uma hipótese mais generalista para a relação entre a toxicidade e a

agregação incide sobre a possibilidade de que a toxidade possa depender de

interacções ou recrutamento de outros componentes celulares durante o processo de

agregação podendo desta forma, nenhuma espécie ser tóxica por si própria mas que o


! 74!

seu ganho de toxicidade se deva ao processo activo de agregação e a interacções com

outras proteínas (Ross & Poirier, 2005).

Assim, analisando as evidências, surge a forte indicação que a formação de corpos

de inclusão pode ser uma resposta protectora da célula contra proteínas misfolding.

Ross et al., sugerem que o processo de agregação por si próprio está provavelmente

relacionado com a toxicidade e que podem existir mecanismos de toxicidade comuns

entre as doenças que apresentam agregação de proteínas e corpos de inclusão (Ross &

Poirier, 2005).

Considerações Finais

75!

4. Considerações Finais

Neste trabalho foram discutido os aspectos gerais da DP, com enfâse nos

mecanismos moleculares envolvendo a α-Syn e a Sinflina-1. A DP afecta 1% da

população com idades superiores a 60 anos, contudo, permanece incurável e a

terapêutica disponível é apenas sintomática não evitando a neurodegeneração nem a

progressão da DP. É, deste modo, crucial aprofundar os conhecimentos sobre a

patogénese da doença e os mecanismos envolvidos de forma a permitir o

desenvolvimento de uma terapêutica capaz de impedir ou abrandar o processo de

neurodegeneração na DP.

A descoberta de mutações no gene SNCA associados à DP familiar levaram à

realização de numerosos estudos com o intuito de esclarecer as funções da α-Syn,

assim como o seu envolvimento na DP. Contudo, estes ainda permanecem por

elucidar. O conhecimento detalhado das funções da α-Syn e o seu papel na DP é de

extrema importância pois pode conduzir a novas estratégias terapêuticas. Estudos

sugerem que o processo de agregação da α-Syn está associado à toxicidade desta.

Contudo, diversas evidências apontam as formas oligoméricas desta proteína como a

espécie tóxica, porém ainda não foi comprovado. Perceber qual a espécie tóxica

envolvida na formação de fibras é de grande importância para possibilitar o

desenvolvimento de estratégias de intervenção e, desta forma, interferir com o

processo de agregação e reduzir a toxicidade desta proteína. Por outro lado, outra

linha de intervenção pode estar relacionada com o envolvimento da alfa-Sinucleína

extracelular na progressão da DP, o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica

com capacidade de interferir com este processo poderia abrandar ou até mesmo parar

a disseminação da DP.

Também as funções exactas da Sinfilina-1 e o seu envolvimento concreto na

fisiopatologia da DP permanecem pouco claras. É de elevado interesse aprofundar os

conhecimentos sobre esta proteína devido ao seu envolvimento no SUP e nas funções

sinápticas. Também a identificação da mutação R621C no gene da Sinfilina-1, em

casos de DP familiar, evidência a relevância desta proteína na DP. Esta proteína não

só esta presente nos CL, como também interage com α-Syn e está envolvida nos

processos de agregação. Isto suporta o facto desta proteína estar implicada na

neurodegeneração. Parece ser necessário a comunidade científica realizar mais


! 76!

estudos nesta área de forma a encontrar um novo alvo terapêutico e desenvolver

novas estratégias terapêuticas.

Conclui-se que é de extrema importância a realização de mais estudos sobre ambas

as proteínas e também sobre a sua interacção, assim como aprofundar o conhecimento

sobre o papel exacto que ambas desempenham na DP, assim como qual o mecanismo

exacto pelo qual estas proteínas provocam toxicidade celular de forma a intervir no

processo de degeneração característico da DP.

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77!

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