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Evaluación de un Proceso Cromatográfico para la Obtenciónde Extractos Fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris)
Libres de Sustratos de Polifenoloxidasa-Edición Única
Title Evaluación de un Proceso Cromatográfico para la Obtenciónde Extractos Fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris) Libres deSustratos de Polifenoloxidasa-Edición Única
Issue Date 2003-12-01
Publisher Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
Item Type Tesis de maestría
Downloaded 27/05/2018 05:02:14
Link to Item http://hdl.handle.net/11285/567571
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOSSUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURAPROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LAOBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus
vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENEREL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIASCON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ
MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOSSUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURAPROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LAOBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus
vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARAOBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIASCON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ
MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003
INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DEMONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesispresentado por el Lic. Oscar Alejandro Aguilar Jiménez sea aceptado como requisitoparcial para obtener el grado académico de Maestro en Ciencias con especialidad en:
BIOTECNOLOGÍA
Comité de Tesis:
Carmen Hernández Brenes, Ph.DAsesor
Marco Antonio Rito Palomares, Ph.DSinodal
Mario Moisés Álvarez, Ph.DSinodal
Federico Viramontes Brown, Ph. D.Director del Programa de Graduados en Ingeniería
Diciembre de 2003
Aprobado:
I
RESUMEN
Las antocianinas han despertado interés debido a sus propiedades nutracéuticas
además de la amplia variedad de colores que despliegan en soluciones acuosas en función del
pH, en aplicaciones en alimentos, para el reemplazo de colorantes de origen sintético. Sin
embargo, una de las limitaciones para el uso de las antocianinas es su baja estabilidad, debido
a su estructura química, factores ambientales y a la presencia de otros fitoquímicos en
solución. El establecimiento de estrategias para la estabilización de estos pigmentos en
soluciones acuosas ha conducido al uso de sustancias llamadas copigmentos, los cuales
tienen la capacidad de incrementar el poder de tinción de estas moléculas de color, por
modificación de sus propiedades espectrales. El empleo de copigmentos como estabilizadores
de antocianinas tiene la desventaja de que la polifenoloxidasa es capaz de usar algunas
moléculas de copigmento como sustratos, conduciendo a la degradación de los mismos y de
las antocianinas, con la consecuente pérdida de las propiedades nutracéuticas del alimento. En
el presente trabajo se planteó como objetivo, obtener un extracto de tomillo (Thymus vulgaris)
libre de sustratos de polifenoloxidasa y con capacidad de copigmentación similar a la de los
copigmentos obtenidos a través del proceso comercial original para ser empleado en ensayos
copigmentación de jugo de fresa (Fragaria anannassa).
Se probaron dos resinas, una aniónicas una fuerte y una débil para modificar el
proceso comercial de obtención de extractos de tomillo, lo que condujo a la obtención de un
nuevo extracto con una reducida capacidad de ser usado como sustrato de polifenoloxidasa,
(extracto fuerte) en comparación con el extracto original en ensayos modelo. En el segundo
estudio, se concluyó que el extracto tratado con la resina fuerte, poseía una capacidad de
copigmentación mayor que el extracto tratado con la resina aniónica débil, incluso mayor que el
extracto original.
El efecto de las resinas aniónicas sobre el extracto de tomillo se evaluó en el tercer
estudio, donde se determinó la composición química de los extractos por cromatografía de
líquidos de alta resolución con detector de fotodiodos. Se determinó que el efecto de ambas
resinas aniónicas fue en la remoción de compuestos que participan del contenido de fenólicos
totales de los extractos, sin embargo en el caso de la resina aniónica fuerte se logra disminuir
selectivamente la concentración de compuestos específicos susceptibles a la oxidación por
acción de la polifenoloxidasa del sistema, mejorando a su vez las propiedades de dicho
extracto para ser usado como copigmento en jugos de fresa.
II
DEDICATORIA
A mis padres, a quien les debo todo lo que soy y lo que seré…….. son un
verdadero ejemplo de dedicación y esfuerzo constante, siempre viendo por el
bienestar de sus hijos.
Con todo mi cariño. Muchas Gracias
Mis evidencias convencen al ignorante, y las evidencias delsabio me convencen a mí. Pero aquel cuyo razonamiento se
halla a la mitad del camino entre la sabiduría y la ignorancia, nipuedo convencerle yo a él, ni puede convencerme él a mí.
Khalil Gibran– Máximas Espirituales –
III
AGRADECIMIENTOS
A mi asesora, la Dra. Carmen Hernández, por dedicarme su tiempo en una etapa muy
especial de su vida. Felicidades.
A mis sinodales, sin duda un apoyo para la elaboración de este documento, y los
maestros, que de una u otra forma dejan su huella en mi formación durante este año y medio.
A mis amigos y compañeros de viaje……. Helena, Balta, Nidya, Ana, Oscar, Jorge y
Benito…….. mucha suerte.
A Isabel, Mayra, Gaby, Armando…… y a todo el mundo ya!! Mil gracias
IV
LISTA DE CONTENIDO
RESUMEN ....................................………………….............………………..…...........….…....…
DEDICATORIA .........................................................…………....…………………............…......
AGRADECIMIENTOS...……....…………………………….....................................…............…..
TABLA DE CONTENIDO .....……....…................................................................…...…...........
LISTA DE TABLAS…...….........................……………………………………………...….............
LISTA DE FIGURAS ……..……….....…………………….................……………......…..............
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................
CAPITULO 1 – REVISIÓN DE LITERATURA............................................................................
1.1 ANTOCIANINAS..................................................................................................................
1.1.1 Estructura Química.....................................................................................................
1.1.2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza................................................................
1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución............
1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad..........................................................................
1.1.4.1 pH.....................................................................................................................
1.1.4.2 Temperatura ....................................................................................................
1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico ..............................................................................
1.1.4.4 Enzimas ............................................................................................................
1.1.4.5 Iones Metálicos..................................................................................................
1.1.4.6 Copigmentos......................................................................................................
1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS............................................................................
1.2.1 Clasificación y Estructura Química.............................................................................
1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en Tomillo.........................................
1.2.3 Características Espectrales........................................................................................
1.2.4 Fraccionamiento de Extractos Fenólicos....................................................................
1.2.5 Función como sustratos de polifenoloxidasa..............................................................
1.3 COPIGMENTACIÓN............................................................................................................
1.3.1 Tipos de copigmentación............................................................................................
1.3.1.1 Autoasociación..............................................................................................
1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular.....................................................................
1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular.....................................................................
1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos............................................................
I
II
III
IV
VII
VIII
IX
1
1
1
4
5
8
8
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9
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20
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21
21
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23
24
V
1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas.............................
CAPITULO 2. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE
POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.......................................................
2.1 INTRODUCCIÓN.................................................................................................................
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................
2.2.1 Materiales..................................................................................................................
2.2.2 Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso
comercial...................................................................................................................
2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo....................................................
2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial........................................
2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos.........................
2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-
Ciocalteau......................................................................................
2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de
Glories............................................................................................
2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO................
2.2.3 Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos
fenólicos de tomillo en jugo de fresa.....................................................................
2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa...........................................................................
2.2.3.1a Clarificación enzimática...................................................................
2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método
de pH diferencial............................................................................
2.2.3.1c Determinación de antocianinas por HPLC-PDA..............................
2.2.3.2 Sistemas de Copigmentación........................................................................
2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación...........................................................
2.2.3.3a Propiedades espectrales.................................................................
2.2.3.3b Método de pH diferencial.................................................................
2.2.3.3c Color instrumental............................................................................
2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color
polimérico......................................................................................
2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas............................................................
2.2.4 Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por
cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos.
2.2.4.1 Método de separación cromatográfica por HPLC..........................................
2.2.4.2 Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos individuales............
2.2.4.3 Procedimiento de interpretación espectros UV-Visible..................................
24
26
26
28
28
28
28
29
30
30
30
30
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32
32
33
33
33
33
33
34
34
35
35
VI
2.2.5 Análisis Estadístico.................................................................................................
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................
2.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES......................................................................
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................................
ANEXOS....................................................................................................................................
VITA...........................................................................................................................................
36
37
63
65
70
79
VII
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas................................................................................
Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de su
patrón de hidroxilación................................................................................................................
Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos..............................................................
Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris................................................................
Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos......................
Tabla 2.1 Programa de elución por gradiente para separación cromatográfica de flavonoides.
Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) de
acuerdo con el método de Glories..............................................................................................
Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado por
cromatografía aniónica...............................................................................................................
Tabla 2.4 Velocidades de formación de producto por la acción enzimática de polifenoloxidasa
sobre extractos de tomillo y catequina.......................................................................................
Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedades
espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)....................................................................
Tabla 2.6 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º
iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con tres tipos de
extracto de tomillo......................................................................................................................
Tabla 2.7 Efecto de la adición de los extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris) sobre las
determinaciones de antocianinas, densidad de color, color polimérico y porcentaje de color
polimérico del jugo de fresa (Fragaria anannassa)....................................................................
Tabla 2.8 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º
iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con iones aluminio.
Tabla 2.9 Efecto de la adición de iones aluminio sobre las propiedades espectrales del jugo de
fresa (Fragaria ananassa)..........................................................................................................
Tabla 2.10 Identificación de picos cromatográficos en extracto de tomillo crudo por HPLC-PDA
Tabla 2.11a Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-
PDA............................................................................................................................................
2
6
15
18
20
35
38
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41
45
y
47
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50
50
t
51
51
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58
VIII
Tabla 2.11b Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-
PDA. (continuación)...................................................................................................................
Tabla 2.12 Concentraciones molares necesarias de copigmento y pigmento para los 5 niveles
de copigmentación.....................................................................................................................
Tabla 2.13 Volúmenes de jugo, copigmento y solución reguladora de citratos necesarios para
cada nivel de copigmentación con los tres extractos.................................................................
Tabla 2.14 Volúmenes de jugo, solución de aluminio y solución reguladora de citratos
necesarios para cada nivel de copigmentación.........................................................................
59
72
73
73
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas.........................................................................................
Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en el equilibrio de las antocianinas...............................
Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles.................................
Figura 1.4 Subclases de flavonoides.........................................................................................
Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografía
aniónica. Flujo de 4 mL/min.......................................................................................................
Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo con
polifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5....................................
Figura 2.3 Cambio en la apariencia del jugo de fresa después de la clarificación....................
Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragaria
anannassa) a 520 nm.................................................................................................................
Figura 2.5 Cambios visuales causados por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre
jugo de fresa (Fragaria ananassa).............................................................................................
Figura 2.6 Cromatograma HPLC-PDA del extracto de tomillo crudo recolectado a tres
longitudes de onda.....................................................................................................................
Figura 2.7 Comparación entre cromatogramas HPLC-PDA de extracto de tomillo crudo con los
tratamientos con resinas aniónicas a 335 nm............................................................................
Figura 2.8 Efecto batocrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las
propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................
Tabla 2.9 Efecto hipercrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las
propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................
Figura 2.10 Espacio de color CIELAB.......................................................................................
Figura 2.11 Disco de tonalidades de acuerdo a su valor de ángulo de color (hue)..................
Figura 2.12 Modificación en la concentración de cuatro compuestos por efecto del tratamiento
con resinas aniónicas.................................................................................................................
3
8
16
17
29
41
43
43
46
54
y
57
6
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t
75
76
77
78
X
LISTA DE ABREVIATURAS
ε Absortividad molar de la antocianina de interés∆%Abs Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas(-) Levógiro(+) Dextrógiroµm Micrómetrosλmax Longitud de onda de máxima absorbanciaλmax A Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas sin
copigmentarλmax AC: Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas
copigmentadas½O2 Medio mol de oxígeno1H-RMN Resonancia magnética nuclear de ion hidrógeno2R Posición de carbono quiral dextrógiro3S Posición de carbono quiral levógiroA AbsorbanciaAλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin
copigmentarAλ�max Absorbancia a la longitud de onda máximaA440 Absorbancia a 440 nanómetrosA700 Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5AAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con aguaAA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con aguaAA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con aguaACλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas
copigmentadas.Al3+ Ion aluminioAlCl3 Cloruro de aluminioAMT Antocianinas monoméricas totalesANOVA Análisis de VarianzaAp Apigeninidinaarctan ArcotangenteAu AurantinidinaAvis-max Absorbancia a 700 nanómetrosBHT Hidroxitolueno butiladoC CarbonoCλ�max Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las
antocianinas copigmentadas.C* Saturación de color ó ChromaC.V. Capital VariableC18 Resina de 18 carbonosCA CaliforniaCAT CatequinaCD3OD Metanol deuteradoCIE Commission Internationale de l’EclairagesCo CompanyCp CapensinidinaCy CianidinaD65 Fuente de iluminación luz de díaDp DelfinidinaE –Cu2+ Enzima-ion cobre(II)E.C. Enzyme Commission
XI
E.U.A. Estados Unidos de AméricaEa Energía de activaciónEAG Equivalentes de ácido gálicoEc. EcuaciónEt al. Y otrosEu EuropinidinaFD Factor de dilucióng GramoGa3+ Ion galioH Hidrógenoh* Ángulo de color ó HueH2O AguaHCl Ácido clorhídricoHPLC Cromatografía de Líquidos de Alta ResoluciónHs HirsutidinaI Fuerza iónicain PulgadaInt InternationalKAl(SO4)2 Alumbrekg KilogramokJ/mol Kilojoules por molL LitroL* LuminosidadLt LuteolinidinaM MolarMA MassachusettsMB Manitobamg MiligramoMg2+ Ion magnesiomeq miliequivalentesMI Mississippimin MinutosmL MililitroMv MalvidinaN NormalNaCl Cloruro de sodioNaOH Hidróxido de sodioNC Carolina del NorteNH4OH Hidróxido de amonioNL Nuevo Leónnm NanómetrosO OxígenoºC Grados centígradosºF Grados FahrenheitOH Grupo hidroxiloOMe Grupo metoxiloPA PennsylvaniaPA308 Resina aniónica fuertePDA Photodiode ArrayPg PelargonidinapH Potencial de hidrógenopKa Función p de la constante de disociación ácidaPl PulchelidinaPM Peso molecular
XII
Pn Peonidinappm Partes por millónPPO PolifenoloxidasaPt PetunidinaPTFE PolitetrafluoroetilenoR1 Sustituyente 1R2 Sustituyente 2RPLC Cromatografía liquida en fase reversarpm Revoluciones por minutoRs RosinidinaRx RadicalS.A. Sociedad AnónimaSAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con bisulfitoSA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfitoSA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con bisulfitoseg SegundosSO2 Dióxido de azufreSt SaintTr TricetinidinaU/mL Unidades por mililitroUV UltravioletaWA30 Resina aniónica débil
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
1
CAPITULO 1
REVISIÓN DE LITERATURA
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
1.1 ANTOCIANINAS
El color juega un papel muy importante en nuestra apreciación de la calidad en
alimentos y bebidas; es apreciado desde un punto de vista estético, así como para el
aseguramiento de calidad. A este respecto, el color nos proporciona claves visuales para la
identificación de sabor, influenciando el gusto por el alimento, su aceptabilidad y por último, la
elección por parte del consumidor (Bridle y Timberlake, 1996).
Las antocianinas comprenden el grupo mas grande de pigmentos solubles en agua en
el reino vegetal, y son especialmente características de las plantas angiospermas. Están
ampliamente distribuidas en al menos 27 familias, 73 géneros y multitud de especies (Bridle y
Timberlake, 1996). En el tejido vegetal, las antocianinas son pigmentos naturales, de la familia
de los polifenoles, responsables de los colores rojos, azules y púrpuras que se encuentran en
muchas flores y frutos. Al estar presentes en los hollejos de la uva, le dan color a los vinos
tintos (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).
1.1.1 Estructura Química
La estructura de una antocianina comparte el esqueleto de carbono C6C3C6 de otros
flavonoides naturales y el mismo origen biosintético (Jackman y Smith, 1996). Son glicósidos
con el esqueleto de una antocianidina. Las agliconas son raramente encontradas en productos
vegetales frescos (Clifford, 2000), y difieren de otros flavonoides naturales por su característica
de absorber fuertemente la luz visible. El rango de colores asociados con las antocianinas
resulta de su habilidad de formar estructuras resonantes a partir del núcleo principal C6C3C6 y
varios factores a su alrededor (Jackman y Smith, 1996). En la naturaleza se encuentran en la
forma de glicósidos dieciocho diferentes antocianidinas, siendo estas derivados
polihidroxilados y polimetoxilados de las sales del ion 2-fenilbenzopirilio (ion flavilio) (Tabla 1.1)
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
2
Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas.1
Grupos funcionales presentesAntocianidina
3 5 6 7 3’ 5’Color
Pelargonidina (Pg) OH OH OH OH H H NaranjaCianidina (Cy) OH OH OH OH OH H Naranja-RojoDelfinidina (Dp) OH OH OH OH OH OH Azul-RojoPeonidina (Pn) OH OH OH OH OMe H Naranja-RojoPetunidina (Pt) OH OH OH OH OMe OH Azul-RojoMalvidina (Mv) OH OH OH OH OMe OMe Azul-RojoApigeninidina (Ap) H OH OH OH H H NaranjaLuteolinidina (Lt) H OH OH OH OH H NaranjaTricetinidina (Tr) H OH OH OH OH OH RojoAurantinidina (Au) OH OH H OH H H Naranja6-hidroxi-Cy (6OHCy) OH OH H OH OH H Rojo6-hidroxi-Dp (6OHDp) OH OH H OH OH OH Azul-RojoRosinidina (Rs) OH OH OH OMe OMe H RojoHirsutidina (Hs) OH OH OH OMe OMe OMe Azul-Rojo5-metil-Cy (5MCy) OH OMe OH OH OH H Naranja RojoPulchelidina (Pl) OH OMe OH OH OH OH Azul-RojoEuropinidina (Eu) OH OMe OH OH OMe OH Azul-RojoCapensinidina (Cp) OH OMe OH OH OMe OMe Azul-Rojo
1(Jackman y Smith, 1996)
Paradójicamente, la mayoría de las antocianinas, se tornan en compuestos incoloros
cuando se extraen de su medio natural y se disuelven en una solución acuosa de acidez
comparable. De hecho, el ion flavilio, que proporciona la principal forma coloreada de las
antocianinas, sufre un ataque nucleofílico en las posiciones 2 y 4 (Ver Tabla 1.1) por parte del
agua y se convierte de forma reversible en un hemiacetal incoloro, de acuerdo a una reacción
química conocida como hidratación del ion flavilio (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).
Las antocianinas se hallan en las vacuolas como un equilibrio de cuatro especies
moleculares (Figura 1.1). La estructura primaria de todas las antocianinas, la cual es pH
dependiente, es el catión flavilio, del cual derivan las estructuras secundarias, ya sea por
transferencia de protones para producir las azuladas bases quinoidales y sus correspondientes
bases quinoidales ionizadas, ó por hidratación para formar pseudobases carbinol incoloras, las
cuales se pueden tautomerizar a pseudobases chalconas incoloras (Bridle y Timberlake, 1996).
R5
R7
R3
R5’
R3’
OH6’
5’4’
3’
2’2
3
4
6
7
8
5
1+ 1’
R6
+
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
3
Las estructuras terciarias resultan de asociaciones moleculares de estructuras primaria
y secundaria, ya sea consigo mismas (auto-asociación) ó con otras moléculas en solución
(copigmentación intermolecular). La estructura cuaternaria resulta de lo efectos del medio
(disolvente) en el color de cualquiera de las estructuras previamente descritas, esto es de
particular importancia sobretodo en las propiedades de las bebidas alcohólicas (Bridle y
Timberlake, 1996).
Se conocen varios cientos de antocianinas, las cuales difieren principalmente en el
esqueleto básico de la antocianidina (el número y posición de los grupos hidroxilo y metoxilo);
la identidad, número y posición en que se encuentra unido el ó los azúcares al esqueleto
principal; y el grado de acilación del azúcar y la identidad del agente acilante (Clifford, 2000).
Las clases mas comunes de glicósidos son los 3-monósidos, 3-biósidos, y 3-triósidos, así
como 3,5-diglicósidos, y más raramente los 3,7-diglicósidos (Strack y Wray, 1989). El residuo
glicósido encontrado más comúnmente es la glucosa, aunque un gran número de diferentes
monosacáridos (ramnosa, galactosa, xilosa, arabinosa, o fructosa), disacáridos (principalmente
rutinosa, sambubiosa, o soforosa, lathyrosa, gentobiosa o laminariobiosa con menor
frecuencia), o trisacáridos (homo- ó heteroglicanos) pueden encontrarse entre los residuos de
azúcares (Jackman y Smith, 1996).
Los residuos de azúcares adheridos a las antocianinas, se hallan con frecuencia,
acilados con ácidos aromáticos, como el p-cumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico ó p-
Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas. (A) catiónflavilio; (B) base quinoidal; (C) pseudobase carbinol;(D) chalcona (Iversen, 1996).
CA
B D
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
4
hidroxibenzoico, y/o ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, ú oxálico
(Jackman y Smith, 1996).
1.1. 2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza
Las antocianinas juegan un papel definitivo como factores de polinización, coloración
de flores y frutos para atraer insectos, aves y animales vectores, por lo cual asisten la
reproducción en plantas. Sin embargo la función de las antocianinas y otros compuestos, como
las betalaínas, en tejidos vegetales no está bien definida. Su acumulación en tejidos dañados y
heridas de la planta que las sintetizan sugiere que funcionan como fitoalexinas, esto significa
que ayudan en la defensa en contra de infecciones virales y microbianas. Cuando se
encuentran asociados a las proteínas, estos pigmentos funcionan como fotorreceptores de luz
verde. Además debido a que su mayor pico de absorción está entre 465-560 nm, cuando se
encuentran en grandes concentraciones, pueden actuar como filtros de luz verde y por lo tanto
contrarrestar la represión del crecimiento en las plantas, que se ha reportado es inducida por la
luz verde. Debido a que estos pigmentos también absorben intensamente la luz UV, se sugiere
que juegan un papel protector contra los efectos adversos de la luz UV (Jackman y Smith,
1996).
Las principales fuentes alimenticias de antocianinas pertenecen a las familias Vitaceae
(uva) y Rosaceae (cereza, ciruela, frambuesa, fresa, zarzamora, manzana y durazno). Otras
familias que contienen plantas comestibles pigmentadas con antocianinas incluyen las
Solanaceae (tamarillo, berenjena), Saxifragaceae (grosella roja y negra), Ericaceae
(arándanos, mora azul) y Cruciferae (col roja). Las antocianinas que se hallan con mayor
frecuencia tienen como núcleo principal, la cianidina, seguida de pelargonidina, peonidina y
delfinidina, luego por petunidina y malvidina. Los 3-glicósidos ocurren aproximadamente dos y
media veces con mas frecuencia que los 3,5-diglicósidos, siendo la mas frecuente la cianidina
3-glucósido (Jackman y Smith, 1996).
La pelargonidina-3-glucósido, la cual es la principal antocianina presente en las fresas
(Fragaria anannassa), es la responsable del atractivo color rojo brillante de esta fruta. En
algunos cultivares de origen español, comúnmente se halla presente en pequeñas cantidades
la cianidina-3-glucósido además de la pelargonidina-3-rutinósido (García-Viguera, et al., 1996).
Bakker (1992) reporta la presencia de antocianinas de fresa de las cuales el 79%
corresponden a pelargonidina 3-glucósido y 5% de cianidina 3-glucósido, además de otros
cinco compuestos coloreados de los cuales cinco fueron identificados como derivados de
pelargonidina, en cantidades de 0.5 a 5 % (Bakker et al., 1992). Numerosos autores han
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
5
demostrado que la segunda antocianina presente en las fresas es la cianidina 3-glucósido.
Sondheimer y Kertesz (1956) reportaron la presencia dos pigmentos en una proporción de 1:1
en fresas salvajes, y de 20:1 en fresas cultivadas. Las cantidades relativas de estos pigmentos,
tienen diversos efectos en el color. La cianidina 3-glucósido en solución 0.01 % HCl en metanol
absorbe a 527 nm y tiene un color rojo, mientras que la pelargonidina 3-glucósido tiene una
absorción a 510 nm y es naranja-roja, las diferencias en la proporción de estos pigmentos
puede provocar diferencias en mediciones de color instrumental (Wrolstad et al., 1970).
1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta
Resolución
En años recientes, la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), ha
surgido como herramienta extremadamente poderosa para la cuantificación de fenólicos y
antocianinas de diversas fuentes. Cuando se dispone de un detector de arreglo de fotodiodos
(PDA), es posible la identificación de los picos así como el establecimiento de la pureza de los
mismos por medio del análisis del espectro UV-Visible completo de cada pico (Parley, 2001). El
análisis de antocianinas por HPLC se realiza empleando columnas para cromatografía de fase
reversa, donde la fase estacionaria es usualmente un polímero de C18 enlazado a un soporte
de sílice, o recientemente soportes poliméricos que son estables sobre un amplio rango de pH
(Hong y Wrolstad, 1990). El pequeño tamaño de partícula de alrededor de 4-5 µm del
empacado asegura un alto número de platos teóricos, y por lo tanto una buena eficiencia y
resolución. La fase móvil es usualmente un gradiente de soluciones basadas, en agua, un
ácido y un modificador orgánico. El tipo más común de modificadores orgánicos es el metanol
o el acetonitrilo. La acidificación es necesaria para prevenir la ionización de los grupos ácidos
de los compuestos fenólicos, y en el caso de las antocianinas, el pH debe ser bajo para evitar
lo mas posible la interferencia de las antocianinas con estructuras diferentes a la forma del ion
flavilio. Los ácidos más comúnmente empleados son fosfórico, acético, perclórico y fórmico
(Parley, 2001).
La detección de las antocianinas ocurre a los 520 nm, debido a que todas las formas
del ion flavilio tienen un máximo en la vecindad de ese valor, y no hay interferencia de muchos
otros compuestos a esa longitud de onda. En la mayoría de los casos, la única preparación que
se necesita previa a la inyección y al análisis por HPLC, es una etapa de concentración de los
analitos de interés por medio de columnas de micro-extracción en fase sólida, además de la
filtración a través de filtros de 0.45µm. Se pueden obtener importantes propiedades
estructurales a partir del análisis de los datos espectrales de las antocianinas, obtenidos por
HPLC, incluyendo la naturaleza de la aglicona (antocianidina), la posición de enlace de la
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
6
molécula de azúcar, e información referente a la acilación por ácidos aromáticos. Típicamente
el espectro de las antocianinas, así como de otros flavonoides se obtienen en metanol con un
0.01% de HCl. Debido a que las características espectrales de las antocianinas son
dependientes tanto del pH como de la naturaleza del disolvente, la comparación directa de las
propiedades espectrales con aquellas publicadas en la literatura puede resultar inapropiada
cuando se trabaja con solventes distintos o en otros valores de pH (Hong y Wrolstad, 1990).
Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de supatrón de hidroxilación.
SustituyentesAglicona
R1 R2
Espectro visibleλmax. (nm)
Pelargonidina H H 494 (naranja)
Cianidina OH H 506 (naranja-rojo)
Delfinidina OH OH 508 (azulado-rojo)
Peonidina OMe H 506 (naranja-rojo)
Petunidina OMe OH 508 (azulado- rojo)
Malvidina OMe OMe 510 (azulado-rojo)
1(Jackman y Smith, 1996)
En soluciones metanólicas las soluciones de pelargonidina-3-glucósido exhiben una
longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) alrededor de 505 nm, la cianidina y peonidina-
3-glucósidos tienen una λmax 520-526 nm, y los derivados de la delfinidina muestran una λmax a
532-537 nm. La longitud de onda de máxima absorbancia esta muy relacionada al patrón de
hidroxilación de la antocianidina, como se puede ver en la Tabla 1.2. Se ha reportado en
bibliografía, información contradictoria respecto al efecto que tiene la naturaleza de la
sustitución de azúcar. Según Guisti, et al., (1999), las características espectrales de las
antocianinas se ven modificadas por el efecto que surte el solvente en el que se encuentran y
la naturaleza de la glicosilación. Estos autores han reportado como una característica general
que un incremento en el número de sustituciones es acompañado por un incremento en la
absortividad molar del catión flavilio cuando se compara con sus similares mono y diglicósidos.
Harborne (1998) reporta que la naturaleza de las sustituciones en la estructura de las
antocianinas (glicosilaciones y acilaciones), impactan en los tiempos de retención y en la
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
7
hidrofobicidad de la molécula. De acuerdo con Hong y Wrolstad (1990), las moléculas análogas
eluirán en un sistema cromatográfico en el siguiente orden (en términos de retención
cromatográfica en HPLC de fase reversa), galactósido, más rápido que glucósido, éste a su
vez mas rápido que arabinósido.
El sistema de solventes empleado para el aislamiento de las antocianinas ejerce su
influencia sobre la estructura cuaternaria de la molécula, y se cree que tienen un gran impacto
en el color de las estructuras primaria, secundaria ó terciaria. (Dangles y Brouillard, 1993). Este
efecto del solvente es dependiente de la estructura química del pigmento. Los pigmentos no
acilados muestran los mayores efectos en sus características espectrales con un drástico
cambio no solo en la dimensión de su absortividad molar, sino también un marcado cambio en
la λmax. Un ejemplo es el metanol, el cual provoca cambios batocrómicos de alrededor de 10
nm en la λmax cuando se compara con el mismo pigmento en solución buffer (Guisti, et al.,
1999).
La presencia de grupos acilo unidos a los residuos azúcares, como los ácidos
cinámicos, provocan desplazamiento en la longitud de onda de máxima absorbancia de los
pigmentos, con un ligero corrimiento hacia el azul (Jackman y Smith, 1996; Dangles et al.,
1993; Harborne, 1967). Los fenoles simples y los ácidos fenólicos tienen una o dos bandas
fuertes entre 230 y 290 nm, mientras que los ácidos hidroxicinámicos muestran un máximo
distintivo a 310 y 332 nm (Strack y Wray, 1989).
Hay dos usos importantes de la espectroscopía en la identificación estructural de las
antocianinas, uno es para la determinación estructural de la posición de los azúcares, y otro es
la investigación de la posible presencia de acilos aromáticos. Para la estimación del primero de
estos factores, se emplea la relación de absorbancia a 440 nm entre la absorbancia de la
muestra a la λmax: %=(A440/Avis-max)*100. Los porcentajes obtenidos son específicos para cada
tipo de sustitución en cada antocianina, permitiendo identificar entre una sustitución en la
posición 3 y una disustitución 3,5 para una misma antocianidina. La presencia de una acilación
en las antocianinas se puede reconocer por la presencia de la banda de absorción
característica de los ácidos hidroxicinámicos entre 310 y 330 nm. Mediante la razón de
absorbancias entre esta banda de absorción y la banda máxima, se obtiene información de la
razón molar de antocianina:ácido hidroxicinámico, con valores de 50-60 % y 90-100 % para
razones 1:1 y 1:2 respectivamente (Strack y Wray, 1989).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
8
1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad
La principal desventaja para el uso de antocianinas como colorantes para alimentos es
su baja estabilidad. De hecho la estabilidad del color de las antocianinas depende de la
combinación de varios factores, entre ellos la estructura y concentración de las antocianinas,
pH, temperatura, presencia de agentes acomplejantes (fenoles, iones metálicos), oxígeno, luz,
enzimas, interacción con componentes del alimento, etc. (Markakis, 1982; Malien-Aubert, et al.
2001; Jackman y Smith, 1996).
1.1.4.1 pH.
La presencia del ion oxonio adyacente al C2 de las antocianinas le da su característica
naturaleza anfotérica. Como se menciona anteriormente, las antocianinas existen como un
equilibrio de cuatro formas moleculares, las cuales se interconvierten por ganancia o pérdida
de un protón (Figura 1.1). Por lo cual las antocianinas se comportan como indicadores de
acidez, y existen como ácidos o como bases, en función del pH. El efecto global del pH en las
antocianinas se ilustra en la Figura 1.2 (Clifford, 2000).
En medios altamente ácidos (pH<2) el rojo catión flavilio es esencialmente la única
especie de antocianina presente. Con el incremento en el pH el ion flavilio se transforma en
base quinoidal por la rápida pérdida de un protón. En valores de pH de alrededor de 3 a 6, la
adición nucleofílica de agua a la posición C-2 del catión flavilio lentamente conduce a la
formación de un hemiacetal incoloro ó pseudobase. Con el incremento en el pH, los extractos
de antocianinas se transforman al punto en el que pueden parecer incoloros, antes de cambiar
por último a color azul o púrpura en pH>6 (Jackman y Smith, 1996).
Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en elequilibrio de las antocianinas (Clifford, 2000).
Estómago Humano
pH de 2 a 5
Pseudobase Incolora
PH de sangre humana approx 7 Intestino delgado pH 7.5-8.0 Catión Flavilio
Chalcona Incolora
Base Quinoidal Azul
Po
rce
nta
je d
e A
nto
cia
nin
as
To
tale
s
pH
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
9
1.1.4.2 Temperatura
La relativamente rápida deterioración del atractivo color rojo en conservas de fresas
frescas, ha sido un problema persistente en la industria del procesado de este alimento a
través de los años. Kertesz y Sondheimer (1948) estudiaron las relaciones tiempo-temperatura
en la deterioración del color, y determinaron que 65ºF (19ºC) como la temperatura crítica, por
encima de la cual ocurría una acelerada pérdida del color rojo y un subsiguiente
obscurecimiento (Jackman y Smith, 1996).
En general, los factores que mejoran la estabilidad al pH (metoxilación, glicosilación y/o
sustituyentes acilo), también conducen a una mayor estabilidad térmica. La desprotonación del
catión flavilio por el solvente es de carácter exotérmica, mientras que la hidratación del catión y
la apertura del anillo de pirilio son ambos procesos endotérmicos. Por lo tanto, la formación de
chalconas esta favorecida por el incremento de la temperatura (durante el almacenamiento y el
procesado) a expensas de las formas quinoidal, hemiacetal y el ion flavilio (Jackman y Smith,
1996).
Con pocas excepciones, la degradación de las antocianinas sigue una cinética de
primer orden, el mecanismo de esta degradación es termo-dependiente. Se han reportado
energías de activación y valores z de alrededor de 70 kJ/mol y 25ºC, respectivamente, a
temperaturas de almacenamiento (<40ºC), y a temperaturas de proceso (<70ºC) valores de Ea
de 95 a 113 kJ/mol y valores z de alrededor de 28ºC. El valor z es el cambio de temperatura
requerido para producir un cambio en el tiempo de destrucción térmica por un factor de diez y
refleja la dependencia de la destrucción térmica con la temperatura. La concentración de
pigmentos poliméricos se ha demostrado que se incrementan con al temperatura y el tiempo
de almacenamiento, como en el caso de los jugos y vinos, y contribuyen a su coloración.
Algunos autores han sugerido tiempos de proceso cortos con alta temperatura para alcanzar
una máxima retención de pigmentos y evitar una degradación significativa de las antocianinas
y/o transformación a productos incoloros como las chalconas (Jackman y Smith, 1996).
1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico
Desde hace tiempo es conocido que las antocianinas y el ácido ascórbico (vitamina C)
son mutuamente destructivos en presencia del oxígeno. Las condiciones que favorecen la
oxidación del ácido ascórbico en un jugo de fresa, se ha encontrado que causan la máxima
pérdida de antocianinas (Sondheimer y Kertesz, 1953). Se ha reportado un efecto sinérgico
entre el oxígeno y el ácido ascórbico en la degradación de los pigmentos (Bakker et al., 1992).
Esta degradación mutua no es inesperada, ya que la vitamina C se ve considerablemente
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
10
afectada durante el procesado, debido a su tendencia a reaccionar con el oxígeno para formar
ácido dehidroascórbico y otros productos (Garzón y Wrolstad, 2002). Muchos de los estudios
son realizados a altas temperaturas (90, 88 y 38ºC) y los productos de la degradación del ácido
ascórbico como el peróxido de hidrógeno y el hidroximetilfurfural, parecen ser los principales
contribuyentes a este efecto degradador de antocianinas (Wrolstad, et al., 1970).
Bajo condiciones aeróbicas, la adición de metales de transición como el cobre,
aceleran la destrucción mutua del ácido ascórbico y las antocianinas; se cree que la causa de
ello es la formación de peróxido de hidrógeno producido por el rompimiento del ácido ascórbico
catalizado por los iones cobre (Timberlake, 1960a,b). La presencia de productos de ruptura en
sistemas decolorados muestra, según Iacubucci y Sweeny (1983), que el blanqueado de las
antocianinas por el ácido ascórbico ocurre por rompimiento oxidativo del anillo de pirilio. Estos
resultados divergen de aquellos publicados por Poei-Langston y Wrolstad (1981), estos autores
notaron que el color característico de las antocianinas se pierde más rápidamente en sistemas
libres de oxígeno (con nitrógeno) que bajo condiciones de oxigenación, favoreciendo un
mecanismo de condensación directa entre la antocianina con el ácido ascórbico para explicar
la pérdida de color observada.
El ion flavilio del núcleo de las antocianinas es deficiente de electrones, por lo tanto es
altamente reactivo, inestable y susceptible al ataque de agentes nucleofílicos. La distribución
de carga del ion flavilio indica que es más susceptible al ataque nucleofílico en la posiciones 2
y 4. Timberlake y Bridle (1968) estudiaron los posibles efectos estéricos en la estabilidad del
color en estudios sobre las sales del ion flavilio, demostrando que la sustitución en la posición 4
era un factor clave en la resistencia de las antocianinas al blanqueado por el dióxido de azufre.
Jurd (1972) postuló una reacción de condensación basado en el conocimiento de que las sales
de flavilio pueden condensarse con diversos compuestos conduciendo a la pérdida de la
pigmentación; entre ellos la dicetona dimedona, la cual es estructuralmente similar al ácido
ascórbico, por lo que sugirió un mecanismo similar. El autor concluyó que el ácido ascórbico se
podía condensar en la posición 4 del núcleo del ion flavilio, de manera análoga a la reacción
con el ion bisulfito.
Los resultados publicados por García-Viguera y Bridle (1999) sin embargo, dan
evidencias de que el mecanismo de condensación sugerido es poco probable de llevarse a
cabo por diversas razones, entre ellas que la pérdida de color es lenta, en lugar de ser una
reacción instantánea como ocurre con el SO2, adicionalmente y el color no regresa
inmediatamente con al acidificación, por otro lado No se observaron por HPLC nuevos
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
11
compuestos formados, debido a que no hubo cambios en λmax que indicaran lo contrario, y el
ácido ascórbico posee efecto degradador sobre el ion flavilio incluso cuando la posición 4 se
encuentra sustituida. Por lo tanto parece ser que ésta degradación es más probable que ocurra
por el mecanismo de radicales libres que por condensación directa en la posición 4. Se ha
comprobado que las antocianinas tienen capacidad de absorber radicales libres, lo cual les
confiere poder como antioxidantes (Wang, et al., 1997), esto nos conduce a soportar la teoría
de la reacción de oxidación, en la que el ácido ascórbico actúa como un activador del oxígeno
molecular, produciendo radicales libres, los cuales rompen el anillo de pirilio, como lo
postularon originalmente Iacobucci y Sweeny (1983).
1.1.4.4 Enzimas
Se han identificado diversas enzimas involucradas en la degradación de antocianinas y
en la correspondiente pérdida del color. La mayoría de estas enzimas son endógenas en
muchos tejidos vegetales. Estas enzimas se han llamado genéricamente ‘antocianasas’, pero
basados en sus distintas actividades, se han identificado dos grupos principales, las
glicosidasas, las cuales hidrolizan los enlaces glicosídicos de las antocianinas para producir
azúcares libres y agliconas, la inestabilidad de éstas últimas, resulta en su degradación
espontánea, vía la formación de chalconas incoloras; y las polifenoloxidasas (PPO), las cuales
actúan sobre las antocianinas en presencia de o-difenoles vía un mecanismo de oxidación
acoplado (Jackman y Smith, 1996).
El procesado de frutas frescas, viene acompañado siempre por un consecuente
rompimiento celular y estrés por daño a los tejidos. La actividad de muchas enzimas se
incrementa como una consecuencia del incremento en la permeabilidad que resulta de la
disrupción de tejidos y el mezclado de enzimas y sustratos, que en tejidos intactos, se
encontrarían secuestrados en vacuolas y otros compartimentos celulares (Lamikanra y
Watson, 2001). La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre y
está ampliamente distribuida en plantas, y puede catalizar varias reacciones: entre ellas la
hidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad cresolasa), la oxidación de o-difenoles a
o-quinonas (actividad catecolasa) y la oxidación de monofenoles a o-quinonas. Las quinonas
formadas pueden polimerizarse para formar pigmentos cafés, los cuales causan decoloración
en muchas frutas y vegetales durante las operaciones de poscosecha. Este oscurecimiento
enzimático afecta la aceptabilidad y es una de las principales causas de la disminución de la
calidad. En muchas frutas, incluida la fresa, la actividad de PPO es responsable de la pérdida
de color rojo, debido a la degradación de antocianinas (Serradell, et al., 2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
12
La degradación de antocianinas no o-difenólicas en presencia de sustratos o-
difenólicos y PPO ha sido estudiada con anterioridad por varios autores. La degradación de
antocianinas no o-difenólicas ha sido establecida como un mecanismo en dos etapas, que
involucran primero la oxidación enzimática de los sustratos o-difenólicos en sus
correspondientes o-quinonas, seguido de la reacción de estas quinonas con las antocianinas.
(Kader, et al., 1999). Wesche-Ebeling y Montgomery (1990) estudiaron la degradación de
pelargonidina 3-glucósido por PPO de fresas. En sistemas modelo con pelargonidina 3-
glucósido, la PPO muestra una ligera pérdida de pigmento (5%), pero en presencia de
catequina, la pérdida fue de un 50% después de 24 horas (Kader, et al., 1999). Ellos sugieren
que las quinonas y los productos intermediarios de reacción formados como resultado de la
acción de la actividad de polifenoloxidasa, son suficientes para iniciar las reacciones de
oxidación y polimerización que conducen a la pérdida de las antocianinas (Bakker, et al., 1992;
Wesche-Ebeling y Montgomery, 1990). Los autores propusieron un mecanismo de degradación
por incorporación de las antocianinas en productos de la reacción de condensación entre
catequina y fenoles. De acuerdo a estos autores, este mecanismo se lleva a cabo con
antocianinas o-difenólicas, tales como los derivados de la cianidina (Kader, et al., 1999).
1.1.4.5 Iones Metálicos
En los sistemas vivos, las antocianinas se encuentran asociadas con otros
compuestos, como iones metálicos, flavonoides (glicosilados y/o acilados) y quizá con
polisacáridos macromoleculares. Todas estas asociaciones afectan el espectro de absorción
de las antocianinas involucradas, lo queda pie a muchos mecanismos que explican la gran
variedad de colores en las plantas (Elhabiri, et al. 1997).
A diferencia de los copigmentos polifenólicos, los iones metálicos, que pueden estar
presentes en el medio natural de las antocianinas son raramente relacionados con la
estabilización del color. Sin embargo, se ha reportado que iones metálicos pequeños altamente
cargados, como el Mg2+ y Al3+, pueden actuar como reforzadores de la interacción entre
pigmento-copigmento. En particular, se ha propuesto que el color azul desplegado por algunas
flores, es el resultado de la interacción pigmento-copigmento-ion metálico (Elhabiri, et al.
1997). Dangles, Elhabiri y Brouillard, (1994) reportaron el acomplejamiento de sales de
aluminio con antocianinas, proveyendo información respecto al mecanismo de
acomplejamiento que se lleva a cabo. Los análisis de 1H-RMN en CD3OD, han confirmado la
conversión de la forma roja del ion flavilio de la antocianina a la forma quinoidal de color azul
intenso, mediante el acomplejamiento con el ion Al3+ (Elhabiri, et al. 1997).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
13
Desde hace tiempo se conoce la reacción de los iones metálicos como el aluminio(III) y
el hierro(III) con el sistema flavilio, y ha sido empleada como prueba cualitativa para demostrar
la presencia de un grupo catecol en las antocianinas derivadas de plantas. La prueba se basa
en la observación de un cambio de color, o cambio batocrómico, en la λmax, con la adición de
iones aluminio(III) en la forma de AlCl3. A partir de cálculos moleculares, parece ser que para la
sal de cloruro de 3-deoxiflavilio, la densidad de carga en la posición C-3 del complejo flavilio-
Al3+ o flavilio-Ga3+ se correlaciona con la longitud de onda máxima de estos compuestos en
solución metanólica. Se deduce que la sustitución en la posición 3 es de gran importancia para
las antocianinas copigmentadas con iones metálicos (Elhabiri, et al. 1997).
1.1.4.6 Copigmentos
La copigmentación fue descrita por primera vez por Robinson y Robinson en 1931 y
estudiada posteriormente en sistemas modelo. Cuando un copigmento se agrega a una
solución acuosa ácida, produce un incremento en la intensidad de color debido a la formación
de agregados coloridos (Baranac, 1996). Es bien sabido hoy en día, que los polifenoles
incoloros (flavonas, flavonoles, ésteres de ácidos cinámicos y benzóicos, taninos) son capaces
de formar complejos empalmes moleculares no covalentes con los núcleos de ion flavilio,
planos y ricos en electrones π (Elhabiri, et al. 1997).
Las interacciones hidrofóbicas eficientemente protegen los cromóforos contra el ataque
nucleofílico del agua, desplazando al mismo tiempo el equilibrio total entre las formas coloridas
e incoloras, (Figura 1.1) hacia las formas coloridas y acomplejadas. Este fenómeno es
conocido como copigmentación y además puede operar de manera intramolecular en
antocianinas más complejas que poseen ácidos cinámicos o benzoicos en sus grupos
glicosídicos produciendo soluciones estables coloreadas a valores de pH ligeramente ácidos
(Elhabiri, et al. 1997). El equilibrio de copigmentación puede ser escrito como sigue:
Antocianinas libres + Copigmentos Antocianinas copigmentadas
Un incremento en la concentración de copigmentos conduce a la intensificación del
color, debido a que desplaza las formas incoloras de las antocianinas a favor de las formas
coloridas. Los copigmentos incluyen una gran variedad de compuestos estructuralmente
relacionados y no relacionados, como los flavonoides, fenólicos no flavonoides, aminoácidos y
ácidos orgánicos (Darias-Martín, 2001). Este efecto estabilizador se discutirá en detalle en
secciones posteriores.
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
14
1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS
En términos muy generales, un compuesto fenólico o polifenol, puede ser
químicamente definido como una sustancia que posee un anillo aromático conteniendo un
grupo hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales (ésteres, metil éteres, glicósidos, etc.).
Los fenólicos derivados de plantas, provienen biogenéticamente de dos rutas principales, la
ruta del shikimato, la cual directamente provee de fenilpropanoides, como los ácidos
hidroxicinámicos y las cumarinas; y la ruta del acetato-malonato, la cual produce fenoles
simples y también muchas quinonas (Harborne, 1989).
El grupo más importante de fenólicos son los flavonoides, y estos a su vez se
subdividen en varios grupos, como se indica en la Tabla 1.3. Los ácidos hidroxicinámicos se
distribuyen en grupos amplios de combinaciones, más que ningún otro grupo de polifenoles. El
ácido caféico por ejemplo, se puede hallar en asociación con ácidos carboxílicos derivados del
ciclohexano, azúcares, ácidos orgánicos, aminas, lípidos, y también unido a otros fenoles. El
flavonoide más comúnmente encontrado , el flavonol quercetina, se ha encontrado en 135
asociaciones diferentes. La mayoría de éstas son O-glicósidos, pero hay O-sulfatos, con
azúcares acilados con ácidos alifáticos o aromáticos (Harborne, 1989).
Una de las funciones indiscutibles de los flavonoides y fenólicos relacionados es su
función como agentes protectores de las plantas en contra de la invasión microbiana. Debido a
su amplia habilidad para inhibir la germinación de esporas de patógenos de plantas, se ha
propuesto su uso contra patógenos fúngicos en el hombre (Harborne, 1989).
1.2.1 Clasificación y Estructura Química
Las principales clases de polifenoles se definen de acuerdo a la naturaleza de su
esqueleto carbonado: ácidos fenólicos, flavonoides, y en menor medida, estilbenos y lignanos
(Figura 1.3) (Scalbert y Williamson, 2000). La química de los compuestos fenólicos es
complicada por el hecho de que la mayor parte de los compuestos que están presentes en
plantas, están en su forma conjugada, principalmente con un residuo de azúcar enlazado a
través de uno o más de los residuos fenólicos. Los monosacáridos asociados con los fenólicos
incluyen glucosa, galactosa, arabinosa, rhamnosa, xilosa, manosa, apiosa, alosa, ácido
glucurónico y galacturónico, y con la complejidad de que algunos de estos azúcares pueden
estar en su forma de di-, tri- o tetrasacáridos (Harborne, 1989).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
15
Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos.1
Clase Número de EstructurasConocidas Propiedades biológicas
Antocianinas 256 Pigmentos de rojo al azul
Chalconas 197
Auronas 29Pigmentos amarillos
Flavonas, flavonoles, ysus O-glicósidos 1660
Copigmentos en flores;protectores UV en las hojas
C-glicosilflavonoides 303
Flavanonas 319
Dihidrochalconas 71Algunas tienen sabor amargo
Dihidroflavonoles 110Con frecuencia presentes enmaderas
Flavanos, leucoantocianinas yproantocianidinas 309
Sustancias Astringentes conpropiedades de taninos
Biflavonoides 134
Isoflavonoides 630 Estrogénicos y fungitóxicos
Neoflavonoides 70
Estructuras misceláneas 100
1(Harborne, 1989)
Los flavonoles, flavonas y flavanoles o catequinas, constituyen tres de las principales
subclases de flavonoides (Figura 1.4). Los flavonoles y las flavonas tienen una estructura
anular similar, con un doble enlace entre los carbonos 2 y 3. Las flavonas, opuestos a los
flavonoles, carecen de un grupo hidroxilo en la posición 3. Los principales flavonoles son la
quercetina (3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona), kaempferol (3,5,7,4’-tetrahidroxiflavona), miricetina
(3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavona), isorhamnetina (3,5,7,4’-tetrahidroxi-3’-metoxiflavona). Las
flavonas mas abundantes en las plantas son la luteolina (5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona) y
apigenina (5,7,4’-trihidroxiflavona) (Hollman y Arts, 2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
16
O
O
O
OH
OH
H
H OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
CH3OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
OHOOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH OOH
OOH
OH O
OH
H
OCH 3
O+
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH3OC
CO
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CO
CO
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OC
O
O
O
O
O
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
resveratrol(estilbeno)
enterodiol(lignano)
ácido clorogénico(ácido fenólico)
quercetina(flavonol)
(+)-catequina(flavanol)
genisteína(isoflavona)
hesperetina(flavanona)
cianidina(antocianidina)
casuarictina(elagitanino)
trimero de procianidina(flavanol)
Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles (Scalbert,2000).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
17
La característica estructural que tienen los flavanoles, que es una característica en
común con las antocianinas, es la ausencia del grupo ceto en la posición 4 del anillo C (Figura
1.4). La falta de un doble enlace entre la posición 2 y 3, y la presencia de un grupo hidroxilo en
la posición 3, crea dos centros de asimetría. Los flavanoles con una configuración 2R, son los
que se encuentran mayoritariamente en la naturaleza. Los flavanoles que predominan son (+)-
catequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavano), (–)-epicatequina (2R,3R-3,5,7,3’,4’-
pentahidroxiflavano), (+)-galocatequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y
epigalocatequina (2R, 3R-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y los correspondientes ésteres de
ácido gálico: galato de (–)-epicatequina y galato de (–)-epigalocatequina. En el pasado a este
tipo de compuestos, flavanoles, se les hacia referencia como flavan-3-oles o catequinas
(Hollman y Arts, 2000).
Los flavonoles y flavonas se encuentran usualmente en plantas unidos a azúcares
como O-glicósidos. Las flavonas pueden encontrarse como C-glicósidos. La forma glicosídica
Figura 1.4 Subclases de flavonoides. La clasificación estábasada en las diferencias en el anillo heterocíclico C(Hollman y Arts, 2000).
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
OH
O
OH
OH
CH3
OH
CH3
OH
O
OOH
OH
CH3
OH
CH3
O+
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
CH3
OH
CH3
O
Flavona Flavonol
Flavanona
Antocianidina
Flavanol
Isoflavona
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
18
es una característica general de los flavonoides, con excepción de los flavanoles, en donde
esta presentación es rara. La forma de aglicona de los flavonoles y flavonas no se halla
presente en plantas frescas, pero pueden encontrarse como resultado del procesado de los
alimentos. Los residuos de azúcar se pueden enlazar en varias posiciones de la estructura de
un flavonoide, sin embargo hay preferencia por la posición 3 (Hollman y Arts, 2000).
1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en el Tomillo
En muchas plantas, los principales flavonoides constituyentes, son las agliconas, como
la quercetina, miricetina, kaempferol y sus glicósidos (Zheng y Wang, 2001). Algunas especies
como el tomillo (Thymus vulgaris) y el romero (Rosmarinus officinalis) son conocidas por tener
alta capacidad antioxidante, y algunas flavonas metiladas fueron aisladas del tomillo como
antioxidantes. En el aceite esencial de tomillo, el timol y el cravacol fueron reconocidos como
los principales componentes que mostraron una alta actividad antioxidante y antimicrobiana
(Zheng y Wang, 2001). Zheng y Wang, (2001), reportan compuestos bifenilos, dímeros del
timol, y flavonoides aislados de tomillo, que mostraron actividad antioxidante tan fuerte como el
BHT. Además los autores reportan altos contenidos de ácido rosmarínico (91.8 mg/100g peso
fresco) y luteolina (39.5 mg/100g peso fresco) hallados en extractos de tomillo.
Varios autores han reportado el contenido de los flavonoides más abundantes en
tomillo, por su importancia como potentes antioxidantes. Entre los compuestos comúnmente
reportados se encuentran aquellos extraídos con soluciones acuosas reguladoras (Tabla 1.4).
Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris1
Compuesto Fenólico Concentración2
Ácido caféico 11.7 ± 1.04
Luteolina 39.5 ± 1.53
Ácido rosmarínico 91.8 ± 2.75
Hispidulina 20.8 ± 0.961(Zheng y Wang, 2001), 2 Expresado en mg/100g de peso fresco.
Existen reportes de tres flavonas alquiladas, las cuales tienen un residuo de ácido p-
hidroxibenzoico enlazado al C-8 de la apigenina, luteolina y diosmentina, estos fueron aislados
con los correspondientes derivados de quercetina y kaempferol de partes aéreas de Thymus
hirtus. Este es uno de los primeros reportes de sustitución a través de enlaces C-C (Harborne y
Williams, 1998).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
19
Los principales compuestos fenólicos reportados en extractos de Tomillo, aparecen en
la Tabla 1.4, sin embargo, se ha reportado también la presencia de algunos otros ácidos
fenólicos como el ácido clorogénico, ácido cinámico, ferúlico, gálico, vainíllico y p-
hidroxibenzoico. La presencia de estos compuestos es altamente dependiente de las
condiciones de crecimiento de la planta, así como la especie y variedad de Thymus sp. de la
que se trate (Duke, 2003).
1.2.3 Características Espectrales
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase reversa (RPLC), es la
técnica más popular y confiable para el análisis de fenólicos. El perfil de elución es típico para
RPLC, esto es, los compuestos polares, (como los ácidos fenólicos) eluyen primero, seguidos
por aquellos de polaridad decreciente. Por lo anterior, se puede establecer un orden de elución
como sigue: ácidos fenólicos < ácidos cinámicos < flavonoides. Aunque pueden presentarse
empalmes entre miembros individuales de diferentes clases debido a la diversidad de
compuestos. El orden de elución de los flavonoides con similar patrón de sustitución se puede
establecer como flavanona-glicósido, seguido de flavonol y flavona glicósidos, seguidos por la
aglicona libre en el mismo orden. En ácidos cinámicos y fenólicos, la polaridad se incrementa
principalmente por los grupos hidroxilos en al posición 4, seguidos por aquellos en la posición 3
y en la posición 2. Los grupos metoxi y acrílicos reducen la polaridad y por lo tanto incrementan
los tiempos de retención (Robards, et al., 1999).
La detección es usualmente basada en la absorción en el rango ultravioleta, o en
menor medida a varias longitudes de onda del rango visible que son características de ciertas
clases de compuestos fenólicos. (Ver Tabla 1.5). La mayoría de los compuestos fenólicos
exhiben dos principales bandas de absorción; la Banda I en la región de 320±385 nm que
representa la absorción del anillo B y la Banda II en la región de 250±285 que representa la
absorción el anillo A (Robards, et al., 1999). Los cambios hacia la longitud de onda del rojo son
debidos a un incremento en el número de grupos hidroxilo, por ejemplo, 367 nm en kaempferol,
a 371 nm, en quercetina, y 374 nm en miricetina. Por esta razón la banda I en las flavonas es
usualmente a una longitud de onda mas corta, por 20 a 30 nm que en los flavonoles
equivalentes (Robards, et al., 1999).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
20
Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos (Robards, et al.,1999).
Tipo de compuesto Banda UV II a Banda UV I a Visible a
Ácidos benzóicos 270-280Ácidos cinámicos (290-300)b 305-330Antocianinas 240-280 (315-325)c 450-560Flavonoles 250-270 (300)b 350-380Flavanoles 270-280Coumarinas 220-230 310-350Flavonas 250-270 330-350Flavanonas, Flavanoles 270-295 (300-330)b
Chalconas 220-270 (300-320)b 340-370Auronas 240-270 340-370Isoflavonas 245-270 300-340
aEl solvente usual es metanol, excepto para antocianinas que es metanol-HCl. bHombro; cEn el caso deacilación por ácidos cinámicos
1.2.4 Fraccionamiento de Extractos Fenólicos
En estudios recientes, Guillén, et al. (1997) reportaron un procedimiento de
fraccionamiento de fenólicos de interés enológico empleando dos cartuchos de extracción en
fase sólida, el primero de C18, seguido de una resina de intercambio aniónico. Esta estrategia
de separación les permitió la separación de compuestos cargados negativamente como ácidos
fenólicos, de aquellos compuestos neutros como aldehídos fenólicos y catequinas.
Seleccionando el pH del medio en el cual la muestra fue inyectada en la resina aniónica, en
función el pKa promedio de los ácidos fenólicos, los autores efectuaron la separación de los
compuestos fenólicos en las dos familias, neutros y cargados negativamente. Empleando un
pH de 6.5 se aseguraron que las especies ácidas se encontraran en la forma ionizada para
poder ser retenidas en la resina aniónica.
El fraccionamiento de compuestos fenólicos también se puede llevar a cabo mediante
el uso de solventes orgánicos, para la elución de polifenoles adsorbidos en cartuchos de C18.
Sin embargo la selectividad de dichos solventes no es suficiente para lograr una separación en
función de sus características químicas (Covarrubias, 2001).
1.2.5 Función como Sustratos de Polifenoloxidasa
Varias sustancias, como el ácido clorogénico, quercetina-5’sulfonato, morina, rutina,
quercetina, etc, han sido identificados como buenos copigmentos (B�kowska, et al., 2003). Sin
embargo se han identificado compuestos que actúan como sustratos de polifenoloxidasa,
principalmente ácidos fenólicos como ácido caféico, protocatecoico y clorogénico (Stauffer,
1999).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
21
La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre como
cofactor además de oxígeno disuelto en el sistema; la reacción de oxidación puede ser
representada por la ecuación (1) de manera general.
OH
OH
O
O
Catecol o-benzoquinona
Algunos compuestos fenólicos no intervienen directamente en el obscurecimiento
enzimático, pero pueden actuar como sinergistas o inhibidores de polifenoloxidasas. Se sabe
que el ácido p-coumárico es un inhibidor no competitivo de la PPO de manzana, y que cataliza
la degradación de ácido clorogénico (Shahidi y Naczk, 2003). Dincer y otros (2002) por otro
lado reportan el uso de 4-metilcatecol como el sustrato ideal para la PPO extraída de plantas.
Al parecer, este tipo de PPO tiene un sitio de unión con una alta afinidad por pequeños o-
difenoles como el catecol o el 4-metilcatecol y menor afinidad por o-difenoles voluminosos
como la epicatequina.
1.3 COPIGMENTACIÓN
1.3.1 Tipos de copigmentación
1.3.1.1 Autoasociación
Cuando la concentración de pigmentos es relativamente alta, las antocianinas mismas,
pueden actuar como copigmentos y participar en reacciones de auto-asociación. En estudios
sobre el equilibrio de las antocianinas en solución acuosa, se ha observado que no se sigue la
Ley de Lambert-Beer, excepto para soluciones muy diluídas. Asen et al. (1972) encontraron
que un incremento en la concentración de cianidina-3,5-diglucósido a pH 3.16 provocaba
incrementos no proporcionales en la absorbancia de la solución. Este efecto fue atribuido a la
auto-asociación de moléculas de antocianinas. Estudios subsecuentes de la auto-asociación
de malvidina-3-glucósido por RMN, mostraron que tanto la forma de ion flavilio como la forma
quinoidal, pueden formar apilamientos verticales con un giro en el sentido de las manecillas del
reloj, y se mantienen juntos gracias a interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Hoshino,
1992).
+ E –Cu2+ + ½O2 + E–2Cu2+ + H2O Ec. (1)
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
22
1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular
Estudios recientes sugieren que el acomplejamiento molecular de las antocianinas con
otros fenoles, denominados copigmentos es el responsable de la estabilización del color en las
plantas (Davies et al., 1993; Brouillard et al., 1989; Mazza y Brouillard, 1990).
La copigmentación consiste en el apilamiento de moléculas de copigmento sobre el
núcleo plano de las formas coloridas de las antocianinas. De esta forma, el ataque nucleofílico
del agua en la posición 2 del núcleo de pirilio, que conduce a las formas incoloras de
hemiacetal y chalconas, es prevenido parcialmente (Figura 1.1) (Dangles y Amiot, 2001). La
copigmentación en un fenómeno ampliamente distribuido en la naturaleza y puede ocurrir en
productos derivados de frutas y verduras, como jugos y vinos. Este fenómeno se vuelve más
eficiente cuando el pigmento y el copigmento se encuentran unidos a través de un espaciador.
Tal es el caso de las antocianinas, en las que las glicosilaciones se encuentran aciladas
(frecuentemente en la posición 6-OH) por ácidos fenólicos. Dentro de estas moléculas
aciladas, la copigmentación consiste en un arreglo conformacional de los grupos acilo sobre el
núcleo del ion flavilio (copigmentación intramolecular) (Dangles et al., 1993).
Los residuos de azúcares unidos a las antocianinas pueden encontrarse acilados con
ácidos aromáticos como p-cumárico, caféico, ferúlico, gálico o por ácidos p-hidroxibenzoicos,
y/o por ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, etc. También se han
reportado antocianinas que tienen dos o más grupos acilos, como la cianodelfinidina,
rubrocinearina, ternatinas y lobelinas, etc. (Jackman y Smith, 1996). Esta acilación posee un
efecto estabilizante en las antocianinas, a través de la copigmentación intramolecular, esto es
a través del apilamiento tipo sándwich de los grupos acilo, con el anillo de pirilio de la molécula
de antocianina y este efecto es más aparente para el caso de las moléculas con acilos
aromáticos. Hay que mencionar que las antocianinas monoaciladas, por lo general no
presentan el efecto estabilizador de las antocianinas di, tri o poliaciladas, indicando que al
menos dos grupos acilo son necesarios para una buena estabilidad y retención de color en
medios ligeramente ácidos ó neutros (Jackman y Smith, 1996). Las antocianinas aciladas, son
particularmente prometedoras como colorantes de alimentos, debido a su gran estabilidad de
color en el rango de pH de 4-5, donde las antocianinas no aciladas son casi incoloras. En la
industria de alimentos, algunas fuentes comunes de estas antocianinas son Tradescantia
pallida, Zebrina pendula, zanahoria morada y col roja (Dangles y Amiot, 2001).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
23
1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular
La adición de compuestos no coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas
ligeramente ácidas, produce un incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia
(λmax), conocido como cambio batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro
visible, llamado cambio hipercrómico, por un mecanismo análogo a la autoasociación. La
magnitud del efecto del copigmento en tales soluciones es dependiente de la estructura así
como de la cantidad de antocianina y molécula de copigmento presente, del pH, la
temperatura, y la composición de la solución empleada como solvente (Mazza & Brouillard,
1990).
Estas modificaciones en las propiedades espectrales probablemente apuntan al hecho
de que la molécula de copigmento interactúa con al antocianina en su primer estado excitado
(transiciones electrónicas en el rango visible) mas fuertemente que con su estado basal (Alluis
et al., 2000).
Robinson y Robinson (1931) describieron por primera vez la copigmentación
intermolecular con diferentes compuestos, y su capacidad de copigmentar soluciones de
malvidina 3-glucósido. Los tipos de moléculas que pueden actuar como copigmentos exógenos
para antocianinas incluyen flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos,
y en el caso de la auto-asociación, las antocianinas (Asen, 1972). Los mejores copigmentos
encontrados son por mucho, los flavonoles, sin embargo el principal prerrequisito de un
copigmento es que contenga un anillo plano rico en electrones π, lo cual permite un
solapamiento π-π con el anillo de pirilio del ion flavilio (Brouillard y Dangles 1994).
La concentración de ambos, las antocianinas, y las moléculas de copigmento,
influencian la magnitud del efecto de la copigmentación (Mazza y Brouillard, 1990). Al
incrementar al concentración de antocianinas, se incrementa la absorbancia así como el
cambio batocrómico. Sin embargo, la magnitud del incremento en la absorbancia es
dependiente de la proporción copigmento:pigmento para una determinada antocianina. El
incremento en esta proporción, también incrementa la magnitud de los cambios hipercrómicos
y batocrómicos (Covarrubias 2001, Del Follo, 2003).
En estudios sobre antocianinas de uva muscadina Talcott, y otros (2003) demuestran
la dependencia de los cambios hipercrómicos y batocrómicos con la concentración de
compuestos fenólicos provenientes de extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
24
En su estudio, el color de los jugos de uva muscadina se incrementa en un 120% con la
adición de dichos extractos.
1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos
La cianidina, la cual posee dos grupos hidroxilo adyacentes, tiene la propiedad de
acomplejar metales como el aluminio en solución metanólica acidificada, lo que provoca una
modificación en el máximo de absorción a 567 nm mientras que la pelargonidina 3-glucósido
no es afectada, debido a la ausencia de hidroxilos en posición orto (Wrolstad et al., 1970).
Se ha estudiado con anterioridad el papel que juega el ácido cítrico, que es el principal
ácido orgánico presente en las fresas, y se sabe que preferentemente reacciona con iones
metálicos, dejándolos no disponibles para el acomplejamiento previamente descrito. Jurd y
Asen (1966) estudiaron la copigmentación de cianidina 3-glucósido con quercetina, ácido
clorogénico y metil-galato, y hallaron que la presencia de sales metálicas era esencial para al
formación del copigmento en soluciones acuosas. El ácido cítrico, al estar acomplejado con el
metal, impide la formación del complejo copigmento-metal-antocianina, responsable de un
indeseable corrimiento hacia el azul de algunas variedades de fresas congeladas. Aunque el
ácido cítrico es el principal ácido presente en la fresas, también se encuentran el málico,
shikímico, succínico, glicérico, glicólico y aspártico. La magnitud de dicho efecto depende del
tipo de ácido orgánico presente (Wrolstad et al., 1970).
1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas
En ausencia de mecanismos estabilizadores de color, las formas coloridas de las
antocianinas, se hallan en menor proporción en soluciones acuosas ligeramente ácidas. Como
una consecuencia de esto, se deduce que la gran variedad de colores naturalmente
expresados por las antocianinas, debe ser estrictamente controlado por la copigmentación y el
acomplejamiento metálico (para el caso de las antocianinas con un grupo 1,2-dihidroxibenceno
en el anillo B) (Dangles y Amiot, 2001). Es sabido desde hace tiempo que los flavonoides están
comúnmente asociados con las antocianinas en las plantas, por lo que se ha sugerido el uso
de algunos de estos compuestos para mejorar la estabilidad de pigmentos como las
antocianinas en alimentos (Lenoble, 1999). Por ejemplo, se ha demostrado la eficacia de
extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis), el cual es rico en flavonoides en la
estabilización del color proveniente de antocianinas (Covarrubias 2001; Del Follo, 2003;
Talcott, et al., 2003).
NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES
25
La formación de complejos entre las antocianinas y los copigmentos en condiciones
ácidas, mejora las cualidades visuales y la estabilidad del color en los alimentos que los
contienen. La estabilidad de las antocianinas copigmentadas en presencia de ácido ascórbico
fue conocida recientemente, y actúa proporcionando un efecto quimoprotector durante el
procesado de los alimentos (Talcott, et al., 2003).
Del Follo (2003) reporta la copigmentación de las antocianinas en el jugo de uva con
extractos fenólicos de romero y tomillo, como un medio efectivo para la protección contra la
reacción de blanqueado con bisulfitos, y este efecto estabilizador, es más efectivo para un
extracto derivado del tomillo. Talcott, y otros, (2003) reportaron incrementos batocrómicos de
10 a 27% por la adición de extractos de romero en jugo de uva, dichos incrementos son
dependientes de la concentración de extracto agregada. Sin embargo, la problemática sigue
siendo la capacidad de estos extractos fenólicos para ser usados como sustratos de
polifenoloxidasa; por lo cual, surge la necesidad de contar con extractos fenólicos que sin
perder su capacidad de actuar como buenos copigmentos, no contribuyan al incremento de
agentes oxidantes que mermen la concentración de antocianinas y de otros fitonutrientes, es
decir, que no puedan ser usados como sustratos por la polifenoloxidasa.
MATERIALES Y MÉTODOS
26
CAPITULO 2
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE
POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.
2.1 INTRODUCCIÓN
La mayoría de los alimentos que se consumen en la actualidad son procesados de
alguna forma antes de llegar a manos del consumidor, y en ocasiones los fabricantes se ven
en la necesidad de reemplazar el color perdido durante dicho procesado, o colorear los
productos, para incrementar su aceptabilidad. Con la creciente preocupación pública respecto
a la seguridad de los colorantes sintéticos, los pigmentos de origen natural están tomando gran
importancia (Bridle y Timberlake, 1996). Se ha observado un incremento paulatino en el
desarrollo de colorantes naturales, así como de alimentos funcionales en años recientes, no
solo debido a las preferencias del consumidor por los pigmentos naturales, sino también por
sus beneficios relacionados con la salud y propiedades nutracéuticas (Clifford, 2000; Del Pozo-
Insfran, et al., 2003). Una de las limitaciones para el uso de las antocianinas como reemplazo
a los colorantes sintéticos es su baja estabilidad, debido a su estructura química, factores
ambientales y a la presencia de otros fitoquímicos en solución. La presencia de polifenoles
incoloros en sistemas con antocianinas conduce a una mayor estabilidad de los pigmentos, por
formación de complejos empalmes moleculares no covalentes con los núcleos de ion flavilio,
planos y ricos en electrones π. Estas interacciones hidrofóbicas protegen los cromóforos contra
el ataque nucleofílico del agua, desplazando al mismo tiempo el equilibrio total entre las formas
coloridas e incoloras hacia las formas coloridas y acomplejadas (Elhabiri, et al. 1997). Además
como ya se mencionó en secciones anteriores, el efecto de la adición de compuestos no
coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas ligeramente ácidas, produce un
incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax), conocido como cambio
batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro visible, llamado cambio
hipercrómico, debidos a estas interacciones electrónicas.
Iacobucci y otros, (1983) reportaron el empleo de soluciones de quercetina-3-rutinósido
como copigmento para disminuir el efecto degradador de la luz solar utilizando soluciones
modelo de cianidina-3-glucósido. Una de las dificultades para el uso de este tipo de estrategias
de estabilización, es que los procedimientos de aislamiento de flavonoides en su forma pura y
en grado alimenticio es un proceso caro y con múltiples operaciones unitarias. Debido a lo
anterior, se sugiere el empleo de extractos fenólicos semi-purificados derivados de plantas, los
cuales contienen una mezcla compleja de polifenoles. En estudios previos, Del Follo (2003),
MATERIALES Y MÉTODOS
27
trabajando sobre estabilidad de antocianinas en jugo de uva, demostró que la adición de
extractos fenólicos de romero y tomillo, provoca incrementos porcentuales en absorbancia de
490 % y 377 % respectivamente con relaciones molares copigmento:pigmento de 100:1, y
cambios batocrómicos del orden de varias decenas de unidades de longitud de onda. Este tipo
de resultados son, en todos los casos, dependientes de la concentración de compuestos
fenólicos. Los tipos de moléculas que se han identificado como eficientes copigmentos incluyen
flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos, y en el caso de la auto-
asociación, las propias antocianinas (Asen, 1972).
Sin embargo el uso de extractos fenólicos como agentes estabilizadores de
antocianinas, tiene la desventaja de que algunos de estos compuestos actúan como sustratos
de enzimas como la polifenoloxidasa (Del Follo, 2003). La degradación enzimática de
antocianinas ha sido establecida como un mecanismo en dos etapas, que involucran primero la
oxidación enzimática de los sustratos o-difenólicos en sus correspondientes o-quinonas,
seguido de la reacción de estas quinonas con las antocianinas (Kader, et al., 1999).
A partir de estos estudios, surge la necesidad de contar con agentes estabilizadores
más efectivos, que conserven su capacidad para actuar como copigmentos pero con una
reducida capacidad de servir como sustratos de PPO. En el presente estudio se planteó como
hipótesis que la introducción de una etapa de cromatografía aniónica al proceso
comercial de obtención produce extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris L.)
libres de sustratos de polifenoloxidasa y con capacidad de copigmentación similar a la
del extracto obtenido a través del proceso comercial original.
A partir de esta hipótesis se generó el objetivo general de este proyecto que fue
evaluar la efectividad de un proceso de cromatografía aniónica para la obtención de extractos
fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris) libres de sustratos de polifenoloxidasa y evaluar su
desempeño como copigmentos para antocianinas.
Para el cumplimiento de este objetivo, la estrategia experimental que se siguió se
dividió en tres estudios. Primero la obtención del extracto de tomillo a través de un proceso
comercial (descrito en secciones posteriores) y la introducción de una etapa de cromatografía
aniónica para modificar su perfil fenólico. Después se evaluó su capacidad para actuar como
copigmento en jugo de fresa (Fragaria anannassa) y por último, su caracterización química y
cuantificación por cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de
diodos (HPLC-PDA).
MATERIALES Y MÉTODOS
28
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1 Materiales
El procedimiento de extracción de compuestos fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris)
se realizó empleando las hojas secas de la especie, obtenida a granel en un supermercado
local. Los estándares para calibración así como el reactivo de Folin-Ciocalteau se obtuvieron
de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO., E.U.A.) y Fluka Chemie GmbH (Buchs, Suiza). Los
reactivos y solventes empleados se obtuvieron de diversas marcas como Fermont-Productos
Químicos Monterrey S.A. de C.V. (Monterrey, NL., México), Merck Co. (Darmstadt, Alemania),
BioRad (Hercules, CA., E.U.A.), Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V. (San
Nicolás de los Garza, N.L., México), Fisher Scientific Int. (Winnipeg, MB., Canadá). Los
cartuchos Sep-Pak ® de resina C-18 empleados para microextracción en fase sólida fueron de
la marca Waters Co. (Milford, MA., E.U.A.). Las dos resinas de intercambio aniónico
empleadas se obtuvieron de la marca Supelco (Bellefonte, PA., E.U.A.).
2.2.2 Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al procesocomercial.
2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo
Para la obtención del extracto acuoso de tomillo se siguió el procedimiento descrito por
la patente No. 5,908,650 de Lenoble (1999). Las hojas secas de tomillo (1 kg) se colocaron en
17 L de agua bidestilada, y se mantuvieron en ebullición a una temperatura de 95ºC durante un
periodo de 8 horas, bajo agitación continua y manteniendo el volumen de agua constante.
Posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente y se separaron los sólidos por filtración
con tela Miracloth (EMD Biosciences Inc., Darmstadt, Alemania). Se ajustó el pH del extracto a
2 con HCl 12 M. Dicho extracto se centrifugó a 6300 rpm por 24 minutos a 4ºC en una
centrífuga Beckman modelo AVANTI J-25 I (Fullerton, CA., E.U.A.). El líquido decantado se
filtró con vacío a través de membranas Millipore de 5µm (Bedford, MA., E.U.A.). La solución
filtrada se pasó por columnas de C-18 Sep-Pak (Waters Co., Milford, MA., EUA.) con
capacidad de 20 mL y 5 g de adsorbente, para retener los compuestos fenólicos del extracto.
Dichas columnas fueron activadas previamente con dos volúmenes (40 mL) de metanol grado
HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M y posteriormente con dos volúmenes de agua grado HPLC con
0.01% v/v HCl 12 M. Los compuestos adsorbidos en la columna C-18 fueron lavados con dos
volúmenes (40 mL) de agua ácida, en la concentración antes mencionada. Se pasó aire
aproximadamente por un minuto a través de la columna para secar el agua y por último los
MATERIALES Y MÉTODOS
29
compuestos fenólicos se eluyeron de la resina C-18 con 10 mL de metanol acidificado grado
HPLC. Los extractos metanólicos resultantes se sometieron a evaporación a presión reducida
en un rotavapor Büchi (Flawil, St. Gallen Canton, Suiza) a 45°C y –25 in Hg para eliminar el
solvente orgánico. Al final se agregó un 10 % de metanol para facilitar la disolución del extracto
en el agua residual. El producto acuoso final se almacenó a –86ºC para su posterior utilización.
2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial
Para el fraccionamiento del extracto de tomillo se emplearon dos tipos de
intercambiadores aniónicos marca Supelco, una resina débil Diaion® WA30 (identificada en lo
sucesivo como WA30) con grupo funcional alquilamina tipo RxNH3OH, donde Rx es la matriz
polimérica de la resina y otra resina Diaion® PA308 (identificada en lo sucesivo como PA308)
con grupo funcional benciltrimetilamina tipo RxNR3OH. Ambas fueron previamente hidratadas
con agua bidestilada por 15 minutos, y activadas con solución reguladora de fosfatos pH 6.5,
I=0.05 con agitación constante durante 30 minutos. Se cargaron dichas resinas en columnas
de polipropileno de 1.5 mL con 1.3 g de resina hidratada y activada. Se realizó una dilución de
5 g del extracto de tomillo en 50 mL de buffer de fosfatos pH 6.5, I=0.05 y se pasaron 6 mL a
través de cada columna por acción de la gravedad en un flujo promedio de 4 mL/min, el
efluente se colectó para ser empleado en los sistemas de copigmentación (esquema general
en la Figura 2.1). La determinación de la concentración de fenólicos en dichos extractos, antes
y después del tratamiento se describe en la siguiente sección. El proceso de regeneración de
las resinas sugerido por el fabricante, es emplear soluciones de HCl ó NaCl 1 N para la resina
fuerte y NaOH ó NH4OH 1N para la resina débil.
Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografíaaniónica. Flujo de 4 mL/min.
Extracto crudode Tomillo
Resinaaniónica débilWA30 (1.3 g)
ExtractoWA30
ExtractoPA308
6 mL 6 mL
Resinaaniónica fuertePA308 (1.3 g)
MATERIALES Y MÉTODOS
30
2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos
2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-Ciocalteau
La determinación del contenido de fenólicos totales en los extractos de tomillo se
realizó mediante una modificación reportada por Vinson et al. (2001) del método de Folin-
Ciocalteau (Swain y Hillis, 1959). Siguiendo dicho método se adicionó a 0.1 mL de muestra, 1
mL de una dilución 1:9 en agua bidestilada del reactivo de Folin-Ciocalteau, se agitó y se dejó
reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente se realizaron lecturas de
absorbancia a 750 nm. en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton,
CA., E.U.A.). La conversión de absorbancia a concentración se obtiene mediante la ecuación
de regresión de la curva de calibración efectuada con ácido gálico, los fenólicos totales se
expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG).
2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de Glories
Una determinación parcial del perfil de compuestos fenólicos presentes en el extracto
de tomillo se llevó a cabo a través del método de Glories reportado por Mazza, et al. (1999) en
el cual se mide la absorbancia de la muestra a las longitudes de onda promedio para los
diferentes tipos de compuestos fenólicos. El método consistió en colocar 0.25 mL de muestra o
estándar en un tubo con 0.25 mL de HCl 0.1 % en metanol 95 % y 4.5 mL de HCl 2 %, se
mezcló y dejó reposar por 15 minutos antes de realizar mediciones de absorbancia en un
espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.) a 280 nm para
fenólicos totales, 320 nm para flavonas, y 360 nm para flavonoles. La calibración del método se
realizó empleando ácido gálico como estándar para fenólicos totales, ácido caféico para
flavonas y quercetina para flavonoles, los primeros dos preparados en soluciones de metanol
10 % y el último en metanol 100%.
2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO
La medición de la capacidad de los copigmentos de actuar como sustratos de
polifenoloxidasa, fue determinada por medición espectrofotométrica de la actividad de dicha
enzima usando una modificación del ensayo descrito por Stauffer (1989) y Worthington (1993).
En una celda espectrofotométrica de 3 mL de capacidad se colocaron 2.8 mL de buffer de
fosfatos pH 6.5, I= 0.05 y 0.1 mL de la solución de copigmento a probar; esta disolución se
mantuvo en un baño a temperatura controlada a 30ºC para equilibrar su temperatura durante 5
minutos. Se utilizó un extracto de polifenoloxidasa comercial (E.C. 1.14.18.1) con una actividad
de 300 U/mL, la cual se colocó en el baño a 30ºC para equilibrar su temperatura un minuto
antes de realizar el ensayo. Se empleó un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650
MATERIALES Y MÉTODOS
31
(Fullerton, CA., E.U.A.), equipado con portacelda para control de temperatura a 30ºC. La celda
fue colocada en el espectrofotómetro y se añadió 0.1 mL de la solución de enzima. Las
lecturas de absorbancia fueron realizadas a 420 nm por un periodo de 5 minutos en intervalos
de 15 segundos entre mediciones. La actividad enzimática se determinó empleando la
pendiente de la recta obtenida de las gráficas de absorbancia contra tiempo. La unidad de
actividad enzimática se definió como un cambio de 0.001 en el valor de la absorbancia por
minuto, bajo las condiciones del ensayo (Rocha y Morais, 2001).
2.2.3 Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos
fenólicos de tomillo en jugo de fresa.
2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa
El jugo de fresa (Fragaria anannassa) se obtuvo a partir de fresas congeladas La
Huerta (Aguascalientes, AGS., México), adquiridas en un supermercado local. Las fresas
fueron descongeladas e inmediatamente sometidas a homogenización en una licuadora marca
Hamilton Beach 7Blend Master (Washington, NC., E.U.A.) durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Se eliminó gran parte de la materia sólida con centrifugaciones sucesivas en una
centrífuga refrigerada marca IEC modelo Centra MP4R (Needham Heights, MA, U.S.A.),
primero durante 5 minutos a 4500 rpm y 4ºC, para eliminar semillas y material grueso,
posteriormente durante 45 minutos a la misma velocidad y temperatura.
2.2.3.1a Clarificación enzimática
Posterior a la centrifugación, el jugo de fresa crudo obtenido se sometió a clarificación
con enzimas pectinasas para eliminar la turbidez debida a la pectina en suspensión. El
protocolo NZFCH13 de Novozymes® (2003) para la depectinización de jugo de manzana, fue
empleado como guía para establecer las condiciones experimentales. Se agregaron 10µL de
extracto enzimático por mL de jugo de fresa, y se colocó en un baño de agua con temperatura
controlada a 45ºC durante 15 minutos. Los flóculos resultantes se precipitaron con ayuda de
una centrífuga IEC modelo HN-SII (Needham Heights, MA, U.S.A.), a 3500 rpm por 5 minutos y
se eliminaron por decantación. Se empleó la prueba del alcohol para corroborar la eliminación
de la pectina soluble tomando jugo clarificado (1 mL) y se agregó en tubos de ensayo con 2 mL
de isopropanol, se agitó por inversión y se dejo reposar por 4 minutos. La ausencia de
precipitado en el tubo de ensayo indica la eliminación de la pectina. Inmediatamente después
de la clarificación, el jugo se almacenó a –86ºC hasta su posterior uso para los sistemas de
copigmentación.
MATERIALES Y MÉTODOS
32
2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método de pH
diferencial
El método de pH diferencial fue reportado por Wrolstad (1976) para la determinación
del contenido de antocianinas monoméricas basado en la transformación estructural reversible
que sufren las antocianinas con un cambio en el pH del medio. Siguiendo el protocolo del
método, se realizaron diluciones de la muestra con dos soluciones reguladoras, una de acetato
de sodio (0.4 M) de pH 4.5 y la otra de cloruro de potasio (0.025 M) de pH 1.0, con un factor de
dilución que permitiera absorbancias en un rango de 0.4 a 0.8. Se dejaron equilibrar durante 15
minutos a temperatura ambiente, se realizaron barridos espectrales para determinar la longitud
de onda de máxima absorbancia (λmax) en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU
650 (Fullerton, CA., E.U.A.), además se realizaron mediciones a 700 nm para corregir la
absorbancia por la turbidez para ambos valores pH. El contenido de antocianinas se calculó
utilizando el coeficiente de extinción molar y el peso molecular de la pelargonidina-3-glucósido,
antocianina presente en mayor proporción en el jugo de fresa (Anexo 1, Ec. 3 y 4).
2.2.3.1c Determinación de antocianinas por cromatografía de líquidos de alta
resolución con detector de arreglo de diodos
La caracterización y cuantificación de las antocianinas presentes en el jugo de fresa
(Fragaria anannassa L.) usado para este estudio, se realizó empleando el método descrito en
el Estudio 3 (Sección 2.2.4.1) pero a 520 nm. Como preparación de la muestra previo a la
inyección en el HPLC, se concentraron las antocianinas a partir de 6 mL de jugo de fresa
clarificado pasándolo a través una columna de C18, posteriormente se eluyeron las
antocianinas con 2 mL de metanol grado HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M. Esta solución se pasó
a través de acrodiscos de PTFE de 0.45 µm marca Gelman (Ann Arbor, MI., E.U.A.).
2.2.3.2 Sistemas de copigmentación
De acuerdo a estudios previos (Del Follo, 2003 y Covarrubias, 2001) se decidió
formular relaciones molares de copigmento:pigmento en niveles de 0, 25, 50, 75 y 100. Estas
relaciones estuvieron basadas en la concentración de antocianinas monoméricas totales en el
jugo de fresa determinado por el método de pH diferencial y expresados como pelargonidina-3-
glucósido, así como en el contenido de fenólicos totales del extracto de tomillo, determinados
por el método de Folin-Ciocalteau, y expresados como equivalentes de ácido gálico, como se
describió previamente. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de jugo
de fresa clarificado y un volumen de copigmento tal que proporcionara la relación molar antes
MATERIALES Y MÉTODOS
33
indicada de acuerdo con su concentración de fenólicos totales, y se completaron a un volumen
total de 10 mL con buffer de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).
2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación
2.2.3.3a Propiedades espectrales
Las características espectrales de los sistemas de jugos de fresa copigmentados con
extractos de tomillo, se determinaron mediante barridos espectrales de las muestras en un
espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.), determinando los
cambios hipercrómicos y batocrómicos que tienen lugar en el jugo, en un rango de 420 a 700
nm de acuerdo con el método descrito por Baranac y otros (1996). Dichos cambio se expresan
como % de incremento en absorbancia máxima y numero de nanómetros que se desplaza la
longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) para cada muestra en relación con el jugo sin
copigmento. (Anexo 1, Ec. 1 y 2)
2.2.3.3b Método de pH diferencial
El método empleado para la determinación del contenido de antocianinas
monoméricas en los sistemas copigmentados fue el de pH diferencial, reportado por Wrolstad
(1976) descrito en la sección 2.3.1b.
2.2.3.3c Color instrumental
Las determinaciones de los cambios visuales en los jugos copigmentados se midieron
a través de los parámetros de color instrumental: luminosidad (L*), saturación de color (C*) y
ángulo de color (h*). Éstos parámetros fueron obtenidos utilizando un colorímetro Minolta
Chroma Meter CR-300 Series (Minolta Co. Ltd., Osaka, Japón) en la escala CIEL*C*h con una
fuente de iluminación D65 y un observador estándar de 10°, utilizando un plato de calibración
blanco como fondo reflejante para las celdas.
2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color polimérico
Los parámetros empleados para medir la degradación de las antocianinas en el jugo
de fresa fueron los reportados por Wrolstad (1976) basado en la asociación que sufren las
antocianinas monoméricas con el bisulfito conduciendo a productos incoloros, dejando a las
antocianinas poliméricas intactas. Siguiendo el protocolo reportado, se determinó el factor de
dilución que proporcionara absorbancias menores a la unidad, así como la longitud de onda de
máxima absorbancia (λmax). De acuerdo con este factor, se realizaron diluciones del jugo de
fresa en agua por duplicado. Se tomaron 2.8 mL de cada una de estas diluciones, se les
MATERIALES Y MÉTODOS
34
agregó 0.2 mL de una solución de metabisulfito de sodio 20 % p/v a una de ellas, y 0.2 mL de
agua bidestilada a la otra. Las soluciones se estabilizaron por 15 minutos a temperatura
ambiente y se determinó su absorbancia a 420 nm, λmax, y 700 nm en un espectrofotómetro
marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.). Las relaciones empleadas para el
cálculo la densidad de color, color polimérico y % de color polimérico se detallan en el Anexo 1
(Ec. 5, 6 y 7).
2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas
Adicionalmente a los estudios de copigmentación con extractos fenólicos de tomillo, se
realizaron pruebas de copigmentación empleando soluciones de alumbre como copigmento.
Se empleó alumbre grado alimenticio (KAl(SO4)2.12H2O; McCormick, Valley, MD, E.U.A.) y los
sistemas de copigmentación se evaluaron en rangos de concentración de 0, 50, 100, 200, 400
y 600 ppm de iones aluminio. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de
jugo de fresa clarificado y un volumen de solución madre de copigmento (10000 ppm) tal que
proporcionara la concentración de iones aluminio antes indicada, y se completaron a un
volumen total de 10 mL con solución reguladora de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).
2.2.4 Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por
cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos
2.2.4.1 Método de separación cromatográfica por HPLC
Para la caracterización de los extractos fenólicos de tomillo, el sistema de separación y
detección empleado fue un cromatógrafo de líquidos de alta resolución Waters Co. (Milford,
MA., E.U.A.) equipado con detector de fotodiodos Waters 2996 y automuestreador Waters 717
plus. Como preparación de la muestra para el análisis, se tomaron 0.5 mL de extracto y se
agregaron 0.5 mL de una solución HCl 1.2 M en metanol puro grado HPLC, quedando la
solución final, aproximadamente en 75% metanol y 0.6 M de HCl; esta solución se pasó a
través de acrodiscos de PTFE de 0.45 µm marca Gelman (Ann Arbor, MI., E.U.A.). La
operación del equipo se realizó empleando las condiciones cromatográficas reportadas por Del
Pozo-Insfran y otros (2003).
En este método se emplearon dos fases móviles consistentes de agua (fase A) y
metanol 60% (fase B), ambas ajustadas a pH 2.4 con ácido ortofosfórico. La columna
empleada fue una columna en fase reversa Symmetry C18 Waters Co. (Milford, MA., E.U.A.)
de 4.6 mm x 250 mm, 5µm, con un guarda columna Novapak C18 de 5µm Waters Co. (Milford,
MATERIALES Y MÉTODOS
35
MA., E.U.A.). El programa de elución con gradiente con el que corrió el método se detalla en la
Tabla 2.1. Al final de cada gradiente de 45 minutos se estableció un gradiente en reversa de 15
minutos, para volver a las condiciones iniciales de 100 % de fase A y 0 % de fase B, el tiempo
total por corrida queda en 60 minutos. El flujo se estableció a 0.8 mL/min a lo largo de toda la
corrida (Del Pozo-Insfran, et al., 2003).
Tabla 2.1 Programa de elución por gradiente para separación cromatográfica de flavonoides1.
Tiempo (min.) Fase A (%) Fase B (%)
0 a 3 100-70 0-30
3 a 8 70-50 30-50
8 a 25 50-30 50-70
25 a 30 30-20 70-80
30 a 35 20-0 80-100
35 a 45
45 a 60
0
100
100
01(Del Pozo-Insfran, et al., 2003)
2.2.4.2 Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos individuales
Se creó una biblioteca de espectros UV-Visible a partir de estándares comerciales
grado analítico, de los cuales se prepararon soluciones madre de 500 ppm empleando metanol
75% con HCl 1.2 M como disolvente. Posteriormente se prepararon los estándares de trabajo
para inyección en el HPLC en concentración de 50 ppm en quedando al final en un medio con
metanol 75 % y HCl 0.6 M. El método cromatográfico empleado fue el mismo que se describió
en la sección 2.4.1. Para la cuantificación se realizaron curvas de calibración por volumen de
inyección en un rango de 12.5 a 250 partes por millón. Los estándares empleados fueron ácido
rosmarínico, luteolina, kaempferol, quercetina, hesperidina, miricetina, catequina, epicatequina,
ácido clorogénico, apigenina, ácido caféico, ácido ellágico, ácido vainíllico, ácido gálico,
naringina, naringenina, ácido p-hidroxibenzoico, ácido protocatechuico, ácido p-cumárico,
rutina, así como estándares de las antocianinas pelargonidina-3-glucósido, cianidina-3-
glucósido, malvidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido y delfinidina-3-
glucósido.
2.2.4.3 Procedimiento de interpretación espectros UV-Visible
La identificación de los componentes de las muestras analizadas, se realizó por tres
métodos, i) mediante comparación directa del espectro de absorción UV-Visible de cada pico
con los estándares auténticos de la biblioteca de espectros; ii) por interpretación espectral de
MATERIALES Y MÉTODOS
36
los máximos de absorción y comparación con espectros reportados en bibliografía y iii) por
tiempo de retención. Los cromatogramas obtenidos se analizaron en 3 longitudes de onda
seleccionadas de acuerdo al tipo de compuestos de interés, 280 nm para ácidos fenólicos, 335
para flavonas y 380 para flavonoles.
2.2.5 Análisis Estadístico
La modificación del extracto por medio de cromatografía aniónica se llevó a cabo por
triplicado en columnas separadas. El diseño experimental para la evaluación de la
copigmentación fue generado utilizando cinco relaciones molares copigmento/pigmento (0, 25,
50, 75 y 100) y tres tipos de extracto de tomillo (Crudo WA30 y PA308). Las diferencias en la
concentración de cada compuesto específico se calcularon usando los datos recolectados para
cada longitud de onda. El análisis estadístico de la información generada se llevó a cabo
utilizando el paquete estadístico JMP versión 5.0 (SAS Institute Inc. Cary, NC., EUA.)
mediante el análisis de varianza (ANOVA), y la separación de medias se llevó a cabo utilizando
la prueba de LSD (p<0.05). Además se evaluaron las correlaciones de Pearson entre las
concentraciones de cada compuesto identificado en los extractos y las variables de respuesta
de cambio hipercrómico, cambio batocrómico y actividad enzimática. Todos los tratamientos y
análisis se llevaron a cabo por triplicado
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
37
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como resultado del tratamiento del extracto de tomillo con las dos resinas aniónicas,
se obtuvieron dos nuevos extractos (WA30 y PA308), los cuales se sometieron a una
caracterización espectrofotométrica en el primer estudio de este proyecto para determinar el
efecto de dicho tratamiento sobre la composición fenólica de los extractos. Una vez evaluado el
efecto de las resinas aniónicas sobre los perfiles fenólicos los tres extractos fueron sometidos a
pruebas en un segundo estudio, para determinar su capacidad de copigmentar jugo de fresa e
incrementar la estabilidad de las antocianinas del mismo. Por último, con la intención de
elucidar los cambios en la composición química de los extractos causados por el tratamiento
con resinas aniónicas, se llevó a cabo un tercer estudio, en el cual se llevó a cabo un análisis
detallado por HPLC-PDA para la identificación y cuantificación de los principales componentes
de los extractos. Esto último con el objetivo de explicar las diferencias encontradas en sus
propiedades de copigmentación y capacidad de servir como sustratos de PPO.
Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso comercial
De acuerdo con el procedimiento descrito en la patente No. 5,908,650, como resultado
de la evaporación del metanol, se obtuvo un extracto de tomillo de alta viscosidad, debido al
contenido de agua residual de las operaciones de lavado en el procedimiento de extracción en
fase sólida con columnas de C18. Se obtuvieron un total de 100 mL del extracto crudo con un
peso de 128.8 g de fuerte olor pungente y color café oscuro, que representa un 12.9 % en peso
con respecto al material vegetal de partida. La materia prima de la que se partió se obtuvo a
granel, lo cual introduce la dificultad de certificar su origen y conocer la variedad de Thymus
vulgaris que se empleó, así como de las condiciones de crecimiento de la planta, las cuales se
sabe, influencian el contenido de ciertos compuestos en la especie. Por esta razón se empleó
un solo lote de especie, adquirida en un supermercado local, para la obtención del extracto
para todo el estudio, y evitar así el efecto de la variabilidad de la materia prima. El primer
análisis realizado al extracto, fue su contenido de fenólicos totales, resultando una
concentración de 0.6464 M ± 1.88 expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG). Una
caracterización parcial de la distribución de compuestos fenólicos en el extracto de tomillo se
realizó mediante el método de Glories (Mazza, et al. 1999), dando como resultado el perfil de
compuestos reportado en la Tabla 2.2.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
38
Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) deacuerdo con el método de Glories1.
Concentración (Molal)2
FenólicosTotales3 Flavonas4 Flavonoles5
Extracto deTomilloCrudo 1.296 ± 0.0216 0.526 ± 0.008 0.233 ± 0.004
1Reportado por Mazza, et al. (1999). 2Concentración expresada en moles de equivalentes por kilogramo de extractoobtenido. 3Expresados como equivalentes de ácido gálico. 4Expresados como equivalentes de ácido caféico.5Expresados como equivalentes de quercetina. 6Error estándar calculado a partir de tres mediciones.
Para la determinación de fenólicos totales se empleó el método de Folin-Ciocalteau
como un parámetro más exacto que el barrido espectral efectuado por el método de Glories,
debido a que por tratarse de una mezcla rica en componentes, la concentración estimada a
través de dicho método resulta más alta, esto es debido a la absorbancia proveniente de
compuestos no fenólicos en ese rango de longitud de onda. Por lo anterior, este método solo
puede ser empleado como una estimación primaria de la distribución de compuestos fenólicos
en una muestra. El método proporcionó información preliminar de la distribución de
compuestos fenólicos en el extracto. Las concentraciones de los tres tipos de compuestos
resultan ser mayores que las estimadas por Del Follo (2003) para tomillo, en las que se reportó
una concentración de fenólicos totales de 0.835 M, 0.288 M para flavonas y 0.142 M para
flavonoles. Esta variación puede deberse a diferencias en el método de extracción de los
compuestos fenólicos (temperatura, tiempo, agitación, etc) así como a la variabilidad de la
materia prima empleada.
Modificación al proceso comercial de obtención de extractos de tomillo
Mediante el uso de la patente comercial de Lenoble (1999), se obtienen
industrialmente extractos con las características descritas anteriormente para el tomillo, sin
embargo uno de los objetivos de este estudio, fue ir mas allá y lograr un refinamiento mayor del
contenido de compuestos fenólicos en dicho extracto mediante una modificación ó
incorporación de pasos adicionales al procedimiento descrito en la patente con el propósito de
superar limitaciones técnicas para la aplicación industrial de este tipo de aditivos.
El extracto original de tomillo (extracto crudo) fue pasado a través de una columna
empacada con una resina aniónica débil, obteniéndose una solución (extracto WA30) con un
contenido de fenólicos totales menor. De la misma forma, el contenido de fenólicos totales del
extracto crudo disminuyó al ser tratado con la resina aniónica fuerte PA308 (en adelante
extracto PA308). Los resultados se muestran en la Tabla 2.3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
39
Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado porcromatografía aniónica.
Extracto deTomillo
1Fenólicos Totales
(Molal)2 Error Estándar
CRUDO 0.81153
± 0,0061
WA30 0.6144 ± 0,0074
PA308 0.6992 ± 0,00101CRUDO= sin tratamiento con resina aniónica, WA30= extracto tratado con resina aniónica débil, PA308= extracto
tratado con resina aniónica fuerte. 2Expresados en moles de fenólicos totales como equivalentes de ácido gálico porkg de tomillo
3Promedio calculado a partir de tres determinaciones.
El empleo de resinas aniónicas para el fraccionamiento de extractos fenólicos para
aplicaciones en alimentos no ha sido reportado antes en un proceso comercial. Sin embargo,
había sido reportado con anterioridad por Guillén et al (1997) como una etapa de preparación
analítica de muestra. Los autores emplearon dichas resinas para el fraccionamiento de
fenólicos cargados y neutros en vino blanco como una etapa previa a su análisis por HPLC.
Uno de los factores clave para el fraccionamiento empleando este tipo de resinas de
intercambio, es la forma iónica de las especies de interés, en este caso los polifenoles
ionizables del extracto de tomillo. La activación previa de las resinas de intercambio, asegura
que la especie química del soporte se encuentre en la forma deseada, en este caso, se empleó
un buffer de fosfatos con un pH de 6.5 y fuerza iónica (I) de 0.05 para asegurar que las aminas
terciarias y cuaternarias de las resinas aniónicas se encontraran cargadas positivamente. De la
misma manera, el extracto de tomillo crudo preparado como solución base para el
fraccionamiento fue ajustado a pH de 6.5, con el fin de tener las formas disociadas de los
ácidos fenólicos e hidroxicinámicos, los cuales tienen rangos de pKa de 3 a 5 (García-Conesa,
1999).
Como se mencionó anteriormente, el empleo de las resinas aniónicas para el
fraccionamiento de los extractos de tomillo tuvo un efecto directo en la concentración de
fenólicos totales (como EAG), disminuyendo la concentración de éstos en un 24.3 % para el
caso de la resina débil WA30 y un 13.8 % para el caso de la resina fuerte PA308. El análisis
posterior de cada uno de estos extractos por HPLC-PDA permitió obtener un perfil de
compuestos fenólicos mas detallado, como se describirá en secciones posteriores. Esta
disminución en el contenido de fenólicos totales influyó en primera instancia en el cálculo de
las relaciones molares empleadas para los sistemas de copigmentación. La concentración
molar de compuestos fenólicos totales del extracto de tomillo se empleó como base para el
cálculo del volumen de copigmento necesario para alcanzar las relaciones
copigmento/pigmento establecidas para este estudio, y debido a esta disminución, fue
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
40
necesario incrementar los volúmenes de copigmento necesarios para alcanzar la
concentración de fenólicos requerida (Anexo 2).
Evaluación de la capacidad de los extractos de tomillo de servir como sustratos de PPO
Se ha observado anteriormente que la adición de extractos de tomillo disminuye la
degradación de antocianinas y vitamina C en jugos procesados por altas presiones con alta
actividad residual de polifenoloxidasa, debido a sus propiedades de copigmentación y
propiedades antioxidantes (Del Follo, 2003). Sin embargo, la actividad enzimática residual
sigue siendo responsable de una buena parte de la excesiva degradación que sufren las
antocianinas copigmentadas durante el procesado y almacenamiento, y esto es debido a que
algunos compuestos fenólicos presentes en el extracto crudo de tomillo actúan como sustratos
enzimáticos de la polifenoloxidasa. Debido a esta limitante, un parámetro importante medido
para cada uno de los copigmentos modificados en el presente estudio, fue su actividad frente a
enzimas como la polifenoloxidasa (E.C. 1.14.18.1) con en fin de evaluar si el tratamiento del
extracto de tomillo con resinas aniónicas tuvo efecto sobre la capacidad del mismo de servir
como sustrato de la polifenoloxidasa. Para el ensayo enzimático se emplearon sistemas
modelo de 3 mL, empleando PPO comercial en solución reguladora de pH 6.5 y un volumen
fijo de solución de copigmento crudo y tratado con resinas aniónicas, estos sistemas de prueba
se mantuvieron siempre a una temperatura de 30ºC. En la Figura 2.2 se muestra gráficamente
la variación de la absorbancia en la solución con respecto al tiempo, de la cual, tomando la
sección lineal, se desprende el valor de la pendiente para cada extracto, la cual expresa el
cambio en la absorbancia con respecto al tiempo (∆A/∆t) en seg-1. Las pendientes de estas
gráficas fueron transformadas en velocidades iniciales de formación de producto considerando
la formación de o-quinonas y empleando su absortividad molar (ε= 5x103 M-1cm-1) reportada
para soluciones reguladoras de fosfato (Stauffer, 1989) (Tabla 2.4).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
41
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 25 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175 190 205 220 235 250 265 280 295 310
Tiempo (seg)
Ab
sorb
anci
a @
420
nm
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Ab
sorb
anci
a (C
AT
) @
420
nm
Tabla 2.4 Velocidades iniciales de formación de producto por la acción enzimática depolifenoloxidasa sobre extractos de tomillo y catequina.
Extracto deTomillo1
ConcentraciónMolar de Fenólicos
Totales2
Velocidad inicial deformación de producto
en µmol/min3
Error Std.de las
velocidades5
Crudo 0.0954 0.1505 b4 ± 0.0031
WA30 0.0574 0.1706 b ± 0.0042
PA308 0.0614 0.0406 c ± 0.0017
Catequina(CAT)
0.0444 0.5676 a ± 0.02481Muestras tomadas a partir de los extractos de tomillo crudo y modificado con resinas aniónicas para copigmentación.2Expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) en los extractos de prueba 3Expresada como µmol/minuto, yobtenido a partir de la pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo, considerando la absortividad molar (ε) delas quinonas en regulador de fosfatos como 5x103 M-1cm-1 (µmol/min) y un volumen de ensayo de 3 mL. 4Los valorescon letras diferentes entre una misma columna indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05).5Obtenido a partir del promedio de tres determinaciones.
Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo conpolifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5.
1Los datos de catequina están graficados en eje secundario del lado derecho 2Los valores con letras diferentes entrelíneas de tendencia indican que poseen pendientes significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3 [FenólicosTotales]=0.0271M en equivalentes de ácido gálico. 4[Fenólicos Totales]=0.0205 M en equivalentes de ácido gálico.5[Fenólicos Totales]=0.0233 M en equivalentes de ácido gálico.
Catequina (CAT)1
Extracto crudo3
Extracto WA304
Extracto PA3085
Líneas de tendencia
c
b
b2 a
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
42
El análisis de las velocidades de formación de producto (método de las velocidades
iniciales) utilizando los diferentes extractos de tomillo como sustratos mostró que no existe
diferencia significativa entre el extracto crudo y aquel tratado con resina aniónica débil WA30,
contrario a lo que sucede con el extracto tratado con la resina aniónica fuerte, la cual presenta
una disminución del 73 % en la actividad de la enzima (Tabla 2.4). Los valores de velocidad de
formación de producto altos sugieren que la enzima dispone de mayor cantidad de sustrato, o
que dispone de los cofactores necesarios para llevar a cabo su actividad enzimática. Los
resultados obtenidos indican que la resina aniónica fuerte podría estar removiendo compuestos
que son sustratos identificados de PPO, como catequina, epicatequina, ácido caféico, ácido p-
cumárico, ácido gálico y otros (Stauffer, 1999). Otra posible explicación a este comportamiento
sería que la remoción de compuestos activadores de la enzima que pudieran haber quedado
retenidos en la resina aniónica. Con el propósito de ofrecer una explicación a lo observado se
llevó a cabo la caracterización detallada de la composición fenólica de los extractos, resultados
que se discutirán en una sección posterior.
Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos fenólicos de
tomillo en jugo de fresa
Una vez efectuados los tratamientos del extracto de tomillo con resinas aniónicas, y
llevados a cabo los ensayos para probar su capacidad para funcionar como sustratos de PPO
(Estudio 1), fue necesario determinar que dichos extractos, aun conservaban su capacidad
para ser empleados como copigmentos e incrementar la estabilidad de las antocianinas
presentes en el jugo de fresa. El contenido de antocianinas monoméricas en las fresas
empleadas para este estudio, determinado por el método de pH diferencial, fue de 16 mg ±
0.12 por cada 100 g de fruta, expresados como pelargonidina-3-glucósido. Este contenido de
antocianinas en las fresas empleadas para producir el jugo, se encuentra dentro del rango de
14.8-41.8 mg/100 g reportado por Wrolstad et al. (1970) para 18 variedades de fresas. La
clarificación del jugo con enzimas pectinasas eliminó el material suspendido (Figura 2.3), así
como la pectina en disolución evitando introducir errores en las determinaciones
espectrofotométricas por la turbidez del sistema, además de ser una práctica común en la
producción industrial de jugos de frutas para evitar la formación de geles que dificultan su
fluidez así como para obtener jugos translúcidos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
43
Adicionalmente se realizó un análisis de las antocianinas específicas presentes en el
jugo de fresa por cromatografía de líquidos de alta resolución y mediante el uso del detector
PDA se estableció la identidad de cada una de las especies identificadas (Figura 2.4). García-
Viguera y otros (1996) reportaron que el contenido de antocianinas en fresas, consiste
primordialmente de pelargonidina-3-glucósido, así como pequeñas cantidades de cianidina-3-
glucósido y pelargonidina-3-rutinósido. Otros autores han reportado análisis de las
Figura 2.3 Cambio en la apariencia deljugo de fresa después de la clarificación.(A) jugo clarificado con pectinasas,15minutos a 45ºC, (B) jugo sin clarificar.
A B
520 nm
1
2
3
1 2 3
Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragariaanannassa L.) a 520 nm. El espectro UV-Visible de cada pico mostrado en la parte superior delcromatograma, confirma su identidad química. Identificación de picos: (1) cianidina-3-glucósido; (2) pelargonidina-3-glucósido; (3) probable pelargonidina-3-rutinósido.
Ab
sorb
anci
a
Minutos
10.4 %
72.3 %
17.3 %
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
44
antocianinas presentes en jugo de fresa, y coinciden en que mas del 70 % de éstas
corresponden a pelargonidina-3-glucósido y pequeñas cantidades de cianidina-3-glucósido,
además de otros pigmentos derivados de la pelargonidina (Bakker, 1992; Sondheimer y
Kertesz, 1956; Garzón y Wrolstad, 2002). El aislamiento y caracterización de las antocianinas
del jugo de fresa empleado en este estudio dio como resultado que el 72.3 % de las
antocianinas totales del jugo de fresa corresponden a pelargonidina-3-glucósido, el 10.4 %
corresponden a cianidina-3-glucósido, mientras que el 17.3 % se trata de otro glicósido de
pelargonidina, posiblemente rutinósido como lo reportaron García-Viguera y otros (1996).
Cambios espectrales en jugos copigmentados con extractos de tomillo
De acuerdo con estudios previos sobre la estabilidad de antocianinas copigmentadas
con extractos fenólicos realizados por Del Follo (2003) y Covarrubias (2001) se formularon
relaciones molares de 0 a 100 en la copigmentación llevada a cabo con jugo de fresa. Con
base en la concentración de antocianinas del jugo de fresa empleado se calcularon los
volúmenes de copigmento que mantuvieran dichas relaciones. Los estudios de Dimitri�-
Markovi� et al. (2000) demostraron el efecto de la variación de la relación molar
copigmento/pigmento sobre las propiedades espectrales de malvidina-3,5-diglucósido
copigmentada con ácidos caféico y ferúlico, empleando como parámetros de medición la
magnitud de los cambios hipercrómicos y batocrómicos en dichos sistemas. Los cambios
hipercrómicos, son comúnmente expresados como el incremento porcentual en la absorbancia
a la longitud de onda de máxima, mientras que los cambios batocrómicos se expresan en
función del número de nanómetros que se desplaza dicha longitud de onda máxima producto
de la adición de copigmentos. Estos cambios hipercrómicos y batocrómicos, se emplearon
como variables de respuesta para determinar la capacidad de los extractos de tomillo
modificados de servir como copigmentos. Los resultados de dichas determinaciones se
muestran en la Tabla 2.5. En el caso de los cambios batocrómicos que tiene lugar en el jugo de
fresa, se observa claramente que la adición de copigmento al jugo de fresa provoca cambios
batocrómicos máximos en el nivel de 75, después del cual en el nivel de 100 no existe
diferencia significativa. Una visualización gráfica de estos resultados puede ser apreciada en el
Anexo 3. Este tipo de comportamiento de aparente saturación ha sido reportado por muchos
autores como Dimitri�-Markovi� (2000); Ansen et al. (1972); Davies y Mazza (1993); Baranac
et al. (1996); Covarrubias (2001); Del Follo (2003). Para el caso de los cambios hipercrómicos,
el comportamiento es diferente; la magnitud del cambio porcentual presentó un máximo de
saturación en el nivel 50 para el extracto crudo, en 75 para el extracto WA30 y en 100 para el
extracto PA308. Independientemente de la relación molar en la que se observa la saturación,
es en este último tratamiento con el extracto PA308 donde se observó un incremento
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
45
significativamente mayor en la absorbancia, lo que es altamente deseable debido a que indica
que el extracto tiene mejor capacidad de copigmentación y potencialmente mayor capacidad
estabilizante del pigmento.
Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedadesespectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa).
RELACIÓN MOLAR COPIGMENTO/PIGMENTO1Extracto deTomillo 0 25 50 75 100
Crudo 0,0 C2 8,0 B a2 13,0 A a 13,3 A b 14,0 A b
WA30 0,0 D 8,0 C a 11,3 B a 13,7 A ab 12,7 AB bCambio
Batocromico3
PA308 0,0 D 9,3 C a 12,0 B a 15,3 A a 16,7 A a
Crudo 0,0 C 47,0 A ab 50,2 A b 30,4 B c 33,6 B b
WA30 0,0 C 32,5 B b 48,8 AB b 53,7 A b 40,2 AB bCambioHipercrómico4
PA308 0,0 E 56,8 D a 73,0 C a 98,5 B a 116,8 A a1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar de antocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.2Valores con letras minúsculas diferentes entre una misma columna indican que son significativamentediferentes, y valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamente diferentes(LSD test, P<0.05). 3Calculado por diferencia con la λmax del jugo de fresa de nivel 0 que fue 498 nm. 4Calculado comoel incremento porcentual en la absorbancia máxima del jugo de fresa copigmentado con respecto al jugo de fresa (ensu valor de λmax), carente de extractos de tomillo.
Como se mencionó en la discusión de resultados del estudio 1 (pagina 38), la
disminución en el contenido de fenólicos totales con el tratamiento con resinas aniónicas
implicó un incremento en el volumen de copigmento necesario para alcanzar las mismas
relaciones molares copigmento/pigmento para los tres tratamientos, este incremento fue de 31
% para el copigmento WA30 y de 15 % para el copigmento PA308, a pesar de que las
concentraciones de fenólicos totales añadidos al sistema de copigmentación son equivalentes.
Este aumento en el volumen de copigmento, podría resultar en la presencia de mayor cantidad
de compuestos específicos en el sistema, debido a diferencias en la respuesta ante el reactivo
de Folin-Ciocalteau por parte de los compuestos individuales. Sin embargo, al realizar una
comparación entre los tres tratamientos, se puede ver que este incremento significativo de 116
% en la absorbancia para el copigmento PA308, no se da en el caso del tratamiento con la
resina WA30. Estos resultados indican que los cambios batocrómicos observados no pueden
ser explicados por los incrementos de volumen, debido a que se esperaría un mayor
incremento para el caso del extracto WA30 al tener mayores volúmenes de copigmento. Con
base en los resultados de la copigmentación, es evidente que el enriquecimiento de la fracción
PA308 con algún compuesto flavonoide específico, podría explicar este comportamiento. Por
otro lado, la remoción de algunos compuestos, como los ácidos fenólicos, también permitiría un
mayor apilamiento de los compuestos con estructuras planares de tipo flavonol o flavona,
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
46
permitiendo una mejor interacción entre las regiones con electrones π, provocando
incrementos mayores en la absorbancia de las antocianinas.
Cambios colorimétricos en jugo de fresa causados por la adición de extractos de tomillo
Además de los cambios espectrales que se describieron en la sección anterior, la
adición de copigmentos causó cambios significativos en las propiedades visuales de los
sistemas con antocianinas (Figura 2.5). Originalmente Robinson y Robinson (1931)
describieron la copigmentación como ‘el fenómeno en el cual el color de las antocianinas se
torna mas azul, mas brillante y mas estable’. Este efecto de corrimiento hacia el azul era
interpretado como una consecuencia del cambio batocrómico que afecta la banda de absorción
en el rango visible, mientras que el incremento en el color ó intensidad era el término común
para describir el subsiguiente efecto hipercrómico. Sin embargo una correcta descripción del
color, de manera objetiva, requiere de tres atributos, el ángulo de color hue (h*, ó también
llamada tonalidad cromática), la saturación de color o chroma (C*, ó también conocida como
pureza del color) y la luminosidad (L*, ó escala de blanco a negro) (Gonnet,, 1998). En la Tabla
2.6 se puede observar el efecto de la adición de extractos de tomillo sobre los valores de
colorimetría instrumental de sistemas de jugo de fresa. Estas determinaciones se realizaron en
los mismos sistemas a los cuales se les midieron sus características espectrales.
Figura 2.5 Cambios visuales causados por la adiciónde extractos fenólicos de tomillo sobre jugo de fresa(Fragaria ananassa). Las razones molarescopigmento:pigmento empleadas fueron de 0, 25, 50,75 y 100, calculadas en base al contenido deantocianinas totales, expresadas como equivalentesde pelargonidina-3-glucósido y fenólicos totales delextracto crudo expresados como equivalentes deácido gálico.
0 25 50 75 100
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
47
Tabla 2.6 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10ºiluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa L.) adicionado con tres tipos deextracto de tomillo.
RELACIÓN MOLAR COPIGMENTO/PIGMENTO1Color
Instrumental4Extracto deTomillo 0 25 50 75 100
Crudo 39,1 A2 30,5 B a3 28,1 C a 26,1 D a 25,1 E a
WA30 37,5 A 28,7 B b 25,9 C b 22,0 D c 21,7 D cLuminosidad
(L*)PA308 38,6 A 28,7 B b 25,9 C b 24,2 D b 23,6 E b
Crudo 48,9 A 39,8 B a 34,8 C a 26,2 D a 22,0 E a
WA30 48,8 A 36,2 B b 28,8 C c 20,0 D b 19,4 D bSaturación de
Color (C*)PA308 50,4 A 40,5 B a 33,1 C b 26,4 D a 22,2 E a
Crudo 41,2 A 25,7 B b 22,7 C b 20,8 D b 19,7 E c
WA30 41,6 A 24,6 B c 21,5 C c 20,8 D b 20,3 D bÁngulo deColor (h*)
PA308 43,0 A 27,3 B a 24,2 C a 21,8 D a 21,2 E a1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico, entrela concentración molar del pigmento en el jugo de fresa, expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.2Los valores con letras minúsculas diferentes entre una misma columna indican que son significativamente diferentes(LSD test, P<0.05). 3Los valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamentediferentes (LSD test, P<0.05). 4Los resultados se expresan como unidades adimensionales de luminosidad (L*),saturación de color (C*) y ángulo de color (h*) empleando un plato de calibración blanco como fondo reflejante para lasceldas.
La adición de extractos de tomillo con incremento gradual en la relación
copigmento/pigmento, provocó a su vez un decremento sucesivo en el valor de luminosidad
para los sistemas. Estas observaciones se deben posiblemente a la aportación que hace el
copigmento al color total del sistema, debido al intenso color café del extracto de tomillo
empleado para preparar los sistemas de copigmentación. La disminución de los valores de
saturación de color, indican una disminución en la pureza ó vividez del color, la cual puede ser
también atribuible a la aportación de color hecha por el copigmento, provocando una
disminución de dichos valores. Los estudios realizados por Gonnet (1999) mostraron un
comportamiento similar a los observados, y confirman que los cambios en la llamada
“intensidad” del color ó hipercromismo, corresponden a las variaciones que provienen de la
modificación de dos atributos del color, la luminosidad (L*) y la saturación del color (C*).
Los cambios en el valor del ángulo de color, siguen una evolución similar al de los
otros dos parámetros, con una disminución gradual que es proporcional al incremento en la
razón molar copigmento:pigmento. El ángulo de color se ubica en un círculo cromático que
corre contrario a las manecillas del reloj (Anexo 4), cuyos valores van de 0 a 360 (magenta),
con extremos de 90 para el amarillo, 180 para el verde-azul y 270 para el azul. Las tonalidades
básicas intermedias son nombradas de acuerdo a su valor de ángulo de color calculados y
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
48
pueden ser ubicadas en el disco de distribución de colores del espacio de color del sistema
CIELAB (Anexo 4). El valor para el ángulo de color en los tratamientos evaluados se desplazó
en promedio desde 42, en la zona del color naranja para el sistema sin copigmento, hasta
valores promedio de 20.4 en la zona de los colores rojos. La comparación entre los diferentes
extractos mostró que el extracto PA308 logró una disminución ligeramente menor del ángulo
de color, lo cual sería deseable desde el punto de vista del rendimiento del extracto, debido a
que valores menores en dicho ángulo indican que lo cambios visuales por intensificación del
color rojo, se pueden lograr con cantidades más bajas de copigmento. En general, los cambios
en el valor del ángulo de color proporcionan una mejor idea de la magnitud de los cambios
visuales que sufre el jugo de fresa con la adición del copigmento; es en cierta forma, un mejor
parámetro para describir el “resultado visual” de la modificación de las características
espectrales causadas por la copigmentación. En esta serie de tratamientos se repitió el
comportamiento observado por otros autores con anterioridad (Gonnet, 1999, Del Follo, 2003)
determinándose que a mayor cantidad de copigmento agregado, mayores fueron los efectos
globales sobre el color instrumental.
Antocianinas monoméricas totales, color polimérico y densidad de color
El método de pH diferencial, fue reportado por Wrolstad (1976) como una forma de
determinar con precisión la concentración de antocianinas monoméricas y es de gran utilidad
en la industria de alimentos, al igual que otras técnicas espectrofotométricas auxiliares como el
blanqueado con SO2 y el índice de color, empleadas industrialmente para medir la extensión de
la polimerización de antocianinas y el obscurecimiento enzimático.
Con la adición de extractos de tomillo con incremento gradual en la relación
copigmento/pigmento, se provocó a su vez un decremento sucesivo en el valor de antocianinas
monoméricas totales para los sistemas (Tabla 2.7). Este fenómeno ha sido observado en
estudios previos por Del Follo (2003) para la copigmentación de jugo de uva con extractos de
tomillo. Los sistemas de copigmentación evaluados en este estudio, sin embargo presentaron
una aparente estabilización del contenido de antocianinas monoméricas totales para el caso
del nivel de copigmentación 75 con el extracto tratado con la resina fuerte PA308. La
comparación entre resinas mostró una disminución de la concentración de antocianinas
monoméricas totales en el nivel 100 con respecto al nivel 0, de 28.6 % para el extracto crudo,
16.2 % para el extracto WA30 y 13.6 % para el extracto PA308. La formación de compuestos
por asociación de las antocianinas con moléculas presentes en los extractos podría ser una
causa por la cual la cantidad de antocianinas monoméricas disminuyeron con la presencia de
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
49
los extractos, debido a la formación de enlaces covalentes antocianina-copigmento, los cuales
han sido reportados con anterioridad (Escribano-Bailón, et al., 1996), impidiéndose la
copigmentación y disminuyendo la concentración de antocianinas monoméricas totales en el
jugo. Las concentraciones de compuestos fenólicos, al estar en proporción mucho mayor que
las antocianinas en los sistemas de copigmentación, podrían también estar influenciando las
determinaciones espectrofotométricas si sus absorbancias están dentro del rango de la
absorbancia máxima de las antocianinas.
La densidad de color se determinó en las muestras sin tratamiento con bisulfitos ó
soluciones reguladoras, y corresponde a la suma de las absorbancias en la longitud de onda
de máxima absorbancia de las antocianinas (λmax) y en la longitud de onda máxima de los
pigmentos poliméricos (420 nm) (Tabla 2.7). Este parámetro mostró un comportamiento inverso
al de las antocianinas monoméricas totales, debido a que la adición de copigmentos en niveles
cada vez mayores, incrementó la densidad de color del sistema. Debido a que esta medición
se trata de la sumatoria de las absorbancias en el jugo de fresa copigmentado empleando
agua bidestilada como solvente, era un comportamiento predecible, encontrar densidades de
color ascendentes conforme se incrementaba la concentración de compuestos fenólicos en el
sistema, por solapamiento entre absorbancias máximas de las antocianinas o compuestos
poliméricos con componentes de los copigmentos.
El color polimérico se determinó de manera similar a la densidad de color pero
empleando los sistemas de copigmentación tratados con bisulfito, causando la decoloración de
las antocianinas presentes por un mecanismo atribuido a la formación de estructuras sulfónicas
incoloras en las posiciones 2 y 4 del catión flavilio de las antocianinas (Jackman y Smith,
1996). Con el incremento gradual en la concentración de compuestos fenólicos, provocados
por la adición de los extractos de tomillo, se incrementó también el color polimérico. Este
efecto, podría explicarse por el efecto protector que tiene sobre las antocianinas el
solapamiento π que sufren con los copigmentos, haciéndolas resistentes al blanqueado.
Además de la presencia de reacciones de asociación entre el copigmento y la antocianina, de
manera similar a lo que ocurre en la determinación de antocianinas monoméricas totales.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
50
Tabla 2.7 Efecto de la adición de los extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris L.) sobrelas determinaciones de antocianinas, densidad de color, color polimérico y porcentaje de colorpolimérico del jugo de fresa (Fragaria anannassa L.).
Niveles de copigmento1Tipo deExtracto 0 25 50 75 100
Crudo 85,28 A2 78,72 B b2 73,67 C b 62,27 D b 60,89 D b
WA30 94,47 A 92,11 A a 83,71 B a 80,11 BC a 79,12 C aAntocianinasMonoméricas
Totales3PA308 94,76 A 82,04 B ab 80,77 B a 79,56 B a 81,86 B a
Crudo 1,91 E 3,10 D c 4,36 C b 5,63 B a 7,12 A a
WA30 2,14 D 3,49 C a 5,13 B a 5,79 B a 6,83 A aDensidad de
Color4
PA308 1,79 E 3,22 D b 4,41 C b 5,84 B a 7,15 A a
Crudo 0,35 E 1,02 D a 1,67 C a 2,77 B a 3,95 A a
WA30 0,37 D 1,08 C a 2,15 B a 2,47 B a 3,30 A bColor
Polimérico5
PA308 0,47 E 1,03 D a 1,75 C a 2,68 B a 3,27 A b
Crudo 18,64 E 32,81 D a 38,34 C a 49,18 B a 55,51 A a
WA30 17,08 D 30,88 C a 41,62 B a 42,71 AB b 48,37 A b% de ColorPolimérico6
PA308 26,40 C 31,90 C a 39,72 B a 45,90 A ab 45,77 A b1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar del pigmento expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido. 2Los valores con letrasminúsculas diferentes entre una misma columna y para una misma medición indican que son significativamentediferentes, y los valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamentediferentes (LSD test, P<0.05). 3Expresado en equivalentes de pelargonidina-3-glucósido. 4Calculado como la suma delas absorbancias a 420 nm y a la longitud de onda de máxima absorbancia de las muestras tratadas con agua. 5
Calculado como la suma de las absorbancias a 420 nm y a la longitud de onda de máxima absorbancia de lasmuestras tratadas con bisulfitos. 6Calculado a partir de la relación de absorbancias entre las muestras tratadas conbisulfitos y muestras tratadas con agua.
Copigmentación con sales metálicas
La prueba de copigmentación con sales de aluminio da resultados desalentadores en
cuanto a su uso potencial como agente estabilizador de color en jugo de fresa. Las
coordenadas de color instrumental (Tabla 2.8) indican que como resultado de la adición
progresiva de iones aluminio, se presenta un obscurecimiento gradual del jugo, al disminuir su
valor de luminosidad. La saturación de color que sufren los sistemas es prácticamente nula, y
solo se presenta un cambio para la concentración de 100 ppm. La disminución en el ángulo de
color presentada es progresiva con relación al incremento en la concentración de iones
metálicos, sin embargo, no llega a niveles comparables con los observados para el caso de la
adición de copigmentos de tipo fenólico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
51
Tabla 2.8 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10ºiluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa L.) adicionado con ionesaluminio.
CONCENTRACIÓN1
Color Instrumental3 0 100 200 400 600
Luminosidad (L*) 43,48 a2 42,28b 41,38c 40,20d 39,69d
Saturación de Color (C*) 51,8 c 55,8 a 53,4 b 53,5 b 52,7 bc
Ángulo de Color (h*) 49,7 a 48,4 b 46,7 c 46,2 d 45,5 e1Definido como la concentración en partes por millón de iones aluminio en solución. 2Los valores con letras diferentesen una misma fila indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Los resultados se expresan comounidades adimensionales de luminosidad (L*), saturación de color (C*) y ángulo de color (h*) empleando un plato decalibración blanco como fondo reflejante para las celdas.
Peculiarmente los cambios batocrómicos observados en la soluciones de jugo de
fresa-copigmento con iones aluminio, presentan retrocesos en el valor de longitud de onda de
máxima absorbancia (λmax), en relación con el valor de λmax en el jugo de fresa con iones
aluminio, este comportamiento indica que este tipo de copigmento provoca corrimientos de la
longitud de onda máxima hacia la zona azul del espectro visible, que es el lado opuesto del
espectro con respecto a la longitud de onda de los colores rojos. Sin embargo esta diferencia
no llega a ser significativa entre los niveles probados (Tabla 2.9). La magnitud de los cambios
hipercrómicos es comparable con la provocada por la adición de copigmentos de tipo fenólico,
sin embargo, como se pudo ver en los resultados del análisis colorimétrico, los cambios
visuales que sufren los sistemas son mínimos.
Tabla 2.9 Efecto de la adición de iones aluminio sobre las propiedades espectrales del jugo defresa (Fragaria ananassa L.).
CONCENTRACIÓN1
0 100 200 400 600
CambioBatocromico3
0,0 a2 -2,0 a -1,0 a -0,7 a -2,3 a
CambioHipercrómico4
0,0 d 55,2 c 76,5 b 89,1 a 93,6 a1Definido como la concentración en partes por millón de iones aluminio.2Valores con letras diferentes entre una mismafila indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Calculado por diferencia con la λmax del jugo defresa de concentración 0 que fue 498 nm. 4Calculado como el incremento porcentual en la absorbancia máxima deljugo de fresa copigmentado con respecto al valor de λmax del jugo de fresa de concentración 0, carente de copigmento.
El comportamiento observado en el jugo de fresa copigmentado con soluciones de
aluminio puede explicarse considerando del mecanismo propuesto para este tipo de
asociaciones entre las antocianinas y los iones metálicos. Elhabiri y otros (1997), sugieren que
una copigmentación efectiva con iones metálicos implica la intervención de grupos hidroxilo en
posición orto en el anillo B de la antocianina, los cuales actúan como donadores de pares
electrónicos para una reacción de formación de un complejo denominado metalocianina. Esta
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
52
reacción de acomplejamiento es un proceso suficientemente estable para inducir cambios de
color de rojo hasta el púrpura, los cuales se deben a la conversión de las formas incoloras de
las antocianinas en un quelato colorido, en el cual los pigmentos adoptan una estructura
quinoidal. Este mecanismo propuesto explica el poco poder de copigmentación que la solución
de iones aluminio tiene sobre las antocianinas del jugo de fresa, debido a que como se
muestra en el análisis HPLC-PDA realizado al jugo (Figura 2.4), casi el 90 % de las
antocianinas presentes son derivados de pelargonidina, la cual carece de hidroxilos en
posición orto requeridos para una copigmentación efectiva con iones metálicos. Los cambios
observados por la adición de iones aluminio en los sistemas de copigmentación, fueron
debidos al efecto de los iones metálicos sobre los derivados de cianidina presentes, la cual si
posee hidroxilos en posición orto, sin embargo, estos cambios son poco perceptibles por efecto
de su concentración.
Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por
cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos (HPLC-
PDA)
Con el objetivo de poder justificar los resultados obtenidos en los dos estudios
anteriores, en donde se comparó la respuesta de los tres extractos tanto para copigmentar
como en los ensayos de actividad enzimática de PPO, se llevó a cabo la caracterización
química de los extractos de tomillo por medio de cromatografía de líquidos de alta resolución
con detector de arreglo de diodos. Esto con el fin de determinar los cambios sufridos por efecto
del tratamiento con las resinas aniónica fuerte y aniónica débil con respecto al extracto de
tomillo sin tratar. Como resultado de los dos estudios anteriores, se determinó que hubo una
disminución considerable en la actividad enzimática del extracto de tomillo tratado con la resina
PA308, así como una notable capacidad de dicho extracto para provocar cambios espectrales
y colorimétricos importantes en jugo de fresa en comparación con los respectivos extractos
crudo y aquel tratado con resina WA30. Los resultados obtenidos de este tercer estudio de
caracterización le arrojarán una posible explicación a estos cambios.
La determinación de la composición química de los extractos de tomillo, se llevó a
cabo empleando el método descrito en la sección de materiales y métodos, en el cual se
emplea un gradiente de polaridad descendente y con solventes acidificados a pH 2.4 con el fin
de lograr una separación de los componentes de la compleja mezcla por un equilibrio de
afinidades entre la fase estacionaria (columna empacada con resina C18) y la fase móvil cuya
polaridad cambia con el tiempo. La ventaja del empleo del detector de arreglo de diodos es la
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
53
posibilidad de obtener un barrido de longitudes de onda a través del tiempo, además de las
lecturas de absorbancia contra tiempo.
El extracto de tomillo, una vez sometido a tratamiento con las resinas aniónicas, se
trató como se describe en la sección 2.4.1 de materiales y métodos previamente a la inyección
en el equipo de separación cromatográfica. Las áreas recolectadas se cuantificaron en
equivalentes de tres estándares comerciales, para las tres longitudes de onda seleccionadas.
Se utilizó 280 nm para la identificación y cuantificación de ácidos fenólicos, 335 nm, para las
flavonas y 380 nm para los flavonoles (Markham, 1982). Los resultados en partes por millón
(ppm) se expresaron como equivalentes de ácido gálico, equivalentes de luteolina y
equivalentes de quercetina, respectivamente. En la Figura 2.6 se muestra el cromatograma
obtenido para el análisis del extracto del tomillo crudo a las tres longitudes de onda
mencionadas.
Para la identificación de los picos cromatográficos, y asignación de identidad química
tentativa, se emplearon tres métodos, por comparación directa con los espectros de la
biblioteca de fenólicos creada para este estudio (Método A), por comparación de espectros de
cada pico, con los espectros reportados en bibliografía (Método B), así como por comparación
de los tiempos de retención para cada pico con los tiempos de retención de los compuestos de
la biblioteca de fenólicos (Método C). La coincidencia en los tres métodos de identificación,
incrementa al certeza de la identidad tentativa reportada en la Tabla 2.10. Cabe mencionar que
la identificación de todos los componentes de la mezcla no fue posible debido a que algunos
de los picos presentan solapamiento de varios espectros de absorción, indicando que se trata
de mas de un compuesto eluyendo al mismo tiempo de retención, dicha co-elución no permite
identificar los máximos de absorbancia para los compuestos individuales. La Tabla 2.10
muestra los valores de longitud de onda de máxima absorbancia de los espectros PDA para
cada uno de los picos empleados en su identificación. La asignación de la identidad también
consideró la comparación de dichos valores con máximas reportadas en literatura, y la
interpretación de los cambios en el espectro de absorción causados por sustituyentes
específicos. Los cambios en el patrón de hidroxilación en esqueletos hidrocarbonados
similares se ven reflejados en el desplazamiento de las bandas de absorción de los
compuestos (Robards, et al. 1999).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
54
Como guía general, Markham (1982) reporta una serie de lineamientos para elucidar la
identidad química a partir de la interpretación del espectro UV-Visible, partiendo de una
primera clasificación del compuesto desconocido en uno de los grandes grupos en los que se
subdividen los compuestos fenólicos (Figura 1.4). Como se puede notar en la tabla de
identificación (Tabla 2.10), algunos de los compuestos se repiten, en ocasiones mas de una
vez, esto se debe a la presencia de formas glicosiladas de los compuestos. Los tiempos de
retención resultan siempre menores en glucósidos debido al aumento de la polaridad de la
molécula, lo que los hace tener menos afinidad por los grupos hidrofóbicos de la columna C18,
y por lo tanto pasan a una mayor velocidad a través de ella.
Figura 2.6 Cromatograma HPLC-PDA del extracto de tomillo crudo recolectado a treslongitudes de onda. (A) 280 nm; (B) 335 nm; (C) 380 nm. Identificación tentativa de picos: (1)glicósido de apigenina ó kaempferol-3,7-O-glucósido; (2) compuestos co-eluyendo; (3)Apigenina-8-C-glucósido; (4) Naringenina; (5) Apigenina glicosilada en anillo B; (6) Apigenina;(7) Luteolina glicosilada en anillo A; (8) Posible flavona; (9) Hesperetina; (10) Probable di-glicósido de 17; (11) Derivado de ácido rosmarínico; (12) Desconocido, probable co-elución;(13) Naringenina; (14) Luteolina; (15) Ácido rosmarínico; (16) Glicósido de 17; (17) Posibleflavona; (18) Posible flavona.
A
1
2
3
4
5 67
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17 18Ab
sorb
an
cia
Minutos
B
C
280 nm
335 nm
380 nm
Tabla 2.10 Identificación de picos cromatográficos en extracto de tomillo crudo por HPLC-PDA.
Número de pico (Tiempode retención, min.)1
λmax. (nm) de las bandasde absorción2 Identificación tentativa Método de identificación3
1 (16.5) 268.7, 349.5Kaempferol-3-glucósido ó probable 3,7-O-
glicósidoA, B
2 (17.72) 297.1, 325.1 Co-elución de dos compuestos A
3 (18.57) 216.8, 273.4, 335.2, Apigenina-8-C-glucósido A, B
4 (23.44) 216.8, 282.9, 330.4h Derivado de Naringenina A, B
5 (25,64) 268.7, 335.2 Apigenina glicosilada en anillo B A, B
6 (27.67) 268.7, 340.0 Apigenina A, B
7 (28.54) 268.7, 349.5 Luteolina sustituida en anillo A A, B
8 (29.83) 282.9, 335.2 Posible Flavona
9 (30.44) 282.9, 335.2 Hesperetina A, C
10 (32.9) 282.9, 340.0 Probable di-glicósido del pico 17
11 (33.93) 330.4 Derivado de ácido Rosmarínico A, B
12 (36.62) 287.6, 325.7 Desconocido, probable co-elución
13 (37.48) 287.6 Naringenina A, B, C
14 (38.26) 254.5, 349.5 Luteolina A, B, C
15 (39.17) 330.4 Ácido Rosmarínico A, B, C
16 (40.96) 282.9, 340.0 Glicósido del pico 17
17 (41.52) 282.9, 340 Posible Flavona
18 (43.97) 287.6, 344.7 Posible Flavona
1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6). 2Tomadas a partir del espectro de absorción de cadapico en el cromatograma, h=hombro. 3Método empleado para determinar la identidad de cada pico: (A) Identificación por comparación directa delespectro de absorción UV-Visible del pico con los estándares auténticos de la biblioteca de espectros; (B) Identificación por interpretación espectralde los máximos de absorción y comparación con las máximas reportadas en bibliografía (Markham, 1982; Harborne, 1989; Markham, 1989) y (C)Identificación por comparación de tiempo de retención con estándares auténticos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
56
En la asignación de la identidad química se observó que varios picos coincidieron con
el espectro de absorción reportado para la apigenina en diferentes tiempos de retención (Tabla
2.10, picos 3, 5 y 6), la presencia de formas glicosiladas para el mismo compuesto permite
este fenómeno, y las diferencias entre los espectros de estos compuestos son pequeños
desplazamientos de los máximos en alguna de las bandas de absorción, en función del anillo y
de la posición en la que se sitúa la glicosilación.
En la Figura 2.7 se muestra una comparación entre cromatogramas de los tres
extractos empleados en los estudios de copigmentación a una longitud de onda de 335 nm, fue
a esta longitud de onda en la que la mayoría de los picos mostraban un máximo de
absorbancia. Se puede apreciar que la diferencia en el perfil de los tres cromatogramas es
mínima, salvo en lo que se refiere a la altura de los picos, y por consiguiente al área de cada
uno de ellos. Como fue mencionado anteriormente, la concentración de cada uno de estos
compuestos identificados, se realizó usando un estándar comercial como equivalente para
cada corte de longitud de onda empleado; ácido gálico a 280nm, luteolina a 335nm y
quercetina a 380 nm (Tablas 2.11a y 2.11b). Las concentraciones de cada uno de los picos se
calcularon utilizando la ecuación de regresión de la calibración efectuada para cada uno de los
tres estándares.
La cuantificación de cada pico en los extractos mostró pocas diferencias significativas
para el caso de los primeros tres picos, lo que confirmó los resultados obtenidos por el método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, en el que se observó una disminución en la
concentración de compuestos fenólicos producto del tratamiento con resinas. Un punto
importante a notar son las diferencias significativas observadas para la naringenina (Tabla
2.8a, pico 4) a 380 nm, que indican que el extracto PA308 (resina fuerte) posee una mayor
concentración de este compuesto que el extracto WA30 (resina débil), aunque ambos tienen
menor concentración que el extracto crudo. Es importante recordar esta pequeña diferencia
debido a que se hará mención de ella en la discusión posterior.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
57
La determinación de Hesperetina (Tabla 2.11a, pico 9) en los extractos arroja un
fenómeno interesante, que se repite para varios de los picos en el cromatograma (picos 14, 15
y 16). Se puede observar que existe una disminución significativa entre su concentración en el
extracto WA30 con respecto al extracto crudo, lo cual no sucede con el extracto PA308, esta
tendencia parece indicar que la resina aniónica está siendo selectiva en la remoción de
compuestos específicos. Estos resultados pueden visualizarse gráficamente en el Anexo 5.
Esta diferencia es importante considerarla debido a que se trata de un compuesto que se
encuentra en concentraciones que son similares significativamente en el extracto crudo y el
extracto PA308, y que sugieren que el compuesto no se ve afectado por el tratamiento con la
resina aniónica fuerte. Esto implicaría que dicha resina, es capaz de remover compuestos
específicos y aumentar la concentración relativa de ciertos compuestos con relación a otros
que si se ven disminuidos en su concentración por efecto del tratamiento.
Figura 2.7 Comparación entre cromatogramas HPLC-PDA de extracto de tomillo crudo con lostratamientos con resinas aniónicas a 335 nm. (A) Extracto Crudo; (B) Extracto resina aniónicadébil (WA30); (C) Extracto resina aniónica fuerte (PA308). Identificación de picos: (1) glicósidode apigenina ó kaempferol-3,7-O-glucósido; (2) compuestos co-eluyendo; (3) Apigenina-8-C-glucósido; (4) Derivado de Naringenina; (5) Apigenina glicosilada en anillo B; (6) Apigenina; (7)Luteolina glicosilada en anillo A; (8) Posible flavona; (9) Hesperetina; (10) Probable di-glicósidode 17; (11) Derivado de ácido rosmarínico; (12) Desconocido, probable co-elución; (13)Naringenina; (14) Luteolina; (15) Ácido rosmarínico; (16) Glicósido de 17; (17) Posible flavona;(18) Posible flavona.
A
B
C
1 2
34
5 6
78 9 10
11
12 13
14
15
161718
Minutos
Ab
sorb
an
cia
Tabla 2.11a Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-PDA.
Concentración (ppm)2Número de pico(Tiempo de
retención, min.)1Identificación tentativa
Tipo deextracto
280 nm 335 nm 380 nm
1 (16.5)Kaempferol-3-glucósido óprobable 3,7-O-glicósido
CrudoWA30PA308
80.665.6064.20
a3
bb
65.3251.2651.36
abb
47.9438.8740.97
acb
2 (17.72)Co-elución de dos
compuestos
CrudoWA30PA308
64.5345.9748.43
abb
57.1437.1536.51
abb
3 (18.57) Apigenina-8-C-glucósidoCrudoWA30PA308
413.27339.71354.59
abb
486.67391.18403.87
abb
173.76139.47147.31
abb
4 (23.44) Derivado de NaringeninaCrudoWA30PA308
2359.311957.732030.78
abb
441.44252.00370.91
aaa
33.1023.7828.47
acb
5 (25,64) Apigenina glicosiladaCrudoWA30PA308
127.31116.78120.97
abab
126.6299.04
101.66
abb
45.6534.8738.08
acb
6 (27.67) ApigeninaCrudoWA30PA308
155.91103.34106.05
abb
157.83114.8794.43
abb
56.0033.7135.14
abb
7 (28.54)Luteolina glicosilada
en anillo A
CrudoWA30PA308
290.76247.85253.47
abb
329.82267.45274.54
abb
215.90175.39183.08
abb
8 (29.83) Posible FlavonaCrudoWA30PA308
123.48128.09121.01
aaa
76.24174.99153.19
baa
155.02131.34114.74
aaa
9 (30.44) HesperetinaCrudoWA30PA308
512.91427.85441.44
abab
Tabla 2.11b Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-PDA (continuación).
1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6); 2Concentraciones determinadas como equivalentes deácido gálico para la determinación a 280 nm, como equivalentes de luteolina para la determinación 335 nm y como equivalentes de quercetina a 380nm. 3Los valores con letras diferentes entre una misma columna para un mismo compuesto, indican que son significativamente diferentes, (LSD test,P<0.05).
Concentración (ppm)2Número de pico(Tiempo de
retención, min.)1Identificación tentativa
Tipo deextracto
280 nm 335 nm 380 nm
10 (32.9)Probable glicósido del
pico 17
CrudoWA30PA308
242.00188.12286.59
a3
aa
118.8967.7689.03
abb
46.1829.8946.50
aaa
11 (33.93)Derivado del ácido
rosmarínico
CrudoWA30PA308
764.05480.15481.03
abb
1142.70654.17647.78
abb
100.0962.5562.06
abb
12 (36.62)Desconocido, probable
co-elución
CrudoWA30PA308
257.68167.82189.73
abb
234.52130.54136.72
abb
43.8121.5014.61
abb
13 (37.48) NaringeninaCrudoWA30PA308
319.76217.74254.16
acb
83.7657.2963.18
abb
13.126.376.77
abc
14 (38.26) LuteolinaCrudoWA30PA308
278.34261.99293.99
abba
341.20318.16360.13
abba
239.10222.30254.09
abba
15 (39.17) Ácido RosmarínicoCrudoWA30PA308
421.97365.47442.53
aba
573.03477.38604.61
aba
73.1755.4964.01
abab
16 (40.96) Glicósido del pico 17CrudoWA30PA308
224.39203.48209.71
abab
184.63159.31162.43
abb
74.9556.7157.82
abb
17 (41.52) Posible FlavonaCrudoWA30PA308
81.17116.94119.76
baa
41.4571.5269.36
baa
24.9917.6618.55
aaa
18 (43.97) Posible FlavonaCrudoWA30PA308
137.02137.51140.35
aaa
122.06106.52106.60
abb
76.7662.6147.99
aaa
1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6); 2Concentraciones determinadas como equivalentes deácido gálico para la determinación a 280 nm, como equivalentes de luteolina para la determinación 335 nm y como equivalentes de quercetina a 380nm. 3Los valores con letras diferentes entre una misma columna para un mismo compuesto, indican que son significativamente diferentes, (LSD test,P<0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
60
En cuanto al ácido rosmarínico, es notable como su derivado (Tabla 2.11b, pico 11) no
muestra diferencias entre los tratamientos con resinas aniónicas, sin embargo el ácido
rosmarínico como tal (Tabla 2.11b, pico 15) se encuentra en concentraciones
significativamente menores en los extractos pasados por la resina WA30. Sin embargo al igual
en el caso de la hesperetina, el contenido de ácido rosmarínico no es diferente entre el extracto
crudo y el pasado por la resina PA308, incluso se observa un efecto concentrador por parte de
esta última resina, que aunque no tiene significancia estadística mayor podría influir en la
capacidad del extracto de copigmentar en jugo de fresa, como se discutirá mas adelante.
El efecto selectivo de la resina aniónica fuerte (con tendencia concentradora) discutido
para el caso del ácido rosmarínico, se repite, ahora para el pico 14 (Tabla 2.11b) identificado
como luteolina, solo que en este caso, el efecto es más notorio, se observó que en las tres
longitudes de onda medidas, el extracto tratado con resina aniónica PA308 mostró una
concentración de luteolina mayor que en el extracto WA30 e incluso levemente mayor que en
el copigmento crudo de partida (Ver Anexo 5). Éste efecto selectivo no fue observado para el
caso del pico 7, que fue identificado como un derivado de la luteolina, donde solo se presentó
una disminución de la concentración por el tratamiento del extracto con resinas aniónicas. Es
notorio como este aparente efecto concentrador, no fue experimentado por las especies
identificadas como derivados glicosilados del mismo compuesto, lo que probablemente indique
algún efecto, quizá de impedimento estérico, ó de disponibilidad de cargas, ó incluso de
polaridad, en la selectividad de la resina aniónica.
El análisis comparativo de los cromatogramas por sobreposición (Figura 2.7 A, B y C),
mostró que en lo que se refiere al perfil de elución de los compuestos, las diferencias son
mínimas entre los tratamientos, e imperceptibles a simple vista, sin embargo, la cuantificación
de cada uno de estos picos, evidenció diferencias importantes. Un fenómeno que hay que
resaltar es que, en comparación con el extracto crudo, la mayoría de los compuestos en los
tratamientos presentaron una disminución en su concentración (Tabla 2.11a y b). Esto
explicaría la disminución en el valor de fenólicos totales determinados por el método de Folin-
Ciocalteau (Tabla 2.3). La excepción a este comportamiento, se presentó en algunos
compuestos con tiempos de retención altos (Tabla 2.11a y b, picos 8, 10 y 18), en los cuales
no hubo diferencias significativas entre los tratamientos en relación al extracto crudo.
Una característica importante que se pudo apreciar por comparación de las
concentraciones entre tratamientos, es que algunos de los compuestos que están identificados
como buenos copigmentos (luteolina y ácido rosmarínico), con tiempos de retención altos no
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
61
se vieron afectados por el tratamiento con la resina aniónica fuerte (como se mencionó
anteriormente). Lo anterior explica el porqué los extractos modificados, no pierden su
capacidad de actuar como copigmentos, sino al contrario se incrementa, comportamiento
observado en los ensayos de copigmentación (Tabla 2.5). La remoción de compuestos
específicos efectuada por las resinas, sin afectar la concentración de otros también presentes
en los extractos podría explicar este comportamiento. Al disminuir la concentración de ciertos
compuestos en el extracto, la competencia de las moléculas de copigmento por la antocianina
disminuye, dando mas oportunidad de copigmentar a moléculas con una mejor capacidad de
efectuar apilamientos π-π y de esta forma provocar cambios hipercrómicos y batocrómicos
mayores, es decir, una copigmentación más eficiente.
La aseveración anterior respecto a la competencia de las moléculas de copigmento por
la antocianina, puede ser respaldada mediante el análisis de correlación de Pearson, donde se
comprobó que la disminución en la concentración de algunos compuestos esta relacionada con
una mayor capacidad de copigmentar de los extractos. Por ejemplo el pico 13 identificado
como naringenina, ve disminuida su concentración por efecto del tratamiento con resinas
(Tabla 2.11b), esto a su vez podría estar contribuyendo al incremento en la capacidad de los
extractos para copigmentar antocianinas (r = -0.92 para cambio hipercrómico en nivel 100),
además, esta disminución en su concentración esta relacionada con la disminución de la
actividad enzimática de PPO del extracto PA308 (r = 0.89). De manera similar, el pico 10 que
no pudo ser identificado plenamente, pero que se trata de un glicósido de flavona, presenta
relaciones del mismo tipo; al disminuir su concentración, la capacidad de copigmentar del
extracto se ve mejorada (r = -0.83), a su vez que disminuye la actividad enzimática de PPO (r =
0.72).
Un comportamiento peculiar es el presentado por el pico 14, identificado como
luteolina. Se ha reportado con anterioridad que la presencia de algunos compuestos fenólicos
en sistemas con PPO puede resultar en efectos inhibitorios de la actividad enzimática
(Shannon y Pratt, 1967). La concentración de luteolina, como se mencionó con anterioridad no
se ve afectada por el tratamiento con la resina fuerte PA308, esto significa que si la luteolina
puede ejercer un efecto inhibitorio sobre la PPO, esta concentración relativamente alta en el
extracto PA308, en comparación con el extracto WA30, explicaría en parte la disminución en
actividad de PPO, la cual no se presenta con el extracto WA30. Esto aunado a la remoción de
sustratos como los dos mencionados en el párrafo anterior, y la disminución en la
concentración de fenólicos totales, explica la diferencia en actividad entre el extracto crudo y el
extracto PA308.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
62
Existen compuestos que se encuentran en el punto medio de este comportamiento, ya
que son sustratos de PPO, y a su vez tienen buena capacidad para copigmentar antocianinas,
entre ellos el ácido rosmarínico (pico 15), el cual al disminuir su concentración, disminuye la
actividad de la PPO en el ensayo (r = 0.70), sin embargo, su disminución también afectaría la
capacidad del extracto para copigmentar (r = 0.58). El tratamiento del extracto con la resina
aniónica fuerte no tiene efecto sobre la concentración de este compuesto y por lo tanto no
contribuye ni a la disminución de actividad enzimática, ni al incremento en la capacidad de
copigmentar del extracto PA308.
En general, la capacidad del extracto PA308 para copigmentar mejor que el extracto
crudo y el extracto WA30 y su menor actividad en ensayos modelo con PPO, se deben a una
serie de factores combinados, entre ellos, la remoción de fenólicos totales y de compuestos
específicos que actúan como sustratos, la disminución en la competencia de los copigmentos
por la antocianina así como la presencia de compuestos que no se ven afectados por el
tratamiento con la resina aniónica y que además de servir como buenos copigmentos, podrían
estar ejerciendo efecto inhibitorio sobre la enzima.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
63
2.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La modificación del proceso comercial para la obtención de extractos fenólicos de
tomillo mediante la introducción de una etapa posterior de cromatografía aniónica, condujo a la
obtención de un extracto con mejoras sustanciales en cuanto a su capacidad de
copigmentación y de ser usado como fuente de sustratos de PPO, en comparación con el
extracto de partida.
El significativo incremento en la capacidad de copigmentación del extracto crudo al ser
tratado con la resina aniónica fuerte PA308 se debió principalmente a la selectividad de dicha
resina para remover compuestos específicos, cuya capacidad de copigmentar es menor que la
de aquellos que no se ven afectados por este tratamiento. De esta forma se logran
incrementos de hasta 117 % en los cambios hipercrómicos en relación con un 34 % logrados
con el extracto crudo.
La caracterización de los extractos obtenidos mediante cromatografía de líquidos de
alta resolución con detector de fotodiodos permitió determinar los cambios en la composición
de dichos extractos. Se logró establecer que la remoción de compuestos específicos afectó
positivamente la efectividad del extracto PA308 para copigmentar, pero también tuvo efecto en
su capacidad de ser usado como sustrato de polifenoloxidasa, debido a la disminución en la
concentración de compuestos específicos y la permanencia de compuestos que podrían
ejercer efecto inhibitorio sobre la enzima. Se piensa que los beneficios en la capacidad de
copigmentación son debidos a una disminución en la competencia entre las moléculas del
copigmento por la antocianina. Además, se pudo comprobar que el tratamiento con resinas
aniónicas, no afecta significativamente la concentración de especies con capacidad conocida
para actuar como buenos copigmentos entre ellas la luteolina y el ácido rosmarínico.
Los cambios hipercrómicos mayores se presentaron en la relación molar de 100, sin
embargo existe la posibilidad de que en relaciones molares mayores, los cambios sean aun
mayores. Un obstáculo para la aplicación de estos copigmentos en niveles altos es su intenso
olor, considero que es necesario implementar una estrategia de eliminación (o por lo menos de
disminución) de el aroma. Industrialmente son comunes las operaciones de desodorización,
especialmente en este tipo de materia prima, una etapa previa podría ser someter el tomillo
crudo a una etapa de destilación por arrastre con vapor de agua, que es un método sencillo de
remoción de aceites esenciales, los cuales además tienen valor comercial. Posteriormente
evaluar el impacto de esta operación en el copigmento.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
64
Como áreas de oportunidad futuras, se recomienda evaluar la capacidad de las resinas
aniónicas empleadas para este tipo de aplicaciones y asegurarse de esta forma que no se esta
sobrepasando su capacidad química para llevar a cabo la separación cromatográfica. De esta
forma se pueden establecer condiciones de proceso adecuadas para el escalamiento
comercial de este proceso, al determinar la concentración máxima de fenólicos que la resina
puede soportar antes de saturarse por completo. Esto implicaría quizá la exploración de
nuevas resinas, con grupos funcionales diferentes con una mayor capacidad en meq./g de
resina y probar así su eficiencia y obtener extractos con nuevos perfiles fenólicos.
De la misma forma, el análisis completo del proceso de intercambio iónico implicaría
analizar la fracción de compuestos fenólicos retenidos en la resina, con el fin de diseñar una
mejor estrategia de separación, ó métodos de elución selectiva. Las soluciones de elución
recomendadas por el fabricante quizá sean efectivas para las aplicaciones para las que fueron
diseñadas estas resinas, sin embrago debido a la alta concentración de fenólicos en los
extractos, estos métodos no resultan muy efectivos. Sería recomendable probar otras
soluciones salinas ó soluciones ácidas en varios rangos de pH para seleccionar la mas
adecuada. Todo esto con el objetivo de lograr la regeneración de la resina aniónica para que
pueda ser utilizada en mas de una ocasión, y que el proceso de modificación de extractos
fenólicos con intercambiadores aniónicos sea factible económicamente.
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ANEXO
70
ANEXO 1
Caracterización Espectral y Fisicoquímica de la Copigmentación
El cambio porcentual en absorbancia (cambio hipercrómico) y el cambio batocrómico
entre los niveles de copigmentación se calculó como se indica en las ecuaciones 1 y 2
(Baranac y otros 1996).
∆%Abs. = (Ec. 1)
Cambio batocrómico = (Ec. 2)
Donde:
∆%Abs: Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas ó
cambio hipercrómico
ACλ�max: Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas
copigmentadas.
Cλ�max: Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las
antocianinas copigmentadas.
Aλ�max: Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin
copigmentar.
λmax AC : Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas copigmentadas
λmax A : Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas sin copigmentar
Las antocianinas monoméricas totales (AMT), en el jugo de fresa y en los sistemas
copigmentados se calcularon de acuerdo a la ecuación 3 y 4 (Wrolstad 1976).
A= (Aλ�max – A700)pH 1.0 – (Aλ�max – A700)pH 4.5 (Ec. 3)
AMT = (Ec. 4)
ACλmax - Cλmax
Aλ�max
A x PM x FD x 1000ε x 1
λmax AC - λmax A
ANEXO
71
Donde:
A: Absorbancia total de las antocianinas
Aλ�max: Absorbancia a la longitud de onda máxima
A700: Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5
AMT: Antocianinas monoméricas totales en mg/L
FD: Factor de dilución
PM: Peso molecular de la antocianina de interés
ε : Absortividad molar de la antocianina de interés
Para este estudio se calcularon concentraciones como equivalentes de pelargonidina-3-
glucósido por lo que se emplearon los valores de 433.2 gr/mol y 22400 M-1cm-1 para las variables
PM y ε respectivamente.
La densidad de color, el color polimérico y el % de color polimérico se calcularon de
acuerdo a las ecuaciones 5, 6 y 7 (Wrolstad 1976).
Densidad de color = [(AA420nm – AA700) + (AAλ�max – AA700)] x FD (Ec. 5)
Color polimérico = [(SA420nm – SA700) + (SAλ�max – SA700)] x FD (Ec. 6)
% de color polimérico = (color polimérico/densidad de color) x 100 (Ec. 7)
Donde:
AA420nm: Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con agua
AA700: Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con agua
AAλ�max: Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con agua
SA420nm: Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfito
SA700: Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con bisulfito
SAλ�max: Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con bisulfito
FD: Factor de dilución
ANEXO
72
ANEXO 2
Sistemas de Copigmentación
Los sistemas de copigmentación de jugo de fresa con extractos de tomillo para el
Estudio 2 se prepararon en un volumen total de 10 mL empleando una dilución del copigmento
crudo (5 g en 50 mL) y los copigmentos modificados con resinas aniónicas, de acuerdo a la
siguiente esquema:
Concentración de antocianinas monoméricas totales del jugo de fresa: 0.423 M como
equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.
Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo crudo: 0.0812 M
Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo WA30: 0.0618 M
Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo PA308: 0.0703 M
De acuerdo con las relaciones molares copigmento/pigmento establecidas en este
estudio de 0, 25, 50, 75 y 100 y para un volumen de 5 mL de jugo en 10 mL de dilución total,
las concentraciones de las especies involucradas quedan especificadas en la Tabla 2.12.
Tabla 2.12 Concentraciones molares necesarias de copigmento y pigmento para los 5 nivelesde copigmentación.
Concentraciones
Copigmento (M) Pigmento (M)
0,000000 2,116x10-04
0,005291 2,116x10-04
0,010583 2,116x10-04
0,015874 2,116x10-04
0,021165 2,116x10-04
Considerando las concentraciones de fenólicos totales en los copigmentos, así como el
contenido de antocianinas en el jugo de fresa, se calcularon los volúmenes necesarios para
alcanzar cada nivel de copigmentación con cada uno de los tres extractos, y se detallan en la
Tabla 2.13.
ANEXO
73
Tabla 2.13 Volúmenes de jugo, copigmento y solución reguladora de citratos necesarios paracada nivel de copigmentación con los tres extractos.
Volúmenes en mLExtracto1 Nivel2
Jugo CopigmentoRegulador de
citratos (pH 3.5)
0 5 0,000 5,000
25 5 0,652 4,348
50 5 1,304 3,696
75 5 1,956 3,044
CRUDO(0.0812 M)
100 5 2,608 2,392
0 5 0,000 5,000
25 5 0,856 4,144
50 5 1,713 3,287
75 5 2,569 2,431
WA30(0.0618 M)
100 5 3,426 1,574
0 5 0,000 5,000
25 5 0,753 4,247
50 5 1,505 3,495
75 5 2,258 2,742
PA308(0.0703 M)
100 5 3,010 1,9901CRUDO= sin tratamiento con resina aniónica, WA30= extracto tratado con resina aniónica débil, PA308= extracto
tratado con resina aniónica fuerte; concentración de fenólicos totales expresada como equivalentes de ácido gálico.2Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar de antocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.
La copigmentación con sales de aluminio se llevó a cabo empleando una solución de
alumbre grado alimenticio con una concentración de iones aluminio de 10000 ppm. Se
formularon sistemas con 3 mL de jugo de fresa y 6 niveles de concentración de iones aluminio
en un volumen total de 10 mL completados con solución reguladora de citratos. Los volúmenes
de cada especie se detallan en la Tabla 2.14.
Tabla 2.14 Volúmenes de jugo, solución de aluminio y solución reguladora de citratosnecesarios para cada nivel de copigmentación.
Volúmenes en mL
Nivel1 JugoCopigmento
CrudoRegulador de
citratos (pH 3.5)
0 3 0.0 7.050 3 0,301 6,699
100 3 0,602 6,398200 3 1,204 5,796400 3 2,409 4,591600 3 3,613 3,387
1Expresado en partes por millón de iones aluminio en el sistema.
ANEXO
74
ANEXO 3
1Calculado por diferencia con el valor de λmax del jugo de fresa de nivel 0 que fue 498 nm. 2Valores con letras diferentesentre grupos de columnas indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Definidos como la relaciónmolar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre la concentración molar deantocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.
Figura 2.8 Efecto batocrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre laspropiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)
Efecto Batocrómico de la Copigmentación de jugo de fresa con extractos de Tomillo
a
a bb
a
a
abb
a
a
a
a
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
25 50 75 100
Niveles de Copigmentación
Cam
bio
en
λ m
ax. (
nm
)
Crudo
WA30
PA308
1
2
3
1
ANEXO
75
1Calculado como el incremento porcentual en la absorbancia máxima del jugo de fresa copigmentado con respecto aljugo de fresa (en su valor de λmax), carente de extractos de tomillo. 2Valores con letras diferentes entre grupos decolumnas indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Definidos como la relación molar de laconcentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre la concentración molar de antocianinasen el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.
Figura 2.9 Efecto hipercrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre laspropiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)
bc
bab
b
b
b
b
a
a
a
a
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
25 50 75 100
Niveles de Copigmentación
% d
e in
crem
ento
en
ab
sorb
anci
a m
áxim
a
Crudo
WA30
PA308
1
2
3
ANEXO
76
ANEXO 4
Colorimetría Instrumental
La escala CIELAB toma su nombre del espacio de color que usa para describir la
localización tridimensional precisa de un color, dentro de un espacio de color visible. CIE son
las siglas de Commission Internationale de l’Eclairages un organismo internacional de
científicos del color que establecen estándares para comunicar información relativa al color de
manera precisa. El parámetro L describe la luminosidad relativa; a representa un punto entre la
escala de rojo a verde; y b representa un punto entre la escala de amarillo a azul.
Los colores se pueden describir y localizarse en el espacio de color usando un método
alternativo especificando sus coordenadas L* C* y h* en el cual L toma los mismos valores que
en el espacio LAB, mientras que C* y h* se calculan de acuerdo a los valores de a y b por
medio de las ecuaciones 8 y 9.
C* = √(a2 + b2) Ec. (8)
h* = arctan(b/a) Ec. (9)
L* representa la coordenada en luminosidad, al igual que en la escala Lab; C*
representa el croma ó saturación de color, la distancia perpendicular del eje L; y h* ó ángulo de
color (hue) expresado como ángulo en el plano formado por los ejes a y b (Figura 2.10). En la
Figura 2.10 Espacio de color CIELAB. (Gonnet, 1998)
ANEXO
77
Figura 2.11 se muestra un ejemplo de la distribución de tonalidades de acuerdo a su valor de
ángulo de color para un determinado valor de luminosidad.
Figura 2.11 Disco de tonalidades de acuerdo a su valor de ángulo de color (hue).
ANEXO
78
ANEXO 5
1Picos asignados de acuerdo a su aparición en el cromatograma (Figura 2.6). 2Expresado enpartes por millón. 3Los valores con letras diferentes entre columnas para un mismo compuesto,indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05).
Figura 2.12 Modificación en la concentración de cuatro compuestos por efecto del tratamientocon resinas aniónicas.
0
100
200
300
400
500
600
HESPERETINA LUTEOLINA AC. ROSMARINICO GLICÓSIDO DE 17
CRUDO
WA30
PA308
1
a
b ab
ab ab
a
a
a
b
b
ab
2
3