intensyvaus ūkininkavimo įtaka antibiotikams atsparių...
TRANSCRIPT
Intensyvaus ūkininkavimo įtaka antibiotikams atsparių bakterijų atsiradimui ir plitimui aplinkoje
Modestas Ružauskas
Vilnius, 2018-11-14
Problema
• Netvaraus agroekosistemų naudojimo tendencijos ir žemdirbystės praktika;
• Sparčiai plečiasi monokultūrų pasėliai;
• Mažai tyrinėtas agroekosistemų naudojimo intensyvinimo poveikis jų tvarumui ir biologinei įvairovei
• Mikroorganizmai – menkiausiai ištirti Lietuvos ekosistemų komponentai;
• Atsparumas chemikalams, antibiotikams, pereinantis į klinikinę plotmę
UŽDAVINIAI• 1. Nustatyti mikroorganizmų rūšinę įvairovę dirvožemyje ir
vandenyje intensyvaus ir neintensyvaus ūkininkavimo zonose.• 2. Nustatyti dirvožemio ir vandenų taršą antibiotikams ir biocidams
atspariomis, tame tarpe ir patogeninėmis, bakterijomis.• 3. Nustatyti genus, koduojančius mikrobiotos, persistuojančios
intensyvaus ūkininkavimo aplinkoje atsparumą biocidams(ketvirtiniams amonio junginiams), ir įvairių klasių antibiotikams, nustatyti genų raiškos lygį.
• 4. Ištirti galimus atsparių bakterijų platinimo aplinkoje vektorius (žuvis, paukščius).
• 5. Nustatyti, ar intensyvus ūkininkavimas kelia potencialią riziką plisti atsparioms antibiotikams ir biocidams bakterijoms aplinkoje ir patekti į visuomenę (per maistą, vandenį).
Darbo metu
• Išskirtos bakterijos ir bakterijų DNR iš intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemių, laukinių gyvūnų (žuvų, paukščių);
• Atlikti metagenominiai tyrimai nustatant mikrobiotos įvairovę;
• Įvertinti mikrobiotos įvairovės skirtumai tos pačios kultūros ekologinio ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemiuose;
• Nustatytas fenotipinis ir genotipinis bakterijų atsparumas
• Įvertina situacija, potenciali rizika
ŽUVŲ TYRIMAI
DIRVOŽEMIO TYRIMAI
PAUKŠČIŲ TYRIMAI
Metodai
DNA Clean & Concentrator
Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Kits
Extract high quality, inhibitor-free
metagenomic DNA from feces, soil,
water, etc.
Naujos kartos sekoskaita
Illumina MiSeq platform
> 2x daugiau nei klinikiniai lūžio taškai
QUICK SHOT
Mega 6
Naudoti pradmenys skirti klinikoje paplitusius atsparumą antibiotikams suteikiančius genus ir integronų sekas (tem, ctx-M, oxa1, oxa2, oxa23, shv, blaIND-1, blaL1, blaL2catI, tetA, tetB, tetC, tetD, tetM, aac(6’)-Ib, qnrA, qnrB, qnrS, qnrD, qepA1, ant(3”)-Ia, aph(3”)-I, aph(6)-I, aac(3)IIa, ermA, ermB, ermC, mefAB, vanA, vanB, vanC1, vanC2/3, vanD, vanE, vanG, intI1);
2. Tarp dirvos mikrorganizmų paplitusiusius atsparumą antibiotikams suteikiančius genus (blaLRA-10, blaLRA-13, bla , aac3, arr1, arr2, bla2, tetW, folA, bcr/cflA (pradmenys sukurti projekto metu).
Atsparumą koduojančių genų nustatymas
REZULTATAI
Bakterijų genčių įvairovė
0
200
400
600
800
1000
1200
Intensyvus ūkis Ekologinis ūkis
609 taksonominiai vienetai genčių lygmenyje išskirti iš ekologinio ir 1103 iš intensyvaus
Vyraujančios bakterijų gentys intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemiuose
3,63,3
1,9 1,8 1,7 1,7 1,71,4
1,2 1,20,9
1,1 1,1 1
4
2,6
1,51,7
1,9
1,5 1,6 1,7
0,91,2
1,6 1,5 1,5 1,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Labiausiai paplitusios bakterijų gentys intensyvaus ir ekologinio ūkininkavimo dirvožemyje
Intense Ecological
Antibiotikams atsparių bakterijų kiekis dirvožemiuose 1 g >x106
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Intensyvus ūkis Ekologinis ūkis
Atsparių antibiotikams bakterijų dažniausiai aptinkamų dirvožemiuose, rūšinė sudėtis
85
100
73,1
81,8
94,1
95,2
80
96,1
73,1
77,3
94,1
95,2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Ž. kv. ekolog.
Ž. kv. intens.
Rapsai ekolog.
Rapsai intens.
Kukurūz. ekolog.
Kukurūz. intens.
FUR FAZ
FUR – cefuroksimas, FAZ – cefazolinas
Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas I-II kartos
cefalosporinams, proc. (n=132)
5
15,4 13,6 11,8
4,8
80
100
86,9
94,1100
3,8
15,4 13,6 11,814,3
0
20
40
60
80
100
120
Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.
TAZ AXO FEP
TAZ – ceftazidimas, AXO – ceftriaksonas, FEP – cefepimas
pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas III–IV kartos
cefalosporinams, proc. (n=132)
5
15,4
4,5
11,8
4,8
19,2
4,5
17,7
9,510
30,8
3,84,5
23,5
9,5
0
5
10
15
20
25
30
35
Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.
AMI GEN TOB
AMI – amikacinas, GEN – gentamicinas, TOB – tobramicinas
pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų atsparumas
aminoglikozidams, proc. (n=132)
10
3,8
94,8
9,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ž. kv. ekolog. Ž. kv. intens. Rapsai ekolog. Rapsai intens. Kukurūz. ekolog. Kukurūz. intens.
CIP GAT
GAT – gatifloksacinas, CIP – ciprofloksacinas
pav. Iš ekologinių ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemių išskirtų bakterijų
atsparumas chinolonams, proc. (n=132)
Genų, būdingų klinikiniams izoliatams paplitimas dirvožemio mikrobiotoje
Unikalių, tik dirvožemiams būdingų atsparumą koduojančių genų paplitimas dirvožemiuose
Judriųjų genomo elementų paieška
Išvada
Tiek ekologinio, tiek ir intensyvaus ūkininkavimo dirvožemiuose gausiai paplitusiosantibiotikams atsparios bakterijos (>106/g), tačiau šios bakterijos didžiąja dalimineturi atsparumą koduojančių genų, kurie paplitę klinikinėse padermėse,žmonėse bei gyvūnuose, sukeliančiuose bakterijų atsparumo antibiotikamsproblemą gydant žmones ir gyvūnus.
Todėl dirbamos žemės dirvožemis šiuo metu nekelia padidintos rizikos žmonėms užsikrėsti, o aplinkai būti kontaminuotai atspariomis antibiotikams bakterijomis, galinčiomis sukelti problemas susijusias su atsparioms antibiotikams bakterijomis klinikinėje plotmėje t.y. patekti į žmones, vėliau gydymo įstaigas, sukelti visuomenėje įgytas infekcijas, sukeltas antibiotikais neišgydomų bakterijų.
Tuo pačiu pažymėtina, kad dirvožemio bakterijose yra unikalių šiomsbakterijoms būdingų atsparumą antibiotikams koduojančių genų, galinčių turėtiklinikinės reikšmės. Tokios bakterijos esant dirvožemyje antibiotikų ar panašioscheminės struktūros medžiagų “spaudimui" galėtų išgyventi ir daugintis,mažėjant jautrių mikroorganizmų skaičiui. Tai sukeltų mikrobiotos disbalansą irrūšinius pokyčius, o tuo pačiu padidintų ir riziką tokių bakterijų patekimui įmaisto žaliavas su augaliniais produktais.
ŽUVYS
PROBLEMA
Išskirti identifikuoti ir apibūdinti daugiaatspariasgramneigiamas bakterijas aptinkamaspramoninio auginimo ir laukinėse žuvyse
Tikslas:
METODAI
Mėginių skaičius = 240
Photo: Grant Bobo
gentamicin (8 mg/L), ciprofloxacin (1 mg/L), chloramphenicol(16 mg/L), and colistin (4 mg/L); Colorex mSuperCarba, ColorexESBL and Colorex C3GR
1-3 atskiros kolonijos
Biocheminis tyrimasMSK
DNA
Koduojančių atsparumą genų nustatymas
REZULTATAI 155 izoliatai išskirti atsparūs bent vienam antibiotikui
Biocheminiais testais pavyko identifikuoti tik 15 izoliatų, likusieji nustatyti pagal DNR sekoskaitosbūdu.
Akvakultūros žuvys
Dominavo Pseudomonas genties bakterijos. Dažniausios rūšys – P. putida, P. syringae, P. fragi, P. azotoformans, P. migulae. Daugiaatspariųizoliatų buvo 44,4%.
Tarp Enterobacteriaceae dominavo Citrobacter, Hafnia, Kluyvera, ir Proteus, bet išskirta ir Rahnella, Moellerella bei Escherichia.Daugiaatsparių izoliatų kiekis 16%.
Aeromonas labai retais atvejais buvo atsparios antibiotikams. Tik 2 izoliatai buvo atsparūs aztreonamui, cefoksitinui, o vienas – ko-trimoksazoliui ir karbepenemams.
REZULTATAIAkvakultūros žuvys
Iš laukinių žuvų išskirtų izoliatų atsparumas
REZULTATAILAUKINĖS ŽUVYS
1. Retas atsparumas fluorochinolonams ir taksonominė atsparių bakterijų sudėtis leidžia manyti, kad didžioji dalis atsparių bakterijų paplitusių žuvininkystės tvenkinių žuvyse yra autochtoninė t.y. natūrali vandens telkinių mikrobiota. Tvenkiniai/žuvys neužteršti fermų mikroorganizmais, kurie paprastai kur kas dažniau yra atsparūs fluorochinolonams.
2. Pseudomonas ir Chryseobacterium genčių atsparumo mechanizmai susiję su išmetimo siurbliais, kitų genų, svarbių klinikinėje plotmėje aptikta mažai.
3. Daugiaatsparūs bakterijų izoliatai aptikti tik upėse gyvenančiose žuvyse. Jose pasitaiko izoliatų greičiausiai patekusių iš nutekamųjų vandenų ar kitų objektų, kur yra paplitę atsparios kliniškai svarbios padermės.
Rekomendacija: laukinių žuvų jautrumo antibiotikams tyrimai galėtų būti atliekami monitoringo pagrindais.
IŠVADOS
LAUKINIAI PAUKŠČIAI
UŽDAVINIAI
1. Išskirti laukiniuose paukščiuose paplitusias indikatorines-zoonotines bakterijas (Escherichia coli ir Staphylococcus spp.)ir nustatyti šių bakterijų jautrumą antibiotikams.
2. Nustatyti genus koduojančius atsparumą ir jas palyginti juossu bakterijų, paplitusių žmonėse ir naminiuose gyvūnuose,žinomais genais.
3. Įvertinti paukščių, kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijųplatintojų vaidmenį.
Stafilokokų genties bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose
415
237
196
57
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Laukinių paukščių mėginių
skaičius
Išskirtų stafilokokų iš
laukinių paukščių padermių
skaičius
Stafilokokų padermių
skaičius, kurios buvo
atsparios bent vienam ar
daugiau tirtų antibiotikų
Daugiaatsparios stafilokokų
padermės
vn
t.
Stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukiniuose paukščiuose
39,3
37,8
27,6
31,1
36,7
33,2
53,1
3
1,5
60,7
59,2
72,4
68,9
63,3
65,3
46,9
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
C (30)
E (15)
CIP (5)
FOX (30)
CN (10)
TET (30)
P (10)
An
tim
ikro
bin
ė m
edži
ag
a
Atsparios Vidutiniškai jautrios Jautrios
(n=196)
P – penicilinas, TET – tetraciklinas, CN – gentamicinas, FOX –cefoksitinas, CIP – ciprofloksacinas, E – eritromicinas, C – chloramfenikolis
42,3
28,6
3,1
14,8
8,7
02,6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1 2 3 4 5 6 7
%
Atsparumas antibiotikų skaičiui (vnt.)
Iš laukinių paukščių išskirtų Staphylococcus spp. atsparumas skirtingam antibiotikų skaičiui (%), (n=196)
1,85,2
3,68,7
8,7
1,8
5,2
10,5
3,6
5,2
7,7
5,2
5,2 1,8 1,8
1,8
3,6
1,8
1,8
1,8
1,8
5,2
3,6
1,8 Pilkoji varna
(Corvus cornix)
Kovas (Corvus
frugilegs)
Didžoji antis
(Anas
platyrhynchos)
Gulbė nebylė
(Cygnus olor)
Rudagalvis kiras
(Larus
ridibundus)
Sidabrinis kiras
(Larus
argentatus)
Iš laukinių paukščių išskirtų daugiaatsparių Staphylococcus spp. rūšinis
pasiskirstymas skirtingose paukščių rūšyse, proc.
Atsparumą lemiančių genetinių determinančių paplitimas tarp Staphylococcus spp. laukiniuose paukščiuose
Antibiotikų klasė Baltymų grupės Genai Pradmuo
Genetinės determinantės
daugiaatspariose padermėse
Tirta Rasta Proc.
β laktamai β -laktamazės blaZblaZ-F
47 18 38,3blaZ-R
Penicilinazėms atsparūs β-
laktamai
Penicilinus surišantys
baltymai
mecAmecA-1
47 10 21,3mecA-2
mecLGA251
(mecC)
mecLGA251
F47 0 0
mecLGA251
R
AminoglikozidaiAminoglikozidų
fosfotransferazės
aph(3’)-IIIa
aph(3’)-IIIa -
F54a 16b 29,6
aph(3’)-IIIa -
R
aac(6’)-Ie-aac6-F
54a 21b 38,9aac6-R
Makrolidai
Makrolidų
metiltransferazės
ermAermA-F
18 5 27,8ermA-R
ermCermC-F
18 0 0ermC-R
Makrolidų nešikliai msrABmsrAB-F
18 0 0msrAB-R
Tetraciklinai
Tetraciklinų nešikliai tetKtetK-F
21 13 61,9tetK-R
Apsauginis ribosomų
baltymastetM
tetM-F21a 5b 23,8
tetM-R
E. coli bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose
415
188 179
60
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Laukinių paukščių mėginių
skaičius
Iš laukinių paukščių mėginių
išskirtų ešerichijų skaičius
Ešerichijų padermių skaičius,
kurios buvo atsparios bent
vienam ar daugiau tirtų
antibiotikų
Daugiaatsparių ešerichijų
padermių skaičius
vnt.
E. coli bakterijų paplitimas laukiniuose paukščiuose (vnt.)
E.coli izoliatų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukiniuose paukščiuose
77,7
21,8
30,7
21,8
32,9
38,5
7,8
1,7
2,8
1,1
22,3
76,5
66,5
78,2
67,1
61,5
91,1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
AMP (10)
CN (10)
CIP (5)
FOX (30)
TE (30)
C (30)
IMP (10)
An
tim
ikro
bin
ė m
edži
aga
Atsaparios Vidutiniškai jautrios Jautrios
. (n=179) ;
AMP-ampicilinas, CN-gentamicinas, CIP-ciprofloksacinas, FOX- cefoksitinas, TET-
tetraciklinas, C-chloramfenikolis, IMI-imipenemas
35,75
30,72
17,31
11,17
3,3
0,5 1,1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1 2 3 4 5 6 7
%
Atsparumas antibiotikų skaičiui (vnt.)
Iš laukinių paukščių išskirtų Esherichia coli atsparumas tam tikram antibiotikų
skaičiui (proc.), (n=179).
Atsparumą lemiančių genetinių determinančių paplitimas tarp E. coli laukiniuose paukščiuose
Antibiotikų klasė Baltymų grupės Genai Pradmuo Genetinės determinantės
Tirta Rasta Proc.
β-laktamai β-laktamazės
tem blaTEM-F
57a 38b 67blaTEM-R
shv blaSHV-F
59 29 49,1blaSHV-R
oxa 1 grupė oxa1-F 56a 6b 10,7
oxa1-R
oxa 3 grupė oxa3-F 56a 10b 17,8
oxa3-R
oxa 5 grupė oxa5-F 56 0 0
oxa5-R
ctx M ctxM-F 49 31 63,2
ctxM-R
cmy cmy2-F 49a 1b 2
cmy2-R
per per1-F 49 0 0
per1-R
per2-F 49 0 0
per2-R
Tetraciklinai Tetraciklinų nešikliai
tetA tetA-F 33 28 85
tetA-R
tetB tetB-F 33a 6b 18
Aminoglikozidai
Aminoglikozidų
adenilyltransferazės
aadB aadB-F 10 0 0
aadB-R
aadA aadA-F 10a 1b 10
aadA-R
Aminoglikozidų
metiltransferazės
rmtB rmtB-F 10 0 0
rmtB-R
armA armA-F 10 0 0
armA-R
Aminoglikozidų
fosfotransferazės
aphA1 aphA1-F 10 10 100
aphA1-R
Aminoglikozidų
acetiltransferazės
aacA4 aacA4-F 10a 1b 10
aacA4-R
aac(3)II aac(3)II-F 10 5 50
aac(3)II-R
Streptomicinas
Streptomicino
fosfotransferazės
strA strA-F 55 20 36,3
strA-R
strB strB-F 55 21 38,1
Sulfonamidai Dihidropteorato
sinatazės
sul1-F sul1-F 49a 11b 22,4
sul1-R
sul2-F sul2-F 49 25 51
sul2-R
sul3-F sul3-F 49 23 46,9
sul3-R
Trimetoprimas Dihidrofoliato reduktazės
dfr1 dfr1-F 13a 2b 15,3
dfr1-R
dfr5 dfr5-F 13a 11b 84,6
dfr5-R
dfr7 dfr7-F 13a 2b 15,3
dfr7-R
Tiriamose ešerichijų padermėse nustatyta dvidešimt vienas skirtingas genas,
koduojantis atsparumą skirtingų klasių antibiotikams.
E. coli atsparumas kolistinui ir mcr-1 geno nustatymas, laukiniuose paukščiuose
• Nustatytos 8 E. coli (6,8 proc.) atsparios kolistinui
• Vienoje padermėje nustatytas mcr-1 genas.
IŠVADOS
1. Tiriant 29 laukinių paukščių rūšis, atsparūs stafilokokaibuvo išskirti iš 6 rūšių: sidabrinių kirų (Larus argentatus),rudagalvių kirų (Larus ridibundus), gulbių nebylių (Cygnusolar), didžiųjų ančių (Anas platyrhynchos), kovų (Corgusfrugilegus) ir pilkųjų varnų (Corvux cornix).
2. Visi iš laukinių paukščių išskirti stafilokokai buvo jautrūssulfametoksazolio/trimetoprimo kombinacijai,vankomicinui, daptomicinui bei linezolidui.
IŠVADOS
Įvertinus paukščių, kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijų vektoriaus vaidmenį nustatyta, kad laukiniuose paukščiuose cirkuliuoja meticilinui atsparios Staphylococcus aureus (MRSA), praplėsto veikimo spektro betalaktamazes (ESBL) gaminančios E. coli, atsparios kolistinui enterobakterijos, bei fluorochinolonams ir aminoglikozidams atspari mikrobiota. Todėl galima teigti, kad laukiniai paukščiai platina bakterijas, atsparias antimibiotikams, kurie pagal PSO ir OIE yra priskirti kritiškai svarbioms antimikrobinių medžiagų klasėms, naudojamoms žmonių ir gyvūnų gydymui.
PASKELBTOS PUBLIKACIJOS
• Ružauskas, Modestas; Klimienė, Irena; Armalytė, Julija; Bartkienė, Elena; Šiugždinienė, Rita; Skerniškytė, Jūratė; Krasauskas, Renatas; Sužiedėlienė, Edita. Composition and antimicrobial resistance profile of Gram- negative microbiota prevalent in aquacultured fish. Journalof food safety. Malden, MA: Wiley. (Original article). ISSN 0149-6085. 2018, vol. 38, no. 3, p. 1-10. https://doi.org/10.1111/jfs.12447. [Science Citation Index Expanded (Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 1.275 (2017).
• Merkevičienė, Lina; Klimienė, Irena; Šiugždinienė, Rita; Virgailis, Marius; Mockeliūnas, Raimundas; Ružauskas, Modestas. Prevalence andmolecular characteristics of multi-resistant Escherichia coli in wild birds. Acta veterinaria Brno. Brno: University School Of VeterinaryMedicine. ISSN 0001-7213. 2018, vol. 87, no. 1, p. 9-17. Prieiga per internetą: https://actavet.vfu.cz/media/pdf/actavet_2018087010009.pdf. [Science Citation Index Expanded (Web of Science); DOAJ]. [Citav. rod.: 0.422 (2017)].
• Merkevičienė, Lina; Ružauskaitė, Neda; Klimienė, Irena; Šiugždinienė, Rita; Dailidavičienė, Jurgita; Virgailis, Marius; Mockeliūnas, Raimundas; Ružauskas, Modestas. Microbiome and antimicrobial resistance genes in microbiota of cloacal samples from European herringgulls (Larus argentatus). Journal of Veterinary Research. Puławy: National Veterinary Research Institute. ISSN 2450-7393. 2017, vol. 61, no. 1, p. 27-35. Prieiga per internetą: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5894407/ [Science Citation Index Expanded (Web ofScience); MEDLINE; AGRICOLA; CABI - Index Veterinarius; DOAJ]. [Citav. rod.: 0.811]
• Ružauskas, Modestas; Misytė, Skaistė; Merkevičienė, Lina; Miknienė, Zoja; Šiugždinienė, Rita; Klimienė, Irena; Pikūnienė, Alma; Kučinskienė, Jūratė. Gut microbiota isolated from the European pond turtle (Emys orbicularis) and its antimicrobial resistance. Polishjournal of veterinary sciences. Warsaw: De Gruyter Open. (Original article). ISSN 1505-1773. 2016, vol. 19, no. 4, p. 723-730. Prieiga per internetą: https://content.sciendo.com/view/journals/pjvs/19/4/article-p723.xml [Science Citation Index Expanded (Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 0.697]
• Ružauskas, Modestas; Vaškevičiūtė, Lina. Detection of the mcr-1 gene in Escherichia coli prevalent in the migratory bird species Larusargentatus. Journal of antimicrobial chemotherapy. London: Oxford University Press. ISSN 0305-7453. 2016, vol. 71, no. 8, p. 2333-2334. Prieiga per internetą: http://jac.oxfordjournals.org/content/early/2016/06/20/jac.dkw245.full.pdf+html. [Science Citation Index Expanded( Web of Science); MEDLINE]. [Citav. rod.: 5.071] 58
Rėmėjas Partneris kartu vykdantis projektą
SIT-6/2015Vykdytojai:M. VirgailisL. MerkevičienėJ. ArmalytėJ. SkerniškytėI. Klimienė
R. KrasauskasR. ŠiugždinienėM. RužauskasKonsultantė: E. Sužiedėlienė