introduÇÃo Às tÉcnicas microbiolÓgicas · 1 maria antonia malajovich / biotecnologia: ......

INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS

MICROBIOLÓGICAS

Dra. Maria Antonia Malajovich

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Maria Antonia Malajovich / Biotecnologia: ensino e divulgação (http://bteduc.com)

INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS (2015)

Dra. Maria Antonia Malajovich Biotecnologia: ensino e divulgação http://bteduc.com

PROGRAMA

Unidade 1 Apresentação do curso - O laboratório de Microbiologia O nascimento da Microbiologia: o legado de Semmelweiss; a obra de Pasteur; a teoria dos germes. Normas de biossegurança. Boas práticas de laboratório.

A1. A distribuição dos microrganismos no ambiente A2. O lavado das mãos A3. Trabalhar mantendo a assepsia

Unidade 2 O cuidado do material básico no laboratório microbiológico. A composição dos meios de cultivo, técnicas bacteriológicas; condições de incubação, esterilização; descarte do material utilizado.

A4. O pH do meio e o crescimento microbiano Unidade 3 Microscopia (revisão) Características morfológicas de bactérias, fungos e algas. Ultraestrutura, formas latentes.

A5. Observações microscópicas de bactérias – métodos de coloração A6. Observação e cultivo de fungos e algas

Unidade 4 Características bioquímicas dos microrganismos: exigências nutricionais, produção de enzimas. Os sistemas miniaturizados de diagnóstico. Cultivo e crescimento de microrganismos. Curva de crescimento típica. As coleções de cultura (pesquisa)

A7. Obtenção de uma cultura bacteriana pura A8. Caracterização bioquímica de microrganismos A9. O número de microrganismos de uma cultura

Unidade 5 Fundamentos do controle dos microrganismos: agentes físicos (revisão) e agentes químicos. Avaliação do poder antimicrobiano de desinfetantes e antissépticos. O modo de ação dos antibióticos. Resistência aos agentes químicos. O controle dos microrganismos no cotidiano.

A10. Ação da luz ultravioleta A11. Ação dos desinfetantes A12. Ação dos produtos cosméticos (desodorantes) A13. Ação dos produtos cosméticos (dentifrícios) A14. Antibióticos e antifúngicos

3 INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS


O LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

PRECAUÇÕES BÁSICAS

O local de trabalho deve ser desinfetado com álcool antes do início de cada sessão de trabalhos práticos, assim como ao termo das manipulações.

Antes e depois de qualquer manipulação, lavar as mãos e passar álcool.

Tomar cuidado com os cabelos.

No caso de ferimento acidental por material séptico, desinfetar-se imediatamente com álcool 70oGL.

Não esquecer que toda picada ou ingestão acidental oferece risco.

OS RECIPIENTES UTILIZADOS

Os recipientes de zinco ou cobre não devem ser utilizados. Esses metais se dissolvem nos meios de cultura, que então se tornam tóxicos. Os recipientes de vidro são adequados.

As placas de Petri plásticas, estéreis, são atualmente cada vez mais empregadas. Depois de esterilizadas, as placas de vidro podem ser utilizadas novamente.

Os meios de cultura devem ser acondicionados em tubos de diversos tamanhos, conforme o volume desejado. Sua distribuição nas placas de Petri é feita após a esterilização das placas vazias.

Os tubos podem ser fechados com algodão em rama, por tarraxas metálicas ou vedados por simples cápsulas metálicas móveis.

Tanto os recipientes como suas tampas devem estar rigorosamente limpos. Na limpeza, deve-se evitar a utilização de detergentes que possam persistir após o enxugamento. Terminada a lavagem, o pH dos meios não deverá sofrer modificações muito apreciáveis após agitação nos recipientes.

PIPETADORES (PERAS)

As peras são de borracha e possuem três “bolinhas” com as letras “A”, “S” e “E”. A primeira serve para retirar todo o ar da pera antes de esta ser acoplada à pipeta; a segunda serve para fazer o líquido subir e a última para expulsar o líquido. Além disso, para expulsar a última gota, quando se está trabalhando com pipetas totais, é só apertar o orifício na extremidade lateral da pêra (ao lado da “bolinha” E).

Procedimento

1. Aperte simultaneamente a letra “A” e a pêra ao mesmo tempo para retirar todo o ar.

2. Introduza a pêra na parte superior da pipeta.

3. Leve a pipeta até o fundo do recipiente, com cuidado para não bater a parte inferior no fundo.

4. Suga-se a água contida no béquer apertando a letra “S”.

5. Aferir elevando a pipeta na altura dos olhos, verificando qual a quantidade sugada.

6. Levar a pipeta até o recipiente de destino e deixar escoar (aperta-se a letra “E”) pela parede lateral.

7. Para expulsar a última gota, quando se está trabalhando com pipetas totais, apertar o orifício na extremidade lateral, ao lado da bolinha E.

Atenção: cuidado redobrado na hora de retirar a pera da pipeta!



OS INSTRUMENTOS DE TRABALHO



NORMAS DE SEGURANÇA

Segundo Pedro Teixeira e Silvio Valle, no livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.

As boas práticas no laboratório consistem de um conjunto de normas e procedimentos de segurança, que visam minimizar os acidentes e aumentar o nível da consciência dos profissionais que trabalham em laboratórios de pesquisa. Abaixo, encontram-se listadas algumas das principais normas de Biossegurança:

Lavar as mãos antes e após a jornada de trabalho;

Nunca pipetar com a boca. Usar, sempre que possível, os pipetadores automáticos ou as peras de borracha;

No laboratório, não fazer refeições ou preparar alimentos, não beber, não fazer higiene bucal ou maquiagem, não barbear, não fumar, não roer as unhas;

Os artigos de uso pessoal devem ser guardados em locais apropriados, nunca no laboratório;

Não trabalhar com calçados abertos, ou seja, use sapatos que protejam inteiramente os pés;

Cuidado com a formação de aerossóis e respingos é importante. Ter sempre um protocolo com procedimentos de segurança para estes casos;

Não trabalhar com material patogênico se houver ferida na mão ou no pulo;

Quando do uso de luvas, evitar abrir portas e atender telefone;

Durante a rotina de trabalho, o profissional deverá utilizar roupas apropriadas ao trabalho desenvolvido como, por exemplo, aventais, jalecos e outros uniformes afins;

O responsável pelo laboratório deverá criar uma rotina de procedimentos em Biossegurança, enfocando principalmente os riscos a que está exposta sua equipe;

As bancadas de trabalho deverão ser lavadas e desinfetadas antes da rotina de trabalho;

Evitar trabalhar sozinho no laboratório.



LOUIS PASTEUR E A TEORIA DOS GERMES

UM POUCO DE HISTÓRIA

Depois de certo tempo, um caldo de carne exposto ao ar apodrece. A observação microscópica mostra muitos tipos de microrganismos. Já que eles não são observados no caldo recém-cozido, podemos nos perguntar: de onde eles vieram? Até 1850-1860 se admitia a teoria da geração espontânea, isto é que os microrganismos podiam surgir espontaneamente em consequência da alteração dos alimentos. Baseado em seus estudos sobre as fermentações, Louis Pasteur considera inadequada esta explicação. Para ele, a alteração dos alimentos é uma consequência da presença de microrganismos. Mas, para convencer os seus contemporâneos, Pasteur deverá demonstrar de maneira inequívoca a sua teoria. A POEIRA DO AR Em 1859 Pasteur analisou o ar de uma rua de Paris. A observação microscópica da poeira acumulada em um chumaço de algodão mostrou a presença de centenas de microrganismos (= germes). A partir desse momento Pasteur inicia uma série de experiências que demoliram a teoria da geração espontânea.

PRIMEIRA EXPERIÊNCIA: Um líquido putrescível esterilizado se conserva indefinidamente se não estiver em contato com o ar. Crítica dos defensores da geração espontânea: em ausência de ar, os germes não se desenvolvem.

SEGUNDA EXPERIÊNCIA: Um líquido putrescível esterilizado se conserva indefinidamente se estiver em contato com ar esterilizado.



TERCEIRA EXPERIÊNCIA: Um líquido putrescível esterilizado se conserva indefinidamente em presença de ar filtrado ao longo de um tubo curvo. Por conseguinte, os germes não surgem por geração espontânea. Eles se encontram no ar e caem nos líquidos onde se desenvolvem alterando o meio. Sendo assim, qual seria a distribuição dos germes na atmosfera?

QUARTA EXPERIÊNCIA: Os germes estão distribuídos na atmosfera de forma desigual.

LUGAR DE EXPOSIÇÃO

NÚMERO DE FRASCOS CONTAMINADOS

Paris 20/20

Campo 8/20

Montanha 1/20

Crítica dos defensores da geração espontânea as terceira e quarta experiências: os resultados obtidos se devem ao fato de ter até agora usado líquidos fervidos longamente. QUINTA EXPERIÊNCIA: O sangue e a urina extraídos de um organismo sadio não se alteram quando conservados ao abrigo do ar. UMA REVOLUÇÃO CIENTÍFICA, TECNOLÓGICA E SOCIAL As evidências experimentais apresentadas por Pasteur levaram seus contemporâneos à substituição da teoria da geração espontânea pela teoria dos germes. Admite-se que os germes presentes no meio ambiente são responsáveis pelas alterações dos meios orgânicos (fermentações, putrefação, doenças). A teoria dos germes abriu novos caminhos na utilização industrial dos processos fermentativos, na conservação dos alimentos e na luta contra as doenças infecciosas.



A1. A DISTRIBUIÇÃO DOS MICRORGANISMOS NO AMBIENTE

"Provavelmente, as primeiras formas de microrganismos habitavam a água. Com o passar do tempo, o solo

se tornou infectado e, agora, aí se encontra a maior parte deles. Do solo passam ao ar pelo vento, que levanta

partículas de poeira nas quais os microrganismos estão presentes. Desde que vivemos em contato com o ar,

aspiramos enormes quantidades de microrganismos cada vez que respiramos. O ar deposita-os em nosso

cabelo, roupa e pele. Do ar passam para nosso alimento e bebida. Estamos completamente cercados por

microrganismos e precisamos aprender a viver com eles. Felizmente, a maior parte não causa mal.

Relativamente são poucos que causam prejuízos. É contra os que causam doenças ou estragam nossos

alimentos que devemos nos prevenir" (Neder R.N. Microbiologia, São Paulo, Ed. Nobel, 1992).

Nesta atividade estudaremos a distribuição dos microrganismos em diferentes ambientes.

MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri contendo meio nutriente estéril, 1 caneta de retroprojetor.

PROCEDIMENTO

1. Escolher um ponto da escola para colocar a placa de Petri.

2. Rotular a placa com a caneta de retroprojetor, indicando o lugar onde esta será exposta. No lugar

escolhido, destampar a placa como indicado no esquema, aguardar 15 minutos e fechá-la novamente.

3. Incubar a placa no laboratório, a temperatura ambiente, até observar o crescimento de colônias

microbianas.

4. Na aula seguinte, contar o número de colônias na placa.

5. Reunir os dados dos outros grupos para comparar o crescimento de microrganismos (número de

colônias) nas placas expostas em diferentes lugares.



RESULTADOS

1. Quantas colônias se desenvolveram na placa?

2. Complete a tabela com os dados da turma.

Tabela: Número de colônias em cada placa.

Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8

Lugar de exposição

N0 de colônias

3. Compare os seus resultados com os dos outros grupos.

Onde foi exposta a placa que apresentou um número maior de colônias? Onde foi exposta a placa

que apresentou um número menor de colônias?

4. Em função dos resultados obtidos, qual a distribuição dos microrganismos no ambiente

estudado?



A IMPORTÂNCIA DO LAVADO DAS MÃOS

Pesquisar na Internet os seguintes temas:

o Ignaz F. Semmelweiss, uma vida trágica. o Mary “a tifóidea”, uma mulher perigosa. o Quais os germes em nossas mãos? Pesquisar as imagens disponíveis na Internet (What germs are in your

hands).

Analisar o procedimento recomendado pela Organização Mundial da Saúde. Duração 40 a 60 segundos, ou dois “parabéns pra você”.



A2. COMO LAVAR AS MÃOS

Objetivo: verificar a eficiência do lavado das mãos

Material

Por aluno: 1 placa de Petri contendo ágar nutriente por aluno.

Por grupo: pia com água e sabão, álcool gel para as mãos, 1 pilot.

Procedimento

Trabalhar em dupla. Um dos alunos será responsável por abrir e fechar a placa, enquanto o segundo realiza o procedimento.

1. Anotar na parte superior da placa de Petri contendo meio nutriente o nome do aluno. Na parte inferior, delimitar com o pilot quatro regiões: A, B, C e D.

2. Com muito cuidado abrir a placa de Petri para que o aluno apoie o dedo polegar da mão dominante na superfície do ágar. Fechar a placa.

3. Lavar as mãos com água. Deixar secar sem tocar absolutamente nada.

4. Com a ajuda do colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor B. Fechar a placa.

5. Repetir os itens 3 e 4, lavando as mãos com água e sabão e apoiando o polegar da mão dominante no setor C.

6. Repetir os itens 3 e 4, esfregando as mãos com álcool e apoiando o polegar da mão dominante no setor D. Sempre com a ajuda do/a colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor C. Fechar a placa.

7. Em outra placa, o colega repetirá o procedimento, invertendo os roles.

RESULTADOS Observar o crescimento microbiano nas quatro regiões das placas e registrar os resultados.

Aluno Antes de lavar as mãos

Depois de lavar as mãos

Água Água e sabão Álcool

-

(0) = nenhum crescimento; (+) pouco crescimento; (++) muito crescimento.

Comparar esses resultados com os que foram obtidos pelas outras duplas.

Qual o tratamento mais eficiente? O álcool é suficiente para desinfetar as mãos? Pesquisa

Nem todos os germes são perigosos. Qual a diferença entre a flora microbiana local e a flora transiente? Qual é perigosa?



A3. TRABALHAR MANTENDO A ASSEPSIA

Como os microrganismos se encontram em todas as partes, resulta complicado conservar a esterilidade do material e dos meios durante as manipulações efetuadas no laboratório. Porém, devemos aprender a trabalhar em condições de esterilidade já que esta é a única forma de garantir que o único tipo de microrganismo a crescer seja aquele que foi inoculado. Nesta atividade distribuiremos caldo de carne em condições estéreis. Material Por aluno: 1 tubo com caldo de carne (10%) estéril, 1 pipeta esterilizada, 3 tubos estéreis. Por grupo: 1 grade, 1 pote, bico de Bunsen. Procedimento 1. Com a pipeta, distribuir 2 mL de caldo de carne estéril em cada um dos três tubos. 2. Incubar a temperatura ambiente. Resultados Houve contaminação em algum tubo? Em qual? Discussão 1. Poderia dizer em que momento houve contaminação do material? Justifique sua resposta 2. O que se entende por “Boas Práticas de Laboratório”?



MICRORGANISMOS: NÍVEIS DE RISCO E BIOSSEGURANÇA

Textos extraídos do livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", de Pedro Teixeira e Silvio Valle, Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, 1996. “Os agentes biológicos apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente. Por esta razão, é fundamental montar uma estrutura que adapte a prevenção aos riscos encontrados nos laboratórios de pesquisa. Os agentes biológicos se dividem em quatro grupos, onde são considerados como critérios: a patogenicidade para o homem; a virulência; o modo de transmissão, a endemicidade e a existência ou não de profilaxia e de terapêutica eficazes. Segundo a resolução nº1 de 1988 do Conselho Nacional de Saúde, Cap. X art. 64, atualizada na portaria n0 1914 de 2011 do Ministério da Saúde, os microrganismos que afetam o homem, os animais e as plantas podem ser classificados em grupos de risco de 1 a 4 por ordem crescente.

Classe de risco 1 (baixo risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos conhecidos por não causarem doenças no homem ou nos animais adultos sadios. Exemplos: Lactobacillus sp. e Bacillus subtilis. Classe de risco 2 (moderado risco individual e limitado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo potencial de propagação na comunidade e de disseminação no meio ambiente é limitado, e para os quais existem medidas terapêuticas e profiláticas eficazes. Exemplos: Schistosoma mansoni e o vírus da Rubéola. Classe de risco 3 (alto risco individual e moderado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos que possuem capacidade de transmissão por via respiratória e que causam patologias humanas ou animais, potencialmente letais, para as quais existem usualmente medidas de tratamento e/ou de prevenção. Representam risco se disseminados na comunidade e no meio ambiente, podendo se propagar de pessoa a pessoa. Exemplos: Bacillus anthracis e o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Classe de risco 4 (alto risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos com grande poder de transmissibilidade por via respiratória ou de transmissão desconhecida. Até o momento não há nenhuma medida profilática ou terapêutica eficaz contra infecções ocasionadas por estes. Causam doenças humanas e animais de alta gravidade, com alta capacidade de disseminação na comunidade e no meio ambiente. Esta classe inclui principalmente os vírus. Exemplos: Vírus Ebola e o vírus Lassa.” Pesquisar: em que grupo de risco é classificado o agente da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis)? O nível de segurança (Biosafety Level) dos laboratórios depende dos microrganismos com os quais se trabalhe. A estrutura e os métodos de trabalho são diferentes em cada nível. Veja na apresentação do filme OUTBREAK (1996).

NO LABORATÓRIO DE ENSINO SÓ SE TRABALHARÁ COM MICRORGANISMOS CLASSIFICADOS NO NÍVEL DE RISCO 1



TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: SEMEADURA EM TUBO

Toda vez que se fizer semeadura é interessante seguir as regras que recomendamos, para que o material não seja contaminado. Tomando todas as precauções de esterilidade, como flambado das bocas dos tubos, alças de platina, etc., uma alçada do material a ser semeado é introduzida no tubo. Deixar esse material na parede interna do tubo, logo acima de líquido. Recolocar o tampão, após flambar a boca do tubo e mexer por rotação para permitir completa mistura do meio com o material semeado. A alça e o fio de platina devem ser flambados antes de depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama duas a três vezes. O material não deve ser colhido com alça quente; esta deve ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio.

A posição exata para flambar a alça é em ângulo de 45·, em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Toda vez que se fizer semeaduras utilizando-se tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este nunca deve ser deixado sobre a mesa de trabalho; deve ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão direita.



SEMEADURA EM TUBOS COM MEIO LÍQUIDO



A4. O pH DO MEIO E O CRESCIMENTO MICROBIANO

Para a maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento se localiza entre 6,5 e 7,5. Embora poucos microrganismos possam desenvolver-se nos limites extremos de pH, as variações mínimas e máximas estão entre pH = 4 e pH = 9. Quando as bactérias são cultivadas num meio originalmente ajustado a um pH determinado (pH = 7, por exemplo), é provável que este pH se altere, como resultado das substâncias produzidas pelo germe, que podem ser tanto ácidas como básicas. Objetivo: Observar como o pH afeta o crescimento microbiano e como o crescimento microbiano afeta o pH. Material

o Teste com E.coli: 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 4, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 6, 1 tubo com caldo nutriente estéril, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 10. Um estante, 1 frasco com desinfetante, indicador universal, 1 alça, bico de Bunsen, caneta pilot, cultura de E. Coli.

o Teste com S. Cerevisiae: Os mesmos elementos, com meio nutriente sacarosado e um cultivo de S. Cerevisiae.

o Controles: Prever duas séries de tubos como controles da mudança de cor.

Procedimento 1. Rotular os tubos (E.coli ou S.Cerevisiae).

2. Colocar 6-8 gotas de indicador em cada tubo.

3. Em condições assépticas, inocular os tubos correspondentes com E. Coli ou com S. Cerevisiae.

5. Incubar os tubos a temperatura ambiente por 24 a 48 horas. Resultados: 1. Complete a tabela indicando a cor observada nos tubos:

TUBOS pH4 pH6 pH8 pH10

E.coli

Controle

S.Cerevisiae

Controle

2. Como se sabe que os microrganismos cresceram? Como se sabe que houve alguma mudança de pH? Discussão 1. Em função dos resultados da turma, qual dos dois microrganismos cresce entre valores mais amplos de pH? 2. Para um microrganismo, qual seria a vantagem de crescer em uma faixa de pH mais ampla? 3. Sugira alguma razão para as mudanças de pH observadas.

4. Pesquise alguma aplicação ligada à tecnologia de alimentos.



MICROSCOPIA / NORMAS DE USO DOS MICROSCÓPIOS

1. Ligue o microscópio.

2. Aumente a intensidade da luz até uma posição média.

3. Abaixe a platina e coloque a lâmina no chariot, com a lamínula voltada para cima.

4. Ajeite a distância entre as lentes oculares, de maneira a trabalhar em posição confortável. A menos de

trabalhar individualmente, evite ajustar as lentes oculares a seus olhos.

5. Torça o parafuso macrométrico até chegar bem próximo da lâmina. (ATENÇÃO: Esta operação deverá ser

realizada pelo lado de fora e não pela ocular, pois assim procedendo você evitará quebrar a lamínula,

estragando o material e perdendo tempo).

6. Olhando pela ocular e torcendo o parafuso macrométrico no sentido contrário, você suspenderá

vágarosamente o canhão, até ver alguma coisa. Se não aparecer nada, é por que você não centralizou o

corte. Use os parafusos do charriot para mexer a lâmina e coloque a parte corada bem na passagem da

luz.

7. A focalização final deverá ser feita com o micrométrico, torcendo-o para frente e para trás até conseguir

o ponto onde a imagem tem maior nitidez, o foco. Não gire o parafuso micrométrico indefinidamente

para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o

foco e para as observações de profundidade.

8. Certifique-se de que a região que quer observar se encontra no médio do campo antes de girar o revolver

e passar para a objetiva de médio aumento (10x). Melhore o foco se for necessário. As objetivas secas

são parafocais, ou seja, se a estrutura está focalizada com uma, estará muito perto de sê-lo com outras.

9. Repita o mesmo procedimento para usar o maior aumento (40x). Se você não estiver conseguindo foco,

não force o microscópio. Volte para o menor aumento, veja se a lamínula está voltada para cima e tente

outra vez. Se não conseguir, chame o professor.

10. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a

objetiva de menor aumento e eleve a platina. Coloque a intensidade de luz no mínimo, verifique que o

condensador se encontra elevado e o diafragma aberto. Desligue o microscópio.

Observação: A finalidade do condensador é a de reunir toda a luz num feixe estreito, mas de grande

intensidade luminosa. Junto ao condensador existe o diafragma, que funciona da mesma maneira que o

diafragma das máquinas fotográficas, ou melhor, que funciona como sua íris, aumentando ou diminuindo o

tamanho da pupila, regulando assim a entrada de luz. Só mexa no condensador e no diafragma em condições

especiais. Normalmente o condensador funciona elevado e o diafragma aberto.



LEMBRE QUE o O aumento de uma imagem vista ao microscópio óptico é sempre o produto dos aumentos fornecidos

pela ocular, multiplicado pelos aumentos fornecidos pela lente objetiva usada. Portanto, se você estiver usando uma ocular de 10X e uma objetiva de 45X, a imagem observada estará aumentada quantas vezes? ________

o Toda vez que for usar o microscópio, use sempre a objetiva de menor aumento em primeiro lugar, pois

ela lhe dará maior visão do material. Em seguida, use o segundo aumento. Repare que quanto maior for o aumento, menor será a área observada.

o A objetiva 100X deverá ser usada em microscopia de imersão, isto é, coloca-se sobre a lâmina uma gota de óleo de cedro e sobre esta gota, mergulha-se a objetiva. A função do óleo de cedro é proporcionar maior iluminação ao canhão evitando a dispersão dos feixes luminosos.

OS CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO 1. Para transportá-lo use as duas mãos, uma segurando o braço do microscópio e a outra o sustentando pela

base. NUNCA carregue o aparelho usando apenas uma das mãos!!! 2. Não gire o micrométrico indefinidamente para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado

mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observações de profundidade. 3. Não passe os dedos nas lentes para limpá-las. O vidro das lentes é facilmente arranhável (mais que o vidro

comum), por isso, só devemos usar um papel especial, bem macio, para limpá-las. 4. Evite molhar o microscópio enquanto estiver trabalhando. Se isso ocorrer, seque-o com um pano bem

macio. 5. Não desmonte qualquer parte do microscópio. Este é um instrumento muito caro, portanto, todo cuidado

é pouco. 6. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a

objetiva de menor aumento e abaixe o canhão. Guarde o aparelho num local adequado, tendo o cuidado de verificar se está pronto para ser usado.



A5. OBSERVAÇÃO E CULTIVO DE FUNGOS E ALGAS

5.1. OBSERVAÇÃO DE LÂMINAS PRONTAS 5.2. MONTAR LÂMINAS A PARTIR DE UM CULTIVO DE ALGAS EM MEIO LÍQUIDO Material: Lâminas, lamínulas, papel toalha, papel de filtro, pinça. Procedimento.

1. Colocar sobre uma lâmina limpa e desengordurada uma gota de líquido. 2. Tomar uma lamínula, também limpa e desengordurada, e encostar um dos lados na lâmina, bem próximo à gota, de modo que o líquido se espalhe em toda extensão da lamínula. 3. Vagarosamente, abaixar a lamínula, só a soltando quando o ângulo formado entre a lâmina e a lamínula for bem pequeno. Procedendo assim, se evitará a formação de bolhas de ar que poderão prejudicar o trabalho. 4. Se houver excesso de água por fora da lamínula ou se a lamínula estiver frouxa, absorver o excesso de água com papel de filtro. 5. Repetir o procedimento até conseguir montar lâminas sem bolhas.

Pesquisar: Qual a composição de um meio de cultivo líquido para algas? Poderíamos cultivar algas em meio

sólido?



5.3. MONTAR LÂMINAS A PARTIR DE UM CULTIVO DE FUNGOS EM MEIO SÓLIDO Os fungos e seus esporos encontram-se, nas mais diversas condições ambientais. A colheita, isolamento e cultura não apresentam, por isso, dificuldades. O problema é, ao contrário, o de não deixar contaminar por fungos as culturas de outros organismos, especialmente de bactérias. Os fungos podem manter-se e crescer no laboratório de 3 maneiras:

o No substrato original, como pão, folhas, frutas em decomposição, corpos de insetos

o Em ou sobre meios fluídos de composição conhecida (cite um exemplo)

o Em meios nutritivos sólidos, tendo o ágar como agente de solidificação. Estes meios podem encontrar-se já preparados nas firmas especializadas. Porém, no laboratório resulta, às vezes, mais econômico usar um meio como o ágar de farinha de milho que se prepara como a seguir:

Misturar 6,0 g de farinha de milho com água até obter uma papa e ferver até obter um mingau. Filtrar por gaze. Juntar 1,5 g de ágar. Aquecer até o ágar estar dissolvido. Completar o volume até 100 mL com água, distribuir em tubos pequenos e esterilizar na autoclave (ou na panela de pressão) durante 20 minutos (121oC).

A cultura em lâminas permite acompanhar o desenvolvimento de um fungo sem que os esporos se espalhem pelo ar contaminando outras culturas e eventualmente, desencadeando reações alérgicas. O procedimento mais simples é o de colocar um pedaço de fita durex sobre as hifas e cola-lo na lâmina. Contudo, se quisermos observar o crescimento dos fungos, o melhor procedimento é o seguinte: A. Inocular um tubo de ágar nutriente, liquefeito e resfriado (45-50oC), com uma cultura de fungos em pão

ou fruta; rolar o tubo entre as palmas da mão para distribuir bem o inoculo; B. Flambar uma lâmina e uma lamínula, pingar uma gota da cultura na lâmina e colocar a lamínula de tal

maneira que o ágar se espalhe até mais ou menos 5 mm de seus bordos; C. Colocar a lâmina em uma placa de Petri contendo uma bolota de algodão carregado de água; a umidade

do algodão retarda o ressecamento do meio; incubar por 2 a 4 dias à temperatura ambiente. D. Fazer observações microscópicas periódicas e desenhar – ou fotografar - o aspecto dos fungos na cultura.

Identificar as estruturas.



A6. OBSERVAÇÕES MICROSCÓPICAS DE BACTÉRIAS – MÉTODOS DE COLORAÇÃO

6.1. EXAME MICROSCÓPICO DE LÂMINAS PRONTAS 6.2. MÉTODOS DE COLORAÇÃO Material Lâminas de vidro, algodão, álcool 95 o GL, álcool 90 oGL, papel absorvente, cultura de Bacillus megatherium, padrões Gram negativos (G-) e Gram positivos (G+), soluções corantes (azul de metileno, cristal violeta, fucsina ou safranina, lugol), nigrosina (= tinta da índia), bico de Bunsen, alça de Níquel-cromo, microscópio. Procedimento

ATENÇÃO!!! Antes de iniciar o trabalho, limpe e desengordure as lâminas com um pedaço de algodão embebido em álcool a 90 o GL. Quando finalizar o trabalho limpe cuidadosamente a objetiva de imersão do microscópio com algodão embebido em xilol ou solução éter-clorofórmio.

A - PREPARO DOS ESFREGAÇOS 1. Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão mista de bactérias na lâmina identificada com o nome

do aluno.

2. Deixar secar espontaneamente.

3. Fixar o esfregaço à lâmina, segurando-a com um pregador de madeira e passando-a três vezes sobre a chama do bico de Bunsen, com a parte do esfregaço para cima.

B - MÉTODO DE COLORAÇÃO SIMPLES 1. A lâmina fixada é tratada com solução de azul de metileno durante 1 a 2 minutos.

2. Lavar ligeiramente com água. Escorrer.

3. Enxugar entre dois papéis de filtro, com cuidado sem esfregar.

4. Adicionar sobre o esfregaço corado uma pequena gota de óleo de cedro e examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).

5. Comentar brevemente as observações. NOTA: Com outros corantes como o cristal violeta ou a fucsina, o procedimento pode ser o mesmo bastando alterar o tempo de tratamento (2 a 60 segundos com cristal violeta e 15 a 30 segundos com fucsina).



C. MÉTODO DE COLORAÇÃO DE GRAM 1. A lâmina fixada é tratada com

solução de cristal violeta durante 1 a 2 minutos.


3. Cobrir o esfregaço com lugol durante 1 a 2 minutos.

4. Descorar rapidamente pelo álcool a 95 oGL.


6. Cobrir com solução de fucsina (ou safranina), durante 30 segundos para contra-corar.

7. Lavar.

8. Enxugar entre dois papéis de filtro, com cuidado, sem esfregar.

9. Adicionar sobre o esfregaço corado uma pequena gota de óleo de cedro e examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).

10. Com ajuda dos padrões G- e G+, interpretar o esfregaço.

Quais as dificuldades encontradas? Pesquisar. Qual a importância da coloração de Gram no diagnóstico?



OS MEIOS DE CULTURA

OS MEIOS DE CULTURA A composição dos meios de cultura varia ao infinito. No entanto podemos, grosseiramente, dividir os meios em duas categorias: o Os meios ditos complexos cuja composição não é bem definida (extrato de carne, de levedura, de

peptona, de malte, etc.).

o Os meios sintéticos de composição determinada Os meios que servirão de substrato para o cultivo bacteriano podem se apresentar como meios líquidos ou sólidos. Geralmente, se acrescenta como agente solidificante o ágar, um açúcar obtido a partir de algas marinhas. Este suporta perfeitamente o autoclavado (salvo a pH < 4 ou a pH > 9), derrete quando a temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce de 500C. PREPARAÇÃO DE MEIO DE DILUIÇÃO a) Dissolver 8,5 g de cloreto de sódio em água destilada.

b) Adicionar água destilada até completar 1000 mL.

c) Esterilizar.

d) Distribuir assepticamente conforme necessário. PREPARAÇÃO DE MEIO LÍQUIDO

Composição do caldo nutritivo (= caldo de carne simples)

Extrato de carne 3 g

Peptona 5 g

Água destilada 1000 mL

a) Misturar os componentes nas proporções indicadas e adicionar água destilada até completar o volume

desejado. Se for necessário, para dissolver os componentes, esquentar no Banho Maria.

b) Determinar o pH e ajustá-lo se necessário.

c) Distribuir o meio em tubos sem enchê-lo totalmente.

d) Tampar

e) Esterilizar. Observação Na falta dos componentes acima, o caldo pode ser preparado como a seguir: Cortar em pedaços pequenos 500 g de carne sem gordura, acrescentar 900 mL de água e manter na geladeira por 12 horas. Esquentar devagar e ferver por 10 minutos. Acrescentar 5 g de sal (não iodado). Tirar a espuma, deixar esfriar e filtrar duas vezes. Completar o volume a 1000 mL.



PREPARAÇÃO DE MEIO SÓLIDO

Composição do ágar nutriente (= ágar simples)

Extrato de carne 3 g

Peptona 5g

Ágar 15 g

Água destilada 1000 mL

a) Molhar o ágar em um pouco de água destilada fria.

b) Acrescentar o estrato de carne e a peptona nas proporções indicadas e adicionar água destilada até completar o volume desejado.

c) Esquentar no Banho Maria até dissolver os componentes.

d) Determinar o pH e ajustá-lo se necessário.

e) Distribuir o meio em erlenmeyer ou tubos sem enchê-los totalmente.

f) Tampar.

g) Esterilizar. A ESTERILIZAÇÃO A esterilização pode ser definida como a destruição completa de todo organismo vivo por processos de aquecimento, filtração ou qualquer outro método físico ou químico. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO

Esteriliza-se no calor seco o material de vidro. A

esterilização é obtida na estufa, a 180 C durante 2 horas.

ESTERILIZAÇÃO POR CALOR ÚMIDO

Esterilizam-se no calor úmido os recipientes que contêm meio de cultura. A esterilização é obtida

na autoclave ou na panela de pressão, a 120C, 2 atmosferas, durante 20 minutos.



ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO Algumas soluções (vitaminas, antibióticos, etc.) não podem ser esterilizadas por calor sem sofrer graves alterações. As preparações que contêm compostos termolábeis são esterilizadas por filtração. Todo o equipamento de filtração é previamente esterilizado em autoclave. As membranas Millipore são esterilizadas por ebulição suave durante 20 minutos em água destilada; deve-se tomar cuidado para que não toquem as paredes do recipiente. Deixa-se esfriar, e retiram-se as membranas da água com uma pinça estéril, colocando-as imediatamente sobre o respectivo disco de suporte. Sistema Millipore Também se podem esterilizar meios líquidos com filtros descartáveis que podem ser acoplados a seringas. Este método é de grande utilidade na preparação de meios de cultivo para células vegetais porque permite esterilizar hormônios sem perda de atividade.

Pesquisa: Existem outras formas de esterilização? Quais? Quais as vantagens e as desvantagens desses métodos?



A SEMEADURA EM PLACA A TÉCNICA BÁSICA



A TÉCNICA DE ESGOTAMENTO DO INÓCULO

Em uma amostra de microrganismos colhida na natureza encontraremos diversos tipos misturados. Para poder caracterizar a atividade de cada um deles devemos estudar culturas contendo um único tipo de microrganismo (cultura pura).

Somente com semeadura em placa é que podem ser obtidas colônias isoladas. É perda de tempo e material simplesmente espalhar a amostra sobre a placa, esperando fazer um diagnóstico bacteriológico. A arte da semeadura só é aprendida através de repetidas práticas diárias.

A técnica de esgotamento do inóculo é uma técnica de rotina para o isolamento de bactérias em culturas puras. Se a semeadura não for satisfatória, não se obtêm colônias isoladas, devendo-se requisitar nova amostra.

A placa de Petri deve conter um meio de cultura, no qual o organismo a ser isolado cresça caracteristicamente. O meio de cultura deve estar bem seco, pois se estiver úmido, a água de condensação pode arrastar as bactérias sobre a superfície da placa.

As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen, para evitar contaminação com germes do ar. A figura abaixo mostra as três formas possíveis de segurar a placa durante o procedimento. Experimente as três com uma placa vazia antes de escolher a que melhor se adapte a suas possibilidades.

Uma alça do material a ser semeado é colocada na parte superior do meio de cultura. Tocar somente a superfície do meio, tratar de não perfurar o ágar. Esse é o chamado inóculo inicial.

Flambar a alça de platina e, a partir do inóculo inicial, semear em ângulos retos ao inóculo, retirando linhas de semeadura, paralelas umas às outras. Virar a placa e semear em ângulos retos às linhas paralelas já feitas, de modo que o resultado seja uma série de linhas formando pequenos quadrados sobre a superfície do meio.

As colônias isoladas devem aparecer no final da semeadura. Se houver crescimento de bactérias nos centros dos quadrados formados pelo processo da semeadura, será obviamente contaminação.

Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas com a tampa voltada para baixo.



A7. OBTENÇÃO DE UMA CULTURA BACTERIANA PURA

Objetivo: Obter colônias a partir de uma suspensão bacteriana mista.

Material Placa de Petri contendo meio de cultura, tubo com solução salina estéril, pipeta estéril, alça de níquel-cromo, caneta pilot, bico de Bunsen, suspensão mista de bactérias. Procedimento 1. Transferir, com uma pipeta estéril, 0,1 mL da suspensão mista de bactérias para um tubo contendo 4,9 mL

de solução salina estéril (diluição 1:50).

2. Agitar bem e homogeneizar.

3. Flambar a alça e retirar uma gota pequena de suspensão mista de bactérias diluída e semeá-la sobre a superfície de um meio sólido (ágar simples).

ATENÇÃO: A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema apresentado a seguir (método de esgotamento). Entre um setor e outro, a alça deve ser esterilizada.

4. Rotular a placa e incubá-la a temperatura ambiente, durante 24 horas. Resultados 1. Desenhe a aparência da placa (ou fotografe a placa) mostrando a distribuição do material inoculado. 2. Descreva as diferentes colônias isoladas, caracterizando-as quanto ao tamanho, bordos, elevação e coloração. Utilize os critérios descritos na página seguinte. 3. Comparar os resultados obtidos pelos diferentes grupos.

Desafio Como você procederia para obter uma cultura pura de uma das colônias observadas?



OS CRITÉRIOS UTILIZADOS

1. TAMANHO

2. FORMA

3. ELEVAÇÃO

4. BORDOS

5. ESTRUTURA

6. BRILHO: transparente, translúcida, opaca.

7. COR: incolor, pigmentada.

8. ASPECTO: viscosa, úmida, membranosa, gelatinosa, leitosa etc.



A8. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE MICRORGANISMOS

Seres vivos visíveis a olho nu são relativamente fáceis de classificar pelas suas características morfológicas. Microrganismos só podem ser vistos com ajuda do microscópio e sendo muito parecidos resulta impossível diferenciá-los. Por isso é necessário estudar as características metabólicas, quer dizer a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos bioquímicos vitais. Atualmente, a utilização de sistemas miniaturizados simplifica a tarefa. Objetivo: Utilizar alguns testes bioquímicos para caracterizar diferentes microrganismos (E. coli, B. subtilis e M. luteus). Material Três culturas bacterianas diferentes (A, B e C), placas de Petri contendo ágar nutriente, placa de Petri contendo ágar-leite, placa de Petri contendo ágar-amido, 3 tubos contendo caldo glicosado e indicador de pH, 3 tubos contendo caldo lactosado e indicador de pH, 3 tubos contendo caldo com sacarose e indicador de pH, solução desinfetante, alça, pipetas Pasteur estéreis, bico de Bunsen, fita adesiva, caneta pilot. Procedimento A. INOCULAÇÃO DAS PLACAS.

1. Dividir cada placa de Petri em 4 seções (A, B, C e D).

2. Em condições assépticas semear com a alça a cultura A no setor correspondente das 3 placas contendo ágar nutriente, ágar-leite e ágar amido respectivamente.

3. Repetir o item anterior com a cultura B.

4. Repetir o item B com a cultura C.

5. Incubar o material a temperatura ambiente.

B. INOCULAÇÃO DOS TUBOS.

1. Rotular os tubos.

2. Em condições assépticas inocular com a pipeta Pasteur a cultura A nos três tubos contendo caldo glicosado, caldo lactosado e caldo sacarosado respectivamente.

3. Repetir o item anterior com a cultura B.

4. Repetir o item B com a cultura C.

5. Incubar o material a temperatura ambiente. . Resultados 1. Descreva as colônias A, B e C.

2. Quais das 3 culturas produzem amilase?

3. Quais das 3 culturas produzem protease?

4. Houve fermentação de carboidratos? Como pode ser acompanhada?



5. Reúna a informação obtida na tabela seguinte:

Cultura

Morfologia das colônias

Produção de

amilase

Produção de

protease

Fermentação

de lactose

Fermentação

de glicose

Fermentação de sacarose

A

B

C

Discussão Identifique as culturas A, B e C sabendo que as colônias de E. coli e B. subtilis são brancas e as M. luteus são amarelas; M. luteus e B. subtilis produzem proteases e fermentam a sacarose; B. subtilis produz amilases; M. luteus, B. subtilis e E. coli fermentam a glicose; E. coli fermenta a lactose.



A9. O NÚMERO DE MICRORGANISMOS DE UMA CULTURA O número de microrganismos em uma cultura pode ser estimado colocando um volume determinado desta em ágar nutriente a 37.0C de maneira que cada célula possa se multiplicar dando origem a uma colônia. Depois de 24 á 48 horas de incubação poderemos observar e contar as colônias. Aceitando que cada uma delas resulta da multiplicação de um indivíduo isolado é possível calcular o número de microrganismos na cultura. Material: cultura de E.coli (diluição / 10-4), placas de Petri contendo meio nutriente, 5 tubos de ensaio com

4,5 mL de água destilada estéril, 1 tubo de solução salina, desinfetante, seringa de 1 mL pipeta Pasteur calibrada, fita adesiva, caneta pilot, estufa a 370.C.

Procedimento. 1. Rotular a cultura (A) e os tubos de ensaio (B, C, D, E

e F).

2. Transferir com a seringa 0,5 mL da amostra de (A) para (B). Misturar o conteúdo de (B). Por que se deve misturar bem o conteúdo do tubo depois da diluição?

3. Transferir com a seringa 0,5 mL de líquido de (B) para (C). Misturar o conteúdo de (C).

4. Continuar a série de diluições até (F).

5. Secar a placa de Petri na estufa, e rotulá-la como o indicado.

6. Evitando contaminações, retirar com a pipeta calibrada uma pequena quantidade de líquido de (F). Abrir a placa de Petri e deixar cair uma gota no lugar correspondente. Fechar a placa e devolver o excesso de líquido a (F).

7. Repetir o procedimento com os tubos (E, D, C, B e A). Descartar a pipeta no desinfetante. Por que as diluições são semeadas na ordem F, E, D, C, B e A?

8. Fechar a placa e colocá-la na estufa. Resultados: 1. Algumas gotas têm entre 10 e 20 colônias? Quais? 2. Todas as colônias têm a mesma aparência? 3. Quantas vezes a cultura original foi diluída nessa gota? (Dica: de A para B a cultura foi diluída 10 vezes) 4. Conhecendo o volume da gota semeada na placa de Petri calcule o número de microrganismos

existentes na cultura (A). Discussão: Sugira diferentes aplicações para esta técnica. Como poderia melhorá-la? Prepare um protocolo apropriado.



A10. AÇÃO DA LUZ ULTRAVIOLETA

Lâmpadas especiais que emitem luz UV com comprimento de onda microbicida são utilizadas para reduzir o número de microrganismos no ar, em superfícies de salas cirúrgicas e em salas assépticas onde produtos esterilizados são distribuídos em garrafas ou ampolas estéreis. Nesta atividade estudaremos a ação germicida da luz ultravioleta sobre diferentes tipos de microrganismos, tais como E. coli, B. subtilis, M. luteus, S. cerevisiae ou Rhodotorula. Material (por grupo): 4 placas de Petri estéreis com meio nutriente para as bactérias e com meio nutriente

sacarosado para as leveduras; swab estéril; 1 pipeta Pasteur estéril, culturas de vários microrganismos, 4 cartões de cartolina preta vazados, fluxo laminar com luz UV.

Procedimento: 1. Rotular uma placa como C (controle) e numerar as outras

seis. 2. Com um cotonete, em condições assépticas, inocular a

superfície do ágar de todas as placas, espalhando um tapete do microrganismo.

3. Colocar as 4 placas no fluxo laminar. 4. Substituir a tampa de vidro das placas 1 a 3 pelos cartões

vazados, como indicado no esquema. Deixar a placa 4 com a sua respectiva tampa de vidro.

5. Expor as placas à luz UV durante 1 min. (placa 1), 5 min. (placa 2), 10 min. (placa 3) e 20 min. (placa 4). 6. Incubar as placas à temperatura adequada por 24-48 h. Resultados 1. Observe o crescimento dos microrganismos na região da placa correspondente à área vazada dos cartões.

Registre as observações de seu grupo no quadro a seguir. Microrganismo _________________________________

TEMPO

1 min.

10 min.

20 min.

20 min. (com

tampa)

CRESCIMENTO

( ++) : crescimento normal (+) : crescimento intermediário ( 0 ) : ausência de crescimento

Esvaziar uma forma de 0,2 cm de largura, aproximadamente



2. Complete acrescentando os dados dos outros grupos:

MICRORGANISMO

1 min.

10 min.

20 min.

20 min. (c/tampa)

( ++) : crescimento normal (+) : crescimento intermediário ( 0 ) : ausência de crescimento Discussão 1. Caracterize a luz UV do ponto de vista físico 2. Qual o mecanismo de ação da luz UV que explica sua ação germicida? 3. Quais os fatores que modificam o efeito da luz UV 4. A luz UV agiu do mesmo modo sobre os diferentes microrganismos? Se a resposta for negativa, explique. 5. Uma caneta de luz UV é utilizada em alguns países para descontaminar os telefones celulares. Você acha

esse método adequado?



A11. AÇÃO DOS DESINFETANTES

A propaganda de muitos desinfetantes se refere a “ação germicida” destes produtos. Nesta atividade vamos pesquisar a ação de diversas concentrações de um desinfetante sobre culturas de Escherichia coli. Material (por grupo): Discos de papel de filtro de 5 mm de diâmetro, água sanitária (diluição 50%), 1 placa de Petri contendo ágar nutriente estéril, 4 tubos com 1,5 mL de água esterilizada, 1 pipeta de 1 mL estéril, 1 pipeta Pasteur estéril,

desinfetante, 1 tubo com 5 mL de ágar nutriente estéril (ágar brando), pinças, bico de Bunsen, estufa a 30C, cultura pura de Escherichia coli, pilot. Observação 1: com outros desinfetantes recomenda-se partir de 0,2 mL e preparar a diluição seriada em tubos com 1,8 mL de água esterilizada. Observação 2: O ágar derrete quando temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce

de 500C.

Procedimento A. PREPARAÇÃO DOS DISCOS

Esterilizar os discos por imersão em etanol 96 0 durante uma noite. Secar. B. PREPARAÇÃO DA PLACA

Em condições assépticas

1. Inocular o tubo contendo ágar nutriente liquefeito (ágar brando) com 1 mL de uma cultura pura de Escherichia coli. Misturar bem.

2. Verter o conteúdo do tubo na placa. Deixar solidificar.

C. PREPARAÇÃO DAS DILUIÇÕES

1. Rotular os tubos de ensaio. Colocar desinfetante no tubo D.

2. Com a pipeta volumétrica estéril, transferir 1,5 mL do desinfetante ao tubo 1. Agitar bem.

3. Continuar a série de diluições (tubos 2, 3 e 4) com a mesma pipeta.

D. O TESTE

Depois de rotular a placa dividindo-a em 5 setores, trabalhar em condições assépticas:

1. Acrescentar no centro da placa um disco-controle.

2. Molhar um disco com o desinfetante diluído (tubo 4), abrir a placa e colocá-la na superfície do meio.

3. Repetir o procedimento com as outras diluições do desinfetante (tubos 3, 2 e 1).

4. Incubar a 30C durante 48 horas antes de proceder à leitura do teste.



Resultados 1. Prepare um desenho (ou fotografia) mostrando a aparência da placa e indicando o diâmetro das zonas

de inibição ao redor dos discos. 2. Em quais diluições não se observou crescimento microbiano? 3. Que aconteceu em redor do controle? Discussão: 1. Qual a diferença entre um antisséptico e um desinfetante? 2. Qual o uso doméstico dos desinfetantes? 3. O desinfetante estudado é eficiente quando concentrado? 4. O desinfetante estudado é eficiente na diluição recomendada na embalagem do produto? 5. A descarga de água no vaso sanitário dilui os desinfetantes. Comente em função de seus resultados. 6. Compare os resultados obtidos na turma com outros desinfetantes.



A12. AÇÃO DOS PRODUTOS COSMÉTICOS (DESODORANTES) Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na pele, isto é nas dobras e partes mais úmidas associadas às glândulas sudoríparas. O cheiro da transpiração é o resultado da ação destes microrganismos. Os desodorantes inibem o crescimento dos microrganismos responsáveis pelo cheiro da transpiração. Nesta atividade estudaremos a ação de diferentes desodorantes sobre o crescimento de Micrococcus luteus. Material 1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky, 3 desodorantes diferentes (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril, caneta pilot, bico de Bunsen. Procedimento 1. Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (A, B, C e D).

2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus no ágar nutriente da placa de Petri. Distribuir com a alça de Drigalsky ou com um swab.

3. Em condições assépticas, colocar com a pinça no setor D um disco de papel de filtro estéril (controle).

4. Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o desodorante A. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.

5. Repetir o procedimento com os desodorantes B e C.

6. Rotular a placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar o crescimento bacteriano na placa.

Resultados Desenhe esquematicamente (ou fotografe) a aparência da placa de Petri. Discussão 1. Os desodorantes estudados têm alguma ação sobre as bactérias? 2. Qual a principal função dos desodorantes?

3. Qual a composição dos desodorantes?



A13. AÇÃO DOS PRODUTOS COSMÉTICOS (DENTIFRÍCIOS)

Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na cavidade oral. Muitos são inofensivos, outros não. Algumas bactérias fermentam os carboidratos (predominantemente a sacarose) produzindo ácido que dissolve os sais de cálcio, num processo de desmineralização. A destruição localizada do tecido dental forma a cárie dentária. Nesta atividade estudaremos a ação de diferentes dentifrícios sobre o crescimento de Micrococcus luteus. Material 1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky, 3 dentifrícios ou três soluções anti-placa bacteriana (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril, pilot, bico de bunsen. Procedimento 1. Dividir a parte inferior da placa de Petri em 4 setores (A, B, C e D).

2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Micrococcus luteus no ágar nutriente da placa de Petri. Distribuir com a alça de Drigalsky ou com o swab.

3. Em condições assépticas, colocar com a pinça no setor D um disco de papel de filtro estéril (controle).

4. Em condições assépticas colocar com a pinça no setor A um disco de papel de filtro molhado com o dentifrício A. Lavar a pinça com água e esterilizar na chama do bico de Bunsen durante 2 a 3 segundos.

5. Repetir o procedimento com os dentifrícios B e C.

6. Rotular a placa e incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Observar o crescimento bacteriano na placa.

Resultado Desenhe esquematicamente (ou fotografe) a aparência da placa de Petri. Discussão 1. Os dentifrícios estudados têm alguma ação sobre as bactérias? Qual é o mais eficiente? 2. Alguns dentifrícios contêm substâncias que inibem o crescimento bacteriano. Quais os outros

ingredientes de um dentifrício e qual a sua função?



A14. ANTIBIÓTICOS E ANTIFÚNGICOS

Na natureza, a produção de substâncias antibióticas pelos microrganismos desempenha um papel importante na competição interespecífica, seja porque matam outros microrganismos seja porque inibem seu crescimento ou sua reprodução. O homem utilizou essa propriedade para desenvolver medicamentos que lhe permitissem lutar contra as infeções. O uso indiscriminado de antibióticos na clínica teve como consequência um aumento de formas resistentes, dificultando o combate aos microrganismos. Atualmente, no Brasil, a venda de antibióticos só é possível com receita médica. Então, como levar a ação germicida ao laboratório de ensino? Desinfetantes, dentifrícios e desodorantes representam algumas das opções possíveis. Outra possibilidade são as soluções antifúngicas de uso tópico destinadas ao tratamento de micoses superficiais, de baixo custo e venda livre nas farmácias. Estes produtos podem ser testados com Saccharomyces cerevisiae, uma levedura vendida comercialmente que é utilizada habitualmente nas atividades práticas por não apresentar risco nenhum. Desvio de função de um produto comercial? Não, se tivermos em conta que Não temos a pretensão de avaliar sua eficiência. Para isso, a sociedade conta com organizações específicas que seguem protocolos estritos antes de dar a autorização correspondente. Objetivo Evidenciar a ação germicida de uma solução antifúngica de uso tópico e venda livre nas farmácias. Materiais Uma placa contendo ágar nutriente estéril (Sabouraud), 1 cultura em caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1 pipeta estéril, 1 swab estéril, uma solução antifúngica, 5 discos de papel de filtro estéreis, 1 pinça estéril, pilot. Procedimento 1. Rotular a placa e dividir a parte inferior em 4 setores (A, B, C e D). 2. Em condições assépticas, colocar umas gotas da cultura de Saccharomyces cerevisiae no ágar nutriente

e distribui-las com um swab. 3. Em condições assépticas, colocar com a pinça um disco de papel de filtro estéril (controle) no centro da

placa. 4. Mantendo a assepsia, colocar com a pinça um disco de papel de filtro embebido no produto em cada

setor (A, B, C e D).

5. Incubar a placa a temperatura ambiente (30 C aproximadamente) durante 48 a 72 horas. Observar o crescimento das leveduras e a aparição de halos de inibição.

Perguntas O produto testado mostrou alguma ação germicida sobre as leveduras? Qual a função do papel colocado no centro da placa? Qual a função das repetições B, C e D?



Como interpretaria a eventual aparição de colônias dentro do halo de inibição?

BIBLIOGRAFIA

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introduÇÃo Às tÉcnicas microbiolÓgicas · 1 maria antonia malajovich / biotecnologia: ......

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