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Introdução à Biologia Molecular
Prof. Leonardo Crema
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HISTÓRICO
1865 - GREGOR MENDEL
Estudou cruzamento entre
diferentes tipos de
ervilhas demonstrando
que certas características
físicas dessas plantas
eram transmitidas de
geração para geração
através de “fatores”.
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HISTÓRICO
1902 – SUTTON e BOVERI
Padrão de herança dos
“fatores” acompanhava a
segregação dos cromossomos
de células em divisão
1909 – JOHANNSEN
Nomeou as unidades
mendelianas da
hereditariedade “fatores” de
GENES
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HISTÓRICO
1915 – THOMAS MORGAN
Concluiu que os genes estavam
organizados de maneira linear nos
cromossomos
Propôs, pela 1ª vez, uma correlação
entre um gene = genótipo e uma
característica física = fenótipo
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HISTÓRICO
• 1941 – BEADLE e TATUM
• Demonstraram que os genes
agiam através da regulação de
diferentes eventos químicos
• HIPÓTESE:
UM GENE → UMA ENZIMA
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HISTÓRICO
• 1952 –Hershey–Chase
Demonstraram que é o ADN a base
do material genético (e não as
proteínas)
Hershey, A. D., i Chase, M. (1952) Independent functions of viral protein
and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36:39-56
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HISTÓRICO
1953 – JAMES WATSON e FRANCIS CRICK
Descrição da estrutura física do DNA
baseando-se nos estudos de difração de
raio X de Rosalind Franklin e Maurice
Wilkins e em estudos químicos da
molécula
Modelo da dupla fita proposto foi
fundamental para a compreensão do
mecanismo de transmissão e execução
da informação genética
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•1953: Watson and Crick
Estrutura do DNA
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HISTÓRICO
1955 – JOE HIN TJIO
Definiu como 46 o número exato
de cromossomos humanos
ARTHUR KORNBERG
Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria
E. coli
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HISTÓRICO
1957 – CRICK e GAMOV
Dogma Central da
Biologia Molecular
DNA → RNA
→ PROTEÍNA
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• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON
• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma
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Dogma Central da
Biologia
Molecular
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ORGANISMO
CÉLULA
NÚCLEO
CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)
- Informação das proteínas eRNAs que serão sintetizadaspelas células do organismo aolongo da sua vida.
-Capacidade de se auto-duplicar para originar outras células.
DNA
NOS SERES HUMANOS
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1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA
Sequências sucessivas de trêsnucleotídeos do DNA (códon)determinam a sequência deaminoácidos de uma proteína
O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!
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DNA
1. Regulação transcricional
mRNA 2. Regulação no processamento doRNA primário
3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO
4. Regulação dasíntese proteíca
Proteínasintetizada
5. Regulaçãopós-síntese
A CÉLULA
- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO
AMBIENTE
NÚCLEO
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DNACromossoma
Gene
Promotor IntronExon
Núcleo
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DNA
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ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Contém toda a informação genética de um organismo
Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatrodiferentes nucleotídeos:
• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA eRNA
• Timina – encontrada somente no DNA
• Uracila – encontrada somente no RNA
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Todos os nucleotídeos
apresentam uma estrutura em
comum:
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
2 tipos de bases nitrogenadas.
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O grupo hidroxil ligado ao carbono3 da pentose de um nucleotídeoforma uma ligação fosfodiéster como fosfato do outro nucleotídeo
ESTRUTURA DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
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DNA
• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estruturade dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fitae as bases projetam-se para o interior da mesma
• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes dehidrogênio entre as bases, o que contribui para a estabilidade dadupla hélice
. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes dehidrogênio
. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes dehidrogênio
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DNA
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As fitas do DNA estão dispostas em
direções opostas
Antiparalelismo
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Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita
Complementariedade
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Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas
ou mães servem de molde para cada fita
nova ou filhacomplementar, que está
sendo sintetizada.
Fita nova
Fita velha
Complementariedade
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Fatores que estabilizam a dupla hélice:
• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+) presentes na solução fisiológica
A Dupla Hélice
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Sulco menor
Sulco maior
A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as
proteínas da cromatina
A Dupla Hélice
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Proteínas:níveis de complexidade estrutural
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O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA
DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)
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A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário
A Dupla Hélice
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Propriedades Químicas e Físicas do DNA
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REPLICAÇÃO DO DNA
Conservativa ou Semiconservativa?
Unidirecional ou Bidirecional?
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REPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958
• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio paracrescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogêniopesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.
• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N(nitrogênio leve – “light”).
• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade quesepara as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.
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•The Meselson-Stahl experiment
A replicação é semi-conservativa
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com aenzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolhachamada bolha de replicação comprovando a existência deum ponto de origem da replicação
Características da origem de replicação:
. estrutura repetitiva
. seqüências ricas em AT
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
ORIGEM Sítio de restrição EcoRI
Cromossomo viral circular
EcoRI
Bolha de replicação
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
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Biologia – Campbell & Cols.
Procariontes vs Eucariontes
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Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de
Replicação”
• Nos eucariontes, a replicaçãorequer “múltiplas origens”,devido ao tamanho de seugenoma. A replicação ébidirecional e, em ambas asfitas, simultânea.
• Este processo gera “bolhas dereplicação”.
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Região GênicaÉ a porção que codifica para um
produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou
um RNA
O DNA é formado por 2 regiões:
Gênicas Intergênicas
Região IntergênicaÉ a porção regulatória, que
sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a
transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a
replicação do DNA
Intergênicas Gênicas
Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Os mecanismos celulares responsáveis pelareplicação do DNA foram descobertosprimeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através deproteínas análogas e com processos semelhantes àreplicação do DNA de E. coli
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PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)
1. DNA Polimerases
2. Endonucleases
3. Helicases
4. Topoisomerases
5. Primases
6. Telomerases
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DNA POLIMERASE
• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênioque ligam as duas fitas do DNA
• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente
• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radicalhidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está seformando. Desta forma, as fitas só podem crescer nosentido 5’ 3’
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Biologia – Campbell & Cols.
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DNA Polimerases
• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo
• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início –alongamento
• 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11
I : importante no sistema de reparo
III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)
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Adição de nucleotídeos
1
2
3
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FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita contínua
“leading”
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FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua I
“Lagging”
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FORQUILHA DE
REPLICAÇÃO
• Fita descontínua II
• “Lagging”
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OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO
HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se moverao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATPpara separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”- proteínas de ligação à fita simples) –ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNAutilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fitaque não está sendo replicada.
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fitamolde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidosopostos
FITA “LEADING” – crescimento segue adireção do movimento da forquilhade replicação
FITA “LAGGING” – crescimento nosentido oposto ao movimento daforquilha de replicação
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de uminiciador na fita molde 3’ 5’
FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir demúltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados empequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando naformação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimeraseI remove o primer do RNA do fragmento adjacentee preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidospela DNA ligase.
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
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ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
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ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE
MOLÉCULAS LINEARES DE DNA
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TELOMERASE
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentamseqüências repetitivas em suas extremidades denominadastelômeros
• A síntese da fita “leading” continua até o término da fitamolde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feitapela primase na fita “lagging” não é digerida.
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempodiminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
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TELOMERASE
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REGULAÇÃO
-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;
-afetada pela metilação de DNA
-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental
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Gene
RNA polimerase
hnRNA
mRNA
Citoplasma
Transcrição
Processamento
Núcleo
Tradução
proteína
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O RNA ou ARN
• O açúcar é uma Ribose;
• É formado, geralmente, por uma fita simples que pode enrolar-se;
• Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.
• Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere doDNA em três aspectos básicos:
A-U
U-A
G-C
C-G
A-T
T-A
G-C
C-G
DN
A
RN
A
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RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).
A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.
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1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:
T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um
! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína.
A - U - G - A - C - U RNAm
Códon início códon proteína
aa A aa B
Tipos de RNA
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Síntese Protéica
• A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’.
• Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.
• Ao final da transcrição a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.
A Transcrição
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Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA
A T A C A T G G G C T A G A A
UU U U U UGG C C CC AAA
Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.
DNA
RNA
RNAm
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2-RNA transportador (RNAt) - é produzidonos cromossomos a partir de DNAespeciais. É uma molécula cadeia curta, (éo menor RNA) que transporta os aa queestão dispersos no citoplasma até osribossomos. O RNAt tem formato de“folhas de trevo” e contém outros tipos debases, além das comumente encontradasnos outros RNAs. Cada RNAt é capaz dereconhecer um determinado aadeterminado códon, no RNAm. Todo RNAttem um filamento livre de sua moléculacomposta pela seguinte seqüência debases: ACC. É nesse local que ocorre aassociação com o aa. Em cada região damolécula existe uma seqüência de 3 basesdenominadas anticódon, que reconhece aposição do aa no RNAm.
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Tipos RNAs (2/2)
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RNA TRANSPORTADOR
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3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre emmaior quantidade nas células. Esse RNA é encontradono nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma,associado às proteínas, formando os ribossomos.
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Tipos de RNA
• RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a
“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
• RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é
responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.
• RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da
estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.
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SÍNTESE DE PROTEÍNAS:
A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAtque estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína.
Núcleo
DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas TraduçãoNúcleoDNA-RNAm
A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmoRNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.
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Os Íntrons e os Éxons
Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré-RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma.
A
Éxon Íntron Éxon ÉxonÍntron Íntron
Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro
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Síntese Protéica
• O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.
• O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.
• O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.
• Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.
• Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.
A Tradução
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O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados
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4. Terminação
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Dogma Central da Biologia Molecular
• Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.
• Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à Proteína – fluxo unidirecional da informação.
• O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).
• Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira.
• Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.
• Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína.
• Projeto Proteômico.
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Diferenças entre RNA e DNA
O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.
Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).
As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.
DNA
RNA
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Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas
principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido
desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as
proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o
DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.
DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico)
Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma
Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas
Apresenta apenas uma fita
É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose
É formado com a pentose ribose
Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G
Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G
DNA e RNA
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Código Genético
Codon que dá origem à síntese dequalquer proteína
Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.
Genoma Conjunto de moléculas de DNA
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Disciplina de Biologia Molecular(60 h)
Prof. Leonardo Crema
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Ementa
• EMENTA:
1) Mecanismos moleculares da replicação doDNA, transcrição e tradução gênica.Características do código genético. Tipos demutações. Polimorfismos. Organização dogenoma. Técnicas de biologia molecular.Bioinformática. Genética forense. Clonagem.Transgenia. Tipos de células tronco. PráticaProfissional Integrada.
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Bibliografia Básica
• ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed. 2010.
• GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002.
• SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
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Bibliografia Básica
• ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.
• COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.
• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular.8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p. 2011.
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