Hev. Med. Univ. Navarra XI; 187, 1967

UN IVERS IDAD DE NAVARRA . F ACULT AD DE MEDICINA

D EPARTAMENTO DE B!OQUIMICA

,Investigaciones sohre una nueva serie de

f osf olípidos metahólicamente activos

E. Santiago

RESUMEN

Hokin y Hokin mostraron, en 1958, que cuando las fracciones de cerebro se incuban en condiciones óptimas para fosforilización oxidativa, se incor­pora ortofosfato radiactivo en algún fosfolípido no identificado. Estos fos­folípidos no identificados se han resuelto por cromatografía en tres man­chas definidas ; el sistema de cromatografía en papel consiste en papel im­pregnado de ácido si lícico con fenol saturado, con NH, 0,1 % como disol­vente. Estas tres manchas se llamaron fosfolípidos A (Rf, 0,09), B (Rf, 0,030) y C (Rf, 0,51). En el pr<:sente trabajo se intentó el estudio de algunas _de las propiedades de estos compuestos, y el ais lamiento y purificación de uno de ellos, me­diante una com binación de técnicas de cromatografía en columna y distri­bución en contracorriente.

lNTRODTJCCIÓN

Los fosfolípidos están ampliamente dis­tribuidos en animales, plantas y micro­organismos; en algunos tejidos y estruc­turas celulares estos compuestos están presentes en grandes cantidades. Esta am­plia presencia de fosfolípidos como com­puestos de los organismos vivos ha con­ducido a inferir que podrían participar en un gran número de funciones bioló­gicas.

Trabajos recientes de Hokin y Hokin 7,

por ejemplo, han demostrado que los fos­folípidos desempeñaban un papel impor­tante en secreción de proteínas s, 9, y en el transporte de iones 10. u.

Aunque los fosfolípidos anteriormente se hubiesen considerado como compues­tos inertes, experiencias con fósforo ra­diactivo han demostrado que algunos de ellos experimentan un intercambio muy activo.

188 E. SANTIAGO Vol. XI

Los isótopos han sido muy útiles para determinar la presencia de algunos fosfo­lípidos en los tejidos 5 y también han de­mostrado ser un medio útil para seguir el aislamiento y purificación de los nuevos y también una amplia identificación de compuestos.

Aunque algunos lípidos están presentes en .. muy pequeñas cantidades en tejidos animales, esto no significa necesariamen­te que su función sea menos importante ; podrían muy bien ejercer su función di­sueltos en los fosfolípidos que están pre­sentes en grandes proporciones.

En 1958, Hokin y Hokin 7, en el curso de algunos experimentos, intentaron estu­diar el efecto de la acetilcolina sobre la incoporación de P 32 en ácidos fosfatfdi­cos, cuando las fracciones particulares de citoplasma cerebral se incubaban en un sistema de fosforilización exidativa, en presencia de P32 inorgánico. La separa­ción de los diferentes fosfolípidos se rea­lizaba por cromatografía sobre papel im­pregnado de ácido silícico con diisobu­tilcetona, ácido acético y agua en las pro­porciones de 40: 30: 7 ó 40: 25: 5 15• La localización de los diferentes compuestos se establecía por tinción con Rodami­na G y autoradiografía.

Los autorradiogramas demostraban que el ácido fosfatídico era el único bien di­ferenciable y a veces encontraban una marca de monofosfoinosítico, y manchas imperceptibles de otros fosfolípidos. Una larga raya aparecía también en los auto­rradíogramas. La separación del com­puesto representado por esta raya se con­siguió por cromatografía sobre papel im­pregnado con ácido silícico utilizando fe­nal saturado con 0,1 % de NH3 como di­solvente; tres compuestos no identifica­dos se separaron con Rfs de 0,06, 0,30 y 0,51. Todos los fosfolípidos conocidos aparecían próximos al frente del disol­vente. Mientras la incorporación de P32

en ácido fosfatídico se estimulaba por la acetilcolina tanto como 70 % , no había

encontrado efecto sobre la incorporación de P32 en estos compuestos no identifi­cados. Estos compuestos eran probable­mente de naturaleza lipoidea, puesto que rep:::tidos lavados de extracto clorofórmi­co con 0,1 NHCl no consiguieron sepa­rarlos de la fase orgá~ica.

,._c.--., _ .. :' .'?'~

MATERIAL y MÉTODOS

MATERIAL

Los ortofosfatos radiactivos se han ob­tenido de Oak Ridge, Tennessee. Se de­secaron in vacuo para separar el HC! y después redisolverlos en agua.

Todos los disolventes utilizados en cro­matografía de columna, cromatoe;raffa de papel o distribución contracorriente fue­ron reactivos de alto grado de pureza, y en todos los casos, exceptuado el ben­ceno, no fue necesaria purificación ulte­rior. El benceno, sin embargo, se encon­tró que contenía alguna impureza no vo­látil; esto fue un serio problema, espe­cialmente cuando se evaporaban por de­secación grandes volúmenes.

Benceno (libre de tiofeno) reactivo de Mallinckrodt, se hacía pasar por una co­lumna de gel de sílice; una banda gris se acumulaba sobre la parte superior; el benceno que había pasado por tal co­lumna no dejaba residuo ninguno en la evaporación. Más de 3 litros de bence­no se podrían purificar en una colum­na de 30 X 2,5 cm. El gel de sílice se regeneraba por lavado de la columna con metanol ; después de desecación el gel de sílice se podía utilizar de nuevo.

MÉTODOS

Fosfato. El fosfato se determinó por el método de Fiske y Sublarow 3 adaptado al uso de los volúmenes de reacción de 3,5 y 10 ml. Cuando las cantidades para determinar fosfato eran del orden de 1 a 3 microgramos se siguió el método de Berenblum y Chain 1•

Diciembre 1967 INVESTIGACIONES SOBRE NU EVA SERIE DE f'OSFOLIPIDOS 189

Deter111i11ació11 de las manchas de fosf a­lo. Las manchas que contienen fosfato en el cromatograma y electrograma fue­ron localizadas por el método de Wade y Morgan 17•

Experimentos con cortes de tejido. Los cobayas fueron decapitados y el cerebro separado cuidadosamente para evitar nl­teración de la corteza. El cerebro se en­frió en solución salina isotónica. Los cor­tes se prepararon con microtomo Stadie­Riggs 16

• Se cortó una lámina de cada he­misferio; los cortes fueron pesados y si­tuados en vasos de incubación. Las lá­minas de tejido cerebral se incubaron en solución salina de bicarbonato de Krebs ­Henseleit 13 a la que se había añadido previamente orlofosfato radioactivo. Este medio contenía 1 mg de glucosa por ml. El peso de las dos láminas de cobaya era aproximadamente de 400 mg. El vo­lumen medio de incubación en cada fras­co era de 3 a 4 ml. El medio de incu­bación se mantenía gaseado con C02 5 % y º" 95 % antes de usarlo. Después de la introducción del tejido en el frasco de incubación se gaseaba de nuevo y se tapaba . El frasco se introdujo en un in­cubador metabólico a 37º e durante un período de 3 a 4 horas.

Extracción de lípidos. La extracción de lípidos en las pequeñas muestras de te­jido se llevaba a cabo de acuerdo con el método descrito por Hokin y Hokin 16.

El tejido fue homogeneizado en ácido tri ­c1oroacético al 5 % o ácido perclórico 0,3 M. El homogenado era entonces cuan­titativamente tr~nsferido a los tubos de centrífuga y se centrifugaba a 4° e du­rante 10 minutos. El líquido sobrenadan­te se descartaba. El residuo se lavaba dos veces más resuspendiéndolo de nuevo en ácido tricloroacético al 5 % o ácido per­clórico 0,3 M. El residuo se resuspendía en 2 mi de etanol 95 % y 2 ml de cloro­formo . Los tubos bien tapados se mante­nían en la cámara fría durante la noche. Al día siguiente se añadía 5 ml de HCl

0,1 N ; la mezcla se emulsionaba por procedimiento mecánico.

Después de centrifugación a 30.000 x g se fo rmaba una capa de cloroformo que contenía todos los lípidos en disolución. El etanol se extraía en la fase acuosa, y las proteínas se separaban como un es­peso disco en la interfase entre la capa acuosa y la orgánica. La cantidad de di­sclvente mencionado arriba se utilizaba cuando el peso del tejido que había que extraer era menor que 500 mg.

De la capa de cloroformo se tomaban partes alíquotas para la determinación de fosfato, radiactividad total, y cromato­grafía de lípidos.

Cromaíografía en papel de fosfolípidos conocidos. La separación de los dife­rentes fosfolípidos conocidos se realizó por cromatografía en papel a~cenden'.e utilizando papel impregnado con ácido silícico como se ha descrito por Mari­netti y colaboradores 15. Como disolven· te se utilizó una mezcla de diirnbutil'.::e­tona, ácido acético y agua en la> propor­ciones de 40: 25: 5. Este disolvente se­paró muy bien todos los fosfolípidos co­nocidos. La localización de las diferen­tes manchas se consiguió por tinción con Rodamina G. Se disolvió 10 m¡z de Ro­damina G en un litro de agua destilada . Los cromatogramas se sumergían en e't1 disolución y después se enjuagaban con agua destilada. Los cromatogramas se se observaban a la luz ultravioleta mien­tras todavía estaban mojados ; los dife­rentes fosfolípidos aparecían como man­chas amarillo o púrpura.

Cromatografía en papel de fosfolípidos A, B y C. En el presente trabajo los ha­llazgos previos de Hokin y Hokin 7 los hemos confirmado. Fracciones de par­tículas de citoplasma cerebral cuando fueron incubadas en condiciones de fos­forilización oxidativa, incorporaban P32

en algún material lipoideo no identifica­do el cual no se podía separar en el sis-

190 E. SANTIAGO Vol. XI

tema de diisobutilcetona descrito más arriba. Este material no identificado se separó en tres manchas cuando el lípido radiactivo se extraía sobre papel impreg­nado de ácido silícico con fenol satura­do con NH3 al 0,1 % como disolvente. Estos compuestos no identificados se les llamó fosfolípidos A (Rf 0,09), fosfolí­pido B (Rf 0,36) y fosfolípido C (Rf 0,51). El valor de Rf varía de uno a otro pa­pel con un cierto margen ; pero el incre· mento en uno corresponde siempre con el incremento similar en todos los otros. Estas variaciones en el valor de Rf eran al parecer debidas a diferencias en el grado de impregnación o humedad del papel.

Prepllr(t(:wn r.lel clisolveníe. .c1 u11;01-

vente fenol-NH3 se preparó fresco cada vez de una disolución patrón. Esta diso­lución patrón contenía cristales de fenol, 2,27 kg y agua destilada 520 ml. El di­solvente cromatográfico se preparó mez­clando 99 ml de esta disolución con l ml de NHa concentrado. A esta mezcla se añadía 30 mg de 8-hidroxiquinolina. La adición de este reactivo se encontró que era necesario para obtener una buena re­solución. Más de 15 microgramos de fós­foro de fosfolípidos se podría aplicar al papel en una mancha sola. Los cromato­gramas se desarrollaron a 27º c durante un período de 40 a 48 horas.

'-:~i Autorradiogramas. Los autorradiogra­mas se prepararon por fijación de pelícu­las de rayos X a los cromatogramas. El tiempo de exposición era de un día cuan­do se aplicaba a una sola mancha apro­ximadamente 10.000 impulsos por minu­to, y se esperaba separar tres o cuatro compuestos. Este tiempo era de dos días si se había aplicado 5.000 y diez días si se empleaban 1.000. Una vez que las películas se habían re­velado y secado, se hacían coincidir con los cromatogramas. Las manchas se marcaban con lápiz y se cortaban para medirlas.

Medida de la radiactividad. Todas las muestras radiactivas se medían por un contador de flujo de gas con una venta­na de micromil. Círculos de papel que contienen las manchas de los cromato­gramas se ponen en los transportadores del contador y se miden directamente. Las soluciones ordinariamente se ponían en copas de aluminio y se secaban bajo rayos infrarrojos. Ocasionalmente el ma­terial disuelto en disolventes muy volá­tiles se evaporaba en pequeños círculos de papel y después se medía. La radiactividad se expresaba como im­pulsos por minuto, corregidos en cada caso.

Cromatografía en columna de ácido silí­cico. Hanahan y col. 4 utilizaban co­lumna de ácido silícico para separación cromatográfica de los diferentes fosfolí­pidos por medio del uso de varias mez­clas de cloroformo-metanol en las pro­porciones de 7:1, 4:1, 3:2 y 1:4 se ob­tuvieron más de 5 fracciones de fosfolí­pidos diferentes. Se obtuvo la elución de un fosfolípido de bajo contenido en ni­trógeno y después fracciones de fo3fati­diletanolamina, fosfatidilserina, inositido­fosfato, fosfatidilcolina y esfingomielina. En nuestro trabajo intentamos una co­lumna similar a la que utilizaban Hana­han y colaboradores 4 para estudiar los tipos de elución de fosfolípidos A, B y C. El método es el siguiente :

Marcado de los fosfolípidos. Los fos­folípidos se marcaban por incubación de cortes cerebrales preparados por el mé­todo descrito. Un me de P32 inorgánico se añadió al medio de incubación. La incor­poración total en fosfolípidos fue de 10.000.000 cpm.

Preparación de la columna. 4 g de áci­do silícico (reactivo para análisis de Ma­llinckrodt) se mezclaban con 2 g de "Hy­flo Super-Cal"; esta mezcla se deseca­ba durante 3 horas a 105° C. Después de enfriamiento, se ponía en columna de

f)i<'ie111brc 1%7 INVESTIGACIONES SOBRE NUEVA SERIE DE FOSFOLIPIDOS 191

vidrio. Se pasaba más cloroformo por la columna hasta que la altura de ácido si­lícico quedaba constante.

Una parte alíquota del extracto lipídico total, conteniendo 828.000 cpm y 1.200 microgamos de fósforo fosfolípido, se desecaba bajo nitrógeno y se guardaba "in vacuo", durante 3 horas. El residuo era redisuelto en 1 ml de cloroformo y aplicado a la parte superior de la colum­na de ácido silícico. La columna se lava­ba con 80 mi de cloroformo con el cual no había elución de ningún compuesto radiactivo. En este punto la columna se situaba en un colector de fracciones y se pasaban de cloroformo y etanol. Las pro­porciones y volúmenes de estas mezcla5 eran !as siguientes:

Cloroformo/metano! en la proporc1on de 7:1,80 mi; 4:1,80 mi; 3:2,160 ml; 1 : 4,80 ml; y metano! sólo 80 ml. El flu­jo era aproximadamente 1 mi por minu­to. Después de un breve período de tiem­po este flujo disminuía apreciablemente y era necesario aplicar alguna presión para mantenerlo constante. Se recogían 10 fracciones de ml. La fi,crnra 1 mues­tra la &;tribución de la radiactividad en el eluato. La cantidad de fosfato en tu­bos 3, 27, 33, 37 y 64 también se deter­minaban y el resultado se marcaba en una gráfica.

Puede verse que los compuestos de alta actividad específica están en el pico de elución, con una mzcla de cloroformo y etanol en la proporción de 7: 1.

o~

<to 75.000 ~m >::> f=i-50.000 u----<t¿ _Q Ou25.000 &~

Distribución Pll co11tracorrie11te. La dis­tribución contracorriente se ha utilizado por Lovern 11 y más recientemente por Hürhammer y colaboradores 12 para la preparación de los diferentes fosfolí pi­das. En nuestro trabajo las posibilidades de esta técnica para la separación de fos­folípidos A, B, y C también la hemos en­sayado.

Los experimentos preliminares de parti­ción 103 hemos realizado utilizando la fracción que se obtiene por elución de una columna de ácido silícico con una mezcla de cloroformo/etanol en la pro­porción de 7: 1 como se cita en lo> ex­perimentos anteriormente descritos. Una parte alíquota del tubo número 3 .~fosfo­lípidos A, B y C y ácido fosfatídico) se evaporó en nitrógeno. El residuo se re­disolvió con 2 ml de la fase superior y la fase inferior de un par disolvente, el cual se había preparado mezclando 6 ml de éter de petróleo (punto de ebullició11

30º-60º) y 4 ml de metano! al 97 º~ (sis­tema "éter de petróleo"). La me:o:cla de estos disolventes fácilmente se cemró en dos fases de volumen casi igual, siendo la primera más rica en éter de petróleo. Después de redisolver los fosfolípidos de ambas fases, 2 ml se juntan mezcbndobc; por completo con varilla de vidrio. De>­pués las dos fases se separan y se mide la radiactividad de una parte alíquota de cada una de ellas. La fase superior se encontró que contenía 1.600 cpm y la in­ferior 550 cpm.

El residuo de la fase superior se separó

80

1oo'c lD -o -50 -j

90

e (IJ

o Fig. l. Cromatografía en columna de ácido si­lícico de un extracto de

lípidos totales.

192 E. S ANTIAGO Vol. XI

cuidadosamente del de la fa se inferior y se desecó bajo nitrógeno. Su contenido de nuevo se redisolvió con 2 ml de la fa se superior y la fase inferior del par de di­solventes. En la fase superior se obtie­nen 1.400 cpm y en la fa se inferior 100 cpm.

Se realizó una experiencia similar de par­tición utilizando otro par de disolventes ("sistema benceno") preparado del si­guiente modo :

Cloroformo Benceno .. . Metano! .. . Agua .. . .. .

15 mi 15 " 23 "

7 "

La mezcla de estos disolventes fácilmen­te se separó en dos fa.ses, la inferior más rica en cloroformo y benceno.

Una parte alíquota del tubo 3 contenien­do fosfolípidos A, B y C se desecó bajo nitrógeno y se redisolvió con 2 ml de la

HOMOGENADO ~TCA

fase superior y fa se inferior. Después de mezclar con va rilla de vidrio se toma­ron partes alíquotas de las dos fases para la medida.

La di stribución de radiactividad era :

Fase superior .. . . .. . .. Fase inferior . . . . . . . . .

600 cpm. 1.661 "

De nuevo vemos que la radiactividad se relaciona preferentemente con la fa se me­nos polar, en este caso la inferior.

Esquema genernl para la purificación de fosfolípido A. Después de la experien­cia obtenida con lo anteriormente indi ­cado se decidió seguir un esquema (fig. 2) en el cual se podían utilizar va­rias técnicas combinadas para obtener fracciones de fosfolípido A purificadas.

Para marcar los fosfolípidos se incuba­ron cortes de cerebro en un medio salt­no-bicarbonatado de Krebs-Henseleit 13

ACIDO SOLUBLE

PRECIPITADO 1. CHCL3 :EtOH1:11

2. 0,1NHCl

L CHCl3 GRASAS NEUTRAS

~ \l' LI PIDOS INTERFASE i PROTEINAS

CROMATOGRAFIA ACIDO s1Uc1co

A. FOSFATIDICO FOSFOLIPIDO A FOSFOLIPIDO 8 FOSFOLIPIDO C

+ ACIDO SOLUBLE

D.C. E . PETROL.EO O O FOSFOLIPIDO A+

A . FOSFATIDICO 97 % tv1 e OH D D O O O O O O O O . 1

D.C. + Me.OH O O O O O O O O O O FOSFOLIP/DO A+

BENCENO O O PRODUCTO DE DEGRADACION

F ig. 2. Esquema gene­ral de la purificación de

fo sfolípido A.

Diciembre 1967 INVESTIGACIONES SOBRE NUEVA SERIE DE FOSFOLIPIDOS 193

como se describe en Métodos. La canti­dad de P32 inorgánico afíadido al medio varió de l a 2 me y la incubación de 3 a 4 horas. La extracción de los lípidos se realizó como se describe en Métodos.

Antes de la cromatografía en columna de ácido silícico el total de lípidos extraído se desecó bajo nitrógeno y se guardó "in vacuo" en hidróxido sódico durante 3 ho­ras. Cuando no se tomaron estas pre­cauciones todos los fosfolípidos fueron eluidos en un solo pico de la columna cromatográfica de ácido silícico.

La columna cromatográfica se preparó del siguiente modo: ácido silícico (5 g), se desecó a 105° e durante 2 ó 3 horas. ~¡:;s l'"\flC'A J:lr\ r>r..l11"'t"'n1'11n ,-l,... 'tT:....l .... ~.-.. ,..:J,... 1 ,..,,--.._,,..., _!-' ..._.._,v VJ.J. VVJ. UJ..1.1.UU U\..- V lULlU UG l \Al!

de diámetro. Más 2 mg de fósforo fos­folípido que se podían aplicar a tal co­lumna. Después de obtenidas las man­chas, la columna se lavó con 80 ml de cloroformo haciendo de este modo elu­ción de todas las grasas neutras 2• Des­pués se pasó una mezcla de cloroformo/ etanol en la razón de 7: 1 ; los primeros 40 mi de eluato de esta mezcla de disol­vente se coleccionaron. Este eluato se de­secó bajo nitrógeno a temperatura am­biente y el residuo sujeto a distribución contracorriente en el "sistema éter de pe­tróleo". Esto se utilizó corrientemente para la redisolución de eluato de fas-

El material dejado en la fase superior se tomó para desecación bajo nitrógeno y se sometió a distribución contracorriente en el "sistema benceno". 10 ml de la fase inferior de este sistema se utilizaron para disolver el residuo de fosfolípidos. Esta fase inferior se pasó por 10 embudos de decantación cada uno conteniendo 10 mi de la fase superior. Cromatografía de pa­pel en ambos sistemas diisobutilbenceno y fenol-NH3, mostró que esta fase inferior contenía fosfolípido A y una menor can­tidad del producto de degradación que tenía un Rf más bajo que el fosfolípi­do A. El comportamiento semejante en todas las fases del fraccionamiento podía significar que estos dos compuestos fuesen muy próximos en su estructura química. Después de este esquema de purificación se vio que la razón de fosfolípido A al producto de degradación era aproxima­damente 2 : 1.

Se encontró que el orden descrito en este esquema era el más conveniente para la mejor recuperación de fosfolípido A. La separación de grasas neutras y la mayo­ría de los fosfolípidos por cromatografía de columna con ácido silícico evitaba la formación de emulsiones durante la dis­tribución de contracorriente.

La Tabla I muestra los resultados de la purificación de fosfolípidos A cuando se siguió el esquema descrito.

TABLA I Purificación del fosfolípido A

Para marcar los fosfolípidos los cortes de cerebro (428 mg) se incubaron en un medio salino con bicarbonato de Krebs-Henseleit 13, Se añadió 1 mg de P32 inorgánico. Los de­talles de esta incubación se dan en Métodos.

Fracción

Extracto de lípido total Acido silícico, 57: 1 C: M "Sistema éter de Petróleo", fase superior "Sistema benceno", fase inferior

Total cpm

13.150.000 3.720.000 1.890.000 1.810.000

Productos Fosfolípido A de degradación

1.100.000 510.000

folípidos 10 ml de la fase superior y ex­traído 10 veces con 10 ml de la fase inferior.

El estudio que hemos realizado conti­nuando estas investigaciones será objeto de ulteriores publicaciones.

194 E. SANTIAGO Vol. XI

SUMMARY

Studies 011 a New Series of Metabolically active Phospholipids

Hokin and Hokin showed in 1958 that, when brain cytoplasmic fractions were incubated under optima! conditions for oxidative phos­phorylation, radioactive orthophosphate incor­porated into sorne unidentified phospholipi­des. These unidentified phospholipides were resolved by paper chromatography into three discrcte spots; the paper chromatographic

system consisted of silicic acid impregnated . paper with phcnol saturated with 0.1 % Nfü

as the solvent. These three spots were called phospholipides A (Rf, 0.09), B (Rf, 0.30) and C ( Rf, 0.51). The present work was aimed at the study of sorne properties of these compounds; the iso­lation and purification of one of them.

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