Isolation and Characterization of Azospirillum spp.

90134014 吳昇達 90134094 楊承琳指導老師 : 趙維良

Azospirillum 的菌種特性1.G(-) 短桿菌，直徑約 1.0μm ，長度約 2~3μm2. 微量好氧菌3. 有移動性，具有鞭毛4. 能進行固氮作用5. 最適合生長溫度 :35-37 度6. 在含有有機酸鹽類的培養基能長的很好 如 :malate( 蘋果酸 ) 、 succinate( 琥珀酸 ) 、 pyruvate

7.DNA 的 G+C 百分比約 69-71%

8. 常出現於榖類作物 ( 常出現稻米中 ) 的根部和土壤中

9. 在 potato agar 上呈現紅色點狀菌落，有皺摺10. 在 BMS agar 上出現粉紅色、不透明、圓形、

有皺摺的菌落11. 培養在 nitrogen-free malate media ，微量好

氧情況下會進行固氮作用12. 在 Congo red medium 會出現鮮紅色菌落

Oxidase +

Urease +

Starch -

gelatin -

indole -

實驗器材1.Phase-contrast microscopy

2. 稻米田的土壤 ( 包含稻米作物 )

＊本次採樣地點為北市中正高中後門稻田3.RC medium 、 BMS medium 、 Nfb tube

4. 各培養基作為生化測試用 (Oxidase 、 Urease 、 Starch 、 gelatin 、 indole)

主要使用培養基成份

1.Nfb medium ( 成份為每公升的需求量 )

a. L-malic acid 5.0g 、 NaCl 0.1g

b. K2HPO4 0.5g 、 MgSO4 ． 7H2O 0.2g

c. CaCl2 0.02g

d. Trace element solution ： (Na2MoO4 ． 2H2O 0.2g 、MnSO4 ． H2O 0.235g 、 H3BO3 0.28g 、 CuSO4 ．5H2O 0.008g 、 ZnSO4 ． 7H2O 0.024g 、 distilled w

ater 1000mL) 2.0mL

e. Bromthymol blue 2.0mL

f. Fe EDTA(1.64% solution) 4.0mL

g. Vitamins solution (biotin 0.01g 、 pyridoxin0.02g 、distilled water 1000ml)1.0ml

h. KOH 4.0g 、 1.75g agar

※ 利用 KOH 調整 pH 值到 6.8

2.RC medium( 成份為每公升的需求量 )

a. K2HPO4 0.5g 、 MgSO4 ． 7H2O 0.2g

b. NaCl 0.1g 、 yeast extract 0.5g

c. FeCl3 ． 6H2O 0.015g 、 DL-malic acid 5g

d. KOH 4.8g 、 agar 20g

※ 利用 0.1N KOH 調整 pH 值到 7.0

15mL,1:400 aqueous solution (RC)

3.BMS medium( 成份為每公升的需求量 )

a. L-malic acid 2.5g 、 KOH 2.0g

b. raw cane sugar 2.5g 、 Vitamins solution (biotin

0.01g 、 pyridoxin 0.02g 、 distilled water 100

0mL) 1.0mL

c. bromthymol blue 2 drops

d. agar 15.0g

實驗步驟

1. 收集稻米作物樣本，以無菌水沖洗

2. 以無菌水沖洗根部，並切下根部約 5-8mm

3. 將根部磨碎加入含有 5mL 的 Nfb medium 試管中

4. 培養 37℃ 72 小時

5. 挑出培養基液面下 1-4mm 的白色菌環，利用 p

hase-contrast 鏡檢，觀察是否有細菌呈桿狀、細長類似 S 型

6. 將白色菌環菌液連續稀釋到 10 的 4~5 次方，利用 RC medium 推平板 ，培養 37 72℃ 小時

7. 挑選 RC medium 上 紅色、點狀菌落，利用 p

hase-contrast microscopy 鏡檢，挑選出形狀為陰性桿菌的菌落

8. 將菌落進行連續稀釋，四區劃線培養在 RC me

dium 上，確保獲得純菌

9. 對菌落進行各種生化測試

採樣地點• 北市市立中正高級中學後門農田

結果ㄧ、稻米根部樣本置入 Nfb tube 中，培養 72 小

時，在試管液面下 1~4mm 出現白色菌環。如圖一

圖一、稻米根部培養於 Nfb 上出現白色菌環 左為對照組

二、菌液連續稀釋到 105 ，滴入 0.1mL 菌液於 R

C medium 上推平板，得到 5 株菌株，分別再接種到 RC medium 上以確保獲得純菌，進行鏡檢。

三、五株菌株的敘述如下表ㄧ

編號 外觀 Gram’s stain

1 點狀，粉紅色，直徑約 0.5mm ，桿狀 G（－）

2 針狀，粉紅色，直徑約 1mm ，球狀 G（＋）

3 針狀，橘色，外圈暈開一圈透明不規則外緣，直徑約 2mm ，球狀

G（＋）

4 針狀，橘色，直徑約 1mm ，球狀 G（＋）

5 點狀中間不規則凸起，粉紅色，直徑約 0.5~1.5mm ，球狀

G（－）

表一、各菌落的外觀型態及染色結果

四、 1 號菌經鏡檢後觀察為 G （－）短桿菌，在 RC medium 上呈現紅色點狀菌落，應為 Azospirillum.spp ，如圖二。

圖二、 1 號菌株在 RC medium 上之生長情況

圖三 .1 號菌株經 Gram’s stain 後在顯微鏡下的觀察

五、將 1 號菌株接種至 BMS medium 上，呈 現綠色菌落，如圖四。

圖四、 1 號菌株在 BMS medium 上產生綠色菌落

討論1. 在 Nfb tube 上產生的白色菌環表示可行固氮作

用。2.RC medium 裡面含有剛果紅，能用來區分 rhiz

obia 和其他種類微生物。3. 一般而言 Azospirillum spp. 在 BMS medium

上會呈現粉紅色或深紅色。

4. 本次實驗所篩選到的 1 號菌株在外觀，型態以及 RC medium 上之生長狀況均符合 Azospirillum 的特徵；但是，在 BMS medium 上，卻出現綠色菌落與理論不符。

5.針對此實驗結果，可能因素為：

（ 1 ）在 rhizobia 中，有其他菌種的外觀型態和 Azospirillum相似，導致在判斷上出現錯 誤。 （ 2 ）樣本只侷限於稻米，變異性太小，導致在 數次實驗中所得到的菌相並無太大變化而 無法篩選到 Azospirillum 。 （ 3 ）在培養過程中，好氧的環境對 Azospirillum 造成傷害，導致無法生長。

感謝1. 本實驗特別感謝北投 賴先生提供稻米作物樣本

References

1.Enrique A. Rodríguez Cáceres . 1982. Improved Medium for Isolation of Azospirillum spp. Appl Environ Microbiol.  44(4): 990–991.

2Klingmuller,W. 1985. Azospirillum III . Springer-Verlag, New York