isolasi dna buah
DESCRIPTION
Laporan Praktikum Biologi MolekulerTRANSCRIPT
ISOLASI DNA BUAH
Oleh:
Nama : Annisa Dwinda FatimahNIM : B1J011082Kelompok : 1 Rombongan : II Asisten : Marsekal Muhammad Karana
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO
2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara
seluler. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat
herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetic
(DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA
dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan (Faatih, 2009).
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,
dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang
mengandung DNA/RNA total (Faatih, 2009).
DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu
organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA
(Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain
seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga strukturnya dapat
terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan mengkarakterisasi DNA
yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya. Tahap-tahap dalam
isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan
membran sel, purifikasi serta presipitasi (Kephart 1999).
Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan
data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan
pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana (Karp et al.
1997). Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah
dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik
jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang
umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung
polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al. 1998).
B. Tujuan
Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi DNA kromosom buah
dan mengetahui prinsip serta proses isolasi DNA buah.
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Bahan yang digunakan adalah buah strawberry (Fragraria vesca), buah
papaya (Carica papaya), buah alpukat (Persea americana), buah mangga (Mangifera
indica), buah naga (Hylocereus undatus), deterjen cair, NaCl (garam dapur), etanol
absolut, akuades, dan tenderizer.
Alat yang digunakan adalah kantung plastik, tabung ependorf, corong plastik,
pipet plastik, sarung tangan, saringan (kain), dan kamera digital.
B. Metode
1. Dua buah masing-masing dimasukkan ke dalam plastik.
2. Buah di dalam kantung plastik dihancurkan dengan cara diremas-remas.
3. Ke dalam kantung yang berisi buah, ditambahkan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml
akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok teh garam dapur).
4. Larutan yang sudah tercampur disaring, ditambahkan tenderizer, dan dimasukkan
ke dalam tabung ependorf.
5. Ditambahkan larutan etanol absolut dan kabut yang terbentuk diamati.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
B. Tabel 1. Pengamatan Isolasi DNA Buah
Kelompok BuahKabut Putih
(+) (-)
1 Strawberry + +
2 Alpokat - -
3 Pepaya - -
4 Mangga + +
5 Buah Naga + +
Gambar 1. DNA Strawberry (+) Gambar 2. DNA Strawberry (+)
Gambar 3. DNA Pepaya (-) Gambar 4. DNA Pepaya (-)
C. Pembahasans
Buah yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA buah ini antara lain buah
strawberry, buah alpokat, buah pepaya, buah mangga, dan buah naga. Dua buah
tersebut masing-masing dimasukkan ke dalam kantung plastik. Kemudian, buah di
dalam plastik dihancurkan dengan cara meremas-merasnya dengan tangan. Buah
yang sudah hancur dimasukkan larutan ekstraksi sebanyak 50 ml. Larutan ekstraksi
terdiri dari 900 ml akuades, 100 ml deterjen, dan 2 sendok teh garam dapur. Buah
dalam plastik kemudian diremas kembali untuk mencampurkannya dengan larutan.
Setelah tercampur, larutan disaring menggunakan corong plastik dan kain saring.
Larutan yang sudah tersaring ditambahkan dengan tenderizer dan dimasukkan ke
dalam tabung ependorf. Etanol dingin kemudian ditambahkan sampai volumenya 1,5
ml. kabut putih yang terbentuk dalam tabung ependorf selanjutnya diamati.
Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kantung plastik yang
berfungsi sebagai tempat untuk menghancurkan buah. Corong plastik dan kain kasa
berfungsi untuk menyaring larutan yang sudah tercampur dengan buah. Sarung
tangan digunakan untuk mencegah DNAse yang ada di kulit merusak DNA. Selain
itu, sarung tangan juga menjaga agar terhindar dari bahan-bahan mutagenik dan
karsinogenik. Pipet plastik digunakan untuk memindahkan larutan. Tabung ependorf
berfungsi untuk sentrifugasi dan kamera digital berfungsi untuk mendokumentasikan
hasil pengamatan.
Berdasarkan pengamatan, didapatkan hasil bahwa isolasi DNA strawberry
kedua-duanya memiliki hasil positif. Begitu juga pada buah mangga dan buah naga.
Namun, pada buah pepaya dan alpokat menunjukkan hasil negatif. Hasil positif
ditunjukkan dengan adanya kabut putih yang terbentuk. Sebaliknya, hasil negatif
ditunjukkan dengan tidak adanya kabut putih yang terbentuk. Tidak terbentuknya
kabut putih tersebut diduga karena buah yang belum benar-benar hancur atau buah
belum tercampur sempurna dengan etanol dingin absolut. Hasil yang positif sesuai
dengan pernyataan Jamilah (2005) bahwa pada saat penambahan etanol, larutan akan
tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di
bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol
memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air.
Sel makhluk hidup memiliki dinding sel pada bagian luarnya, sehingga untuk
mengeluarkan materi DNA dari inti, dinding sel harus dipecah terlebih dahulu
dengan cara mekanik ataupun enzimatik yang biasa disebut sebagai proses isolasi
DNA. DNA merupakan bahan penyusun gen dan makromolekul beruntai ganda
berbentuk heliks yang berfungsi sebagai pewarisan sifat yang menyimpan beragam
materi genetik. Tiap molekul DNA terdiri atas dua rantai panjang yang masing-
masing tersusun dari empat jenis penyusun kimiawi yang disebut nukleotida
(Campbell et al.2002). DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki
oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein
dan RNA (Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari
molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga
strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan
mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya.
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis
dinding dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5)
Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi
dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang
bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm
(rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal
yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses
selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel
yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA (Rogers and Bendich, 1994).
DNA hasil isolasi perlu dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian DNA
bertujuan untuk memperoleh DNA yang terbebas dari kontaminasi senyawa dan
makromolekul lain. Tahapan yang dilakukan untuk memperoleh DNA murni yaitu
membebaskan DNA dari dinding dan membran sel, disosiasi kompleks DNA-protein
dengan cara denaturasi atau proteolisis, serta pemisahan DNA dari berbagai
makromolekul lain (Ausubel et al., 1990). Pemurnian DNA dilakukan dengan
menambahkan etanol ke dalam larutan yang mengandung DNA. Penambahan etanol
dapat menyebabkan terjadinya pengendapan DNA (Sudjadi, 2008). DNA juga dapat
diendapkan dengan larutan isopropanol, namun larutan ini lebih sulit menguap
dibandingkan dengan etanol sehingga memerlukan waktu yang lebih lama dalam
proses evaporasi.
Tahap yang paling penting dalam mengisolasi DNA adalah tahap pemecahan
dinding sel untuk mengeluarkan DNA. Menurut Taylor et al. (1993), kegagalan
dalam memecahkan semua dinding sel dari suatu jaringan dapat mempengaruhi hasil
akhir isolasi DNA. Selain itu, selama penggerusan perlu ditambahkan nitogen cair
untuk menjaga suhu tetap dingin sehingga DNA tidak rusak. Menurut Rogers and
Bendich (1994), penambahan deterjen cair berfungsi melisis sel, mendenaturasi
protein, dan memisahkan karbohidrat dari asam nukleat yang disebabkan perbedaan
kelarutan. Fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan
karbohidrat karena garam dapat menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi.
Penambahan garam juga dpat digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+
yang dikandung oleh garam mampu memblokir dengan kutub negatif fosfat DNA.
Dalam hal ini penambahan garam bisa dikatakan dapat membantu dalam hal
pemekatan DNA (Dollard, 1994). Penambahan NaCl konsentrasi tinggi juga
dilaporkan dapat meningkatkan kelarutan polisakarida dalam etanol, secara efektif
mengurangi presipitasi tambahan pada polisakarida dan DNA (Sahasrabudhe &
Deodhar, 2010).
Purifikasi genom DNA tergantung pada seberapa kali pencuciannya. Tiga kali
pencucian dengan sentrifugasi singkat cukup untuk purifikasi DNA dan membuang
nuclease endogen atau protein lain. Penggunaan etanol dingin untuk presipitasi DNA
meningkatkan hasil isolasi DNA (Sahasrabudhe & Deodhar, 2010). Penambahan
etanol dingin berfungsi untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-
strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih
yang terapung di atas filtrat. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel
sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Jamilah, 2005).
Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan
pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada
dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil
dibandingkan air (Jamilah, 2005). Akuades pada larutan ekstraksi berfungsi sebagai
pelarut.
Menurut Syafaruddin dan Santoso (2011), seiring dengan berkembangnya
ilmu pengetahuan yang mampu mendukung akselerasi kemajuan dari seleksi untuk
mendapatkan karakter yang diinginkan, berbagai metode seleksi dengan
memanfaatkan isolasi DNA juga berkembang, antara lain adalah seleksi dilakukan
pada tingkat gametofit dan sporofit, seleksi secara in vitro, dan seleksi tingkat
molekuler. Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, yang meliputi :
STSs (Sequence-Tagged Sites) dan (SCARs) Sequence Characterized Amplified
Regions, DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple
Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed
Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan
REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand
Conformation Polymorphism) dan melacak beberapa sifat QTL (Quantitative Trait
Locus). Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik yang digunakan untuk tujuan
ilmiah, medis atau forensik, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau
tanaman untuk tujuan diagnostik. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA
untuk identifikasi individu (misalnya bagi pencuri, kecelakaan atau korban perang),
penentuan ayah atau identifikasi hewan.
IV. KESIMPULAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan
bahwa:
1. Hasil isolasi DNA buah strawberry (Fragraria vesca), buah mangga
(Mangifera indica), dan buah naga (Hylocereus undatus) adalah positif, yang
artinya terdapat kabut putih pada tabung ependorf. Sedangkan hasil isolasi DNA
buah papaya (Carica papaya) dan buah alpukat (Persea americana) adalah
negatif.
2. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan
membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
B. Saran
Untuk praktikum selanjutnya sebaiknya lebih dimaksimalkan lagi waktu
praktikumnya.
DAFTAR REFERENSI
Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada, John Willey & Sons.
Campbell NA, JB Reece, and LG Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Lestari R, EIM Adil, N Anita, Andri, Wibowo WF, W Manulu, penerjemah; Safitri A, L simarmata, HW Hardani, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology Fifth Edition.
Dollard. 1994. Personality And Psychotherapy: An Analysis In Terms Of Learning, Thinking And Culture. New York: McGraw-Hill.
Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom Isolation and Digestion of Chromosomal DNA. Sains dan Teknologi, 10(1), 61-67.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.
Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997. Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A Guide to The Technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2.
Kephart D. 1999. Rapid Isolation of genomic DNA from small quantities of human tissue. http://www.promega.com/profiles/203/ProfilesinDNA_203_07.pdf. Diakses pada tanggal 18 Mei 2013.
Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA Extraction Procedure For Species High In Phenolics And Polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G. Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall, London.
Rogers, S.O. and Bendich, A.J. 1994. Extraction of total celluler DNA from plants, algae, and fungi. Plant Mol Biol DI: 1-81.
Sahasrabudhe, A., & Deodhar, M. 2010. Standardization of DNA Extraction and Optimization of RAPD-PCR. International Journal of Botany, 6(3), 293-298.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta, Kanisius.
Syafaruddin dan T. J. Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi Dna Yang Efisien dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 – 17.
Taylor BH, Manhart JR, Amasino RM. 1993. Isolation and Characterizations of Plants DNA, Methods in Plant Moleculer Biology and Biotechnology. London: CRC Pr.