Isolement des actinomycètes

TP n°2: Analyse microbiologique du sol

L3 Microbiologie Module microbiologie de l’environnement

Isolement des actinomycètes

Les actinomycètes (Actinobacteria) sont un groupe d'eubactériesGram-positives.

La plupart d'entre elles se trouvent dans le sol, y jouant un rôle important dans la décomposition des matières organiques.

C'est le regroupement des bactéries sous forme d'« arbre » qui utilise ses cystes (fruits), ici des endospores, afin de résister à un milieu ses cystes (fruits), ici des endospores, afin de résister à un milieu nutritif défavorable (par exemple, présence de myxomycètes dans le milieu).

Le groupe des actinomycètes et Nocardia a souvent été présenté comme à cheval entre bactéries et champignons. Il se rapproche en fait des champignons essentiellement par l'existence de filaments ramifiés, ressemblance morphologique assez superficielle.

La phylogénie moléculaire a montré sans appel l'appartenance du groupe aux Eubactéries ; cette phylogénie est soutenue morphologiquement par la finesse de ces filaments (maximum 1 micron, les filaments mycéliens allant de 2 à 5 microns) et par le fait que, en culture surtout, ces filaments se fragmentent au point de ressembler beaucoup à des bacilles (aspect similaire à celui des corynaebactéries). Par ailleurs, la composition de leur paroi et corrélativement leur sensibilité aux antibiotiques les rapprochent corrélativement leur sensibilité aux antibiotiques les rapprochent des eubactéries.

La majorité des espèces sont saprophytes ou commensales ; quelques-unes peuvent être pathogènes chez des individus à résistance affaiblie.

Echantillonnage du sol rhizosphérique

Des plantes sont prélevées du sol et leur racines sont secouées doucement pour éliminer le sol de la zone racinaire.

Les échantillons sont collectés dans des flacons en verre stériles et étiquetés.

Les échantillons de sol sont séchés à l’air à température Les échantillons de sol sont séchés à l’air à température ambiante pendant 7 jours et conservés à température ambiante jusqu’à utilisation.

Prétraitement du sol rhizosphèriqueIl existe plusieurs méthodes de prétraitements:

Prétraitement du sol avec 1,5% du phénol

Prétraitement du sol avec le CaCO3

Prétraitement du sol par la chaleur: 2g du sol de chaque échantillon sont chauffé à 50°C pendant une heureéchantillon sont chauffé à 50°C pendant une heure

Isolement Six milieux d’isolement sélectives peuvent être utiliser:

La gélose acide humique vitamine

Le milieu amidon-caseine à pH 7

Le milieu gélose à l’extrait de levure et de l’extrait de malt

Le milieu Bennett… Le milieu Bennett…

Ces milieux sont additionnés d’antifongiques et d’antibiotiques (anti-bactéries à Gram-).

Les boites sont incubées à 28°C pendant 4 semaines. Les boites de Pétri sont alors observés après 2, 3 et 4 semaines d’incubation

A l’aide d’un microscope photonique, les colonies des actinomycètes sont repérées d’après leur aspect microscopique caractéristique

Identification préliminaire

Les colonies suspectes d’être des actinomycètes sont ensuite purifier par repiquage en strie

L’étude macroscopique et microscopique permet de révéler plusieurs morphotypes d’actinomycètes

Par les aspect culturaux; les colonies d’actinomycètes sont en générale des colonies ronde parfois bombées présentant souvent des traits circulaires concentriques difficile à prélever présentant différentes couleur avec une odeur caractéristique (la géosmine)

Principaux genres

Arthrobacter

Corynebacterium

Frankia

Micrococcus

Micromonospora

Mycobacterium

Nocardia

Propionibacterium

Streptomyces

Actinomycètes isolés du solActinomycètes isolés du sol

Actinomycètes isolés de plantes

Micromonospora sp

Par microscope optique:

Sans coloration: afin de mettre en évidence l’aspect filamenteux caractéristiques des actinomycètes. Toutes des les colonies isolées sont observées sous microscope

En générale, toute colonie présentant des filaments courts En générale, toute colonie présentant des filaments courts autour d’elle est retenue (GrX10)

Coloration de GRAMPréparation des frottis + coloration au violet de gentiane + rinçage au lugol + lavage avec mélange éthanol et acétone + lavage à l’eau de robinet + coloration à la fuschine de Ziehl+ rinçage à l’eau + sécher et examiner sous microscope optique à l’aide de l’objectif (X100)optique à l’aide de l’objectif (X100)

Morphologie On ne trouve l‘Actinomyces que dans les grains. Ceux-ci,

écrasés entre lame et lamelle, se révèlent constitués d'un feutrage de fins filaments ramifiés se terminant en périphérie par des renflements en massue.

Au Gram, les filaments sont Gram positifs, les massues Gram Au Gram, les filaments sont Gram positifs, les massues Gram négatives.

Dans les préparations faites à partir des cultures, on trouve des fragments de filaments de longueurs très variables, beaucoup de formes bacillaires et on recherche les formes bifurquées.

Morphologie de Streptomyces sp.

colonie (a) and mycélium (b)

Structure en chaîne des spores de Streptomyces rochei

(a) Phase contrast microscope x100

(b) Phase contrast microscope x400

Mycelium aérien et chaîne de spores de Streptomycestoxytricini observés au Microscope éléctronique(×10,000)

Purification et conservation Des colonies individuelles sont ensemencées sur milieu

gélosé ISP-2, exempt d’antifongique et d’antibactérien, puis incubation à 28°C.

Les colonies ainsi purifiées sont conservées d’une part dans Les colonies ainsi purifiées sont conservées d’une part dans des tubes contenant le milieu Hickey-Tresner ou GLM incliné ou sur les même milieux d’isolement et d’autre part conservée dans 20% du glycérol à -20°C (V/V)

QUESTION?

Quels sont les antifongiques et les antibiotiques les plus utilisés pour l’isolement des Actinomycètes?