interaÇÃo antÍgeno-anticorpo dayse locateli 2005
TRANSCRIPT
INTERAÇÃO
ANTÍGENO-ANTICORPO
Dayse Locateli2005
Ligações não covalentes:
•Pontes de Hidrogênio
• Ligações iônicas
• Interações hidrofóbicas
• Interações de Van der Waals
Interação reversível
Complementariedade
Especificidade
AfinidadeForça de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo).
AvidezForça de interações total entre Ac e Ag.
Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos
Reação cruzadaDois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico
Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares.
Pesquisa
Diagnóstico
Soroepidemiológia
Métodos:
Precipitação
Aglutinação
Imunoensaios
Aplicações
Metodologias que utilizam:
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blot
Reagentes não marcados
Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac
Interação: ac - ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver um precipitado visível.
Anticorpos bivalentes
+
Antígenos multivalentes
Reação de Precipitação
PRECIPITADO
1- Reação de precipitação em soluções
Reação quantitativa:•Qtidade cte Ac•Qtidade cresc. Ag
Qtidade precipitina
2 - Reação de Precipitação em gel
Utiliza uma matriz de ágar
Ag + Ac = linha de precipitação visível
a) Imunodifusão radial
(Método de Mancini)
• Ag ou Ac fixos
• Dosagem de proteínas séricas
b) Imunodifusão dupla
• Identidade de Ags = Ac de reatividade conhecida
Reações de Aglutinação
Ac + Ag particulado aglutininas
Agregação visível de partículas
• Efeito pró-zona
EritrócitosBactériasFungoslátex
Aglutinação Direta
Tipagem ABO
Testes confirmatórios para sífilis
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
• Detecção Acs específicos• Quantificação
Aglutinação bacterianaPresença de infecçãoDiferenciação de espécies
Aglutinação passiva
Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)
+
Inibição da Aglutinação
Reagentes Marcados
Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
substrato (incolor)
Qualitativos Quantitativos
Direto = Ag Indireto = Ac
Ac marcados com Enzimas + + = CORAg
Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase
ELISA Indireto
ELISA Direto ou Sanduíche
ELISA Competitivo
Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa
Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
Imunofluorescência
luz
Ac + fluorocromo Ac + Fluorocromo
rght
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Reagentes secundários:
Anticorpo secundário marcado com fluorocromoproteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA
Aplicações:
• Identificar subpopulações de linfócitos• Identificar espécies bacterianas• localização de hormônios• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA• Teste qualitativo
Fc
Citometria de Fluxo
Separação de células ativadas por fluorescência Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente Teste qualitativo e quantitativo
CD 4
CD 18
CD 125
CD 147
Tamanho Granulosidade Fluorescência
CD4
CD8
CD20
Aplicações:
Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas
isolar populações celulares
distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag
o tamanho celular.
Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes
HIV , Leucemias
Western Blotting
• Eletroforese de proteínas• Diferença de tamanho (PM)• Mobilidade da proteína• Detecção Ag ou Ac
Western Blotting
Gelmembrana de transferênciapapel filtropreenchimentotela de suportetela de suporte
Gel/ membrana/ filtro
Tampão
( +)( - )
Separação e detecção de proteínas
• Identificação de Ac específico
Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima
Radioimunoensaio RIA
• Hormônio• proteínas séricas• drogas• vitaminas• Ac
0,0001 microgramas/ mL
Moléculas marcadas com ISÓTOPO
Marcações:
– I125: emite raios gama
– H3: raios beta
Aplicações:
Testes que necessitem de alta sensibilidade
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue
Pesquisa
Desvantagem: Não é um teste seguro!