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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ISOLAMENTO DE METABÓLITOS ANTIFÚNGICOS DE
Streptomyces sp. UFPEDA 3347, ENDÓFITO DE Momordica charantia
L. (Cucurbitaceae)
Sâmea Mesquita Bomfim
RECIFE-2008
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Sâmea Mesquita Bomfim
ISOLAMENTO DE METABÓLITOS ANTIFÚNGICOS DE
Streptomyces sp. UFPEDA 3347, ENDÓFITO DE Momordica charantia
L. (Cucurbitaceae) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de Concentração: Avaliação e Obtenção de Produtos Naturais e Bioativos
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Janete Magali de Araújo
Co-orientador (a): Prof.ª Dr.ª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim
RECIFE-2008
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Bomfim, Sâmea Mesquita Isolamento de metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) / Sâmea Mesquita Bomfim. – Recife: O Autor, 2008.
60 folhas : il., fig. tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Streptomyces –2 Metabólitos antifúngicos - isolamento I. Título.
579.873.7 CDU (2.ed.) UFPE
579.378 CDD (22.ed. CCB – 2008- 053
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof.ª Jane Sheila Higino
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Samuel Daniel de Sousa
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Prof. Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof.ª Beate Seagesser Santos
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DEDICO
Aos meus pais Bomfim e Nanci, pelo amor, apoio e incentivo oferecidos durante toda minha vida.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, minha fortaleza!!! Obrigada Senhor por ter me dado força nos momentos de
fraqueza, ânimo nos momentos de tristeza, calma nos momentos de desespero, por ter
estado sempre ao meu lado durante a execução deste trabalho. Sempre entreguei tudo
em tuas mãos Senhor e confiei. Muito obrigada!!!
Ao painho e a mainha, presente de Deus em minha vida, que mesmo à distância se
fizeram sempre presentes;
Aos meus irmãos Sóstenes e Sócrates, pelo carinho, força, incentivo e amizade
dedicados apesar da distância;
Ao meu namorado Elom, por ser tão especial em minha vida, mesmo distante na maior
parte da execução deste trabalho, sempre se fez presente me dando força, carinho e
incentivo;
Aos meus irmãos de coração Vânia e Eduardo, amigos de graduação desde Maceió, pela
amizade, força, incentivo e pelos momentos em que compartilhamos nossas alegrias e
angústias durante esses dois anos de convivência aqui no Recife, Valeu por tudo!!!;
A Prof.ª Janete Magali de Araújo pela orientação, ensinamentos, amizade e exemplo de
dedicação e seriedade em tudo que faz;
A Prof.ª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim pela co-orientação, ensinamentos, amizade e
apoio na realização deste trabalho;
Aos meus amigos do Laboratório de Genética: Ivana, Adriana, Jana, Virgínia, Érica,
Amanda, Eliz, Mariana e em especial a Luis e Renato pelo carinho, amizade, incentivo e
pelos momentos de alegria compartilhados. Valeu!!!
Aos técnicos do Departamento de Antibióticos, Fátima, Orlando e Luiz pelo apoio e
amizade;
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A Ruth, técnica do Núcleo de Controle de Qualidade Medicamentos e Correlatos, pelo
apoio e dedicação na realização das análises de espectrofotometria;
Aos amigos do LAPRONAT pelo apoio e amizade;
Aos amigos do Hospital das Clínicas, pessoas especiais que Deus colocou em minha
vida, em um dos momentos mais difíceis aqui no Recife;
Aos meus amigos deixados em Maceió, obrigada pelo carinho e amizade. Sei que vocês
torcem por mim!!! Saudades...
A minha prima Cau e as minhas cunhadas Juliana e Rocielle pelo carinho e amizade;
Aos colegas de Pós-Graduação pelos momentos de estudos e dedicação durante a
obtenção dos créditos.
Ao Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco,
pela oportunidade da realização do curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, meu
muito obrigada!!!
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“Sem sonhos a vida não tem brilho,
Sem metas os sonhos não têm alicerce e
Sem prioridades os sonhos não se tornam reais.”
Augusto Cury
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SUMÁRIO
Pág LISTA DE FIGURAS...............................................................................................
LISTA DE TABELAS.............................................................................................. RESUMO................................................................................................................... ABSTRACT............................................................................................................... 1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 4 2.1. Microrganismos endofíticos.............................................................................. 5 2.2. O Gênero Streptomyces..................................................................................... 8 2.2.1. Características Gerais.................................................................................. 8 2.2.2. Produção de Metabólitos Secundários........................................................ 10 2.2.3. Aplicações Biotecnológicas de Streptomyces............................................. 11 2.3. Momordica charantia L.................................................................................... 13 3. OBJETIVOS.......................................................................................................... 16 3.1. Objetivo Geral................................................................................................... 17 3.2. Objetivos Específicos........................................................................................ 17 4. ETAPAS INICIAIS............................................................................................... 18 4.1. Objetivos........................................................................................................... 19 4.2. Material e Métodos........................................................................................... 19 4.2.1. Seleção do Meio e Tempo de Fermentação............................................... 19 4.2.2. Teste de Difusão em Agar.......................................................................... 20 4.2.3. Produção e Extração de Metabólitos Bioativos......................................... 20 4.2.3.1. Pré-inóculo e Fermentação................................................................ 20 4.2.3.2. Extração do Líquido Fermentado...................................................... 21 4.2.3.3. Extração de Metabólitos Bioativos da Massa Celular...................... 21 4.2.3.4. Cromatografia em Camada delgada.................................................. 22 4.3. Resultados......................................................................................................... 22 4.4. Conclusão.......................................................................................................... 25
11
5. ARTIGO................................................................................................................ 26 Resumo........................................................................................................................ 28 Introdução................................................................................................................... 29 Material e Métodos..................................................................................................... 30 Preparação do inóculo e fermentação......................................................................... 30 Isolamento de metabólitos bioativos........................................................................... 31 Cromatografia em camada delgada (CCD) e bioautografia........................................ 31 Atividade antifúngica.................................................................................................. 32 Determinação da Concentração Mínima Inibitória..................................................... 32 Análise espectroscópica UV-VIS................................................................................ 33 Resultados e Discussão............................................................................................... 34 Conclusão.................................................................................................................... 38 Abstract....................................................................................................................... 39 Referências Bibliográficas.......................................................................................... 40 6. CONCLUSÕES..................................................................................................... 43 7. PERSPECTIVAS.................................................................................................. 45 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 47 ANEXOS.................................................................................................................... 57
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LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA Pág Figura 1 - Ciclo de vida de Streptomyces coelicor....................................................
9
Figura 2 - Momordica charantia L.- Melão-de-São Caetano.................................... 14 ETAPAS INICIAIS Figura 1 - Diâmetro dos halos de inibição da fermentação de Streptomyces sp. UFPEDA 3347 nos meios utilizados para produção de metabólitos bioativos......................................................................................................................
23
Figura 2 - Diâmetro dos halos de inibição dos extratos do líquido fermentado com os diferentes solventes orgânicos nos diferentes pHs.................................................
24
Figura 3 - Diâmetro dos halos de inibição dos extratos da massa celular com os diferentes solventes orgânicos nos diferentes pHs...................................................... 24 ARTIGO Figura 1 - Espectrofotometria UV-VIS de 200 a 450 nm da fração F1 da massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347................................................................
37
Figura 2 - Espectrofotometria UV-VIS de 200 a 450 nm. Curva 1 - Fração F7 da massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347; Curva 2 - Anfotericina B a 0,5 µg/mL.......................................................................................................................... 38
13
LISTA DE TABELAS
ETAPAS INICIAIS Pág Tabela 1 - Diâmetro dos halos de inibição e variação de pH durante 96h da fermentação de Streptomyces sp. UFPEDA 3347 nos quatro meios utilizados..........
23
ARTIGO
Tabela 1 - Avaliação da atividade antifúngica do extrato etanólico bruto e das frações F1 e F7 da massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347......................
35
Tabela 2 - Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração Mínima Fungicida (CMF) do extrato etanólico bruto e das frações F1 e F7 da massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347................................... 36
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RESUMO
Microrganismos endofíticos atualmente se apresentam como uma fonte importante para a produção de metabólitos secundários com ação antibacteriana, antifúngica, antitumoral, antimalária, entre outras. Para produção de metabólitos bioativos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de Momordica charantia L, diferentes meios de fermentação foram testados e a atividade antifúngica foi avaliada através do método de difusão em ágar. O líquido fermentado e a massa celular foram tratados respectivamente com solventes orgânicos apolares e polares em diferentes pHs, para extração de metabólitos antifúngicos. Após a seleção do solvente orgânico, os extratos obtidos foram submetidos à cromatografia em camada delgada (CCD) realizada em placas de sílica gel GF254. O extrato etanólico bruto foi cromatografado em coluna de sílica gel e as 65 frações obtidas foram reunidas em sete grupos (F1, F2,....F7). Tanto o extrato etanólico como as sete frações foram submetidos à CCD seguido da revelação bioautográfica. A avaliação da atividade antifúngica do extrato etanólico e das frações F1 e F7 foi realizada pelo teste de difusão em ágar, enquanto que a concentração mínima inibitória (CMI) e concentração mínima fungicida (CMF) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O meio MA (MPE modificado) favoreceu a maior produção de metabólitos bioativos por 48h, com pH entre 7,8 a 8,0. O ensaio bioautográfico mostrou a presença de metabólitos antifúngicos com Rfs diferentes nos extratos acetato e etanólico.O extrato etanólico e as frações F1 e F7 apresentaram halos de inibição acima de 14 mm de diâmetro para as diferentes cepas de Candida, enquanto que a CMI verificada para o extrato etanólico e para as frações F1 e F7 variou entre 200 a 400 µg/mL. A anfotericina B foi utilizada como padrão. A análise espectroscópica na região UV-VIS das frações, mostrou bandas de absorção características de um antibiótico macrolídeo poliênico para F7 e não-poliênico para F1.
Palavras-chave: Atividade antifúngica, CMI, Streptomyces, Endófito, Polieno.
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ABSTRACT
Endophytic microorganisms now come as an important source for the production of secondary metabolites with antimicrobial, antifungal, antitumoral, antimalaria action, among others. For production of bioactive metabolites from Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endophyte from Momordica charantia L., different medium of fermentation were tested and the antifungal activity was carried through the agar diffusion method. The fermented liquid and the cellular mass were treated respectively with apolares and polar organic solvents in different pHs, for extraction of antifungal metabolites. After the selection of the organic solvent, the obtained extracts were submitted to thin layer chromatography (TLC) carried on silica gel plates GF254. The crude ethanolic extract was chromatographed on silica gel column and the 65 fractions gotten was gathered in seven groups (F1, F2… F7). As the ethanolic extract as the seven fractions were submitted to TLC following by the bioautographyc revelation. The evaluation about the antifungal activity of ethanolic extract and the F1 and F7 fractions was carried out by the agar difusion method while the minimal inibitory (MIC) concentration and minimal fungicidal (MFC) concentration were determinate by the broth dilution method. The MA medium (modified MPE) favored larger production of bioactive metabolites for 48 hours, with pH among 7.8 to 8.0. The bioautographyc test showed the antifungal metabolites presence with differents Rfs in the acetate and ethanolic extracts. The ethanolic extract and the F1 and F7 fractions presented inibition zones with diametro above 14 mm to the different strains of Candida, while that the MIC verified to the ethanolic extract and to the F1 and F7 fractions varied through 200 - 400 µg/mL. The amphotericin B was used as standard. The spectroscopical analysis in the UV-VIS region from fraction showed sides of absorption characteristic of a polyene macrolide antibiotic to F7 and non polyene to F1.
Key-words: Antifungal activity, MIC, Streptomyces, Endophyte, Polyene.
1. INTRODUÇÃO
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1. INTRODUÇÃO
Um dos maiores problemas no combate a microrganismos patogênicos humanos
é sua grande capacidade de adquirir e transferir resistência a diversos antibióticos. O uso
indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos tem levado à
seleção de microrganismos patogênicos resistentes a esses compostos. Este problema é
intensificado em países em desenvolvimento como o Brasil, no qual a população tem
por hábito a automedicação, utilizando de maneira indevida os antibióticos, com
dosagem insuficiente e não seletiva (TRESOLDI et al., 2000).
O problema da resistência microbiana é crescente e a perspectiva do uso de
drogas antimicrobianas no futuro é incerta. Portanto, devem ser tomadas atitudes que
possam reduzir este problema como por exemplo, controlar o uso de antibióticos,
desenvolver pesquisas para melhor compreensão dos mecanismos genéticos de
resistência e continuar o estudo de desenvolvimento de novas drogas, tanto sintéticas
como naturais (NASCIMENTO et al., 2000).
Uma imensa variedade de produtos naturais vem sendo estudada, dos quais
grande parte são metabólitos secundários produzidos por microrganismos e plantas.
Segundo Arai (1976) os antibióticos de uso clínico em sua maioria foram obtidos de
Streptomyces spp. isolados do solo e de acordo com Goodfellow e William (1983) neste
hábitat, a ocorrência destas bactérias filamentosas é de um milhão por grama de solo,
mostrando que a bioprospecção do solo favoreceu a descoberta dos metabólitos
bioativos disponíveis no mercado. Entretanto, este nicho ecológico está exaurido e
atualmente, inúmeras pesquisas mostram que microrganismos endofíticos, que vivem
dentro de tecidos vegetais, especialmente de plantas medicinais, vem se destacando
como uma nova fonte para isolamento de compostos bioativos previamente não isolados
3
de microrganismos do solo (STROBEL, DAISY, 2003; STROBEL, 2003). Portanto, a
busca por plantas que abrigam tais Streptomycetes endofíticos tem sido iniciada.
(CASTILLO et al., 2002; KUNOH, 2002).
Streptomyces sp. UFPEDA 3347 foi isolado da raiz da planta medicinal
Momordica charantia L. (LIMA, 2006). Esta planta, conhecida popularmente como
melão-de-São Caetano possui várias propriedades medicinais incluindo, antidiabética,
antiviral, antihelmíntica, antimicrobiana, anticancerígena, abortiva, contraceptiva,
antimalária, imunoestimulante e laxante (YESILADA et al., 1999).
Apesar das plantas serem utilizadas no tratamento de várias doenças há bastante
tempo, muitas pesquisas vêem demonstrando que os microrganismos endofíticos
isolados de plantas medicinais são capazes de sintetizar produtos bioativos idênticos ou
similares aos metabólitos bioativos do vegetal (STROBEL, 2003).
A fim de comprovar que os microrganismos endofíticos, constituem uma
alternativa promissora para a obtenção de novos fármacos de importância
biotecnológica, o objetivo deste trabalho foi isolar metabólitos antifúngicos produzidos
por Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de M. charantia L.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Microrganismos endofíticos
Os microrganismos endofíticos foram descritos pela primeira vez por De Bary
em 1866, nesta época não foi dada muita importância a estes microrganismos, pois
pouco se conhecia a respeito de sua função. Só no final dos anos 70 do século XX,
vários estudos demonstraram que os microrganismos endofíticos vivem em uma
associação mutualística com as plantas recebendo nutrientes e proteção do hospedeiro,
além de produzir compostos químicos que trazem benefícios para o vegetal (PEIXOTO-
NETO et al., 2002).
Para Schulz e Boyle (2005), a definição da palavra endófito reporta ao potencial
de bactérias, actinomicetos e fungos habitarem o interior de tecidos vegetais e de algas.
Qualquer órgão do hospedeiro pode ser colonizado, e esses microrganismos podem
viver nos espaços intercelulares dos tecidos vegetais ou dentro das células sem que haja
nenhum dano para a planta. Portanto, para a maioria dos autores os endófitos são
aqueles microrganismos, os quais, a colonização nunca resulta em sintomas visíveis de
doenças (AZEVEDO, et al., 2002; SCHULZ, BOYLE, 2005).
Os endófitos, com exceção dos transmitidos pelas sementes (transmissão
vertical) penetram primariamente através da zona radicular, embora microrganismos do
ar possam utilizar aberturas naturais como estômatos e hidatódios presentes nas partes
aéreas da planta como folhas, caule, cotilédones, flores e frutos (transmissão horizontal)
(KOBAYASHI, BACON, WHITE, 2000; SAIKKONEN et al., 2004; MARINHO et al.,
2005; JOHRI, 2006). Segundo Strobel e Long (1998), o relacionamento entre o endófito
e a planta hospedeira deve se estender desde a fitopatogênese latente à simbiose
mutualística. Pullen et al. (2002) relatam que um microrganismo em particular pode se
6
comportar como um patógeno em uma determinada situação e como um endófito em
outra na mesma planta, indicando uma íntima associação entre a patogenicidade e o
endofitismo e uma possível co-evolução entre os endofíticos e seus hospedeiros.
Evidências da associação entre vegetais e microrganismos têm sido observadas
em tecidos fossilizados de caules e folhas de vegetais superiores (STROBEL, 2002)
levando a compreensão de que estas relações tenham começado a centenas de milhares
de anos atrás. Para Faeth (2002), comunidades endofíticas vêm sendo mantidas devido a
combinações genotípicas com o hospedeiro por meio de pressões seletivas como
competição, herbivoria e fatores abióticos. Como resultado desta associação é possível
imaginar que alguns destes microrganismos endofíticos puderam dividir sistemas
genéticos através da transferência de genes ao longo de milhares de anos (STIERLE, et
al., 1993; STROBEL, et al., 1999; SULLIVAN, FAETH, 2004).
Quase todas as espécies de plantas examinadas até hoje, foram encontradas
abrigando bactérias e fungos endofíticos. Comumente, muitos microrganismos
endofíticos podem ser isolados de uma única planta, e entre estes microrganismos, pelo
menos um mostra especificidade ao hospedeiro (STURZ et al., 2000).
Fungos endofíticos são comumente isolados e geralmente, quando estão
associados às folhas e pecíolos, são importantes produtores de enzimas celulolíticas e
lignolíticas, como algumas espécies do gênero Xilaria, que degradam celulose e lignina
após a morte do tecido vegetal (CARROL e CARROL, 1978). Fatores de crescimento,
como o hormônio giberelina, produzido pelo endofítico Fusarium moniliforme, são
exemplos que podem indicar a transferência de genes entre as plantas e os
microrganismos, numa verdadeira engenharia genética “in vivo” (AZEVEDO, 1998).
Há também, um grande número de espécies bacterianas endofíticas encontradas
em associação com as plantas. Um dos gêneros mais comuns é Pseudomonas, onde
7
algumas espécies produzem compostos fitotóxicos assim como antibióticos. Entre
algumas substâncias identificadas, estão presentes as ecomicinas, produzidas por
Pseudomonas viridiflava, com atividade para Cryptococcus neoformans e Candida
albicans (MILLER et al., 1998) e as pseudomicinas, peptídeos ativos contra uma ampla
variedade de fungos patogênicos de humanos e de plantas (STROBEL et al., 2004).
Entre as bactérias endofíticas, um grupo pertencente à família Actinomicetaceae,
tem se destacado por produzir metabólitos secundários com atividade biológica
diversificada. Segundo Schippers et al. (1987), vários relatos referem-se à atuação de
actinobactérias na proteção da planta hospedeira contra patógenos e a influência de seus
produtos metabólicos no crescimento e na fisiologia da planta.
A prospecção de novos habitats mostra, que as actinobactérias endofíticas,
particularmente o gênero Streptomyces, têm sido as principais fontes de novos
antibióticos com atividade contra bactérias, fungos e protozoários. Segundo Cohen e
Coffey (1986), na década de 50 os antibióticos estreptomicina e cicloheximida, ambos
produzidos por Streptomyces griseus, já eram utilizados para controlar doenças de
plantas. De acordo com Yamaguchi et al. (1988), inúmeras pesquisas relataram a
atividade antimicrobiana de diversos antibióticos isolados de linhagens de Streptomyces
contra uma variedade de patógenos de interesse para a agricultura.
Desta forma, a utilização da etnobotânica na prospecção de microrganismos de
interesse biotecnológico isolados de plantas medicinais, tornou-se mais freqüente e vem
mostrando a descoberta de novos metabólitos bioativos (STROBEL, DAISY, 2003;
WIYAKRUTTA et al., 2004; LI et al., 2005).
8
2.2. O Gênero Streptomyces
2.2.1. Características Gerais
As bactérias do gênero Streptomyces são Gram positivas, filamentosas, aeróbias
estritas, com ciclo de vida complexo que pertencem à família Streptomycetaceae, e se
caracterizam por apresentarem micélio substratal vegetativo e hifas aéreas.
(THEILLEUX, 2000). A maioria das espécies de Streptomyces cresce em pH neutro ou
medianamente alcalino. No entanto, muitos relatos mostram que algumas linhagens
crescem em pH ácido (3,5) ou alcalino (8,0 a 11,5) (SCHREMPE,1999). Os melhores
crescimentos são obtidos frequentemente, em meios complexos, contendo, por exemplo,
extrato de levedura, extrato de malte ou outras fontes orgânicas de nitrogênio.
Espécies que pertencem ao gênero Streptomyces podem produzir grande
variedade de pigmentos responsáveis pela cor do micélio aéreo e vegetativo. Além
disso, também podem ser formados pigmentos coloridos que se difundem no meio com
ágar, cuja produção depende em grande parte da composição e condições de cultivo.
Quando cultivados em laboratório e em meios de cultura favoráveis, o
crescimento de Streptomyces spp. se inicia com a formação de um tubo germinativo que
se ramifica, formando o micélio vegetativo, fortemente aderido ao substrato sólido,
seguido pela formação do micélio aéreo, que se diferencia formando a cadeia de esporos
(CHATER e HOPWOOD, 1993). A esporulação começa com a formação simultânea de
septos na hifa aérea e termina com a liberação de esporos, fechando assim, o ciclo de
vida (LANCINI e LORENZETTI, 1993). (Figura 1). Cada esporo contém um único
cromossomo linear (FLARDH, 2003).
9
Formação de célula
hifal espiral
Esporulação específica-formação
de septo
Maturação dos poros
Dispersão dos esporos
Figura 1 – Ciclo de vida de Streptomyces coelicolor (CHATER e MERRICK, 1979).
Como observado na literatura, o ciclo de diferenciação geralmente ocorre em
meio sólido, embora algumas espécies como S. griseus sofrem esporulação em meio
líquido (McCUE et al., 1996). Recentemente a diferenciação de S. coelicolor A3 (2) foi
demonstrada em meio líquido (VAN KEULEN et al., 2003).
Vários Streptomyces mostram uma transição lenta durante o crescimento em
cultura líquida antes de entrar na fase estacionária. Esta fase de transição é caracterizada
por um aumento em ppGpp (guanosina 3', 5'-pirofosfato), por uma diminuição em GTP,
como também pela ativação de genes essenciais no metabolismo secundário. A síntese
das duas proteínas ribossomais L10 e L7/L12 fica drasticamente reduzida quando a
cultura chega à fase estacionária (BLANCO et al., 1994).
De acordo com Korn-Wendisch e Kutzner (1992a) o metabolismo é oxidativo e
quimiorganotróficos, a reação de catalase é positiva, e geralmente, nitratos são
reduzidos a nitritos. A maioria dos representantes do gênero Streptomyces pode
10
degradar polímeros como caseína, gelatina, hipoxantina, lignina, amido e também
celulose, além de produzir importantes metabólitos secundários de interesse industrial
(LANCINI e LORENZETTI, 1993 l) Além disso, uma gama extensiva de substâncias
orgânicas é usada como fonte exclusiva de carbono para energia e crescimento
(WILLIAMS et al., 1983a; KÄMPFER et al., 1991b; KORN-WENDISCH e
KUTZNER, 1992a).
2.2.2. Produção de Metabólitos Secundários
A expressão “metabolismo secundário” foi introduzida por Bu’Lock em 1960
para indicar metabólitos microbianos que não eram essenciais para o metabolismo
celular, e eram encontrados como produtos da diferenciação celular em um grupo
taxonômico restrito. Este termo foi usado por fisiologistas de plantas para indicar a
presença de alcalóides (LANCINI et al., 1995).
Segundo Demain (1999) durante a fase de produção (idiofase) que ocorre após a
fase de crescimento (trofofase), os metabólitos secundários se acumulam no meio
fermentativo e por isto são conhecidos também como idiotróficos. Entretanto, em
decorrência da baixa especificidade de algumas enzimas do metabolismo secundário,
estes metabólitos são produzidos como componentes de famílias químicas específicas,
com uma grande diversidade de estruturas. Estas estruturas químicas são poucos
comuns e incluem anéis β-lactâmicos, peptídeos cíclicos contendo aminoácidos não
naturais, novos açúcares e nucleosídeos raros, polienos e grandes anéis macrolídeos.
Os metabólitos secundários são sintetizados por vários caminhos e também por
espécies geneticamente distintas, sendo sua produção afetada por diferentes condições
ambientais. Parâmetros da fermentação tais como, tempo, temperatura, pH e nutrientes,
11
podem ser modificados visando ampliar a quantidade dos metabólitos secundário
produzidos (PFEFFERLE et al., 2000).
Actinobactérias em geral, e em particular o gênero Streptomyces, continuam
sendo fonte de novos metabólitos secundários com uma grande variedade de atividades
biológicas, tais como, antibacterianas, antifúngicas, antivirais, anticancerígenas,
antiparasitárias, entre outras. A produção destes metabólitos secundários por estas
bactérias filamentosas, geralmente coincide ou ligeiramente precede com o
desenvolvimento do micélio aéreo em meio sólido. Nos meios líquidos, geralmente é
limitada à fase estacionária, que frequentemente coincide com a escassez dos nutrientes
no meio (YU et al., 1999).
Os genes para a produção de metabólitos secundários são organizados em
grupamentos que variam em tamanho, alguns com mais de 100 kb (BENTLEY et al.,
2002; BENTLEY et al., 2004; IKEDA et al., 2003; SCHWECKE et al., 1995). A
maioria destes agrupamentos contem genes reguladores específicos, cuja expressão
freqüentemente depende de genes que são essenciais para a produção dos metabólitos
secundários produzidos pela espécie. Alguns destes genes, notavelmente os genes bld
(CHATER e HORINOUCHI, 2003; ELLIOT e TALBOT, 2004) também são
necessários para a formação do micélio aéreo e esporos.
2.2.3. Aplicações Biotecnológicas de Streptomyces
O gênero Streptomyces é de grande valor para a Biotecnologia, especialmente
devido a sua importância como fonte de vários metabólitos secundários de interesse
industrial, em particular, os antibióticos (GOODFFELLOW et al., 1988; SANGLIER et
al., 1993a, b). Segundo Sanglier, et al. (1993), entre 1988 e 1992 mais de cem novas
moléculas originárias de actinobactérias foram descobertas. Aproximadamente 75%
12
destas substâncias são produzidas pelo gênero Streptomyces e de acordo com Demain
(1999) cerca de 5.000 compostos bioativos relatados na literatura são conhecidos como
sendo produzidos por este gênero.
Pullen et al. (2002) isolaram da madeira de Celastraceae Streptomyces MaB-
QuH-8, que produz os antibióticos celastramicinas A e B com atividade antagônica
contra Mycobacterium vaccae e Bacillus subtilis.
Castillo et al. (2003) isolaram das folhas de Grevillea pteridifolia, o endófito
Streptomyces sp. NRRL 30566, produtor de cacadumicinas, antibióticos com atividade
contra bactérias Gram-positivas particularmente B. anthracis e também com alta
atividade contra Plasmodium falciparum (IC50 de 7.04 ± 0.12 ng ml-1).
Em trabalho desenvolvido por Shimizu et al. (2004), a linhagem de
Streptomyces sp. R-5, identificada como Streptomyces galbus, endófito isolado de
Rhododendron, produziu duas substâncias denominadas actinomicinas X2 e
fungicrominas, ativas contra Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae.
Ezra, et al. (2004) observaram atividade contra Cryptococcus neoformans a
partir da substância denominada coranamicina, antibiótico peptídeo produzido pela
linhagem Streptomyces sp. (MSU-2110), endófito isolado de Monstera sp., planta da
Amazônia peruana. Esta substância apresentou também elevada atividade contra o
parasito da malária Plasmodium falciparum (IC50 de 9.0 ng ml-1).
O antibiótico metilabonousina foi obtido a partir da fermentação de
Streptomyces albus, endófito isolado da planta Lolium perenne (STROBEL, et al.,
2004).
Sacramento, et al. (2004), em trabalho realizado com plantas da floresta tropical
brasileira, isolaram actinobactérias do gênero Streptomyces capazes de produzir
substâncias com atividade antiviral e antimicrobiana que apresentaram concentração
13
mínima inibitória de 20 µg/ml contra Pythium ultimum e 2 µg/ml contra Streptococcus
pneumoniae.
Lima (2006) isolou da planta medicinal M. charantia L. 5 actinobactérias do
gênero Streptomyces capazes de produzir metabólitos bioativos contra as bactérias
Gram-positivas Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis e contra as leveduras Candida
spp. e Malassezia spp., enquanto Silva (2006) trabalhando com a planta medicinal
Conysia bonarienses (L) Cronquist isolou um Streptomyces sp. produtor de metabólitos
com atividade antibacteriana e antifúngica.
Recentemente, Strobel et al. (2007) isolaram três Streptomyces spp., endófitos
das plantas medicinais Thottea grandiflora (família – Aristolochiaceae), Polyalthia spp.
(família – Annonaceae), e Mapania sp. (família – Cyperaceae), que produzem
metabólitos antifúngicos contra Phytophthora erythroseptica, Pythium ultimum,
Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella fijiensis e Rhizoctonia solani.
Estes trabalhos mostram a grande importância da exploração deste hábitat,
principalmente plantas medicinais, para obtenção de novos metabólitos com atividade
antimicrobiana rara produzida por Streptomyces endofíticos.
2.3. Momordica charantia L.
Momordica charantia L., conhecida como melão-de-São Caetano, é uma
herbácea da família Cucurbitaceae, muito comum em vários estados brasileiros. Planta
trepadeira com flores amarelas muito finas e frutos cor de ouro com espinhos moles na
superfície que se abrem espontaneamente expondo as sementes vermelhas quando
amadurecem. Seus frutos são parecidos com um pequeno melão, o que lhe rendeu seu
nome (Figura 2) (BRAGA, 2001).
14
É uma planta muito utilizada pela medicina popular no tratamento de várias
doenças de pele, como eczemas, acne, pano branco, sarna, sendo também usada para
diabetes, furúnculos, hemorróidas e vermes intestinais (GÜRBÜZ et al., 2000; BASCH
et al., 2003). Estudos científicos desenvolvidos nas últimas décadas, revelaram que M.
charantia possui várias propriedades medicinais como antidiabética, antiviral,
antitumoral, antileucêmica, antimicrobiana, antihelmíntica, antimutagênica,
antimicobacteriana, antioxidante, antiinflamatória, hipotensiva, imunoestimulante,
hipocolesterolêmica, hipotrigliceridêmica, além de propriedade inseticida (NG et al.,
1992; RAMAN e LAU, 1996; BASCH et al., 2003).
Figura 2 - Momordica charantia L.- Melão-de-São Caetano. Fonte: LIMA, V.T. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia – Recife, 2006
Momordica charantia contém vários compostos biologicamente ativos
distribuídos em diferentes grupos químicos que incluem glicosídeos, saponinas,
alcalóides, óleos, triterpenos, proteínas, esteróides (RAMAN e LAU, 1996). Destes
grupos, diversas substâncias já foram isoladas tais como: momorcharinas, momordenol,
momordicilina, momordicinina, momordina, momordolol, charantina, charina,
criptoxantina, cucurbitinas, cucurbitacinas, cucurbitanas, cicloartenóis, diosgenina,
eritrodiol, ácidos galacturônico, clacosteárico, gentísico, multiflorenol, goiaglicosídeos
e goiasaponinas (HUSAIN et al., 1994; XIE et al., 1998; YUAN et al., 1999;
15
PARKASH et al., 2002), distribuídas por todas as partes da planta e com atividade,
principalmente, hipoglicemiante, antiviral e antitumoral (MURAKAMI et al., 2001).
No trabalho realizado por GÜRBÜZ et al. (2000) foram detectados alto
conteúdo de carotenóides nos extratos etanólicos dos frutos e verificado o seu efeito em
úlceras induzidas em ratos para explicar o efeito antioxidante dos carotenóides na
atividade anti-ulcerogênica do extrato, uma vez que, como relatado por Kiraly et al.
(1992), os carotenóides podem atuar como potentes antioxidantes e protetores da
mucosa gástrica. Já no trabalho desenvolvido por Yesilada et al. (1999), os extratos
etanólicos dos frutos apresentaram atividade para Helicobacter pylori.
Omoregbe et al. (1996) verificaram a atividade antimicrobiana dos extratos
aquoso, etanólico e metanólico das folhas contra Escherichia coli, Salmonella
paratyphi, Shigella dysenterae, Streptomyces griseus e Mycobacterium tuberculosis.
Enquanto Prabakar e Jebanesan (2004) verificaram a eficiência de extratos metanólicos
das folhas no controle de larvas do mosquito Culex quinquefasciatus.
Schmourlo et al. (2005), em suas pesquisas, utilizando extratos aquosos de
várias partes da planta M. charantia L., demonstraram atividade contra Candida
albicans e Cryptococcus neoformans.
Pesquisas recentes evidenciaram a atividade antiviral e antihelmíntica de
triterpenóides glicosídicos isolados das folhas, classificados de momordicinas I e II,
destacando principalmente a eficiente atividade nematicida dessas substâncias
(BELOIN et al., 2005).
16
3. OBJETIVOS
17
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Isolar metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito
de Momordica charantia L.
3.2. Objetivos Específicos
Testar meios de fermentação para a produção dos princípios ativos;
Realizar a extração dos princípios ativos;
Verificar o espectro da atividade antifúngica;
Analisar os extratos orgânicos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347 através de
métodos cromatográficos;
Caracterizar os metabólitos bioativos através de espectroscopia UV-VIS.
18
4. ETAPAS INICIAIS
19
4. ETAPAS INICIAIS
Durante o desenvolvimento desta pesquisa, foram obtidos resultados
preliminares, que foram apresentados no VI Simpósio Brasileiro de Farmacognosia,
realizado no período de 11 a 14 de Setembro de 2007 em Belém/PA (ANEXOS 1 e 2).
4.1. OBJETIVOS
Selecionar o melhor meio de fermentação para a produção de metabólitos
bioativos e avaliar a atividade antifúngica do líquido fermentado e da massa celular de
Streptomyces sp. UFPEDA 3347.
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. Seleção do Meio e Tempo de Fermentação
A linhagem de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, isolada da planta medicinal
Momordica charantia L. (LIMA, 2006) foi cultivada em diferentes meios líquidos de
fermentação (ANEXO 3), para através da técnica de difusão em ágar com discos de
papel (BAUER et al., 1966) selecionar o melhor meio de cultivo e o tempo de
fermentação para a produção de compostos bioativos. Streptomyces sp. UFPEDA 3347
foi cultivado em erlenmeyer (250 mL) contendo 50 mL do meio ISP-2 (PRIDHAM et
al., 1957) e mantidos sob agitação (180 rpm), a 28°C por 48 horas. Após este período,
10% (v/v) deste pré-inóculo foi transferido para erlenmeyer (250mL), contendo
contendo 50 mL de meio líquido para fermentação. Os meios utilizados foram ISP-2,
20
MPE (HAMADA et al., 1974), MA e MB e a fermentação foi mantida por 96 horas sob
agitação de 180 rpm.
4.2.2. Teste de Difusão em Ágar
A cada 24 horas de cultivo, alíquotas dos meios fermentados foram retiradas e
centrifugadas para separar o líquido fermentado da massa celular. Os discos de papel de
6 mm de diâmetro foram umedecidos lentamente com 30 µL do líquido fermentado,
transferidos para placas contendo os microrganismos-teste: Candida sp. (UFPEDA-
720), Candida sp. (URM-4224), Candida sp. (UFPEDA-4249) e Candida albicans
(UFPEDA-1007), seguida da incubação a 30ºC por 24 horas. O teste foi realizado em
triplicata e os resultados foram determinados como a média aritmética dos diâmetros
dos halos de inibição em milímetro. A variação do pH foi acompanhada nos diferentes
tempos de fermentação.
4.2.3. Produção e Extração de Metabólitos Bioativos
4.2.3.1. Pré-inóculo e Fermentação
A linhagem de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, foi semeada em placa de Petri
contendo o meio ISP-2 e incubada em estufa BOD a 30°C por 5 dias. Após este período,
blocos de gelose (6 mm) foram transferidos para frascos de Erlenmeyer (250 mL)
contendo 50 mL do meio MPE modificado neste trabalho (MA). O meio MA (glicose
20g/L; farinha de soja 5 g/L; NaCl 5g/L; CaCO3 4g/L e pH= 6,7 – 7,0) foi incubado sob
agitação (180 rpm), a 28°C por 48 horas. Em seguida, 10% (v/v) deste pré-inóculo foi
transferido para fernbach, contendo 300 mL do meio MA e cultivados por 48 horas sob
21
as mesmas condições de temperatura e agitação. Após este período, a fermentação foi
centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos para a separação do líquido fermentado da
massa celular.
4.2.3.2. Extração do Líquido Fermentado
Para a extração dos princípios ativos, o líquido fermentado foi ajustado a pH 2,0
e 9,0 com HCL e NaOH, respectivamente , e mantido o pH original da fermentação. O
líquido fermentado de cada pH foi tratado com três solventes orgânicos imiscíveis em
água (acetato de etila, éter e clorofórmio). Para cada solvente foi utilizado uma
proporção de 1:2 do líquido fermentado, seguido da agitação durante 20 minutos em
shaker. Após a agitação, foi realizada a separação das duas fases, uma orgânica
composta pelo solvente com o princípio ativo extraído, e outra aquosa que consistiu na
fase aquosa do líquido esgotado. Foram retirados 30 µL de cada fase e colocados em
discos de papel de filtro seguido do ensaio antimicrobiano para o microrganismo-teste
como descrito anteriormente (item 4.2.2).
4.2.3.3. Extração de Metabólitos Bioativos da Massa Celular
A massa celular foi tratada com os solventes miscíveis em água, acetona,
metanol e etanol, em pH 2,0; 7,0 e 9,0 para a extração dos princípios ativos. A cada 10
mL de solvente foi adicionado 1 grama de peso úmido da massa celular e colocado sob
agitação por 15 minutos para a desidratação das células e extração dos produtos
bioativos intracelulares. Em seguida, o material foi filtrado para separar a massa do
solvente contendo os princípios ativos extraídos. Discos de papel foram umedecidos
22
lentamente com 30µL de cada solvente e o ensaio antimicrobiano realizado como citado
anteriormente.
4.2.3.4. Cromatografia em Camada delgada
Após a seleção dos solventes orgânicos os extratos obtidos foram submetidos à
cromatografia em camada delgada (CCD) realizada em placas de sílica gel GF254, com
o sistema eluente HCCl3:MeOH (1:1 v/v). Após secagem, as cromatoplacas foram
depositadas em placas de Petri e recobertas com ágar Sabouraud-dextrose contendo 100
µL da suspensão de Candida sp. (URM-4224). Após a solidificação, as placas foram
incubadas a 30°C por 24 horas e ao fim deste período, os bioautogramas foram
borrifados com solução de 3-(4,5-dimetil) tiazol-2-il-2,5-difenil brometo de tetrazolio
(MTT) 5 mg/mL para observação das zonas de inibição (SAXENA et al., 1995) e
determinação dos Rfs das substâncias que exibiram atividade antifúngica.
4.3. RESULTADOS
Dos quatro meios utilizados na fermentação de Streptomyces sp. UFPEDA 3347,
o meio MA favoreceu maior produção de metabólitos bioativos sob agitação (180 rpm),
a 28°C, (Figura 1) por 48 horas com pH entre 7,8 a 8,0 (Tabela 1). Os extratos do
líquido fermentado produziram halos parciais variando entre 20 a 23 mm (Figura 2),
enquanto que nos extratos da massa celular foram observados halos totais entre 16 e 23
mm (Figura 3). O ensaio bioautográfico indicou a presença de dois metabólitos
antifúngicos com Rfs diferentes nos extratos acetato e etanólico.
23
0
5
10
15
20
25
720 4224 4249 1007
Microrganismos-teste
Hal
o de
Inib
ição
(mm
)
ISP-2 MPE MA MB
Figura 1 - Diâmetro dos halos de inibição da fermentação de Streptomyces sp. UFPEDA
3347 nos meios utilizados para produção de metabólitos bioativos.
Tempo Patógenos 24 h 48 h 72 h 96 h
Meios Halos(mm) pH Halos
(mm) pH Halos(mm) pH Halos
(mm) pH
ISP-2 12 7,30 13 7,35 12 7,42 12 7,45 MPE 14 7,96 16 8,72 15 8,88 13 8,98 MA 19 7,85 21 8,00 17 8,12 16 8,20 720
MB 16 7,78 17 8,35 16 8,48 14 8,53 ISP-2 12 7,30 12 7,35 10 7,42 10 7,45 MPE 14 7,96 15 8,72 14 8,88 12 8,98 MA 19 7,85 20 8,00 18 8,12 17 8,20 4224
MB 15 7,78 17 8,35 16 8,48 13 8,53 ISP-2 13 7,30 15 7,35 13 7,42 10 7,45 MPE 16 7,96 18 8,72 18 8,88 16 8,98 MA 21 7,85 23 8,00 19 8,12 18 8,20 4249
MB 17 7,78 18 8,35 16 8,48 14 8,53 ISP-2 12 7,30 13 7,35 12 7,42 10 7,45 MPE 15 7,96 16 8,72 14 8,88 14 8,98 MA 19 7,85 20 8,00 18 8,12 16 8,20 1007
MB 16 7,78 18 8,35 17 8,48 15 8,53 Tabela 1 - Diâmetro dos halos de inibição e variação de pH durante 96 h da fermentação
de Streptomyces sp. UFPEDA 3347 nos quatro meios utilizados.
24
18
19
20
21
22
23
24
pH= 2,0 pH= 7,83 pH= 9,0Halo
de
Inib
ição
(mm
) con
tra
Cand
ida
sp.(U
RM 4
224)
AcOEt Éter HCCl3
Figura 2 - Diâmetro dos halos de inibição dos extratos do líquido fermentado com os
diferentes solventes orgânicos nos diferentes pHs.
0
5
10
15
20
25
pH=2,0 pH=7,0 pH=9,0
Hal
o de
inib
ição
(mm
) con
tra
Can
dida
sp.
(UR
M 4
224)
Etanol Metanol Acetona
Figura 3 – Diâmetro dos halos de inibição dos extratos da massa celular com os
diferentes solventes orgânicos nos diferentes pHs.
25
4.4. CONCLUSÃO
O meio MA modificado proporcionou maior produção dos metabólitos bioativos.
O etanol em pH neutro foi selecionado como o melhor solvente para extração dos
metabólitos antifúngicos da massa celular.
Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de M. charantia L. produziu dois
metabólitos ativos para cepa de Candida sp. (URM-4224).
26
5. ARTIGO Artigo submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas (RBCF)
27
Isolamento de metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347,
endófito de Momordica charantia L. (Cucurbitaceae)
Sâmea Mesquita Bomfim1*, Vânia Teixeira Lima2, Ivana Gláucia B. Cunha1, Elba Lúcia
C. Amorim1, Janete Magali de Araújo2
1Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade
Federal de Pernambuco
2Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco
* Correspondência: Sâmea Mesquita Bomfim Departamento de Ciências Farmacêuticas-UFPE Laboratório de Química Farmacêutica E-mail: [email protected]
28
RESUMO
Da fermentação submersa de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de Momordica
charantia L., a massa celular foi tratada com etanol na proporção de 1:10 para extração
de metabólitos antifúngicos. O extrato etanólico bruto foi cromatografado em coluna de
sílica gel e as 65 frações obtidas foram reunidas em sete grupos (F1, F2,....F7). Tanto o
extrato etanólico como as sete frações foram submetidos à CCD que na revelação
bioautográfica mostrou a presença de metabólitos antifúngicos com Rfs diferentes. A
avaliação da atividade antifúngica do extrato etanólico e das frações F1 e F7 foi
realizada pelo teste de difusão em ágar, enquanto que a concentração mínima inibitória
(CMI) e concentração mínima fungicida (CMF) foram determinadas pelo método de
diluição em caldo. O extrato etanólico e as frações F1 e F7 apresentaram halos de
inibição acima de 14 mm de diâmetro para as diferentes cepas de Candida, enquanto
que a CMI verificada para o extrato etanólico e para as frações F1 e F7 variou entre 200
a 400 µg/mL. A anfotericina B foi utilizada como padrão. A análise espectroscópica na
região UV-VIS das frações, mostrou bandas de absorção características de um
antibiótico macrolídeo poliênico para F7 e não-poliênico para F1.
Unitermos: Atividade antifúngica, CMI, Streptomyces, Endófito, Polieno
29
INTRODUÇÃO
Durante as últimas décadas, houve um aumento significativo na incidência de
infecções fúngicas invasivas observadas em vários pacientes, incluindo aqueles com
câncer, AIDS e hospitalizados por períodos prolongados em unidades de terapia
intensiva (Nwosu, 2001). Apesar do aumento no número de antimicóticos co-
mercialmente disponíveis, estes ainda encontram-se em desvantagem, quando
comparados às drogas antibacterianas. Além disso, a resistência aos antifúngicos tem
representado um grande desafio para a clínica médica (Batista et al., 1999).
Uma estratégia para combater o problema da resistência microbiana é investigar
a ocorrência de microrganismos em outros habitats, como os endófitos, que vivem no
interior do tecido vegetal, visando selecionar novos microrganismos produtores de
metabólitos bioativos raros. Atualmente, os endófitos constituem uma fonte importante
para a produção de metabólitos secundários com ação antimicrobiana, antifúngica,
antitumoral, antimalária, entre outras (Strobel, Daisy, 2003; Wiyakrutta et al., 2004).
A maioria dos antibióticos de uso clínico foi obtida de Streptomyces spp.
isolados do solo. (Waksman, 1967; Arai, 1976) e neste hábitat segundo Goodfellow e
William (1983) a ocorrência destas bactérias filamentosas é de um milhão por grama de
solo, mostrando que a bioprospecção do solo favoreceu a descoberta dos metabólitos
bioativos disponíveis no mercado. Entretanto, este nicho ecológico está exaurido e
atualmente, inúmeras pesquisas mostram que microrganismos endofíticos,
especialmente de plantas medicinais vêm se destacando como uma nova fonte para
isolamento de compostos bioativos previamente não isolados de microrganismos do
solo (Strobel, Daisy, 2003; Strobel, 2003). Portanto, a busca por plantas que abrigam
tais Streptomycetes endofíticos foi iniciada. (Castillo et al., 2002; Kunoh, 2002). Pullen
et al. (2002) isolaram de plantas da família Celastraceae, Streptomyces sp. (MaB.QuH-
30
8) que produz um novo metabólito denominado cloropirrol com alta atividade contra
uma série de bactérias multiresistentes e micobactérias. Taechowisan et al. (2005)
isolaram da planta medicinal Zingiber officinalei, popularmente conhecida como
Gengibre, várias espécies de actinobactérias, entre elas a linhagem de Streptomyces
aureofaciens (CMUAc130) – isolada da raiz – que apresenta atividade contra
Colletotrichum musae e Fusarium oxysporum, através da produção dos compostos 5,7-
dimetoxi-4-p-metoxifenilcumarina e 5,7-dimetoxi-4-fenilcumarina.
Apesar das plantas serem utilizadas no tratamento de várias doenças há bastante
tempo, muitas pesquisas vêem demonstrando que os microrganismos endofíticos
isolados de plantas medicinais são capazes de sintetizar produtos bioativos idênticos ou
similares aos metabólitos bioativos do vegetal (Strobel, 2003). Recentemente,
investigações de Schmourlo et al. (2005), utilizando extratos aquosos de várias partes
da planta M. charantia L., demonstraram atividade contra Candida albicans e
Cryptococcus neoformans.
Portanto, este trabalho teve como objetivo isolar metabólitos antifúngicos
produzidos por Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de Momordica charantia L.,
a fim de comprovar, que os microrganismos endofíticos, constituem uma alternativa
promissora para a obtenção de novos fármacos de importância biotecnológica.
MATERIAL E MÉTODOS
Preparação do inóculo e fermentação
A linhagem de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, isolada da planta medicinal
Momordica charantia L. (Lima, 2006), foi semeada em placa de Petri contendo o meio
ISP-2 (Pridham et al., 1957) e incubada em estufa BOD a 30°C por 5 dias. Após este
31
período, blocos de gelose (6 mm) foram transferidos para frascos de Erlenmeyer (250
mL) contendo 50 mL do meio MPE (Hamada et al., 1974) modificado neste trabalho
(MA). O meio MA (glicose 20g/L; farinha de soja 5 g/L; NaCl 5g/L; CaCO3 4g/L e pH=
6,7 – 7,0) foi incubado sob agitação (180 rpm), a 28°C por 48 horas. Em seguida, 10%
(v/v) deste pré-inóculo foi transferido para fernbach, contendo 300 mL do meio MA e
cultivados por 48 horas sob as mesmas condições de temperatura e agitação.
Isolamento de metabólitos bioativos
O líquido fermentado foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e a massa
celular tratada com etanol na proporção de 1:10 para a extração de metabólitos
antifúngicos. O extrato etanólico foi concentrado a vácuo e o resíduo bruto (4,35 g)
submetido à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (70- 230 mesh, Merck), a qual, foi
eluída com clorofórmio e metanol com gradiente de polaridade (10-100% de MeOH).
Cromatografia em camada delgada (CCD) e bioautografia
A separação das frações com atividade antifúngica foi observada pela técnica de
bioautografia em placas de cromatografia de camada delgada (CCD) através do método
agar-overlay (Rahalison et al., 1991). A suspensão da levedura Candida sp. (URM-
4224) foi padronizada a 3 x 106 UFC/mL, em solução salina (grau 1 da escala de
MacFarland) (Murray, 1995; Washington, 1972). Do extrato etanólico bruto (0,25
mg/mL) e de cada fração (0,15 mg/mL) foram aplicados 10 µL sobre placas de sílica gel
GF254 (5 cm x 7cm) e como fase móvel utilizou-se clorofórmio : metanol (1:1 v/v).
Após secagem, as cromatoplacas foram depositadas em placas de Petri e recobertas com
ágar Sabouraud-dextrose contendo 100 µL da suspensão de Candida sp. (URM-4224).
32
Após a solidificação, as placas foram incubadas a 30°C por 24 horas e ao fim deste
período, os bioautogramas foram borrifados com solução de 3-(4,5-dimetil) tiazol-2-il-
2,5-difenil brometo de tetrazolio (MTT) 5 mg/mL para observação das zonas de
inibição (Saxena et al., 1995) e determinação dos Rfs das substâncias que exibiram
atividade antifúngica.
Atividade antifúngica
A atividade antifúngica foi realizada em placas de Petri pelo método de difusão
em ágar com discos de papel (Bauer et al., 1966). Foram utilizados diferentes isolados
de Candida como microrganismos-teste: Candida sp. (UFPEDA-720), Candida sp.
(URM-4224), Candida sp. (UFPEDA-4249), Candida albicans (UFPEDA-1007),
Candida albicans (ATCC-90023), Candida kruzei (isolado clínico LM-64), Candida
tropicalis (isolado clínico LM-13). Em placas de Petri contendo 10 mL de ágar
Sabouraud-dextrose, foram adicionados discos de papel (6,0 mm de diâmetro) contendo
30 µL (20 mg/mL) do extrato etanólico bruto e das frações F1 e F7 selecionadas por
bioautografia. Foi espalhada com o auxílio de um swab, 100 µL da suspensão de cada
levedura. O padrão utilizado foi a anfotericina B (SIGMA) na concentração de 10
mg/mL. As placas foram incubadas a 30°C por 24 horas e o teste foi realizado em
triplicata. Os resultados foram determinados como a média aritmética dos diâmetros dos
halos de inibição em milímetro.
Determinação da Concentração Mínima Inibitória
Para este ensaio, foram inoculados em tubos estéreis contendo caldo Sabouraud,
10 µL das suspensões de cada cepa de Candida (106 cels/mL). O extrato etanólico bruto
33
e as frações F1 e F7 (10 mg) foram solubilizados em 1 mL de metanol e posteriormente
distribuídos nos tubos contendo 1 mL de caldo Sabouraud de maneira que se obtivesse
uma concentração que variasse de 1000 µg/mL a 100 µg/mL. A Concentração Mínima
Inibitória (CMI) foi determinada como a menor concentração capaz de inibir o
crescimento visível (turbidez) dos microrganismos (Koneman et al., 2001), após
incubação por 48 horas a 30°C. Foi utilizado como controle positivo a anfotericina B
(SIGMA). A anfotericina B (5 mg) foi dissolvida em 1 mL do dimetilsulfóxido
(DMSO) e concentrações que variaram de 250 µg/mL a 25 µg/mL foram distribuídas
nos tubos contendo 1 mL de caldo Sabouraud. Como controles positivos, foram
preparados tubos com 1,0 mL de caldo Sabouraud e inoculados 10µL das suspensões de
cada levedura a fim de se confirmar o crescimento viável dos microrganismos durante o
teste. Após a determinação da CMI, 5 µL de cada tubo que não apresentou crescimento
visível dos microrganismos e os controles positivos, foram subcultivados em placas de
ágar Sabouraud-dextrose para a realização do teste de Concentração Mínima Fungicida
(CMF). Após 24 horas de incubação a 30ºC, as leituras das CMFs foram realizadas com
base no crescimento dos controles, sendo considerada CMF a primeira concentração que
não proporcionou nenhum crescimento no subcultivo (Batista et al., 1999).
Análise espectroscópica UV-VIS
Após o isolamento dos metabólitos bioativos, as frações F1 e F7 foram
submetidas à espectrometria de varredura no intervalo de 200 a 450 nm, utilizando o
espectrofotômetro UV-VIS Cary 50 Varian Vankel, acoplado a computador.
34
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a fermentação de Streptomyces sp. UFPEDA 3347, a massa celular
separada por centrifugação foi tratada com etanol e rotaevaporada para obtenção dos
princípios ativos. O extrato etanólico bruto foi cromatografado em coluna de sílica gel
60, e obtido 65 frações, as quais, por comparação em placas cromatográficas de sílica
gel GF254, foram reunidas em 7 grupos (F1, F2,..., F7). A análise bioautográfica destas
sete frações mostrou a presença em F1 (Rf=0,92) e F7 (Rf=0,45) de substâncias ativas
com Rfs semelhante ao observado no extrato bruto. A bioautografia confirmou neste
trabalho a sua praticidade, visto ser uma técnica que pode ser utilizada tanto para
extratos como para metabólitos isolados, principalmente por ser um ensaio simples,
eficiente e sensível, pois menos de 2,5 µg de substância bioativa formam áreas de
inibição visíveis (Pinto et al., 2002).
Os resultados da atividade antifúngica pelo método de difusão em ágar (Tabela
I) do extrato etanólico bruto e das frações F1 e F7, apresentaram halos de inibição acima
de 14 mm de diâmetro para as diferentes cepas de Candida. A anfotericina B, foi
utilizada como controle positivo. A produção de metabólitos bioativos por espécies de
Streptomyces endofíticos com atividade antifúngica também tem sido verificada em
vários trabalhos (Taechowisan et al., 2003; Taechowisan et al., 2005), os quais, relatam
a atividade contra os fungos fitopatogênicos Colletotricum musae e Fusarium
oxysporum. Recentemente, Castillo et al. (2006) isolaram de Streptomyces NRRL 3052,
endófito da planta medicinal Kennedia nigriscans, os antibióticos munumbicinas E4 e
E5 com atividade contra Pythium ultimum, fungo fitopatogênico e contra Plasmodium
falciparum, parasita da malária. Vale salientar, que a atividade da munumbicina é duas
vezes maior que a da cloroquina, substância tradicionalmente utilizada no tratamento da
35
malária. No trabalho realizado por Strobel et al. (2007) também pôde ser constatada a
atividade antifúngica de três Streptomyces endofíticos, isolados das plantas medicinais
Thottea grandiflora (família – Aristolochiaceae), Polyalthia spp. (família –
Annonaceae), e Mapania sp. (família – Cyperaceae) contra os diferentes fungos
Phytophthora erythroseptica, Pythium ultimum, Sclerotinia sclerotiorum,
Mycosphaerella fijiensis e Rhizoctonia solani, confirmando assim, que este novo nicho
ecológico constitui uma fonte promissora para a obtenção de linhagens produtoras de
metabólitos antifúngicos.
TABELA I – Avaliação da atividade antifúngica do extrato etanólico bruto e das
frações F1 e F7 da massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347
Halos em mm
Microrganismos
Extrato
etanólico
bruto
Fração F1* Fração F7 Anfotericina B
Candida sp. (UFPEDA-720) 18 14 16 22
Candida sp. (URM-4224) 24 16 18 25
Candida sp. (UFPEDA-4249) 20 17 18 21
Candida albicans (UFPEDA-1007) 19 15 17 21
Candida albicans (ATCC-90023) 22 19 21 24
Candida kruzei (LM-64) 19 14 15 22
Candida tropicalis (LM-13) 22 18 20 23
* halos parciais em (mm)
Na tabela II podem ser observados os valores da CMI e CMF obtidos para o
extrato etanólico bruto e para as frações F1 e F7 frente às cepas de Candida. O perfil de
sensibilidade das cepas de Candida frente às amostras-teste foi semelhante entre elas.
Os resultados obtidos mostram que tanto o extrato etanólico bruto e as frações F1 e F7,
36
inibiram o crescimento das sete cepas de Candida testadas, com CMI de 200 a 400
µg/mL. Trabalho semelhante é relatado por Martins et al. (2006) verificando uma
Concentração Mínima Inibitória de 150 a 450 µg/mL nos extratos de Streptomyces
sp.T8, endófito, isolado das folhas da planta medicinal Symphytum officinale contra as
leveduras Cryptococcus neoformans e Candida albicans.
TABELA II – Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) e Concentração
Mínima Fungicida (CMF) do extrato etanólico bruto e das frações F1 e F7 da massa
celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347
CMI e CMF (µg/mL)
Microrganismos Extrato
etanólico brutoFração F1 Fração F7 Anfotericina B
CMI CMF CMI CMF CMI CMF CMI CMF
Candida sp. (UFPEDA-720) 400 500 400 500 400 500 25 50
Candida sp. (URM-4224) 200 300 400 500 300 400 25 50
Candida sp. (UFPEDA-4249) 300 300 300 400 300 400 25 50
Candida albicans (UFPEDA-1007) 300 400 400 500 400 500 25 50
Candida albicans (ATCC-90023) 200 300 300 400 400 500 25 50
Candida kruzei (LM-64) 300 400 400 500 400 500 25 50
Candida tropicalis (LM-13) 200 300 300 400 300 400 25 50
A análise espectroscópica na região UV-VIS para a fração F1 apresentou curvas
de absorção com picos de 269.0 e 270.1 nm (Figura 1), sendo, portanto, classificado
como não poliênico (Ujikawa, 2003). Enquanto, que para a fração F7 as curvas de
absorção foram de 405.0, 381.9, 360.1 e 322.0 nm (Figura 2) que são característicos de
antibióticos poliênicos (Etienne et al., 1990; Omura et al., 1979; Pandey e Rinehart,
37
1976; Silverstein et al., 1994). Os antibióticos poliênicos caracterizam-se por apresentar
um grande anel lactona e uma seqüência de ligações duplas conjugadas. De acordo com
o número destas ligações podem classificar-se em tri, tetra, penta, hexa e heptaênicos.
As bandas de absorção UV-VIS apresentadas na fração F7 são semelhantes as da
anfotericina B (Figura 2), com duas duplas all-trans, de acordo com os trabalhos de Ball
et al. (1957); Martin e Mc Daniel (1977). Segundo Martin e Mc Daniel (1977), de 34 a
88% dos actinomicetos produzem antifúngicos poliênicos. Em pesquisas realizadas por
Ball et al. (1957) a proporção de antibióticos antifúngicos não-poliênicos para
poliênicos produzidos por actinomicetos foi de 1:20, enquanto, que a proporção
encontrada por Ujikawa (2003) foi de 1:3,6. De acordo com Schilingmann et al. (1999)
um número relativamente alto de polienos estão descritos como produtos metabólicos
dos actinomicetos, no entanto, estes compostos podem ser reconhecidos por seu
espectro UV-VIS específico, porém, suas estruturas nem sempre são conhecidas.
250 300 350 400 4500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abs
Comprimento de onda (nm)
FIGURA 1 – Espectrofotometria UV-VIS de 200 a 450 nm da fração F1 da massa
celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347.
38
250 300 350 400 4500,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
2
1Abs
Comprimento de onda (nm)
FIGURA 2 – Espectrofotometria UV-VIS de 200 a 450 nm. Curva 1 - Fração F7 da
massa celular de Streptomyces sp. UFPEDA 3347; Curva 2 - Anfotericina B a 0,5
µg/mL.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que Streptomyces sp.
UFPEDA 3347, isolado da planta medicinal Momordica charantia L., produz dois
metabólitos ativos para diferentes cepas de Candida, os quais foram caracterizados
como poliênico e não-poliênico.
39
ABSTRACT
From the fermentation of Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endophyte from
Momordica. Charantia L., the cellular mass was treated with ethanol in the proportion
of 1:10 to extraction of antifungal metabolites. The crude ethanolic extract was
chromatographed on silica gel column and the 65 fractions gotten was gathered in seven
groups (F1, F2… F7). As the ethanolic extract as the seven fraction were submitted to
TLC which in the bioautographyc revelation showed the antifungal metabolites
presence with Rfs differentes. The evaluation about the antifungal activity of ethanolic
extract and the F1 and F7 fractions was carried out by the agar difusion method while
the minimal inibitory (MIC) concentration and minimal fungicidal (MFC) concentration
were determinate by the broth dilution method. The ethanolic extract and the F1 and F7
fractions presented inibition zones with diametro over of 14 mm to the different strains
of Candida, while that the MIC verified to the ethanolic extract and to the F1 and F7
fractions varied through 200 - 400 µg/mL. The amphotericin B was used as standard.
The spectroscopical analysis in the UV-VIS region from fraction showed sides of
absorption characteristic of an polyene macrolide antibiotic to F7 and non polyene to
F1.
Uniterms: Antifungal activity, MIC, Streptomyces, Endophyte, Polyene
40
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43
6. CONCLUSÕES
44
6. CONCLUSÕES
Parâmetros como meio de cultura, pH e tempo de fermentação interferiram na
produção dos metobólitos antifúngicos.
O meio MA modificado proporcionou maior produção dos metabólitos antifúngicos.
O etanol em pH neutro foi selecionado como o melhor solvente para extração dos
metabólitos antifúngicos da massa celular.
Streptomyces sp. UFPEDA 3347, endófito de M. charantia L. produziu dois
metabólitos ativos para diferentes cepas de Candida.
A análise bioautográfica dos metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp. UFPEDA
3347 apresentou Rfs diferentes.
Os metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp. UFPEDA 3347 foram
caracterizados por seu espectro UV-VIS como macrolídeo poliênico e não-
poliênico.
45
7. PERSPECTIVAS
46
7. PERSPECTIVAS
Comparar os metabólitos antifúngicos produzidos por Streptomyces sp. UFPEDA
3347 com os produzidos pela planta medicinal M. charantia L.
Realizar a caracterização estrutural dos metabólitos antifúngicos de Streptomyces sp.
UFPEDA 3347.
Ampliar o teste de atividade antimicrobiana contra fitopatógenos de interesse
agronômico.
47
REFERÊNCIAS
48
REFERÊNCIAS
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57
ANEXOS
58
ANEXOS
ANEXO 1
59
ANEXO 2
60
ANEXO 3
Meios de Cultura Ágar Extrato de Levedura-Extrato de Malte (ISP-2) – (PRIDHAM et al., 1957). Extrato de levedura ................................................................. 4 g Extrato de malte .................................................................... .10 g Glicose .................................................................................... 4 g Amido ......................................................................................5 g Ágar ....................................................................................... 20 g Água destilada ................................................................ ........1000 mL
pH 7,2 Meio para Produção de Eurimicina (MPE) – (HAMADA et al., 1974) Farinha de soja ....................................................................... 20 g Glicose ................................................................................... 20 g Cloreto de sódio ..................................................................... 5 g Carbonato de cálcio ................................................................ 2 g Água destilada ........................................................................ 1000 mL
pH 7,0 Meio MA (MPE modificado) Farinha de soja ...................................................................... 5 g Glicose ...................................................................................20 g Cloreto de sódio .....................................................................5 g Carbonato de cálcio ................................................................4 g Água destilada ........................................................................1000 mL
pH 7,0 Meio MB (MPE modificado) Farinha de soja ...................................................................... .5 g Glicose ................................................................................... 5 g Cloreto de sódio ..................................................................... 5 g Carbonato de cálcio .................................................................4 g Água destilada .........................................................................1000 mL
pH 7,0