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8/12/2019 INTERACCIN PLANTA-HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES.pdf

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Camarena-Gutirrez, GabrielINTERACCIN PLANTA-HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES

Revista Chapingo. Serie Ciencias Forestales y del Ambiente, vol. 18, nm. 3, septiembre-diciembre, 2012, pp.

409-422

Universidad Autnoma Chapingo

Chapingo, Mxico

Cmo citar? Nmero completo Ms informacin del artculo Pgina de la revista

Revista Chapingo. Serie Ciencias Forestales y

del Ambiente,

ISSN (Versin impresa): 2007-3828

[email protected]

Universidad Autnoma Chapingo

Mxico

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Revista Chapingo Serie Ciencias Forestales y del Ambiente

INTERACCIN PLANTA-HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARESPLANT-ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI INTERACTIONS

Gabriel Camarena-Gutirrez

Unidad de Morfologa y Funcin, FES Iztacala, UNAM. Av. de los Ejidos Nm. 1, Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de Mxico, MXICO.C. P. 547090.Correo-e: [email protected]

RESUMEN

La simbiosis de la micorriza arbuscular est formada por las races de ms del 80 % de las especiesde plantas terrestres y los hongos Zigomicetes del Orden Glomales. Los efectos benficos de estasimbiosis suceden como resultado de un dilogo molecular complejo entre los socios simbiticos. Laidentificacin de las molculas involucradas en este proceso es un prerrequisito para una mayor com-prensin de la simbiosis. Hay evidencia de los eventos de sealizacin-reconocimiento en diferentesestados de las interacciones planta-hongo en la micorriza arbuscular, pero no se conoce la naturalezade las molculas seal y los procesos de percepcin-transduccin. Para conocer el potencial de lamicorriza arbuscular en la agricultura sustentable, es preciso identificar las molculas principales dela interaccin planta-hongo. Existen numerosos mtodos disponibles para el anlisis molecular delos hongos arbusculares que ayudan a comprender la interaccin dinmica entre las plantas y stos.

ABSTRACT

Arbuscular mycorrhizal symbiosis is formed between the roots of over 80 % of all terrestrial plantspecies and Zygomycete fungi of the order Glomales. The beneficial effects of this symbiosis occuras a result of a complex molecular dialogue between the two symbiotic partners. Identifying the mole-cules involved in this dialogue is a prerequisite for a better understanding of thesymbiosis. Althoughthere is evidence for an interplay of signaling-recognition events at different stages during plant-fungalinteractions in arbuscular mycorrhiza, the nature of signaling molecules and signal perception/trans-duction processes are still not known. To unlock the potential of arbuscular mycorrhiza for sustainableagriculture, we must identify the key molecular players. A number of methods are availablefor thoseresearchers considering the addition of molecular analyses of arbuscular fungi to their research pro-

jects and weighing the various approaches they might take. Increasingly powerful molecular methodsfor analyzing arbuscular communities make this area of research available to a much wider range ofresearchers.

PALABRAS CLAVE:Micorriza, estrigolactonas,

aparato de pre-penetracin

KEYWORDS: Mycorrhiza,strigolactones, pre-penetra-

tion apparatus

INTRODUCCIN

Las plantas han desarrollado numerosas estrategiasdesde que colonizaron los ecosistemas terrestres, para ha-cer frente a los diversos retos biticos y abiticos. Una delas ms eficaces es la capacidad de los sistemas de races,para establecer relaciones simbiticas mutualistas benfi-

cas con los microorganismos. La micorriza, una forma in-trincada de asociacin de las races con algunos gruposde hongos, es la ms frecuente y representa a los rganosde absorcin de la mayora de las plantas en la naturaleza(Gianinazzi-Pearson, 1984). Esta asociacin cumple unafuncin muy importante en la explotacin eficaz de los re-cursos minerales del suelo y en la proteccin de las racescontra una serie de patgenos. Por ello, las micorrizas sonfundamentales para la supervivencia de muchos taxonesde plantas en diversos ecosistemas, incluyendo muchasespecies de cultivo (Bethlenfalvay & Linderman, 1992).

Recibido: 13 de diciembre de 2011Aceptado: 19 de abril de 2012

doi:10.5154/r.rchscfa.2011.11.093http:// www.chapingo.mx/revistas

INTRODUCTION

Ever since they first colonized terrestrial ecosystems,plants have developed numerous strategies to addressvarious biotic and abiotic challenges. One of the most ef-fective is the ability of root systems to establish mutualisticsymbiotic relationshipswith microorganisms. The mycorrhi-

za, an intricate form of association between the roots andsome fungal groups, is the most common and representsthe absorptionorgans of most plants in nature (Gianinazzi-Pearson, 1984).This association plays a very importantrolein the effective exploitation of mineral resources in the soiland in the protection of roots against a number of patho-gens. Mycorrhizae are therefore essential for the survivalof many plant taxa in diverse ecosystems, including manycrop species (Bethlenfalvay & Linderman, 1992).

The term mycorrhiza describes the symbiotic as-sociation between plant roots and the hyphae of soil-


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Interaccin planta-hongos... Camarena-Gutirrez

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El trmino micorriza describe la asociacin simbi-tica de las races de plantas con hifas de hongos espe-cializados del suelo, y se considera el rgano principalinvolucrado en la captacin de nutrientes por la mayorade las plantas terrestres. Se pueden distinguir siete tiposde asociaciones en funcin de su morfologa y de los

taxones de plantas asociados con hongos: 1) Ectendo-micorrizas. Son asociaciones formadas entre un nme-ro limitado de ascomicetos y los gneros de conferasPinusy Larix; tienen un manto y una estructura complejaaltamente ramificada llamada red de Hartig. Despus dela formacin de esta red, se desarrolla la hifa intracelularen clulas de la epidermis y en la corteza (Yu, Egger, &Peterson, 2001); 2) Ericoide.Representa un tipo nicode micorrizas confinadas a varias familias del orden Eri-cales. Las plantas que desarrollan este tipo de micorrizaforman races laterales muy finas que carecen de cre-cimiento secundario. Cada raz consiste de un cilindrovascular delgado, una o dos capas de clulas cortica-

les y una capa de epidermis. La asociacin incluye lacolonizacin de las clulas de la epidermis por la hifa,seguida de la formacin de un complejo de hifas ramifi-cadas (Cairney & Ashford, 2002); 3) Arbutoide. Dos g-neros de la familia Ericaceae (ArbutusyArctostaphylos)y varios gneros en Pyrolaceae forman micorrizas ar-butoides tpicas. Estas micorrizas tienen un manto, unared de Hartig y forman complejos hifales intracelularesconfinados a la epidermis (Molina & Trappe, 1982); 4)Monotropoide. Las especies de plantas que tienen estamicorriza son no fotosintticas. La evidencia sugiere quelos hongos que forman este tipo de micorriza se asociantambin a rboles vecinos fotosintticamente activos, yque han desarrollado un mecanismo para obtener susfotosintatos. Bjrkman (1960) demostr que se puedenmover fotosintatos desde rboles vecinos a Monotropahypopithys; 5) Orquideoide. Slo se desarrollan en lafamilia Orchidaceae. La principal caracterstica de estamicorriza es la formacin de pelotones dentro de las c-lulas de la planta (Smith & Read, 1997); 6) Ectomicorri-za. Aunque hay mucha variacin estructural y morfolgi-ca, se pueden distinguir tres caractersticas reconocidaspara tipificar esta asociacin: la formacin de un mantoo vaina de hifas que cubren porciones considerables deraces laterales, el desarrollo de hifas entre las clulas

de la raz para formar la red de Hartig, y la hifa que ema-na del manto y crece en el suelo (Peterson, Massicote,& Melville, 2004); 7) Arbuscular. Tambin llamada mi-corriza vesicular-arbuscular. Es una asociacin entre lasraces de la mayora de plantas vasculares y un grupopequeo de hongos del nuevo phylum Glomeromycota(Schbler, Schwarzott, & Walker, 2001). Esta micorrizase caracteriza por la presencia de una hifa intra o in-tercelular, arbsculos (hifas finamente ramificadas queparticipan en el intercambio de nutrientes), micelio ex-tra-radical que conecta a la raz con el suelo, y esporas

specialized fungi, and it is considered the principal or-gan involved in nutrient uptake by most terrestrial plants.Seven types of associations based on their morphologyand theplant taxa associated with fungi can be distin-guished: 1) Ectendomycorrhizae. They are associa-tions formed between a limited number of asocmyce-

tes and the genera of Coniferas, Pinusand Larix; theyhave a mantle and a highly-complex branching structurecalled the Hartig net. After the formation of this net, theintracellular hypha develops in epidermal and corticalcell layers (Yu, Egger, & Peterson, 2001); 2) Ericoid.It represents a unique type of mycorrhizae confined toseveral families of the order Ericales. Plants that devel-op this type of mycorrhizae form very fine lateral rootsthat lack secondary growth. Each root consists of a thinvascular cylinder, one or two cortical cell layers andan epidermal layer. The association involves the colo-nization of the epidermal cells by the hypha, followedby formation of an arrangement of branching hyphae

(Cairney & Ashford, 2002); 3) Arbutoid. Two generaof the family Ericaceae (Arbutus and Arctostaphylos)and several genera in Pyrolaceae form typical arbutoidmycorrhizae. These mycorrhizae have a mantle and a Har-tig net, and they form intracellular hyphal arrgangementsconfined to the epidermis (Molina & Trappe, 1982); 4)Monotropoid.Plant species that have this mycorrhizaare not photosynthetic. Evidence suggests that fungithat form this type of mycorrhiza are also associatedwith photosynthetically-active neighoring trees, and thatthey have developed a mechanism to obtain their photo-synthates. Bjrkman (1960) showed that they can movephotosynthates from neighboring trees to Monotropa hy-

popithys; 5) Orchid. They only grow in the family Orchi-dacea. The main feature of this mycorrhiza is the forma-tion of pelotons within plant cells (Smith & Read, 1997);6) Ectomycorrhiza. Although there are many structuraland morphological variations within this association,there are three recognized features that distinguish it:the formation of a mantle or sheath of hyphae that coverssignificant portions of lateral roots, the development ofhyphae between root cells to form the Hartig net, and thehypha that emanates from the mantle and grows in the soil(Peterson, Massicote, & Melville, 2004); 7) Arbuscular.

Also called vesicular-arbuscular mycorrhiza, it is a part-

nership between the roots of most vascular plants and asmall group of fungi of the new phylum Glomeromycota(Schbler, Schwarzott, & Walker, 2001). This mycorrhizais characterized by the presence of an intra- or intercel-lular hypha, arbuscles (finely-branched hyphae involvedin nutrient exchange), extraradical mycelium which con-nects the root with the soil, and spores formed in theextraradical mycelium. Some species form structurescalled vesicles that are portions of hyphae filled with lipidbodies, thus giving this group the name of vesicular-ar--ar-buscular mycorrhiza.


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formadas en el micelio extra-radical. Algunas especiesforman estructuras llamadas vesculas que son porcio-nes de hifa que se llenan de cuerpos lipdicos, dando aeste grupo el nombre de micorriza vesicular-arbuscular.

Las micorrizas ms abundantes y con una distribu-

cin amplia en el planeta son las ectomicorrizas y las ar-busculares. En esta revisin se resaltan algunos conoci-mientos sobre el proceso de colonizacin en la micorrizaarbuscular; las propiedades de la interfase simbitica,los genes involucrados de la planta y una lista de oligo-nucletidos que se estn utilizando en la investigacinmolecular, para la identificacin de las especies de hon-gos micorrzicos en esta interaccin.

Colonizacin de la raz

La compatibilidad de las plantas con los hongosmicorrzicos es un fenmeno generalizado y antiguo.

Aproximadamente 80 % de las familias de plantas soncapaces de establecer micorrizas arbusculares (MA). Laevidencia de fsiles sugiere que este tipo de simbiosisexista desde hace 400 millones de aos en los tejidosde las primeras plantas terrestres (Pirozynski & Dalp,1989). Como tal, la capacidad de las plantas para formarMA debe estar bajo el control de mecanismos que sehan conservado en los nuevos taxones de plantas. Estacompatibilidad tambin implica que en las plantas, losprocesos de reconocimiento selectivo discriminen en-tre los microorganismos benficos y perjudiciales y quelos determinantes genticos esenciales para el estable-cimiento de MA son comunes a una parte extensa delreino vegetal. En contraste con la gama amplia de hos-pedantes y, a pesar de sus antiguos orgenes, slo seisgneros (Figura 1) de hongos pertenecientes al ordenGlomales de los Zigomicetes han desarrollado la capa-cidad para formar MA (Morton & Benny, 1990).

Las esporas de muchas especies no requieren fac-tores de la planta hospedante para la germinacin e ini-ciacin del crecimiento de la hifa. No obstante, el conti-nuo crecimiento de sta, la diferenciacin en estructurasde infeccin y la penetracin al hospedante son afec-tadas por seales de las plantas. Cuando una espora

de un hongo micorrzico germina, ramifica en todas lasdirecciones para incrementar la oportunidad de encon-trar races. Sin embargo, en ausencia del hospedante,el crecimiento de sta se limita a un periodo de 20 a 30das. Despus de este lapso, varias modificaciones enla morfologa como la retraccin del citoplasma de lospices, la produccin de septos y el desarrollo de ra-mas laterales, indican la terminacin del crecimiento dela hifa (Bonfante & Perotto, 1995). La percepcin de lasseales correctas, provenientes de las races de la plan-ta, promueven la morfognesis diferencial que consiste

The arbuscular mycorrhizae and the ectomycorrhi-zae are the most abundant and widely distributed myco-rrhizae on the planet. This review highlights some of ourexisting knowledge about the colonization process in thearbuscular mycorrhiza, the symbiotic interface proper-ties, the plant genes involved and a list of oligonucleoti-

des that are being used in molecular research to identifythe mycorrhizal fungal species in this interaction.

Root Colonization

The compatibility of plants with mycorrhizal fungi isa widespread and ancient phenomenon. Approximately80 % of plant families are able to establish arbuscularmycorrhizae (AMs). Fossil evidence suggests that thistype of symbiosis existed 400 million years ago in the tis-sues of the first land plants (Pirozynski & Dalp, 1989).

As such, the ability of plants to form AMs must be con-trolled by mechanisms that have been preserved in the

new plant taxa. This compatibility also means that inplants, selective recognition processes discriminate be-tween beneficial and harmful microorganisms, and thatgenetic determinants essential for establishing AMs arecommon to a large partof the plant kingdom. In contrastto thewide range of hosts and, despite their ancient ori-gins, only six genera (Figure 1) of fungi belonging to theorder Glomales of the Zygomycetes havedeveloped theability to form AMs (Morton & Benny, 1990).

The spores of several species do not require hostplant factors for germination and initiation of hyphalgrowth. However, its continued growth, differentiation ininfection structures and host penetration are affected byplant signals. When a mycorrhizal fungus spore germi-nates, it branches out in all directions to increase thechances of finding roots. However, in the absence of thehost, this growth is limited to a period of 20 to 30 days.

After this period, several morphological changes suchas retraction of cytoplasm in the apices, septa produc-tion and development of lateral branches indicate thecompletion of hyphal growth (Bonfante & Perotto, 1995).Perception of the correct signals from the plant roots pro-motes differential morphogenesis that consists of pro-fuse hyphal branching and proliferation. In the absence

of such signals, neither morphogenesis nor appresso-rium formation occurs. It has been shown that flavones(hepertina, naringenin and apigenin), the flavonoid quer-cetin and isoflavonoids stimulate hyphal growth in vitro.It is also suggested that these compounds promote in-teraction among cells during the early stages of arbuscu-lar symbiosis (Sharma & Johri, 2002).

Rapid recognition of a potential invader is a pre-requisite for initiating an effective plant defense. Thisis done by recognizingspecific signal molecules called


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FIGURA 1. Clasificacin de los hongos micorrzicos arbusculares. Tomado de Montao, Camargo-Ricalde, Garca-Snchez, y Mon-

roy (2007).

Phylum Orden Familia Gnero

Glomeromycota

Archaeosporales

Geosiphonaceae Geosiphon

Archaeosporaceae Archeosphora

Diversisporales

Diversisporaceae Diversispora

Acaulosporaceae

Entrophospora

Acaulospora

Gigasporaceae

Gigaspora

Scutellospora

Pacisporaceae Pacispora

Glomerales

Glomeraceae (A) Glomus

Glomeraceae (B) Glomus

Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus

en una ramificacin profusa de hifas y su proliferacin.En ausencia de tales seales, no ocurre ninguna mor-fognesis ni formacin del apresorio. Se ha demostradoque las flavonas (hepertina, naringenina y apigenina), elflavonoide quercitina y los isoflavonoides, estimulan elcrecimiento de hifas in vitro. Tambin se sugiere que es-tos compuestos promueven la interaccin entre clulasdurante las primeras fases de la simbiosis arbuscular(Sharma & Johri, 2002).

El reconocimiento rpido de un invasor potenciales un prerrequisito para iniciar una defensa efectiva dela planta. Esto se realiza a travs del reconocimiento demolculas seal especficas conocidas como elicitores.stos pueden ser secretados por el microbio (elicitor

exgeno) o generados como resultado de una rupturafsica o qumica de la pared celular de la planta (elicitorendgeno). En la interaccin planta-hongo micorrizge-no arbuscular se han encontrado algunos eventos simi-lares a los de la interaccin planta-patgeno. En una in-teraccin compatible con micorrizas arbusculares (MA)se ha observado una respuesta hipersensitiva parecidaa la que sucede cuando la planta es confrontada con unpatgeno. Tambin se ha detectado un estallido oxidati-vo en los sitios donde las puntas de las hifas de Glomusintraradices intentan penetrar una clula de la corteza

elicitors. These can be secreted by the microbe (exoge-nous elicitor) or generated as a result of a physical orchemical breakdown of the plant cell wall (endogenouselicitor). In plant-arbuscular mycorrhizal fungi interac-tions, some events similar to those involved in plant-pathogen interactions have been found. In an interac-tion compatible with arbuscular mycorrhizae (AMs), ahypersensitive response similar to what happens whenthe plant is confronted with a pathogen has been obser-ved. Also, an oxidative bursthas been detected in placeswhere the hyphal tips of Glomus intraradicesattempt topenetrate a cell of the root bark of Medicago truncatu-la(Zeze, Hosny, Tuinen, Gianinazzi-Pearson, & Dulieu,1999). This hypersensitive response is characterized bya rapid, localized chemical defense, and by the death of

plant cells surroundingthe infection site.

During the early stages of arbuscular mycorrhi-za formation,as in the case of tobacco mycorrhizae, atransient increase has been observed in the activity ofcatalase and peroxidase enzymes, which coincides withappressorium formation and fungal penetration of theroot. The increased activity of these enzymes also coin-cides with the accumulation of salicylic acid (SA), a sig-nal molecule involved in the signal transduction pathwayactivated in plant-pathogen reactions (Blilou, Bueno,


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de la raz de Medicago truncatula(Zeze, Hosny, Tuinen,Gianinazzi-Pearson, & Dulieu, 1999). Esta repuesta hi-persensitiva est caracterizada por una defensa qumicarpida, localizada y por la muerte de clulas de la plantaque rodean el sitio de infeccin.

Durante los primeros momentos de formacin de lamicorriza arbuscular, como en el caso de micorrizas detabaco, se ha observado un incremento transitorio de laactividad de las enzimas catalasa y peroxidasa, lo cualcoincide con la formacin del apresorio y la penetracindel hongo en la raz. El aumento de la actividad de estasenzimas tambin coincide con la acumulacin de cidosaliclico (AS); una molcula seal involucrada en la vade transduccin de seales activadas en las reacciones

planta-patgeno (Blilou, Bueno, Ocampo, & Garca-Ga-rrido, 2000). Un posible mecanismo para atenuar la res-puesta de defensa de la planta puede ser el bloqueo de loscomponentes de la va de transduccin de las seales,que activa dicha respuesta. Entre estos componentesse encuentran el cido saliclico y las especies reactivasde oxgeno que participan como segundos mensajerosen las micorrizas arbusculares (Figura 2). Aunque no sehan medido los niveles de las especies reactivas de ox-geno y H

2O

2,existen evidencias indirectas que sugieren

que los niveles de este ltimo en la micorriza son ele-

FIGURE 1.Classification of arbuscular mycorrhizal fungi. Taken from Montao, Camargo-Ricalde, Garca-Snchez, and Monroy (2007).

Phylum Order Family Genus

Glomeromycota

Archaeosporales

Geosiphonaceae Geosiphon

Archaeosporaceae Archeosphora

Diversisporales

Diversisporaceae Diversispora

Acaulosporaceae

Entrophospora

Acaulospora

Gigasporaceae

Gigaspora

Scutellospora

Pacisporaceae Pacispora

Glomerales

Glomeraceae (A) Glomus

Glomeraceae (B) Glomus

Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus

Ocampo, & Garca-Garrido, 2000). One possible me-chanism for attenuating the plant defense response maybe the blocking of the components of the signal trans-duction pathway, which triggers this response. Thesecomponents include salicylic acid and reactive oxygenspecies involved as second messengers in arbuscularmycorrhizae (Figure 2). Although the levels of reactiveoxygen species and H

2O

2have not been measured, the-

re is indirect evidence suggesting that the levels of thelatter in mycorrhiza are elevated (Zeze et al., 1999). Theincreased catalase and peroxidase activity may be dueto their function as antioxidants, for any active oxygenmolecule that has been generated during the initial sta-ges of fungal penetration. The H

2O

2and other reactive

oxygen species are involved in the signal transduction

cascade in plant-pathogen interactions. It is thereforepossible that H2O

2 degradation by catalase in the ar-

buscular mycorrhiza is the mechanism for evading theactivation of defense response genes (Van Camp, VanMontagu, & Inze 1998).

Arbuscule development

Simultaneously with the inter- or intracellular growthof the hypha in arbuscular mycorrhizal fungi, the terminalhypha differs in arbuscules within certain cortical cells. It


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vados (Zeze et al., 1999). El aumento en la actividad de lacatalasa y peroxidasa se puede deber a la funcin que tie-nen como antioxidantes, para cualquier molcula activa deoxgeno que ha sido generada durante los estados inicialesde la penetracin del hongo. El H

2O

2y otras especies reac-

tivas de oxgeno estn involucradas en la cascada de trans-duccin de seales en las interacciones planta-patgeno.Por tanto, es posible que la degradacin de H

2O

2 por la

catalasa en la micorriza arbuscular sea el mecanismo paraevadir la activacin de los genes de respuesta de defensa(Van Camp, Van Montagu, & Inz, 1998).

Desarrollo del arbsculo

Simultneamente al crecimiento inter o intracelu-lar de la hifa del hongo micorrzico arbuscular, la hifaterminal se diferencia en arbsculos dentro de ciertasclulas corticales. Se ha sugerido que el desarrollo dearbsculos en estas clulas puede ser regulado por ungradiente de carbono debido a la proximidad con el sis-tema vascular (Blee & Anderson, 1998). Aun cuando lacolonizacin de las clulas corticales es esencial parala diferenciacin del arbsculo, no se conocen las se-ales que disparan las ramificaciones dicotmicas de la

hifa para formarlo. La diferenciacin del arbsculo estacompaada de varios cambios fisiolgicos en la clulade la planta, cuyas vacuolas se fragmentan aumentan-do el volumen de citoplasma y el nmero de organelos(Bonfante & Perotto, 1995). Las clulas que contienenarbsculos muestran un ncleo hipertrofiado, nmeromayor de mitocondrias y niveles ligeros de actividadtranscripcional (Fester, Strack, & Hause, 2001).

El carbono de la planta es transportado al hongoa travs de dos membranas en la interfase simbitica.

FIGURA 2. Modelo hipottico representando los mecanismos re-

guladores involucrados en la defensa de la planta du-

rante el establecimiento de la simbiosis. Modifcado de

Garca-Garrido y Ocampo (2002).

FIGURE 2. Hypothetical model depicting the regulatory mecha-

nisms involved in plant defense during establishment

of the symbiosis. Modified from Garca-Garrido and Oc-

ampo (2002).

has been suggested that arbuscule development in the-se cells may be regulated by a carbon gradient due tothe proximity of the vascular system (Blee & Anderson,1998). Even though the colonization of cortical cells isessential for arbuscule differentiation, the signals thattrigger dichotomous hyphal branching to form it are stillnot known. Arbuscule differentiation is accompanied byvarious physiological changes in the plant cell, who-se vacuoles are fragmented to increase the volume ofcytoplasm and the number of organelles (Bonfante &Perotto, 1995). Cells containing arbuscules show a hy-pertrophied nucleus, a higher number of mitochondriaand low levels of transcriptional activity (Fester, Strack,& Hause, 2001).

Plant-derived carbon is transported to the fungusthrough two membranes at the symbiotic interface. Thiscarbon is first released into the periarbuscular space, pro-bably in the form of sucrose, then cleaved into hexosesand taken up by AM fungi through transport across thefungal plasma membrane. Within the fungal cytoplasm,hexoses are converted into glycogen granules and trigly-ceride droplets, which serve as suitable units for long-dis-tance transport through the hyphal network.

Nutrients acquired by the fungus from the soil haveto cross the plasma membrane, be transported to theintraradical hyphae, including the arbuscules, and final-ly pass through the periarbuscular membrane to reachthe plant cytoplasm. Phosphate is mobilized by fungalphosphate transporters present in the extraradical hy-pha. It is then transported to the root and intraradicalhypha in the form of phosphate granules wrapped inmembrane vesicles. The negative charge of these gran-ules likely makes them vehicles for transporting metals


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Este carbono primero es liberado en el espacio periar-buscular, probablemente en la forma de sacarosa, des-pus se fracciona en hexosas y es tomado por el hongoMA a travs del transporte por la membrana del hongo.En el citoplasma del hongo, las hexosas son convertidasen grnulos de glucgeno y gotas de triglicridos, que

sirven como unidades disponibles para el transporte alarga distancia a travs de la red de hifas.

Los nutrientes adquiridos por el hongo desde elsuelo, cruzan la membrana plasmtica, son transporta-dos a la hifa intra-radical incluyendo los arbsculos, yfinalmente atraviesan la membrana periarbuscular paraalcanzar el citoplasma de la planta. El fosfato es mo-vilizado por transportadores de fosfato del hongo queestn presentes en la hifa extra-radical. Posteriormen-te, es transportado hacia la raz y la hifa intra-radical,en forma de grnulos de fosfato envueltos en vescu-las de membrana. La carga negativa de estos grnulos

probablemente los hace vehculos para el transporte demetales y arginina. El nitrgeno es captado en la hifaextra-radical por transportadores de amonio, nitrato oaminocidos, que lo transportan principalmente comoarginina. Dentro de la hifa intra-radical el nitrgeno selibera de ella en forma de urea y puede ser transporta-do directamente a la planta o despus ser transformadoen amonio. Durante el desarrollo y senescencia del ar-bsculo se ha observado la activacin del ciclo de loscidos tricarboxilicos y la biosntesis de aminocidos,cidos grasos y apocarotenoides, indicando una fuerteinduccin del metabolismo de la planta (Parniske, 2008).Tambin se ha observado un re-arreglo del citoesquele-to (Lohse et al., 2005).

Harrison (2005) sugiere que ocurren al menos dosseales durante el desarrollo del arbsculo. Una sealautnoma de la clula que podra ser responsable de laactivacin de la expresin de ciertos genes exclusiva-mente en las clulas que contienen arbsculos (es de-cir, transportadores de fosfato especficos de micorrizas,una celulasa, una quitinasa, y una ATPasa). La seal noautnoma de la clula debe estar involucrada en la ac-tivacin de genes especficos en clulas que contienenarbsculos (es decir, una protena GST [Glutation-S-

transferasa], una quitinasa y una -13-endoglucanasa).Los arbsculos son estructuras efmeras y su periodode vida puede alcanzar de cuatro a diez das (Sanders,Tinker, Black, & Palmerly, 1977). Despus de este pe-riodo, se observa la formacin de un septo en la hifa delarbsculo y la estructura se colapsa. Durante la senes-cencia y colapso del arbsculo se observa una produc-cin localizada de especies reactivas de oxgeno. Des-pus que los arbsculos se colapsan son degradadoscompletamente y las clulas de la planta regresan a sufisiologa normal.

and arginine. Nitrogen is captured in the extraradicalhypha by ammonium, nitrate or amino acid transport-ers, which transport it mainly as arginine. Within the in-traradical hypha, nitrogen is released as urea and canbe transported directly to the plant or after being con-verted into ammonium. During arbuscule development

and senescence, activation of the tricarboxylic acidcycle and biosynthesis of amino acids, fatty acids andapocarotenoids have been observed, indicating a stronginduction of plant metabolism (Parniske, 2008). A rear-rangement of the cytoskeleton has also been observed(Lohse et al., 2005).

Harrison (2005) suggests that at least two signal-ing events occur during arbuscule development. A signalacting in cell autonomous fashion could be responsiblefor activating the expression of certain genes only incells containing arbuscules (that is, mycorrhiza-specificphosphate transporters, a cellulase, a chitinase, and a

protonATPase). A signal acting in cell non-autonomousfashion must be involved in the activation of specificgenes in cells containing arbuscules (that is, a GSTprotein [glutathione-S-transferase], a chitinase and a-1,3-endoglucanase). The arbuscules are temporarystructures and their lifespan can be fromfour to ten days(Sanders, Tinker, Black, & Palmerly, 1977). After this pe-riod, the formation of a septum in the arbuscule hypha isobserved and the structure collapses. During arbusculesenescence and collapse, localized production of reac-tive oxygen species is observed. After the arbusculescollapse, they are completely degraded and the plantcells return to their normal physiology.

Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi

Research initiated by Mosse (1973) on arbus-cular mycorrhizal fungi was vigorously followed bynumerous researchers worldwide. A large number ofthese studies deal with the beneficial aspects of thismycorrhiza on plant growth. This indicates the need todevelop arbuscular fungi crops as bio-inoculants foruse in agriculture, forestry and horticulture. There havebeen relatively few studies aimed at the cultivation,phylogeny, taxonomic aspects and nature of the sym-

biosis. There are three main reasons for this: 1) arbus-cular mycorrhizal fungi are obligatesymbionts and fewauthors have attempted to cultivate them in axenic me-dium, 2) there are no reliable characteristics for phylo-geny and taxonomy because these fungi do not produ-ce sexual states and only exist as an imperfect state; inthe absence of spores, the intraradical structures onlyallow identification at the family level in the best of ca-ses (Merryweather & Fitter, 1998), and 3) identifyingcurrent micosymbionts confers greater benefits to thehost, since it finds a variety of AM fungal spores in the


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Diversidad molecular de hongos micorrzicos

arbusculares

La investigacin de hongos micorrzicos arbuscula-res iniciada por Mosse (1973) fue seguida vigorosamen-te por numerosos investigadores en todo el mundo. Una

gran cantidad de trabajos tienen que ver con aspectos be-nficos de esta micorriza sobre el crecimiento de la planta.Esto indica la necesidad de desarrollar cultivos de hongosarbusculares como bio-inoculantes para la agricultura,forestera y horticultura. Se han producido relativamen-te pocos trabajos dirigidos al cultivo, filogenia, aspectostaxonmicos y naturaleza de la simbiosis. Las razones deello son principalmente tres: 1) los hongos micorrzicosarbusculares son simbiontes obligados y pocos autoreshan hecho el intento de cultivarlos en medio axnico, 2)no hay caractersticas confiables para la filogenia y taxo-noma debido a que estos hongos no producen estadossexuales y slo existen en estado imperfecto; en ausen-

cia de esporas, las estructuras intra-radicales permiten laidentificacin a nivel de familia en el mejor de los casos(Merryweather & Fitter, 1998), y 3) la identificacin de losmicosimbiontes actuales confiere mayores beneficios alhospedante, debido a que encuentra una variedad de es-poras de hongos MA en la vecindad de la raz. Los enfo-ques de la identificacin molecular tienen el potencial pararevolucionar nuestra comprensin del hongo micorrzicoarbuscular. Este enfoque puede permitir la posibilidad deinvestigar acerca de su evolucin, el dilogo cruzado en-tre los socios simbiontes, que es la base para el progresofuturo en el campo de las interacciones planta-microbio

(Franken & Requena, 2001).Tendencias de la investigacin en las seales de la

simbiosis micorrzica arbuscular

La pregunta de cmo se establece la interaccin en-tre simbiontes sin disparar eventos de rechazo haba frena-do la investigacin. Algunas de las razones fueron las ca-ractersticas de la simbiosis MA, tales como la carencia deespecificidad entre los simbiontes, el estatus obligado delhongo y el desarrollo asincrnico. Sin embargo, el traba-

jo de Akiyama (2005) hizo una aportacin importante a lacomprensin del inicio de la interaccin entre los simbion-

tes. Akiyama identific y caracteriz los compuestos qumi-cos en los exudados de la raz que producen cambios mor-fogenticos en la misma. Estos cambios son cruciales alconvertir los tubos germinales con potencial de crecimientolimitado, en micelio presimbitico que tiene la capacidadde iniciar la colonizacin de las races. Lo anterior significaun paso crucial en la vida de un simbionte obligado. Loscambios incluyen una alteracin rpida en la expresin degenes y un aumento en la actividad mitocondrial (Lohseet al., 2005). Los compuestos activos son estrigolactonas(Figura 3) y son efectivas a concentraciones extremada-

vicinity of the root. Molecular identification approacheshave the potential to revolutionize our understanding ofthe arbuscular mycorrhizal fungus. This approach mayenable us research its evolution and the cross dialoguebetween symbiont partners, which is the basis for fu-ture progress in the field of plant-microbe interactions

(Franken & Requena, 2001).

Research trends related to signaling in the arbuscu-

lar mycorrhizal symbiosis

The question of how to set offthe interaction bet-ween symbionts without triggering rejection eventsslowed research in the past.The reasons given includedthe characteristics of the AM symbiosis, such as lackof specificity between symbionts, the obligate nature ofthe fungus and asynchronous development. However,the work of Akiyama (2005) made an important con-tribution to ourunderstanding of the onset of the inte-

raction between the symbionts.Akiyama identified andcharacterized thechemical compounds in the root exu-dates that produce morphogenetic changes in the root.These changes are crucial to convert germ tubes with li-mited growth potential intopre-symbiotic mycelium withthe ability to start root colonization. This representsacrucial step in the life of an obligate symbiont. Changesinclude rapid alteration in gene expression and increa-sed mitochondrial activity (Lohse et al., 2005). The ac-tive compounds are strigolactones (Figure 3) and theyare effective at very low concentrations. This behaviorsuggests that they act through signaling pathways thatallow the catabolism of lipidsas the main carbon sou-rce for the fungus. These findings will allow carryingout controlled research into the metabolic changes thatoccur in the germ tubes of the fungus. On the otherhand, Genre (2005) showed how root epidermal cellsassemble a special intracellular structure before pene-tration occurs. For this, the author studied in vivo ce-llular dynamics within Medicago truncatularoot clonesusing green fluorescent protein (GFP) labeling of boththe plant cytoskeleton and the endoplasmic reticulum.By usinga confocal microscope, the author could followthe responses of the epidermal cells to fungal appres-sorium formation and hyphal penetration in living cells.

The author observed that the nucleus of the epidermalcell migrates across the cell, allowing the formation ofa special pre-penetration apparatus withina column ofcytoplasm. The fluorescence showed a high-densityarray of microtubules and microfilament bundles run-ning parallel to the column. This effect was associatedwith a very dense region of endoplasmic reticulum cis-ternae. Once the pre-penetration apparatus is formed,fungal entry and hyphal growth through the cell preci-sely follow the pathdefined by the cytoskeleton and thestructures of the endoplasmic reticulum.


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FIGURE 3. Chemical structures of strigolactones. (A) 5-deoxy-

strigol (B) four natural strigolactones. Modified from

Akiyama (2005).

mente bajas. Este comportamiento sugiere que actan atravs de vas de seales que permiten el catabolismo delpidos como la fuente principal de carbono para el hon-go. Estos hallazgos permitirn desarrollar investigacionescontroladas de los cambios del metabolismo que ocurrenen los tubos germinales del hongo. Por otro lado, Genre(2005) demostr cmo las clulas de la epidermis de laraz ensamblan una estructura intracelular especial antesde que ocurra la penetracin. Para ello, us clones de razde Medicago truncatula que expresan a la protena verdefluorescente (GFP) en el citoesqueleto y retculo endopls-mico. Mediante la utilizacin del microscopio confocal pudoseguir las respuestas de las clulas de la epidermis parala formacin del apresorio del hongo y la penetracin dela hifa en clulas vivas. Observ que el ncleo de la clulade la epidermis se mueve permitiendo la formacin de unaparato de pre-prenetracin especial que se forma dentrode una columna citoplsmica. La fluorescencia mostr unarreglo de alta densidad y un haz de microfilamentos para-lelo a la columna. Este efecto se asoci con una regin de

cisternas densas del retculo endoplsmico. Una vez queel aparato de pre-penetracin se forma; la entrada del hon-go y el crecimiento de la hifa a travs de la clula siguenprecisamente el camino definido por el citoesqueleto y lasestructuras del retculo endoplsmico.

Los mtodos moleculares para la investigacin de

las micorrizas arbusculares

Adems de la observacin de las caractersticasmorfolgicas, frecuentemente se emplean tcnicas bio-qumicas y fisiolgicas, principalmente en levaduras. Sinembargo, estos mtodos son muy laboriosos, requieren

de mucho tiempo y suministran una resolucin taxon-mica insuficiente en hongos filamentosos. En contraste,dos avances tcnicos importantes han estimulado el usode tcnicas moleculares. El primero, la llegada de PCR(Reaccin en Cadena de la Polimerasa) que ha permi-tido el anlisis de pequeos grupos celulares o aun deuna sola espora, material seco de herbario o de orga-nismos extintos. El segundo, la seleccin de iniciadores(primers) especficos para hongos que han permitido unfcil acceso a las secuencias de nucletidos.

FIGURA 3. Estructuras qumicas de estrigolactonas. (A) 5 desoxi-

estrigol; (B) cuatro estrigolactonas naturales. Modifca-

do de Akiyama (2005).

Molecular methods for research on

arbuscular mycorrhizae

In addition to morphological observation, bioche-mical and physiological techniques are frequently used,mainly in yeast. However, these methods are very labo-rious and time-consuming, and provide insufficient taxo-nomic resolution in filamentous fungi. By contrast, two

major technical advances have stimulated the use of mo-lecular techniques. The first was the arrival of PCR (Po-lymerase Chain Reaction), which has enabled the analy-sis of small cell groups or even a single spore, dry matterfrom a herbarium or extinct organisms. The second wasthe selection of fungi-specific primers that have allowedeasy access to the nucleotide sequences.

Analysis of DNA base composition in nine speciesshowed that genomes contain many repeated DNA se-quences and that there is a low content of guanine andcytosine bases (35 %) with high methylcytosin elevels.

Significant progress has been made to reveal the me-chanisms governing the symbiosis, particularly in rela-tion to the molecular response of the host and the ge-nes involved. The location of these genes and their lowactivation suggests that some signaling pathway in thearbuscular mycorrhiza and other plant-microbe interac-tions may be shared. The hypothesis to explain attenua-ted defense responses in plant includes the degradationof elicitors, cell signals through altered sugar flows andhormonal balance (Blee & Anderson, 2000).

Ribosomal DNA gene cluster

Molecular technologies have been particularly suc-cessful for studying ribosomal DNA sequences (rDNA) inarbuscular mycorrhizal fungi. A growing cell has millionsof ribosomes for the production of proteins. RibosomalRNA (rDNA) is the essential structural component of ri-bosomes. As a result, millions of copies of each type of5S, 5.8S, 18S and 28S RNA molecule must be synthe-sized in each cell generation for the cell to meet the re-quirements for protein synthesis.The highly conservedmultiple copies of the rRNA genes in a given chromoso-


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El anlisis de la composicin de bases del ADN ennueve especies demostr que los genomas contienenmuchas secuencias repetidas de ADN y que hay un con-tenido bajo de las bases guanina y citosina (35 %) conniveles altos de metilcitosina. Se han logrado avancessignificativos para revelar los mecanismos que gobiernan

la simbiosis, particularmente, con relacin a la respuestamolecular del hospedante y los genes involucrados. La lo-calizacin de tales genes y su baja activacin sugiere quealguna va de seales en la micorriza arbuscular y otrasinteracciones planta-microbio puede ser compartida. Lahiptesis para explicar las respuestas de defensa atenua-das en la planta incluyen la degradacin de elicitores; se-ales celulares a travs de flujos alterados de azcares ybalance hormonal (Blee & Anderson, 2000).

El grupo de genes del ADN ribosomal

Las tecnologas moleculares han sido exitosas, par-

ticularmente, para estudiar secuencias de ADN ribosomal(ADNr) en los hongos micorrzicos arbusculares. Una c-lula en crecimiento tiene millones de ribosomas para laproduccin de protenas. El ARN ribosomal (ARNr) es elcomponente estructural esencial de los ribosomas. Debi-do a ello, millones de copias de cada tipo de molcula deRNA 5S, 5.8S, 18S y 28S tienen que ser sintetizadas encada generacin celular con el fin de que la clula llenelos requerimientos para la sntesis de protenas. Las co-pias mltiples altamente conservadas de los genes ARNren un cromosoma dado estn localizadas en tndem.Cada gen est separado del siguiente por regiones co-nocidas como DNA espaciador, el cual vara en tamao

FIGURE 4. Ribosomal DNA gene cluster.The spacer DNA varies

in size and sequence among species. One group con-

sists of genes for ribosomal RNA molecules 18S, 5.8S

and 28S, which are separated by an internal transcribed

spacer (ITS-1 and ITS-2).

Grupo de genes DNA ribosmico

ETS ITS-1 ITS-2

rRNA 18S rRNA 5.8S rRNA 28S

rRNA 18S

Subunidad

pequea

RIBOSOMA

Subunidad

grande

FIGURA 4. Grupo de genes de DNA ribosmico. El DNA espacia-

dor vara en tamao y secuencia entre especies. Un

solo grupo consiste de genes para molculas de RNA

ribosomal 18S, 5.8S y 28S, las cuales estn separadas

por un espaciador interno transcrito, o ITS-1 e ITS-2 (In-

ternal Transcribed Spacer).

me are located in tandem. Each gene is separated fromthe next by regions known as spacer DNA, which vary insize and sequence between species. A group of genesconsists of 18S, 5.8S and 28S rRNA molecules, whichare separated by an inner transcribed spacer (ITS-1 andITS-2) (Figure 4).

There is strong selective pressure (evolution) tomaintain functional rDNA because its intact rRNA mole-cules are essential for the generation of ribosomes, pro-tein synthesis and cell function. Ribosomal genes belongto the most conserved genes in eukaryotic cells, showingsequence similarity even between distant phylogenetictaxa. However, there is less homology in the ITS-1 andITS-2 regions because these DNA areas do not contribu-te to structural RNA. Therefore, less selective pressure isapplied tothese regions, enabling one to find differences(point mutations) in the DNA sequence even betweenspecies of the same genus. Due to these features, rDNAmolecular data are widely used for the determination ofphylogenetic relationships or to discriminate between

closely related species.

The earliest primers to gain wide acceptance forwork with the ITS region were ITS1 and ITS4. These pri-mers amplify in a large number of fungal species andadequately serve to analyze DNA isolated from individualorganisms. However, these primers have a drawbacksince isolating nucleic acids from the plant-fungus in-teraction does not exclude plant sequences. Primerswere later designed to exclude plants, such as ITS1-Fand ITS4-B, which have gained wide use in fungal ITS


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y secuencia entre especies. Un grupo de genes consistede molculas de ARNr 18S, 5.8S y 28S, que estn sepa-radas por un espaciador interno transcrito ITS-1 e ITS-2(Internal Transcribed Spacer) (Figura 4).

Existe una fuerte presin selectiva (evolucin) para

mantener funcional al DNAr, debido a que sus molcu-las intactas de ARNr son esenciales para la generacinde ribosomas, sntesis de protenas y funcin celular.Los genes del ribosoma pertenecen a los genes msconservados en las clulas de eucariontes mostrandosimilitud de secuencias incluso entre taxones filogen-ticos distantes. Sin embargo, en las regiones ITS-1 eITS-2 se encuentra menos homologa debido a que esaszonas de ADN no contribuyen al ARN estructural. Por lotanto, se aplica menos presin selectiva en dichas regio-nes, pudindose encontrar diferencias (mutaciones pun-tuales) en la secuencia de ADN aun entre especies delmismo gnero. Debido a estas caractersticas los datos

moleculares del ADNr son muy utilizados para la deter-minacin de relaciones filogenticas o para discriminarespecies estrechamente relacionadas.

TABLE 1. Primers for amplification of ribosomal RNA genes in

fungi. All primers are 5. The sequences are written

5-3. Product sizes are approximated based on rRNA

genes of Saccharomyces cerevisiae. (Inns, 1990)

ITSname

Nucleotide sequenceBase

pairs

ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 290

ITS5 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 315

ITS2 5 GCTGCGTTCTTCATCGATGC 290

ITS3 5 GCATCGATGAAGAACGCAGC 330

ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 580

ITS1F 5 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 700

TW13 5 GGTCCGTGTTTCAAGACG 1200

CUADRO 1. Primers para amplificacin de genes RNA ribosomal

en hongos. Todos los primers son 5. Las secuencias

estn escritas 5-3. Los tamaos de los productos

son aproximados con base en los genes rRNA de Sa-

charomyces cerevisiae. (Inns, 1990)

Nombre

del ITSSecuencia de nucletidos

Pares de

bases

ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 290

ITS5 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 315

ITS2 5 GCTGCGTTCTTCATCGATGC 290ITS3 5 GCATCGATGAAGAACGCAGC 330

ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 580

ITS1F 5 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 700

TW13 5 GGTCCGTGTTTCAAGACG 1200

analysis, although other primers have also been develo-ped (Table 1) (Ram, Pavan, & Reddy, 2005). Kendall andRygiewicz (2005) recently published a set of primers foruse in nested amplifications of ITS sequences.This suiteof primers for Dicariomicota serves as the basis for awide-ranging system to analyze microbial communities,particularly in association with plants.These emergingmethods for molecular analysis of microbial communi-ties are allowing increased sampling. This increase, inturn, is the strength behind the characterization of thesecomplex and spatially diverse groups.

Perspectives

Future studies of the symbiosis of arbuscular fungiwill benefit from the development of molecular tech-niques. The coupling of these techniques with tradi-tional physiological experimentation will help improveour understanding of the dynamic interaction betweenplants and fungi. The development of molecular meth-ods allows us to perform phylogenetic studies that givehistorical consistency between groups of higher taxo-nomic levels. Moreover, it will also allow for diagnosticapplications, that is, recognition of defined taxonomicentities, as well as epidemiology and population genet-ics. Furthermore, they can be used to track outbreaksof sub-specific entities in relation to population analysisand their mode of reproduction.

End of English Version

Inicialmente, los primers que ganaron una acepta-cin amplia para trabajar con la regin ITS fueron los ITS1e ITS4. Estos primers amplifican en un nmero elevadode especies de hongos y trabajan adecuadamente paraanalizar el ADN aislado de organismos individuales. Sinembargo, dichos iniciadores presentan un inconvenien-

te ya que al aislar los cidos nucleicos de la interaccinplanta-hongo, no excluyen las secuencias de las plantas.Posteriormente se disearon primers que excluyen alas plantas, como los ITS1-F e ITS4-B con un uso am-plio en el anlisis de ITS de hongos, aunque tambin sehan desarrollado otros primers (Cuadro 1)(Ram, Pavan,& Reddy, 2005). Kendall y Rygiewicz (2005) publicaronrecientemente un conjunto de primers para utilizarse enamplificaciones anidadas de secuencias de ITS. Esteconjunto de primers para Dicariomicota sirven como basepara un intervalo amplio de sistemas de anlisis de comu-


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nidades microbianas, particularmente, en asociacin conplantas. Estos mtodos emergentes para el anlisis mole-cular de las comunidades microbianas estn permitiendoel aumento de los muestreos. A su vez, el aumento destos es la fuerza detrs de la caracterizacin de dichosgrupos complejos y diversos espacialmente.

Perspectivas

En el futuro, los estudios de la simbiosis de los hon-gos arbusculares se beneficiarn del desarrollo de lastcnicas moleculares. El acoplamiento de estas tcnicascon la experimentacin fisiolgica tradicional, ayudar ala comprensin de la interaccin dinmica entre plantasy hongos. El desarrollo de los mtodos moleculares per-mitir realizar estudios filogenticos que den coherenciahistrica entre los grupos de los niveles taxonmicos su-periores. Por otra parte, tambin permitir realizar aplica-ciones para el diagnstico; es decir, el reconocimiento deentidades taxonmicas definidas, as como la epidemiolo-ga y la gentica de poblaciones. Adems, se podrn vigi-lar los brotes de entidades sub-especficas con relacin alanlisis de poblaciones y su modo de reproduccin.

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