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INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADAMULTIVARIADA
APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOSDE FÁRMACOS
Prof. Dr. Marcelo Martins de Sena
MÓDULO 04
1Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas
UnUCET – Anápolis
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2 MÓDULO 04
CALIBRAÇÃO:CALIBRAÇÃO:
Revisão deRevisão deCalibração Calibração UnivariadaUnivariada
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3 CALIBRACALIBRAÇÇÃOÃOUm mundo sob observação indireta requer calibração⇒ Estabelece um modelo para descrever a relação entre variável independente (x) e uma variável dependente (y)
⇒Transforma medidas instrumentais em resultados que possam ser compreendidos
⇒ Previsão de informação quantitativa (concentração ou outra propriedade) a partir de medidas químicas (frequentemente instrumentais), via alguma função de transferência
⇒ Desenvolvimento de funções empíricas (MODELOS): y = f(x)
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4 CALIBRACALIBRAÇÇÃOÃOTIPOS:
1) LINEAR X NÃO LINEAR
2) UNIVARIADA X MULTIVARIADA
3) CLÁSSICA (DIRETA) X INVERSA
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5 UnivariadaUnivariada xx MultivariadaMultivariada
⇒ O modelo é baseado somente em uma variável medida (x)⇒ É usada quando existe uma variável seletiva, que torna possível a previsão (ex: absorbância em um comprimento de onda onde não existe sobreposição espectral de interferentes)
1) Univariada
2) Multivariada⇒ O modelo é baseado em muitas variáveis (x é um vetor para cada amostra)⇒ É usada quando não existe uma única variável seletiva, tornando possível previsões na presença de sinais analíticos sobrepostos e de interferentes
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6 ClCláássica x Inversassica x Inversa
⇒ A concentração (C) como função da resposta instrumental (S)⇒ Mais usada em calibração univariada⇒ Ex: Lei de Beer → S = f(C) + E
1) Clássica
2) Inversa⇒ A resposta instrumental como função da concentração⇒ Mais usada em calibração multivariada⇒ C = f(S) + F
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7 CalibraCalibraçção ão UnivariadaUnivariada ClCláássicassicaExemplo de Curva de Calibração Clássica
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8 CALIBRAÇÃO UNIVARIADACALIBRAÇÃO UNIVARIADADuas Etapas:1) Construção do Modelo: Medidas feitas em uma série de padrões analíticos de concentrações conhecidas são usadas para estimar um modelo que relacione as medidas (espectrais, cromatográficas, potenciométricas, etc.) com a concentração (ou outra propriedade) da espécie de interesse.
2) Previsão: Usa-se esse modelo para prever concentrações de novas amostras, a partir dos sinais analíticos medidos para elas.
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9 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAO modelo mais simples consiste em estimar os parâmetros b0 e b1 que satisfaçam à equação:
y = b0 + b1x
onde “x” pode representar a concentração de uma espécie química, e “y” a medida analítica (Calibração Clássica).
Como encontrar a estimativa de b0 e b1 a partir dos pares de valores xi,yi para cada amostra medida i ?
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10 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAAtravés do Método dos Mínimos Quadrados⇒ Não é possível ajustar uma reta passando por todos os pontos ao mesmo tempo.⇒ Então, ajusta-se uma reta que passe o mais perto possível dos pontos.⇒ Isto é feito pela minimização da soma dos quadrados dos resíduos (ou erros).⇒ Também conhecida como Análise de Regressão (Sir Francis Galton, 1885).
iii yye −= ˆResíduo de uma medida
( )2
1
ˆ∑=
−n
iii yy
Soma quadrática dos resíduos
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11 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADA
xi xPor que minimizar os quadrados dos resíduos?
Porque a soma dos resíduos é zero
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12 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAEstimando os parâmetros b0 e b1:
→ Somatória dos resíduos: ( ) ( )210
22 ˆ ∑∑∑ −−=−= iiiii xbbyyye
→ Derivando em relação a b0 e b1:
( ) 02 210
0
2
=−−−=∂
∂∑∑
iii xbby
be
( ) 02 210
1
2
=−−−=∂
∂∑∑
iiii xbbyX
be
→ Resolvendo o sistema de 2 equações acima:
( )( )( )∑
∑−
−−= 21 xx
yyxxb
i
ii xbyb 10 −=
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13 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAGeneralizando o modelo: y = b01 + b1x
→ Forma matricial:
⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡
⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
=
⎥⎥⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢⎢⎢
⎣
⎡
1
02
1
2
1
.
1
11
bb
x
xx
y
yy
nn
MMM
→ Forma matricial abreviada: y = Xb→ Estimando o vetor b: b = (XTX)-1XTy→ Condições p/ resolução desta equação:1) A matriz (XTX)-1 deve ser inversível, ou seja, não singular (det≠0);2) Os modelos devem ser lineares nos parâmetros, ou seja não
devem conter termos como b02 ou b0b1.
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14 AnAnáálise de Variância (ANOVA)lise de Variância (ANOVA)⇒ Separa a variação sistemática da variação aleatória⇒ Se baseia na análise dos resíduos (variância aleatória)⇒ O desvio de uma resposta pode ser decomposto como:
( ) ( ) ( )yyyyyy iii ˆˆ −+−=−
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15 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)⇒ Os desvios são expressos como somas de quadrados
( ) ( ) ( )∑∑∑ −+−=− 222 ˆˆ yyyyyy iii
SQT = SQR + SQr
variância total
variância aleatória
(resíduos)variância sistemática (Regressão)
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16 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)Tabela de ANOVA
Significância estatística da Regressão:→ Avaliada através de um teste F
Se MQR/MQr > F1,n-2 ⇒ A regressão é significativaSe MQR/MQr < F1,n-2 ⇒ o valor de b1 não é significativo
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17 Análise de Variância (ANOVA)Coeficiente de Determinação (R2)
( )( )2
2
2 ˆ
∑∑
−
−==
yy
yySQSQR
i
i
T
R
0 < R2 < 1R2 = 1 ⇒ Ajuste perfeito
O coeficiente de correlação r entre uma resposta observada e um valor previsto é igual a raiz quadrada do coeficiente de determinação
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18 AnAnáálise dos Reslise dos Resííduosduos⇒ Suposições assumidas na Regressão Linear:1) O erro na variável independente (x) pode ser desprezado
(assume-se que não há erros no preparo dos padrões);
2) Os resíduos não são correlacionados (as medidas em y são independentes umas das outras); ⇒ Para isto, a amostragem deve ter sido feita em ordem aleatória (Aleatorização)
3) Os resíduos seguem uma distribuição normal (graças ao TLC e ao esforço dos pesquisadores p/ evitar erros sistemáticos);
4) Os dados são homoscedásticos: a variância dos erros éconstante ao longo de toda a faixa estudada.
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19 AnAnáálise dos Reslise dos Resííduosduos⇒ É fundamental que os resíduos sejam plotados e se
garanta que eles possuam comportamento aleatório
Exemplos de Resíduos não aleatórios
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20 Dados Dados HeteroscedHeteroscedáásticossticos
⇒ Deve-se aplicar alguma transformação linearizante (ex: log) ou usar uma regressão ponderada (weighted regression)
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21 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)Falta de Ajuste e Erro Puro⇒ A soma quadrática dos resíduos (SQr) pode ainda ser
dividida em um fator devido à falta de ajuste (SQfaj) e outro fator devido ao erro experimetal (erro puro, SQep)
⇒ Só é possível estimar SQep se tiverem sido feitas replicatas de pelo menos um ponto da curva
⇒ Para que o modelo seja adequado, é preciso que a falta de ajuste não seja significativamente maior do que o erro experimental (Faz-se um teste F)
SQr = SQfaj + SQep
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22 CALIBRAÇÃO UNIVARIADABIBLIOGRAFIA:1) B. Barros Neto, I. S. Scarminio e R. E. Bruns, “Como Fazer
Experimentos. Pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria”, Cap. 5, 2a ed., Ed. da UNICAMP, Campinas, 2003.
2) D.C. Harris, “Análise Química Quantitativa”, Cap. 5, 6a ed., Rio de Janeiro: LTC, 2005.
3) M.F. Pimentel e B. Barros Neto, “Calibração: Uma Revisão para Químicos Analíticos”, Quím. Nova 19: 268-277 (1996).