1

Ion Reporter™ソフトウェア デモンストレーション

Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panelを用いたがん部および非がん部の体細胞変異比較解析

2

Ion Torrent システムを用いた実験例

• Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panelを2サンプル実施

サンプル1

ランレポート ランレポート

サンプル2

3

研究目的

• がん部と非がん部の体細胞変異を比較• Variant Callerでは、サンプルごとの検出変異のみを表示

• Hg19をリファレンスに検出

がん部(Tumor)非がん部(Normal)

Sample_1 1300 Sample_2 2000 159

サンプル1

Variant Caller プラグインレポート Variant Caller プラグインレポート

サンプル2

1,300箇所 2,000箇所

4

• がん部と非がん部で異なる変異のみを表示

Ion Reporterソフトウェアを用いた比較解析

非がん部共通1,300箇所

Ion Reporter™で違いを検出

がん部特異的700箇所

全2,000箇所

5

Ion Reporterソフトウェアによる変異の絞り込み

• がん部に特異的な変異の中から意義のある変異を抽出

非がん部

Ion Reporter™で絞り込み

がん部

6

解析の流れ

• ワークフロー

データ レポート解析転送 絞り込み

Torrent Server Ion Reporterのサーバー PDFやExcelファイル

7

事前準備

• 各種設定

データ レポート解析転送 絞り込み

Torrent Server Ion Reporterのサーバー ExcelやPDFファイル

ラン設定• サンプル名• がん部・非がん部

転送設定• 転送用プラグイン• アカウント情報

解析設定• サンプル選択• がん部・非がん部比較

絞り込み設定• アミノ酸配列• 既知・未知

レポート作成• 結果確認• ExcelをPDFに変換

アカウント作成• ID• パスワード

8

Ion Reporterアクセス画面

①登録アドレス

②登録パスワード

③ログイン

ログインのワンポイント• ブラウザのバージョン確認

• 最新版が望ましい

解析条件• サンプル選択• がん部・非がん部比較

8

9

① サンプル読込：転送済みランデータ

② 解析条件：カスタマイズ用

③ データ解析：閲覧や絞り込み

ホーム画面

① ②③

10

サンプルファイルの注意点

• 比較解析にはBAMファイルが必要• がん部と非がん部の比較• VCFファイルではアノテーション機能に限定

• 解析不能

• サンプル画面でのデータインポートはVCFのみ• BAMファイルはインポートできない

• データ転送プラグイン必須

• 手動でのデータ転送プラグイン使用時に注意• Ion Reporter Uploader

• BAMファイルを忘れずに

① サンプル読込：転送済みランデータ

サンプルファイルのワンポイント• BAM: 塩基配列、位置、QV• VCF: 変異情報のみ

11

サンプル画面

サンプル画面のワンポイント

• データの転送が完了しているか確認できる

① サンプル読込：転送済みランデータ

VCFファイルの手動インポート

11

12

目的のサンプル：CCPのNormalとTumor

解析へ

12

13

解析を始める： Launch Analysis

• 解析条件を選択• Ion AmpliSeq™

• Comprehensive Cancer Panel• Tumor - Normal

• サンプルファイルを選択• Tumor• Normal

• 設定の確認• 解析スタート

③ データ解析：閲覧や絞り込み

解析条件のワンポイント• すでに最適化されている• 目的に合うものを選択

14

解析画面

解析画面のワンポイント• 解析が始まるとリストに追加• 未解析では何も表示されない

14

15

解析の始め方• まずはLaunch Analysisを

クリックし、Manualを選択

15

16

解析の進め方• Workflowから順に選択• 解析条件

16

17

解析条件の探し方• 目的に応じて絞り込み• AmpliSeq, Tumor-Normal

17

18

解析条件を見つけたら• 目的のWorkflowをハイライト• Summaryに条件の概要 次へ

18

19

サンプルファイルを選択• Samples画面と同様のリスト• キーワードで絞り込み

19

20

目的のペアを見つけたら① チェックを入れる② Add Samplesをクリック

① ②

20

21

サンプル追加のポイント• TumorとNormalに振り分け• チェックを入れた順に左・右

左右切り替えボタン

21

22

サンプルの紐づけ• 何のがん部－非がん部か• 3文字以上

22

23

ペアに名前を付けたら• Add to Analysis• 解析の準備へ

23

24

解析準備完了• Ready to Analyze• Confirm & Launchへ

次へ

24

25

プラグインはスキップ

• 現在、準備中• Nextをクリック

25次へ

26

解析スタート• Launch Analysis• プラグインはスキップ

Overviewへ

26

27

解析 : Overview Analysis

• 解析状況• 準備～実行～完了⇒結果確認

• 解析段階• 解 析～検 証～レポート作成

28

解析状況• Pending• 準備中

100GBまで無償

28

29

解析状況• Running• 実行中

ステータス更新

29

30

解析完了• Successful• リンク生成（解析名の色が青）

30

自動解析はこの段階まで自動実行

31

結果検証へ• 解析名クリック⇒変異リストへ• 周辺クリック⇒詳細表示

31

32

解析から検証作業へ

• サンプル比較（解析）• がん部と非がん部でジェノタイプの異なる個所をリストアップ

• 様々なフィルター条件で変異を絞り込み（検証）• アミノ酸配列、新規・既知

• Filter Chains

• ローカスのポジションをクリックし、リードの確認（検証）• IGV(Integrative Genomic Viewer)

33

解析結果• がん部に特異的な変異を検出• タブで表示内容を変更可能

解析結果

33

34

サマリー• ローカス、ジェノタイプなど• テーブルは右にスクロール

34

35

機能• アミノ酸配列の変化• タンパク構造への影響

35

36

集団• dbSNPのアクセション番号• マイナーアリル頻度

1000人ゲノム

European Global

African

36

37

分類• データベースの遺伝子関連情報• がん、生物学的プロセスなど

37

38

薬理• 薬剤応答性• 遺伝子型と表現型の関係

38

39

体細胞• アレルのカバレッジ• アレルの割合

39

40

QC• クオリティチェック• 信頼度

40

41

絞り込み方法

• フィルター機能を利用• Filter Chains

フィルターのポイント• 目的に応じて作成• アミノ酸配列、分類など

クリックして新規作成

絞り込まれた変異

条件に合わない変異

精査して除いた変異

絞り込み設定• アミノ酸配列• 既知・未知

42

フィルター条件作成

作成例①• アミノ酸配列の変化を伴う変異• ミスセンス、ナンセンス

①

②

③

③

④

⑤

42

43

絞り込み例①

変異数• 674から156個に絞り込まれた• さらに絞り込み

条件編集

全てアミノ酸配列が変化する変異

43

44

フィルター条件編集

作成例②• 癌種の分類(COSMIC)• 腺腫(Adenocarcinoma)

①

②

③

④

44

45

絞り込み例②

癌種の分類• 156から11個に絞り込まれた• 過去に報告済み（新規含まず）

右スクロールで詳細情報確認

45

46

腺腫に関連する遺伝子情報

データベース• 遺伝子の表現型情報• 遺伝子の機能情報

46

47

COSMIC (Catalogue of somatic mutations in cancer)

ハイパーリンク• 実際に観察された体細胞変異• ALK：3182G>T

http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/mutation/overview?id=1407666 47

48

OMIM® (Online Mendelian Inheritance in Man®)

ハイパーリンク• 変異による疾患に関する情報• 融合遺伝子が含まれる

http://www.omim.org/entry/10559048

49

Gene Ontology

ハイパーリンク• 生物学的プロセス• ALKはアポトーシス制御関連

http://amigo.geneontology.org/amigo/term/GO:0042981

49

50

変異の詳細情報

個別ウィンドウ• 全アノテーション情報を閲覧• 各種データベースへのリンク

クリック

51

IGVを開く

起動• Locusをクリック• Java™を事前にインストール

①

②

③

51

52

IGV: Integrative Genomics Viewer

検証• 塩基配列の確認• がん部・非がん部を直接比較

遺伝子名で検索可能

エリアを囲んで拡大

右クリックをしてShow all bases

52

53

着目したい変異

マーキング• 精査した変異をチェック• 意義のある変異を見失わない

①

Deleterious（悪性）

53

②

54

精査

取捨選択• 重要な変異はフラグを立てる• 不要な候補はリストから削除

①

Benign（良性）

54

②

55

絞り込み結果

最終候補（例）• 5つに絞られた重要な変異• 6つの除外された候補

55

56

データダウンロード

出力• 絞り込まれたリストをExcel化• 全項目も可

レポート作成• 結果確認• ExcelをPDFに変換

57

絞り込み条件確定

検証作業完了• レポート作成段階へ• 以降はフィルタ条件変更不可

①

②

58

レポート作成

形式• リストから変異を選択• アノテーションから情報を選択

③

②

④

①選択

59

レポート公開

解析完了• 最終確認• ロック後はフィルタ条件固定

Ion 318™ Chip×2枚で13GByte

59

60

レポート PDF化

ダウンロード• ロック後に作成可能• サインの記入欄

①

③

②

④

60

61

解析結果の共有

メール配信• ダウンロードリンク （VCFなど）• データの閲覧（ID所有者のみ）

①

③

④

②

メールアドレス入力

61

62

Technical Support

Call   0120‐477‐392jptech@thermofisher.com

営業時間：午前9時から午後6時まで

The Chip is the Machine™

ご不明な点がございましたら弊社テクニカルサポートまで

お問い合わせください

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.© 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.