Universidad del Mar

FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DE PROTOCOLOS DE PROYECTOS DE

INVESTIGACIÓN

1.       CONCENTRADO DE INFORMACIÓN

1.1    Instituto de investigación: INSTITUTO DE INDUSTRIAS

1.2    Línea de investigación: BIOTECNOLOGÍA

1.3    Título del proyecto: ESTUDIO INTEGRADO DE LA INCIDENCIA DE

Phytophthora EN LOS CULTIVOS DE PAPAYA EN LA ZONA COSTA DE OAXACA.

1.4    Director del proyecto: M. EN C. FRANCISCO GUMARO RUIZ RUIZ

1.5    Beneficiarios de los productos de la investigación: ESTUDIANTES DE LA UMAR

CAMPUS PUERTO ESCONDIDO QUE PARTICIPARÀN EN EL DESARROLLO

DE LA PRESENTE INVESTIGACIÓN; PRODUCTORES DE LA ZONA COSTA DE

OAXACA; CINVESTAV U.I.

1.6    Duración estimada del proyecto: 12 meses.

1.7    Monto solicitado para proyecto: 22,000.00 MN.

FUENTE MONTO (EN PESOS)PORCENTAJE DEL

MONTO TOTAL

Otras instituciones:    

Usuarios:    

Otras fuentes:    

UMAR: 22,000.00

TOTAL 22,000.00 100%

1

1.8 Preguntas sobre financiamiento:

1.8.1 ¿Actualmente su proyecto está en proceso de evaluación por una Institución externa a

la UMAR? No

1.8.2 ¿El proyecto fue evaluado anteriormente y no obtuvo recursos? SI. En caso

afirmativo, responda a las siguientes preguntas:

1.8.2.1 ¿Qué institución lo evaluó?

Universidad del Mar

1.8.2.2 ¿En que mes y año fue evaluado el proyecto?

Marzo/2009

1.8.2.3 ¿Cuáles fueron las razones por las cuales no fue apoyado el proyecto?

Falta de recursos económicos

1.9     Preguntas sobre normatividad:

1.9.1 ¿Está plenamente enterado de la normatividad ambiental y de otra índole, relevante

para las actividades que se pretenden llevar a cabo en el proyecto? Si

1.9.2   Se requerirá obtener permisos de algún tipo? SI

1.9.3   En caso afirmativo, describa qué tipo de permisos, indique para qué actividades, y

mencione la instancia ante la cual habrá que tramitar dichos permisos:

Localizar las zonas de colecta.

Permisos a productores de papaya para colecta de tejido afectado.

Acudir a la realización de colectas de tejido vegetal en las zonas previamente

ubicadas.

2

1.10  Firma del director del proyecto: 

2. PROTOCOLO DEL PROYECTO

2.1     Descripción del problema o situación a investigar:  

A nivel internacional las pérdidas de diversos cultivos causados por el ataque de diferentes

plagas y enfermedades es altamente considerable, así como el uso de pesticidas para

contrarrestar los daños producidos, a su vez es importante mencionar la contribución que

presentan las enfermedades fungosas debido a su diversidad y la dificultad de

erradicación[1]

3

Uno de los principales agentes fitopatógenos con una gran diversidad de especies, es

conocido como Phytophthora, los cuales atacan a una amplia variedad de cultivos [2]

Dentro de las actividades agrícolas de mayor importancia económica en Oaxaca destacan,

el cultivo de café, limón, papaya, mango, cacao, coco, chile; esta producción de cultivos

perennes se obtiene de los siguientes distritos [3]:

Huajuapan de León

Valles centrales

Costa

Istmo

Cañada

Tuxtepec

Siendo la Papaya, uno de los principales cultivos que destaca en el distrito de la costa.[4]

La disminución de los rendimientos obtenidos en algunos de estos cultivos a nivel nacional

son ocasionados entre otros factores por enfermedades y plagas causadas por bacterias

(Enterobacterium cloacae) y pudrición púrpura por Erwinia herbicola, hongos (Fusarium,

Rhizoctonia, Collectotrichum, Alternaria solani, entre otros), virus (v. de la mancha

anular), oomicetos (Phytophthora sp), insectos (ácaros, dípteros, homópteros, hemípteros) y

nemátodos [5]

Debido a esto, es importante realizar un estudio preliminar enfocado a la incidencia de

Phytophthora en los cultivos de papaya para así lograr su aislamiento e identificación como

agente patógeno, una vez caracterizado se procederá a realizar investigaciones futuras para

su control con compuestos naturales.

2.2 Estado del conocimiento y contribución:  

Antecedentes:

El género Phytophthora (del griego Phyton: planta: phthora: destructor) fue creado por

Bary en 1876 con P. infestans de Bary como especie tipo. Este investigador reconoció a

dicho agente como causante del “blight” tardío en la Patata, En Europa (1840) previamente

identificado como “Botrytis infestans” y luego como Peronospora infestans[6]

4

Phytophthora presenta la siguiente clasificación taxonómica

Reino Stramenopila

División Oomicota (mohos acuáticos)

Subdivisión Mastigomicotina

Clase Phycomycetes

Subclase Oomycetes

Orden Peronosporales

Familia Pythiaceae

Genero Phytophthora

La clasificación de Phytophthora según tabla 1; la cual pertenece al Reino Straminipila [7],

Orden Peronosporales, Familia Pythiaceae. Es un organismo patógeno de plantas

dicotiledóneas [8], en donde la especie phytophthora capsici fue primero descrito por

Leonian en 1922 en Nuevo México el cual es patógeno de chile [9].

Debido a su crecimiento filamentoso y a las características morfológicas superficiales que

comparten con los hongos, los oomicetos habían sido considerados dentro del reino fungi.

Entre estas características se encuentran: la diferenciación del apresorio para romper la

barrera física de las plantas; la variedad de esporas adaptadas a la dispersión aérea

(conidias) y acuática (zoosporas); la persistencia de éstas por un largo tiempo

(clamidiosporas) y el heterotrofismo [10].

Sin embargo, análisis moleculares (basados en las secuencias de genes conservados tales

como los de 18S rARN, actina y tubulina [10], filogenéticos y bioquímicos revelaron que

los oomicetos evolucionaron a lo largo de una línea diferente de los ascomicetos y

basidiomicetos, por lo que tienen poca afinidad taxonómica con el reino fungi y están más

cercanamente relacionados con las algas cafés y diatomeas [12] que pertenecen al reino

Straminipila, grupo cuya característica diferencial es la posesión de cabellos tubulares de

ultraestructura tripartita (mastigonemas) en el flagelo anterior (filamentoso) de las esporas

móviles y de un flagelo posterior liso [7,13]

5

Tabla 1. Clasificación de Phytophthora

Otra característica que diferencía a los oomicetos de los hongos es que los primeros

sintetizan lisina vía diamino-pimelato, mientras que los hongos la sintetizan vía α-amino-

adipato [14,10]. Por otra parte los oomicetos tienen cresta mitocondrial tubular, son

diploides en el estado vegetativo y en el caso particular del género Phytophthora, la falta de

epoxidación del escualeno a esteroles, los distinguen de los hongos verdaderos [15].

Algunas especies de Phytophthora

Phytophthora capsici

La especie phytophthora capsici fue primero descrito por Leonian en 1922 en Nuevo

México [9].

Afecta severamente la producción de una amplia variedad de cultivos a nivel mundial. En

1996, Erwin y Ribeiro reportaron 49 especies de plantas que son infectadas por este

patógeno siendo las principales: chiles rojos y verdes (Capsicum annuum), pimienta (Piper

nigrum), tomate (Lycopersicon esculentum), sandía (Citrullum lanatus), melón dulce

(Cucumis melo), pepino (Cucurbita pepo), berenjena (Solanum melongena), melón chino

(Cucumis melo), diversas especies de calabaza (Cucurbita maxima, Cucurbita mostacha),

cocoa (Theobroma cacao), espinaca (Spinacia olerace), acelga (Beta vulgaris var. cicla),

remolacha (Beta vulgaris), frijol (Phaseolus lunatus), nabo (Brassica rapa), macadamia

(Macadamia integrifolia) [16; 17; 18; 19].

Phytophthora citrophthora y Phytophthora parasitica

Su acción es en los cítricos, las enfermedades que estas especies producen en los cítricos se

conocen como [20; 21; 2]

La podredumbre del cuello de la raíz y parte basal del tallo

La gomosis

El aguado o podredumbre marrón de los frutos.

6

Phytophthora cinnamomi

Afecta específicamente el aguacatero, con la pudrición de las raíces, se ha reportado que

son cuatro especies la que atacan a este cultivo, provocando la pudrición de las raíces, el

declinamiento de las plantas de semillero [2]

P. cinnamomi, P. citrícola, P. palmivora, P. heveae

Phytophthora palmivora

La pudrición de la yema causada por especies del genero Phytophthora fue reportada por

primera vez en Grand Cayman (1834) y descrita subsecuentemente en Cuba, India,

Filipinas, Jamaica, África, constituyendo una de las enfermedades mas devastadoras del

cultivo del coco [22]

La importancia de la actividad agrícola en la zona costa

El estado de Oaxaca colinda al norte con Puebla y Veracruz; al este con Chiapas; al sur con

el Océano Pacífico; al oeste con Guerrero. Con las siguientes coordenadas; Al norte 18°39',

al sur 15°39' de latitud norte; al este 93°52', al oeste 98°32' de longitud oeste.[23]

La Agricultura es la principal actividad del sector primario, caracterizada por ser extensiva,

temporal, tradicional y de subsistencia; debido a que la mayor parte de la población es

rural, este sector absorbe el 51.39 % de la población ocupada, cuyo rasgo es la ser mano de

obra no calificada; además de considerarse como población que vive en la marginación,

pobreza y pobreza extrema, siendo uno de los factores que inciden en el alto grado de

migración

Pese a lo anterior, existen zonas privilegiadas por la naturaleza, con potencial agrícola y

frutícola, como lo es la región del Papaloapan o de Tuxtepec, colindante con el estado de

Veracruz; así como parte de la región del Istmo considerada por su ubicación, como

estratégica, en lo particular la zona de los Chimalapas, Tapanatepec, Chahuites y Matías

Romero; en la región de la Costa: Jamiltepec, Juquila y Pochutla; en la región de la Sierra

Sur: la zona de Putla de Guerrero.[24]

7

La papaya (Carica papaya) es uno de los frutos tropicales con mayor demanda nacional e

internacional. En México en el año 2007 se cultivaron aproximadamente 22,623 Ha, tanto

de riego como de temporal, siendo los principales estados productores Veracruz, Chiapas,

Michoacán Yucatán, Oaxaca, Tabasco, Guerrero, Colima. El estado de Veracruz ha

ocupado el primer lugar en superficie plantada y en producción de este frutal (Tabla 2) [4].

Sin embargo,

diversos factores afectan la producción de este fruto, siendo los principales las plagas y las

enfermedades, los cuales reducen el rendimiento de un 5 a un 100% [4]

8

Tabla 2. Principales productores de papaya a nivel nacional

Ubicación

Sup.

Sembrada

Sup.

CosechadaProducción Rendimiento PMR

Valor

Producción

(Ha) (Ha) (Ton) (Ton/Ha) ($/Ton)(Miles de

Pesos)

BAJA

CALIFORNIA

SUR 16 16 376.4 23.52 6,732.20 2,534.00

CAMPECHE 250.5 163 5,752.68 35.29 3,308.32 19,031.73

CHIAPAS 2,201.00 2,049.00 150,467.71 73.44 3,510.52 528,220.21

COLIMA 1,027.00 985 46,443.00 47.15 3,662.53 170,098.70

GUERRERO 1,269.00 1,267.00 29,961.90 23.65 2,752.84 82,480.25

HIDALGO 5 1 6 6 5,000.00 30

JALISCO 713.2 666 32,670.50 49.06 2,844.49 92,930.86

MEXICO 28 28 698 24.93 4,055.87 2,831.00

MICHOACAN 1,717.00 1,515.00 51,831.40 34.21 3,255.30 168,726.57

MORELOS 122.1 119.1 3,275.00 27.5 7,181.50 23,519.40

NAYARIT 487.7 436.7 8,450.00 19.35 2,371.83 20,042.00

OAXACA 1,383.00 1,309.00 77,328.60 59.08 2,583.61 199,786.84

PUEBLA 87.5 82.5 2,577.50 31.24 3,015.32 7,772.00

QUINTANA

ROO 313.3 194.8 10,537.17 54.09 2,353.33 24,797.47

SAN LUIS

POTOSI 349 126 2,899.80 23.01 2,297.64 6,662.70

SINALOA 392 392 11,276.00 28.76 2,023.99 22,822.50

TABASCO 641.5 618.5 23,025.00 37.23 2,808.04 64,655.03

TAMAULIPAS 363 357 7,010.00 19.64 3,648.50 25,576.00

VERACRUZ 9,837.75 9,635.75 398,031.00 41.31 2,574.68 1,024,802.30

YUCATAN 1,419.50 984.52 56,807.40 57.7 3,689.01 209,562.85

22,623.05 20,945.87 919,425.06 43.9 2,933.23 2,696,882.40

La pudrición radical de la papaya es considerada una de las enfermedades más importantes

que afectan a este cultivo a escala mundial, Dado que esta enfermedad generalmente es de

lento desarrollo en el hospedante, el daño mayor se presenta luego del primer año de edad

de la plantación, dando oportunidad al productor de cosechar parte de la producción, sin

embargo su impacto más importante está relacionado con la reducción en la vida útil en la

plantación, se tiene reporte que en una plantación de papaya en Costa Rica no dure más de

18 meses mientras que en la literatura se tiene reportado que debería de durar de 24 a 36

meses [25].

El agente causal de esta enfermedad ha sido identificada como Phytophthora palmivora

[25]

Teniendo como conocimiento que el distrito de la costa el principal productor de papaya en

el estado de Oaxaca en el año 2007 (tabla 3).[4]

Se procederá a identificar a los principales productores de la zona costera para realizar las

colectas de tejido, analizarlas para determinar la incidencia de este agente patógeno

responsable de grandes pérdidas a nivel mundial ya que no existe reporte alguno sobre este

agente patógeno en la franja costera.

Contribución:

Los resultados de este primer proyecto nos ayudarán para:

1.-Identificación de la especie de Phytophthora como el agente causal de la pudrición

radical en papaya en la zona costera.

2.- Que los alumnos interaccionen con el sector agrícola, validando sus conocimientos ante

problemas que atañen a su estado natal.

3.-Implementación de una metodología adecuada para realizar el diagnóstico oportuno del

agente patógeno (Phytophthora sp), de acuerdo a sus características y daños que provoca,

esto es indispensable para sentar las bases que permitan proyectar investigaciones futuras

9

para ampliar el conocimiento en cuanto el control y el manejo de los daños que este agente

patógeno genera.

2.3     Objetivos: 

2.3.1    Objetivo general del proyecto: 

Identificación de Phytophthora como el causal de la enfermedad en los cultivos de papaya

en la región costa

2.3.2    Objetivos específicos del proyecto, actividades a realizar, e indicadores de

cumplimiento de los objetivos específicos

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ACTIVIDADES INDICADORES DE

CUMPLIMIENTO

No. Descripción No. Descripción  

1  Localización de las áreas

de colecta

1 

2

 Realizar el estudio de las

diferentes zonas de cultivo

Identificación de plantas

que presentan los síntomas

característicos producidos

por los agentes fungosos

Generar encuestas a

productores que

estén relacionados

con la actividad del

cultivo de papaya en

relación a la

superficie sembrada,

volumen cosechado,

pérdidas causadas

por agentes

patógenos

Obtención de

fotografías, datos

geográficos y

colectas de tejido en

las zonas afectadas

10

(previamente

seleccionadas)

  2  Aislamientos y

multiplicación de cepas

   Realización de resiembras

consecutivas en medios de

crecimiento previamente

seleccionados.

  Obtención de cepas

  3 Caracterización

morfológica 

  Características de la

colonia, micelio y presencia

de anillos radiales

Obtención de

fotografías de las

cepas para

identificar su

morfología e

identificarlas de

acuerdo a los

procedimientos de

caracterización

morfológica en la

literatura

4 Caracterización

molecular

1

2

3

Diseño y síntesis de

oligonucleótidos

específicos, para la

amplificación de una región

altamente conservada de

Phytophthora

Extracción de ácidos

nucleicos y uso de la

reacción de la cadena de la

polimerasa (PCR) usando

los oligonucleótidos como

cebadores y ADN de las

Identificación de

Phytophthora por

biología molecular

11

cepas

Electroforesis en gel de

agarosa para la

visualización de los

fragmentos amplificados,

correspondiente a la

secuencia conservada.

2.4 Métodos y técnicas:

Metodología

1.- Recopilación de información sobre los principales productores de los cultivos de

papaya

2.- La colecta se llevará a cabo en el presente año que comprenderá campos pertenecientes

a los municipios de la zona costera, se colectará tejido de 10 a 12 plantas enfermas de cada

uno de los campos seleccionados, recopilando información gráfica de las plantas enfermas,

datos geográficos de las colectas y características de suelo.

3.- Obtención de aislados de Phytophthora se obtendrán de acuerdo al siguiente el

procedimiento

1. Mantener el tejido a -20ºC debidamente etiquetado hasta que sea tratado.

2. Cortar la parte aérea de la planta, dejando aproximadamente 10 cm de tallo y la

raíz. Etiquetar la raíz y el cuello del tallo. Conservar las raíces a 4ºC en caso de no

ser tratadas inmediatamente.

3. Lavar la raíz de la planta con agua para eliminar el exceso de tierra.

4. En ambiente aséptico: hacer un pequeño corte al cuello del tallo con bisturí estéril.

Seleccionar las dos raíces más gruesas y cortar pequeños discos (de 1 mm de

12

espesor aproximadamente) a 3 niveles: cerca del nacimiento, a la mitad y en la parte

inferior de la raíz. Conservar la raíz etiquetada a 4 ºC.

5. Colocar los segmentos en caja petri y tratar por 2 minutos con hipoclorito de sodio

al 1%.

6. Lavar 2 veces con agua destilada estéril

7. Del trozo que se cortó del cuello del tallo obtener dos fragmentos muy pequeños.

8. Secar los fragmentos de raíz y tallo con papel absorbente estéril

9. Colocar los fragmentos en medio PDA acidificado (200 μL de ácido láctico al 85%)

10. Verificar a las 24 horas si hay crecimiento de Phytophthora. Si existe crecimiento

tomar una punta de hifa con una aguja de disección estéril y purificarla en caso de

estar contaminada con bacterias. En caso de no presentarse crecimiento a las 24 h

verificar a las 48 h.

11. Una vez que se ha purificado el aislado, transferirlo a medio V8 clarificado.

Identificar en cada aislado si procede de raíz o de tallo.

4.-Obtención de cultivos monozooporicos de cada uno de los aislados obtenidos,

siguiendo el procedimiento

1. Colocar 3 cuadros de 1 cm2 de agar con micelio en medio líquido V8 clarificado

(con Ampicilina y Rifampicina) y dejar en incubación a temperatura ambiente

durante 24 ó 48 horas.

2. Después de obtener crecimiento de micelio, separarlo de los cuadros de agar y

lavarlo con agua destilada estéril y volver a incubar a 28ºC durante 8-10 horas.

3. Comprobar al microscopio la formación de zoosporangios utilizando el lente de

10X.

4. Reventar los zoosporangios, cambiando el agua donde está suspendido micelio por

agua estéril a 4 ºC, mantener a esta temperatura durante una hora.

5. Dejar a temperatura ambiente por 1 hora.

6. Revisar al microscopio (10X) si las zoosporas fueron liberadas por el zoosporangio.

7. Al observar las zoosporas liberadas se toman de 25 a 100 μL de agua y se extienden

en una caja con PDA (por la claridad del medio) con una varilla de vidrio.

13

8. Verificar el crecimiento de la germínula a las 4 y 6 horas. Al ser visible el

crecimiento de la germínula, se extrae ésta con ayuda de una aguja de disección

estéril y se coloca en una caja de PDA.

9. Revisar a las 24 horas si hay crecimiento de bacterias. De ser así purificar

extrayendo una punta de hifa.

10. Una vez que se comprueba la pureza del monozoospórico, transferirlo a medio V8

(con antibiótico).

5.- Caracterización de los cultivos monozoospóricos

Se analizaran los morfotipos de cada uno de los cultivos monozoospóricos, determinando la

forma de la colonia y su crecimiento a 35ºC.

6.- Caracterización de la colonia

Transferir un círculo de micelio de 8 mm a una caja con agar V8 clarificado.

Determinar el color de la colonia y el tipo de crecimiento

7.- Obtención de micelio

1. Colocar 1 cuadro de 1 cm2 en caja petri con 10-15 ml de medio líquido V8. Incubar

a temperatura ambiente durante 4-5 días.

2. Separar el micelio que ha crecido del medio de cultivo sólido. Lavar el micelio dos

veces con una solución TE 1X estéril para eliminar residuos de medio.

3. Colocar el micelio en papel absorbente estéril para eliminar el agua.

4. Envolver el micelio en papel aluminio y almacenar en nitrógeno líquido o bien a

-80ºC hasta su molienda

8.-Aislamiento y purificación de ADN

1. Para la Obtención de ADN genómico de Phytophthora se sembraran cuatro discos

de micelio de 1 cm2 procedentes de PDA en matraces de 250 mL, conteniendo 150

mL de PDB. Los matraces se incubaran a 28C con agitación a 125 rpm durante 5

días

2. Teniendo suficiente masa micelial, se procederá a lavarlo quitándole el exceso del

medio con agua destilada estéril

14

3. El paquete celular será colectado en cajas petri, almacenarlas a -20C para su

posterior tratamiento

4. Con ayuda de nitrógeno liquido se procederá a pulverizar el micelio congelado con

el uso de un mortero y pistilo previamente esterilizados

5. EL micelio en polvo será colocado en tubos Eppendorf aproximadamente 500 mg

inmediatamente agregar 500 μL de regulador de extracción estéril NTES

6. Mezclar suavemente la mezcla por inversión de los tubos, agregar un volumen de

fenol:cloroformo, agitar en vortex por 10 minutos

7. Centrifugar a 12000rpm por 30 minutos obteniéndose dos fases

8. Transferir la fase acuosa superior a un tubo Eppendorf limpio

9. Adicionar 500 L de iso-propanol, mezclando por inversión

10. Centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos

11. Desechar el sobrenadante y dejar secar la pastilla

12. Resuspender la pastilla en 200 L de agua desionizada estéril, asegurar que la

pastilla se disuelva golpeando el fondo del tubo Eppendorf para que el ADN quede

en suspensión.

13. Adicionaron 5 L de ARNasa a (1 mg/mL)

14. Incubar durante 30 minutos a 37 °C (la ARNasa debe mantenerse a –20 °C y

descongelarse antes de agregarla a los tubos).

15. Decantar y dejar secar pastilla completamente colocando el tubo invertido sobre una

superficie limpia y absorbente.

16. Resuspender pastilla adicionando 50 μL de TE 1X, mezclando hasta suspender

pastilla.

17. Almacenar a 4 ºC.

18. Cuantificar la concentración de DNA

19. Diluir el DNA a una concentración de 10 ng/ μL.

20. Almacenarlo a -80°C

9.- Amplificación de un fragmento de Phytophthora mediante la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)

15

Se empleará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual, se basa en la

amplificación de una secuencia de ADN específico por acción de la enzima Taq

polimerasa, empleando el ADN del micelio como molde o templado, oligonucleótidos

conservados previamente diseñados ITS1 y ITS4 (White y col., 1990) utilizados para

amplificar la región ITS1 de varias especies, así como un par de oligos diseñados para la

amplificación específica de la región ITS1 del ADNr del género Phytophthora

Por estar diseñados en una región altamente conservada que funcionan como iniciadores

para la síntesis de la molécula, se procederá a programar el termociclador en varios ciclos

de temperaturas de desnaturalización, apareamiento de oligonucleótidos y polimerización,

obteniéndose como resultado el enriquecimiento de la secuencia de ADN contenida entre

los dos iniciadores.

Se empleará una mezcla de reacción para PCR, la cual, será preparada para correr 5

reacciones entre los cuales se deben de incluir controles negativos y positivos, de acuerdo a

lo siguiente:

1.- EN un tubo Eppendorf para PCR adicionar 2.5 μL del oligo ITS1 y 2.5 μLde

ITS4, 100 μL de agua desionizada estéril, 12.5 μL de regulador 10x, 2.5 μL de dNTPs, 1

μL ADN genómico de Phytophthora, 1 μL de Red Taq polimerasa

2.-EL programa constará de 35 ciclos, con tres temperaturas de desnaturalización,

alineamiento y polimerización. Se muestra a continuación

1. Temperatura de ajuste inicial (94 °C por 4 minutos)

2. Desnaturalización inicial de la cadena de ADN (94 °C por 1 minuto)

3. Alineamiento de los oligonucleótidos (50 °C por 1.5 minutos)

4. Polimerización(72 °C por 1 minutos)

5. Temperatura de ajuste final (72 °C por 10 minutos)

6. Temperatura de almacenamiento (4 °C hasta su uso)

Al terminar la reacción de PCR, se procede a visualizar los productos del PCR mediante un

gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio y revelado con luz ultravioleta

16

Al haber comprobado que los fragmentos fueron amplificados, en proyectos futuros se

procederá a realizar reacciones de ligación, transformación con el vector TOPO 2.1 con

dichos fragmentos amplificados.

2.5 Cronograma de actividades: ver anexo 1

2.6  Infraestructura, equipo y mobiliario requerido:

  DESCRIPCIÓN

DISPONIBILIDAD

(EN LA UMAR, EN OTRA

INSTITUCIÓN O USUARIO,

SE NECESITA ADQUIRIR)

INFRAESTRUCTURA:  

   

EQUIPO: Autoclave, centrifuga, Campana de flujo

laminar, Incubadora con agitación, Ultracongelador,

microscopio, potenciómetro y micropipetas automáticas.

 EXISTENTES EN LA UMAR

 

MOBILIARIO: MESA DE LABORATORIO  EXISTENTES EN LA UMAR

Cristaleria: Matraz Erlenmeyer, Probetas, Tubos de

ensaye, cajas de petri y lo referente a material no

consumible.

 EXISTENTES EN LA UMAR

EQUIPO: Termociclador, equipo de revelado y

fotodocumentador

EXISTENTES EN LA UMAR

Diseño y síntesis de iniciadores para PCR. CINVESTAV U.I

2.7 Desglose financiero: ver Anexo 2

17

2.8 Grupo de trabajo:

A. DIRECTOR DEL PROYECTO:

Nombre: FRANCISCO GUMARO RUIZ RUIZ

Grado académico: POSGRADRO (MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERIA

BIOQUÍMICA)

Nivel SNI: NO

Especialidad: BIOTECNOLOGIA EN PLANTAS

B. COLABORADOR(ES):

Nombre: JULIETA KARINA CRUZ VAZQUEZ

Grado académico: POSGRADRO (MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERIA

BIOQUÍMICA)

Nivel SNI: NO

Especialidad: BIOTECNOLOGIA EN PLANTAS

Institución/ Instituto: Instituto de Industrias; Universidad del Mar, Campus Puerto

Escondido

Actividades en las que participará: Caracterización microscópica de Phytophthora

Nombre: Francisco Valdez Martínez

Grado académico: Licenciatura en planeación territorial

Nivel SNI: NO

Especialidad: Cartografía y Ordenamiento Territorial

18

Institución/ Instituto: Instituto de Ecología; Universidad del Mar, Campus Puerto

Escondido

Actividades en las que participará: Caracterización geográfica de suelo

Nombre: Edmundo Lozoya Gloria

Grado académico: Doctor

Nivel SNI: II

Especialidad: Doctor en ciencias con especialidad en Biotecnología de plantas

Institución/ Instituto: Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados del IPN

(CINVESTAV U.I.)

Actividades en las que participará:

Diseño y síntesis de oligos para la amplificación de una secuencia conservada de

Phytophthora.

2.9 Productos esperados de la investigación:

TIPO DE PRODUCTO DESCRIPCIÓN

LIBROS:   N/A

REPORTE TECNICO

Se realizará un reporte técnico sobre la situación de la

afectación de cultivos de papaya con Phytophthora y

conclusión sobre la incidencia del patógeno en los

cultivos de la región costa de Oaxaca.

TESISTA Titulo propuesto: “Caracterización de Phytophthora en cultivos de papaya” Tratará de las diferentes pruebas moleculares realizadas para la caracterización de Phytophthora

PRESENTACIONES  Se harán presentaciones en ciclos de seminarios de la

Umar, conforme a los avances del proyecto y al

19

concluir el mismo.

   

PRODUCTOS

TECNOLÓGICOS: Manual

  Descripción: Se sentarán las bases para la

identificación de Phytophthora en los cultivos de la

costa de Oaxaca.

   

FORMACIÓN DE

RECURSOS HUMANOS:

Núm. de Estudiantes: 1

Nivel Académico Esperado: Tesista o residencias

profesionales.

Actividades a realizar: Medios de cultivo, resembrado

de las cepas, Realización de colectas, aislamiento

Identificación morfológica de Phytophthora

Implementación de la técnica de Biología molecular

  2.10 Factores que podrían evitar el logro de cada uno de los objetivos del

proyecto:

ACTIVIDAD DESCRIPCIÓN DEL FACTOR O EVENTO

LIMITANTE

No. DESCRIPCIÓN  

 

 

2.11 Referencias bibliográficas

 [1] Goodwin, S.B. 1997. The populations genetics of Phytophthora. Phytopathology (87):

462-473.

[2] Zentmyer, G.A., and Mitchell, D.J. 1986. Phytophthora diseases of fruit trees in the

tropics. Rev Trop Pl Path (2): 287 – 309.

[3 ] http://www.oeidrus-guerrero.gob.mx/aagricola_gro/ientidad/index.jsp

20

[4] Anuario Estadístico de la Producción Agrícola 2007

http://reportes.siap.gob.mx/aagricola_siap/icultivo/index.jsp

[5] Loaiza, Ingrid. 2001. Capsicum y sus derivados en Iberoamérica. CYTED. 1ª ed.

P.519.

[6] Erwin, D.C., and Riberiro, O.K. 1996. Phytophthora diseases worldwide. St paul,

Minnesota, USA: APS Press.

[7] Dick, M. W. 2001. Straminipilous Fungi. Kluwer Academic Publishers. The

Netherlands. p. 670.

[8] Kamoun, S. 2003. Molecular Genetics of pathogenic Oomycetes. Eucaryotic Cell. Vol 2

No. 2. p. 191-199.

[9] Universidad Illinois, 2001 Phytophthora blight of pepper. Report on plant disease.

Department of crop sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign. RPD no.

947. Disponible en: http://web.aces.uiuc.edu/vista/pdf_pubs/947.pdf

[10] Tyler, Brett. 2001. Genetics and genomics of the oomycete-host interface. TRENDS in

Genetics, Vol. 17, No. 11, 611-614.

[12] Kamoun, S.; E. Huitema y V. Vleeshouwers. 1999. Resistance to Oomycetes: a

general rol for the hypersensitive response. Trends in Plant Science. Vol 4 No. 5. p.

196-200.

[13] Hardman, A. 2006. Cell biology of plant-oomycete interactions. Cellular

Microbiology. Doi:10.1111/j. 1462-5822.2006.00833.x.

[14] Kamoun, S. 2003. Molecular Genetics of pathogenic Oomycetes. Eucaryotic Cell. Vol

2 No. 2. p. 191-199.

[15] Van West, P.; A. A. Appiah y N. A. R. Gow. 2003. Advances in research on oomycete

root pathogens. Physiological and Molecular Plant Pathology 62:99-113

[16] Schwartz, H.F. 1998. Phytophthora diseases of vegetables. Diseases crop series.

Colorado State University Cooperative Extension. 6/98. no. 2.943. Disponible en:

http://www.ext.colostate.edu/pubs/crops/02943.pdf

[17] Biles, Charles. B. Bruton, M. Wall y M. Rivas. 1995. Phytophthora capsici zoospore

infection of pepper fruit in various physical environments. Proc. Okla. Acad.

Science 75:1-5.

21

[18] Tian, D. y M. Babadoost. 2004. Host Range of Phytophthora capsici from pumpkin

and pathogenicity of isolates. Plant Disease. Vol. 88, no. 5. p 485-489.

[19] Appiah, A. A., J. Flood, P. D. Bridge, S., A. Archer. 2003. Inter- and intraspecific

morphometric variation and characterization of Phytophthora isolates from cocoa.

Plant Pathology 52: 168-180.

[20] Sitko, S.E., Timmer, L.W., and Sandler, H.A. 1991. Isolation of Phytophthora

palmivora pathogenic to citrus in Florida. Plant Disease (75): 532-535.

[21] Tuset, J.J. 1983. La “gomosis” y “podredumbre del cuello de la raíz” de nuestros

agrios. I. Aspectos biológicos y patológicos. Levante Agrícola, No 246: 90-96.

[22] Nambir, K.K.N., and Rawther, T.S.S. 1993. Fungal diseases of coconut in the world.

In: Nair, M.K., Khan, H.H., Gopalasundaram Pand Bhas Kara Rao, E.V.V. Advances in

coconut research and development. Indian Society for plantation crops.

[23] (a)INEGI. Marco Geoestadístico, 2000.  (b)INEGI-DGG.Superficies Nacional y

Estatales. 1999.

[24] http://www.siea.sagarpa.gob.mx/Publicaciones/Archivos

[25] Mora, D.; Morales, F. 1980 Etiología de la pudrición radical de la papaya en Costa

Rica. Agronomía Costarricense 4(2):191-193 

ANEXO 1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 

A C T I V I D A D E S PERIODOS

(TRIMESTRES) COLABORADORES

No. DESCRIPCIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8  

01  Investigación X             L.P.T Francisco Valdez

Martínez, MC. Julieta

Karina Cruz Vázquez

02  Caracterización del suelo  X X            L.P.T Francisco Valdez

Martínez. 

22

03 Colectas X MC Julieta Karina Cruz

Vázquez

 

04

Aislamiento y multiplicación    

X

 

X

      MC Julieta Karina Cruz

Vázquez

 

05

Caracterización Morfológica      

X

           MC Julieta Karina Cruz

Vázquez

06 Caracterización Molecular X X Dr. Edmundo Lozoya

Gloria, MC Julieta

Karina Cruz Vázquez

ANEXO 2. DESGLOSE FINANCIERO

a) Aportaciones solicitadas a la UMAR

  PERIODOS (TRIMESTRES)  1 2 3 4 TOTAL

GASTO CORRIENTE          

1. Viajes y viáticos del grupo de trabajo 2,000.00 2,000.00 1,000.00   $ 5,000.00

2. Trabajo de campo         3. Pago de servicios externos especializados

      5,000.00 $ 5,000.00

4. Gastos de operación:          4.1 Consumibles (seres vivos,

energéticos, combustibles, cristalería, reactivos, etc.)

5,000.00 5,000.00     $ 10,000.00

4.2 Diseño y prototipos de prueba         4.3 Arrendamiento de vehículos y

equipo       

4.4 Acervos bibliográficos, documentales, servicio de información científica y tecnológica

2,000.00

      $ 2,000.00

5. Registro de patentes        

6. Publicaciones y materiales de divulgación y difusión.

       

7. Otros, especificar:       

Total de gasto corriente 9,000.00 7,000.00 1,000.00 5,000.00 $ 22,000.00

b) Aportaciones Concurrentes

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Gasto corriente         $ -

Gasto de inversión         $ -

Total de aportaciones concurrentes $ -

$ -

$ -

$ -

MONTO TOTAL $ 9,000.00

$ 7,000.00

$ 1,000.00

$ 5,000.00 $ 22,000.00

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ANEXO 3

RESUMEN CURRICULAR DE PARTICIPANTE EXTERNO

1. Nombre:   Edmundo Lozoya Gloria 2. Institución: CINVESTAV U.I 3. Dependencia: INVESTIGACIÓN-EDUCACIÓN 4. Dirección de la institución:  Km. 9.6 Libramiento Norte Calle:  Carretera Irapuato-León                                                Ciudad: Irapuato C.P.:   36821 Estado: Guanajuato                                          E-mail: elozoya@ira.cinvestav.mx Teléfono: 01462-6239659 Fax: 01462-6245849 5. Responsabilidad: COLABORADOR 6. Logros en los últimos tres años: Villa-Ruano, N., Betancourt-Jiménez, M.G. and Lozoya-Gloria, E. (2009) Biosynthesis of

uterotonic diterpenes from Montanoa tomentosa (zoapatle). J Plant Physiol. 166: 1961-1967.

Lozoya-Gloria, E. (2009) Terpenos de plantas mexicanas. Ciencia Conocimiento Tecnología Nuevo León N 89, 6-19 Feb 2009 pag. 24-28.

Robles-Zepeda, R.E., Lozoya-Gloria, E., López, M.G., Villarreal, M.L., Ramírez-Chávez, E. and Molina-Torres, J. (2009) Montanoa tomentosa glandular trichomes containing kaurenoic acids chemical profile and distribution. Fitoterapia. 80: 12-17.

Alvarado-Gutiérrez, A., Del Real-Monroy, M., Rodríguez-Guerra, R., Almanza-Sánchez, L., Lozoya-Gloria, E. and Fraire-Velázquez, S. (2008) A Phaseolus vulgaris EF-hand calcium-binding domain is induced early in the defense response against Colletotrichum lindemuthianum and by abiotic stress: Sequences shared between interacting partners. Physiol. Mol. Plant Pathol. 72: 111-121.

Maldonado-Bonilla, L., Betancourt-Jiménez, M. and Lozoya-Gloria, E. (2008) Local and systemic gene expression of sesquiterpene phytoalexin biosynthetic enzymes in plant leaves. Europ. J. Plant Pathol. 121: 439-449.

Arreola-Cortés, A., Castro-Mercado, E., Lozoya-Gloria, E., and García-Pineda, E. (2007) Capsidiol production in pepper fruits (Capsicum annuum L.) induced by arachidonic acid is dependent of an oxidative burst. Physiol. Mol. Plant Pathol. 70: 69-76

Arreola-Cortés, A., Soriano-Bello, E.L., Lozoya-Gloria, E., Barriga-Guzmán, A. and García-Pineda, E. (2007) The effect of acetylation of capsidiol phytoalexin on fungitoxic activity. Arch. Phytopathol. Plant Prot. 40: 69-73.

Carrillo-Tripp, J., Lozoya-Gloria, E. and Rivera-Bustamante, R. (2007) Symptom remission and specific resistance of pepper (Capsicum annuum L.) plants after infection by Pepper golden mosaic geminivirus. Phytopathology 97: 51-59.

25

8. Tesis Dirigidas:     Licenciatura __8__       Maestría _1__      Doctorado __10__  9. Líneas de investigación: Desarrollo de productos biotecnológicos

Investigación básica y aplicada sobre la bioquímica y la biología molecular de metabolitos secundarios de plantas y cultivos de tejidos vegetales.

 

Estudio molecular de la defensa química por fitoalexinas en Solanáceas Estudio molecular de la producción de terpenos activos de Montanoa tomentosa  

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