ISOLASI DNAISOLASI DNA

Dian Riana Ningsih

DNAMerupakan molekul yang amat panjang terdiri dari ribuan

deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi tiap organisme

Sel prokariot

Mengandung kromosom yang merupakan satu molekul DNA yang berkaitan erat menjadi daerah inti atau nukleoid

Selain itu ditentukan DNA berukuran kecil berbentuk lingkaran yang disebut dengan plasmid

plasmid

Kromosom bakteri

Gambar. Unsur genetik bebas yang terdapat di dl sel bakteri

Sel eukariot• Mengandung lebih banyak DNA• DNA berukuran jauh lebih besar• DNA bergabung dengan protein menjadi serabut kromatin di dalam

nukleus (histon) yang dikelilingi oleh sistem membran ganda yang bersifat kompleks

• Masing-masing kromosom membawa serangkaian gen yang bersifat unik

Gen : bagian dari kromosom yang menunjukkan spesifitas suatu sifat tertentu

Jumlah kromosom normal pada berbagai spesies- Organisme prokariot

- Bakteri 1

- Organisme eukariot- Kucing 38- Mencit 38- Tikus 40- Kelinci 44- Manusia 46- Ayam 78

Pemurnian DNA dari Sel HidupPemurnian DNA dari Sel Hidup

Tiga macam DNA yang diperlukan oleh ahli rekayasaTiga macam DNA yang diperlukan oleh ahli rekayasa1. DNA sel total1. DNA sel total Sebagai sumber bahan untuk memperoleh gen yang akan diklonSebagai sumber bahan untuk memperoleh gen yang akan diklon Dapat berasal dari kultur sel bakteri, sel tanaman, sel hewanDapat berasal dari kultur sel bakteri, sel tanaman, sel hewan2. DNA plasmid yang murni2. DNA plasmid yang murni Langkah-langkah dasar preparasi DNA plasmid sama dengan Langkah-langkah dasar preparasi DNA plasmid sama dengan

pemurnian DNA sel total pemurnian DNA sel total perbedaan : DNA plasmid harus perbedaan : DNA plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom yang juga terdapat bersama dipisahkan dari DNA kromosom yang juga terdapat bersama dalam seldalam sel

3. DNA fag3. DNA fag Diperlukan jika vektor fag digunakan untuk kloningDiperlukan jika vektor fag digunakan untuk kloning

Preparasi DNA Sel TotalPreparasi DNA Sel Total

Prosedur preparasi DNA totel dari kultur sel Prosedur preparasi DNA totel dari kultur sel bakteri :bakteri :

1. Kultur bakteri ditumbuhkan kemudian dipanen1. Kultur bakteri ditumbuhkan kemudian dipanen2. Sel dilisis untuk mendapat ekstrak kasar2. Sel dilisis untuk mendapat ekstrak kasar3. DNA dimurnikan dari ekstrak kasar3. DNA dimurnikan dari ekstrak kasar4. Larutan DNA yang dihasilkan kemudian 4. Larutan DNA yang dihasilkan kemudian

dipekatkandipekatkan

Preparasi DNA Sel TotalPreparasi DNA Sel Total

Menumbuhkan dan menanam kultur Menumbuhkan dan menanam kultur bakteribakteri

Medium untuk kultur harus memberikan campuran nutrien Medium untuk kultur harus memberikan campuran nutrien penting yg seimbang pd konsentrasi yang memungkinkan penting yg seimbang pd konsentrasi yang memungkinkan bakteri tumbuh dan membelah secara efisienbakteri tumbuh dan membelah secara efisien

Tabel: komposisi dua media khas untuk pertumbuhan kultur Tabel: komposisi dua media khas untuk pertumbuhan kultur bakteribakteriKomponenKomponen g/lg/l

1. medium M91. medium M9 NaNa22HPOHPO44 6,06,0 KHKH22POPO44 3,03,0 NHNH44ClCl 1,01,0 NaClNaCl 0,50,5 MgSOMgSO44 0,50,5 GlukosaGlukosa 2,02,0 CaClCaCl22 0,010,01

2. medium LB (Luria-Bertani)2. medium LB (Luria-Bertani)

TriptonTripton 10 g/l10 g/l Yeast ekstrakYeast ekstrak 5 g/l 5 g/l NaClNaCl 10 g/l 10 g/l

Medium M9 Medium M9 medium tertentu (defined medium) medium tertentu (defined medium) semua komponennya diketahuisemua komponennya diketahui

Medium LB Medium LB medium kompleks (undefined) identitas medium kompleks (undefined) identitas dan kuantitas komponen2 nya yang tepat tidak dan kuantitas komponen2 nya yang tepat tidak diketahuidiketahui

Tripton dan ekstrak ragi Tripton dan ekstrak ragi campuran senyawa kimia yang campuran senyawa kimia yang tidak diketahuitidak diketahuiTripton Tripton asam amino dan peptida asam amino dan peptidaEkstrak ragi Ekstrak ragi nitrogen, gula serta nutrien organik dan nitrogen, gula serta nutrien organik dan anorganikanorganik

Dalam medium LB pada 37 Dalam medium LB pada 37 C dengan C dengan pengocokan pada kecepatan 150-250 rpm/ pengocokan pada kecepatan 150-250 rpm/ menit, sel menit, sel E. coliE. coli akan membelah sekali setiap akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira-kira 2-3 x 10maksimum kira-kira 2-3 x 1099 sel/ml. sel/ml.

Pertumbuhan kultur dapat dimonitor dengan cara Pertumbuhan kultur dapat dimonitor dengan cara pembacaan densitas optik pada panjang pembacaan densitas optik pada panjang gelombang 600 nm gelombang 600 nm

Untuk E. coli 1 unit OD = 0,8 x 10Untuk E. coli 1 unit OD = 0,8 x 1099 sel/ml sel/ml

sentrifuge

Endapan sel

Preparasi Ekstrak SelSel bakteri terbungkus dalam membran sitoplasma dan dikelilingi

oleh dinding sel yang kuatTeknik-teknik untuk memecah dan membuka isi sel bakteri :1. cara fisik Sel dipecah dengan kekuatan mekanis2. cara kimiawi Dilakukan dengan senyawa yang merusak dinding sel dan

senyawa lain yang merusak membran selLisozim mendigesti senyawa polimetrik yang menyebabkan kekakuan dindingEDTA menghilangkan ion Mg yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, disamping dapat menghambat enzim-enzim selular yang dapat merusak DNADetergen untuk mengganggu interaksi ionik antara histon yang bermuatan positif dan tulang punggung DNA yangg bermuatan negatif. Untuk menjamin pemecahan kompleks DNA-protein

B. Sentrifugasi untuk menghilangkan debris selB. Sentrifugasi untuk menghilangkan debris sel

Merusak dinding sel

Merusak membran sel

Debris selSentrifugasi 8000 rpm, 10 menit

DNA, RNA, protein

A. Lisis sel

Ekstrak sel

Pemurnian DNA dari ekstrak selPemurnian DNA dari ekstrak sel

Cara baku untuk menghilangkan protein dari ekstrak sel adalah Cara baku untuk menghilangkan protein dari ekstrak sel adalah dengan penambahan fenol atau campuran fenol dan kloroform (1:1) dengan penambahan fenol atau campuran fenol dan kloroform (1:1) presipitasi protein tetapi DNA & RNA tetap berada dalam larutan presipitasi protein tetapi DNA & RNA tetap berada dalam larutan

Proteinase K : memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil lebih mudah dihilangkan

Ekstrak sel

Lapisan air (DNA +RNA)

Koagulasi protein

Fenol

+ fenol

RNA dihilangkan dg menambahkan enzim nuklease sub unit ribonukleotida

sentrifuge

Pemekatan sampel DNAPemekatan sampel DNA

A. Etanol absolut ditambahkan pada lapisan atas larutan DNA A. Etanol absolut ditambahkan pada lapisan atas larutan DNA yang pekat. Serabut-serabut DNA dapat ditarik dengan yang pekat. Serabut-serabut DNA dapat ditarik dengan batang kacabatang kaca

B Untuk larutan DNA encer, maka presipitat diperoleh dengan sentrifugasi. (untuk 1 volume larutan DNA + 2,5 volume etanol absolut). presipitat dilarutkan dengan H2O steril

Presipitat DNA dihasilkan dg sentrifugasi

etanol

Serabut DNA

Larutan DNA pekat

etanolInkubasi semalaman suhu -15 oC atau 15 menit suhu -70 oC.

Pengukuran DNAPengukuran DNA

Spektrofotometri UVSpektrofotometri UV Banyaknya radiasi UV yang diserap oleh Banyaknya radiasi UV yang diserap oleh

larutan DNA larutan DNA ~ DNA dalam sampel~ DNA dalam sampel λλ = 260 nm = 260 nm nilai nilai 1 = 50 nilai nilai 1 = 50 g DNA g DNA

untai ganda / mluntai ganda / ml Kemurnian : Kemurnian : A 260A 260 = 1,8 = 1,8

A 280A 280

Sel bakteriSel bakteri

1. suspensi dalam EDTA1. suspensi dalam EDTA

2. + lisozim, inkubasi2. + lisozim, inkubasi

3. + 25 % SDS, panaskan3. + 25 % SDS, panaskan

4. + NaCl4. + NaCl

5. + CHCl5. + CHCl33 – penol – penol

6. sentrifugasi pada 10.000 g6. sentrifugasi pada 10.000 g

Lapisan organikLapisan organik lapisan airlapisan air protein pada antar permukaanprotein pada antar permukaan

(bawah)(bawah) (atas)(atas)

+ etanol 95 %+ etanol 95 %

Lapisan airLapisan air DNA pada endapanDNA pada endapan

karakterisasipeartial dengan karakterisasipeartial dengan spektro UVspektro UV

Diagram alir isolasi DNA dari sel bakteriDiagram alir isolasi DNA dari sel bakteri