Maria Teresa S. R. Gomes

Mtodos Instrumentais de Anlise

2o Ano Bioqumica e Biotecnologia (2o semestre 2014/15)

1. Introduo 1.1 O que faz o qumico analtico. 1.2 O processo analtico 1.3 Mtodos analticos 1.4 Escolha do mtodo analtico: definio do problema analtico, 1.5 Algarismos significativos 1.6 Erros nos resultados experimentais 1.7 Intervalo de confiana 1.8 Rejeio de valores anmalos 1.9 Mtodos absolutos e mtodos relativos 1.10 Calibrao: curva de calibrao, mtodo de adio de padro, mtodo do padro interno 1.11 Propagao de incertezas. 1.12 critrios numricos para seleccionar o mtodo analtico

ProgramaBibliografia*1. Skoog, D. A.; Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis, Harcourt Brace College Publishers: USA. 1998, cap.1*2. Christian G. D. Analytical Chemistry, Johm Wiley & Sons: NY. 1994, cap.1, cap.2. 3. Miller, J. C.; Miller, J. N. Statistics for analytical chemistry, Ellis Horwood: Chichester. 1992. Cap.5. 4. EURACHEM/CITAC Guide 4: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement Third Edition Editors S L R Ellison (LGC, UK) A Williams (UK), 2012

1.1 O que faz um Qumico AnalticoarguacomidaControlo de qualidadesade

1.1 O que faz um qumico AnalticoO que ?Onde?Quanto?Qual o arranjo, estrutura ou forma?Presena de plvora nas mos do assassinoQual o teor de glucose no sangue?

1.2 O processo AnalticoO que tem dentro?

1.2 O processo Analtico2. Selecionar o mtodo3. Preparao da amostra para a anlise2. Obteno de uma amostra representativa4. Proceder s separaes qumicas necessrias5. Fazer as medies6.Fazer os clculos e apresentar o resultado1. Definio do problema

1.3 Mtodos Analticos Prima o botomgicoMtodos AnalticosClssicos(qumica molhada)Instrumentais

1.3 Mtodos Analticos ClssicosInstrumentaisseparao dos componentes por precipitao, extraco ou destilao, seguida de tratamento com reagentes para identificao dos produtos por meio das suas cores, pontos de ebulio ou de fuso, solubilidade, odores, propriedades pticas...possvel separao cromatogrfica, seguida da medio da condutividade, potenciais de elctrodo, absoro ou emisso de luz, fluorescncia, razo massa/carga...Mtodos Instrumentais vs. Mtodos clssicosou?

1.3 Mtodos AnalticosClssicos

InstrumentaisgravimetriatitulometriaMtodos Quantitativosespectroscopiaspotenciometria, coulometria, amperometriamicrobalana de cristais piezoelctricosespectrometria de massamtodos radioqumicos

facilidadecustoO que escolher?sensibilidadeselectividaderapidezpreciso exactido

1.3 Mtodos Analticos

1.4 Escolha do mtodo analtico 1. Definio do problemaQual a exactido exigida?Qual a quantidade de amostra disponvel?Qual a gama de concentraes do analito?Quais os componentes da amostra que podero interferir?Quais as propriedades fsicas e qumicas da matriz?Quantas amostras vo ser analisadas?Custo da instrumentao, desenvolvimento do mtodo e calibraoCusto do operador / amostraselectividadesensibilidade

1.5 Como apresentar o resultado? O chumbo txico. S bebo esta gua se me garantir que a concentrao zero.No posso.Mas posso beber ou no?A concentrao 15,7 0,3 g / LE ento?

1.5 Algarismos significativosTodos os algarismos certos + um incerto92,067 mm9,2067 cm0,92067 dm0,092067 m2mL2,050mL2,05mL2,0mL230 Km232 Km200 KmNo. 232,3 KmAlgarismos significativos: todos os algarismos de um nmero a partir do primeiro algarismo da esquerda que seja diferente de zero

1.5 Algarismos significativosAdies e subtraesNmero de casas decimais igual ao do termo que tiver menos casas decimais3,4+0,02+1,31=4,7Multiplicaes e divisesNmero de algarismos significativos igual ao do termo que tiver menos algarismos significativos24 0,452 / 100,0 = 0,1112,68 841 / 132,6 0,5247 = 546,6

1.5 Algarismos significativoslogaritmosApesar de apenas conhecermos a concentrao com 2 dgitos o pH tem 3Se o factor que tem menos algarismos significativos comear por um algarismo superior a 5 conta-se esse algarismo como se fossem dois8,4 3,612 = 30,3log 2,00 10-3 = -2,699S indica a localizao do ponto decimal. No significativopH=-log 2,0 10-3 = -(-3 + 0,30) = 2,70

1.5 Algarismos significativosArredondamentosSe o dgito que se segue ao ltimo algarismo significativo menor do que 59,43 = 9,4Se o dgito que se segue ao ltimo algarismo significativo maior do que 59,47 = 9,5Se o dgito que se segue ao ltimo algarismo ltimo par8,65 = 8,68,75 = 8,88,55 = 8,6

1.5 Algarismos significativosArredondamentosExemplos concretos onde podem surgir dvidas:6,6500 = 6,6Todos os dgitos a seguir ao 5 so zero. O ltimo dgito arredonda para par501>5 O ltimo algarismo arredondado para cima6,6501 = 6,7Arredondar s dcimas:

1.6 Erros nos dados experimentais

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0 0,5 1,.0

Analista 1Analista 2Analista 3Analista 4Erro absoluto %Erros indeterminados ou aleatriosErros determinados ou sistemticosErros grosseiros, ocorrem ocasionalmente e originam valores anmalos (outliers)

1.6.1 Erros sistemticos

Erros nos instrumentosPipetas e bales volumtricos descalibradosErros no mtodoReaces lentas ou incompletasInstabilidade dos reagentesReaces paralelas interferentescontaminaes

Pequeno excesso: erro constanteAnlise de brancos, material de referncia, mtodo independente, variar o tamanho da amostra

1.6.1 Erros sistemticos

Erros associados s pessoasJ est azulGastei 16,04 mL (parece ... est muito alto) melhor escrever 16,05, at porque deve ser isto que d

conscincia de limitaes fsicas; cuidado e disciplina

1.6.2 Erros grosseirosDesleixoPreguiaInpcia

No usar folhas soltas no laboratrioNo passar a limpoManter registos pormenorizadosNo confiar na memria

1.6.3 Erros aleatrios

Flutuaes aleatrias volta da mdia

1.7 Intervalo de confiana1) s uma boa aproximao de Para uma nica medioPara N rplicas

Nvel de confiana %z500,67681,00801,29901,64951,96962,00992,5899,73,0099,93,29

2) desconhecido1.7 Intervalo de confiana

ExemploUm qumico obteve os seguintes resultados, para o contedo em lcool de uma amostra:%C2H5OH = 0,084 0,089 e 0,079Calcule o limite de confiana para a mdia a 95%, assumindo que:a) No existe nenhum conhecimento adicional acerca da preciso do mtodo. b) Com base em experincias anteriores , sabe-se que:s =0,005% C2H5OH

Mais do que um conjunto de dadosObtidos em dias diferentesObtidos com amostras diferentes, com ligeiras variaes na composioPresumindo que o erro indeterminado o mesmo para cada conjunto, poder-se-o combinar os dados dos diferentes conjuntos Desvio padro pesado (pooled)

1.8 Rejeio de valores anmalos (outliers) reter resultados anmalos e afectar significativamente a mdiaPerigos rejeitar resultados que pertencem ao conjunto e distorcer os dados

Testes de rejeioBom sensoManter um registo laboratorial detalhadoOs testes estatsticos assumen que a distribuio da populao normal ou gaussianano se pode provar para pequenas amostras

1.8 Rejeio de valores anmalos (outliers)Teste QConfiana resultado suspeito resultado mais prximo intervaloRejeitar se Qexp > Qcritw

Q crticoNo de observaes96%99% 30,980,9940,850,9350,730,8260,640,7470,590,6880,540,63

Recomendaes para o tratamento de valores anmalos 1.Reexaminar cuidadosamente os dados para verificar se o valor pode ter sido afectado por um erro grosseiro2. Estimar a preciso que razovel esperar, se possvel, e certificar-se de que o resultado verdadeiramente questionvel3. Repetir a anlise se tiver tempo e amostras disponveis4. Aplicar o teste Q5. Se o teste estatstico indicar que o valor deve ser retido, considerar apresentar a mediana em vez da mdia.No caso de possuir apenas trs medies (vulgar nos trabalhos prticos das disciplinas laboratoriais) a mediana d provavelmente uma melhor estimativa do valor verdadeiro do que a mdia aps rejeio do resultado e a mediana no afectada pelo resultado anmalo.

1.9 Mtodos absolutos e mtodos relativosAbsolutosClculo da quantidade de analito, utilizando constantes fundamentais que se conhecem com rigor.Exemplo: anlise gravimtrica, onde se pesa um derivado insolvel do analito, cuja composio bem conhecida e se efectuam os clculos recorrendo s massas atmicasRelativosExigem comparao com solues de concentrao conhecida.Exemplo: anlise volumtrica, onde o analito reage com uma estequiometria conhecida com um reagente numa soluo de concentrao conhecida.A maioria dos mtodos instrumentais exige callibrao

segundo pressuposto: os erros nas respostas instrumentais so independentes da concentrao do analitoMelhor recta de regresso de y em x mtodo dos mnimos quadrados minimiza o quadrado dos desvios, em y, dos pontos recta1.10 Calibrao concentraoSinal InstrumentalSinal Instrumental no eixo dos yyConcentrao no eixo dos xxPresume-se que todos os erros esto nos valores de y e que as concentraes esto isentas de erro y=bx+a

Quo bem se ajustam os pontos a uma linha recta?1.10 Calibrao 0

Recta de calibrao y=bx+aO intervalo de confiana pode ser melhorado aumentando nClculo da concentraoy0x0Clculo do erro (estimativa) na concentraoNa prtica, o resultados mais preciso obtm-se quando o sinal est perto do centride da recta, quando y0 se aproxima de y Melhora-se a preciso medindo vrias vezes y0 (aumentando m)

1.10.1 Mtodo da adio de padroAmostra complexa (efeito de matriz)Adio de padro de Eu(III) a gua da piscina e gua da torneira

padroCs1.10.1 Mtodo da adio de padroVolume total constante0V2V3V4V5V6Volume de amostra VxVolume dos bales VTConcentrao do adicionado em cada balo Concentrao do analito proveniente da amostra, em cada balo

1.10.1 Mtodo da adio de padroVolume de amostra VxVolume dos bales VTConcentrao do adicionado em cada balo Concentrao do analito proveniente da amostra, em cada baloa/byC1 C2 C3 C4 C5 C6

1.10.2 Mtodo do padro interno padro interno: deve produzir um sinal semelhante ao do analito em muitos aspectos, mas suficientemente diferente para que o instrumento os distinga.Deve ser adicionado em igual quantidade amostra, padres e branco, ou ser um constituinte principal das amostras e padres, por forma a que a sua concentrao seja to grande que se possa supor que no varia em todos os casos.Pode compensar erros aleatrios e sistemticos. especialmente til em anlises onde a quantidade de amostra ou a resposta do instrumento varia entre anlises, por razes difceis de controlar.analitopadro internofactor de resposta

1.11 Propagao de incertezas Suponha que para dispensar 20 mL utiliza uma pipeta de 20 mL classe A (10.00 mL 0.02 mL). Calibrou essa pipeta no laboratrio fazendo 10 medies e obteve:mdia 9.992 mL e desvio padro 0.006 mL.

Este volume 9.992 mL uma melhor estimativa do volume esperado que o dado pelo fabricante e a calibrao permitiu-nos reduzir a incerteza de (0.02 mL) para (0.006 ml).

NumberVolume (mL)NumberVolume (mL)110.00269.98329.99379.99139.98489.99049.99699.98859.989109.999

1.11 Propagao de incertezas Suponha que para dispensar 20 mL faz duas medies com uma pipeta de 20 mL classe A. Se o volume e incerteza no volume da pipeta para uma nica medio for (9.9220.006) mL, qual o volume e incerteza quando se usa duas vezes?Se somarmos os volumes e as incertezas:(9.992 mL + 9.992 mL) (0.006 mL + 0.006 mL) = (19.984 0.012) mL fcil perceber que estamos a sobreestimar a incerteza, uma vez que estamos a assumir que a incerta a maior possvel e que as duas tm o mesmo sentido. Outro extremo ser supor que uma positiva e a outra negativa:(9.992 mL + 9.992 mL) (0.006 mL - 0.006 mL) = (19.984 0.000) mLO que constituir uma subestimativa da incerteza. Como fazer?

1.11 Propagao de incertezas Adio e subtraco Multiplicao e diviso

1.11 Propagao de incertezas Suponha que para dispensar 20 mL faz duas medies com uma pipeta de 20 mL classe A. Se o volume e incerteza no volume da pipeta para uma nica medio for (9.9220.006) mL, qual o volume e incerteza quando se usa duas vezes?Voltemos ao problema anterior:Usando os dados do fabricante: 10,00 mL 0,02 mL:

V= 10,00 mL + 10,00 mL = 20.00 mL

2. Usando os dados da calibrao da pipeta:

V= 9,992 mL + 9,992 mL = 19,984 mL

Arredondando os valores, viria 20,00 mL 0,03 mL usando os valores dados da tolerncia do material e 19,98 0,01 mL usando os dados da calibrao da pipeta.

1.11 Propagao de incertezas Quando em presena de um intervalo de confiana (a a p%) divide-se o valor de a pelo valor correspondente da distribuio normalAntes do clculo da incerteza combinada, todas as contribuies devem ser expressas como desvios padroExemplo: uma especificao declara que a leitura de uma balana est dentro do intervalo 0,2 mg com 95% de confianaEnto s=0,2/1,96=0,12. Se os limites a forem dados sem intervalo de confiana e houver motivos para pensar que os valores extremos so provveis, em geral apropriado assumir uma distribuio Retangular com um desvio padro a/3Exemplo: um balo volumtrico de 10 mL certificado numa faixa de 0,2 ml. Ento s=0,2/3=0,12 mL

1.11 Propagao de incertezas 3. Se os limites a forem dados sem intervalo de confiana e houver motivos para pensar que os valores extremos so improvveis, em geral apropriado assumir uma distribuio triangular com um desvio padro a/6Exemplo: um balo volumtrico de 10 mL certificado numa faixa de 0,2 ml, mas as verificaes internas de rotina mostraram que valores extremos so raros. Ento s=0,2/6=0,08 mL

1.11 Clculo do intervalo de confiana Esta fase corresponde, conforme equao abaixo, a multiplicar a incerteza padro combinada pelo fator de abrangncia k, escolhido a fim de obter uma incerteza expandida.A incerteza expandida fornece um intervalo que abrange uma grande frao da distribuio de valores que podem razoavelmente ser atribudos ao resultado.U = k.ucU = incerteza expandida; k = factor de abrangncia; uc = incerteza combinadaApresentao do resultado: R = q U

Para quase todos os fins se recomenda k=2 (95%)

Ateno que este valor pode ser insuficiente quando a incerteza combinada se baseia em observaes estatsticas com num nmero pequeno de graus de liberdade (menos de seis).Quando a incerteza combinada for dominada por uma nica contribuio com menos que seis graus de liberdade, recomenda-se que k seja o valor de t-student para uma distribuio bimodal para o nmero de graus de liberdade associado a essa contribuio e para o nvel de confiana exigido (em geral 95%).

Por falta de tempo no iremos aprofundar este problema do clculo dos graus de liberdade. Fica o alerta para o futuro.

1.11 Clculo do intervalo de confiana Exerccio: O valor de magnsio da amostra diluda, obtido por emisso atmica foi calculado por si. Chegou concluso que era 20,4 ppm com um s=0.125 (5 padres). Ora a amostra original tinha sido diluda pipetando 5,00 mL com uma pipeta que o fabricante diz ter uma tolerncia de 0,02 mL para um balo de 50,00 mL onde se l que exibe 0,06 mL.Calcule a concentrao de magnsio na amostra original, no se esquecendo de indicar o intervalo de confiana.

Nota: No caso das incertezas associadas aos Volumes medidos, vamos considerar apenas a componente de incerteza associada s suas tolerncias, pois o Laboratrio trabalha num ambiente climatizado, cuja oscilao/variao da temperatura em torno da de referncia (normalmente de 20C) inferior ou igual a 3 C, verificando-se uma diferena entre a temperatura ambiente e a temperatura de referncia das tolerncia (marcada nos materiais volumtricos e normalmente de 20C) que no ultrapassa os 3C. Alm disso, no foi considerada a Variabilidade associada a um conjunto de medies de volumes (n), pelo facto desta componente de incerteza ser includa no grupo de componentes de preciso

1.11 Clculo do intervalo de confiana (Resoluo do exerccio) Como a tolerncia do balo de 50 mL de 0,06 mL a incerteza padro que lhe est associada, admitindo uma distribuio rectangular ser dada por : 0,06/3=0, 104mL1. Incertezas padro associadas aos volumesClculo da concentrao da amostra C=20,4x50/5=204 ppmComo a tolerncia da pipeta de 5 mL de 0,02 mL a incerteza padro que lhe est associada, admitindo uma distribuio rectangular ser dada por : 0,02/3=0, 035mL2. Propagao das incertezas

1.11 Clculo do intervalo de confiana (Resoluo do exerccio) 3. Intervalo de confiana

1.12 Critrios numricos para seleccionar o mtodo analtico PrecisoyConcentrao xxxxxxxxxxxxxerros aleatriosdesvio padro absolutodesvio padro relativodesvio padro da mdiaCoeficiente de variaoVarinciaExactidoProximidade ao valor realerros sistemticos

Limite de deteco: concentrao do analito que d origem a um sinal igual ao sinal do branco yb mais trs vezes o desvio padroSensibilidade analticadepende da concentraoLimite de quantificao

Fizeram-se uma srie de medies de absorvncia de um branco durante uma anlise espectrofotomtrica para determinar a pureza de comprimidos de aspirina. As leituras foram: 0,002 0,000 0,008 0,006 e 0,003. Sabendo que uma soluo padro de aspirina de 1ppm d origem a uma leitura de absorvncia de 0,051, qual o limite de deteco? LD=conc do analito que d um sinalPadro 1 ppmsinal relativoLDA que corresponderia um sinal deacima do brancoFizeram-se uma srie de medies de absorvncia de um branco durante uma anlise espectrofotomtrica para determinar a pureza de comprimidos de aspirina. As leituras foram: 0,002 0,000 0,008 0,006 e 0,003. Sabendo que uma soluo padro de aspirina de 1ppm d origem a uma leitura de absorvncia de 0,051, qual o limite de deteco?

A definio de Limite de Deteco arbitrria, e torna-se necessrio defini-lo sempre que o mesmo apresentado Em presena de uma regresso linear sb pode ser substitudo por sy/x e e yb por a (ordenada na origem) Nota: no mtodo dos mnimos quadrados cada ponto, incluindo o branco, tem uma variao na direco dos ys que segue uma distribuio normal substituir sb por syx

Gama dinmica: desde a a concentrao mais baixa que se pode quantificar (limite de quantificao LOQ) at concentrao para a qual a curva de de calibrao se afasta da linearidade (LOL)LOQLOL

Teste selectivo ou reaco selectiva: pode ocorrer com outras substncias, mas exibe um grau de preferncia pela substncia de interesseTeste especfico ou reaco especfica: ocorre apenas com a substncia de interesseA B CanalitointerferentesCoeficiente de selectividade de A em relaco a B

1.11 Validao do mtodopadro interno: deve produzir um sinal semelhante ao do analito em muitos aspectos, mas suficientemente diferente para que o instrumento os distinga.Deve ser adicionado em igual quantidade amostra, padres e branco, ou ser um constituinte principal das amostras e padres, por forma a que a sua concentrao seja to grande que se possa supor que no varia em todos os casos.Pode compensar erros aleatrios e sistemticos. especialmente til em anlises onde a quantidade de amostra ou a resposta do instrumento varia entre anlises, por razes difceis de controlar.analitopadro internofactor de resposta

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