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Istituto Clinico di Ricerca e Formazione in• Medicina Rigenerativa e Antiaging• Riabilitazione Avanzata• Ottimizzazione Neuro Psico Fisica

Università degli Studi di SassariDipartimento di PatologiaClinica Chirurgica Veterinaria

© 2012 Rinaldi Fontani Institute, Italy – Web: www.irf.it - Email: [email protected]

IstitutoRinaldi Fontani

Istituto Clinico di Ricerca e Formazione in Medicina Rigenerativa e Antiaging

Riabilitazione Avanzata Ottimizzazione Neuro Psico Fisica

Direttore PresidenteDr.ssa Vania Fontani Dr. Prof. Salvatore Rinaldi

Università degli Studi di Sassari

Facoltà di Medicina VeterinariaDipartimento di Patologia e Clinica

Chirurgica Veterinaria

Direttore Prof. Eraldo Sanna Passino




Effect of Radio Electric Asymmetric Conveyer treatment on sperm ultrastructure of infertile stallions: a pilot study.

Reproduction in Domestic Animals, In press.

Autori:Giulia Collodel, Salvatore Rinaldi, Elena Moretti, Vania Fontani, Alessandro Castagna, Francesca Iacoponi, Gaia Terzuoli, Francesca Cubeddu, Giovanni Mario Careddu, Ignazio Cossu, Eraldo Sanna Passino.

Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione Biologia Applicata;

Centro Interdipartimentale per la Ricerca e la Terapia della Sterilità Maschile, Università degli Studi di Siena,

Istituto Rinaldi Fontani,

Dipartimento di Patologia e Clinica Veterinaria, Clinica Chirurgica, Università degli Studi di Sassari,

AGRIS, Dipartimento di Ricerca per la Riproduzione Equina, Ozieri,




La possibilità di valutare la fertilità di uno stallone, visto il grande aumento

delle procedure di fecondazione artificiale in medicina equina, è

economicamente rilevante.

Nella pratica è noto come sia facile osservare nello stesso stallone,

variazioni quali/quantitative dello sperma, anche in ambito stagionale.

Il poter valutare tali parametri ha enorme importanza per poter ipotizzare

le potenzialità di conservazione del seme, che deve mantenere il piu’

possibile le sue caratteristiche per garantirne la commerciabilità.




L’osservazione dell’eiaculato al Microscopio Ottico, pur

consentendo di valutare la concentrazione e la motilità degli

spermatozoi, non fornisce il quadro della compromissione funzionale

nè dell’aspetto morfologico degli stessi.

L’unico strumento in grado di valutare la fine struttura degli

spermatozoi è la Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM).




In ambito scientifico è ormai ampiamente dimostrata la relazione tra

lo stress da interazione ambientale ed alterazioni della regolazione

dinamica del sistema nervoso autonomo, neuroendocrino e del

sistema immunitario.




L'effetto negativo dello stress sulla riproduzione è stato osservato sui

ratti (Retana-Marquez et al. 2003), nei suini (Einarsson et al.

2008), e sugli esseri umani.

Nell’uomo come nella donna è ampiamente dimostrata una

correlazione tra il disagio psicologico e l’ipo-infertilità, aspetto

rilevato da diversi questionari psicologici effettuati nell’ambito delle

pratiche di fecondazione in vitro (Wichman et al. 2011).




In Medicina Umana un innovativo device noto come Radio Electric

Asymmetric Conveyer (REAC) è stato utilizzato nella gestione dello

stress in soggetti affetti da infertilità maschile idiopatica (Collodel et

al. 2008).

Scopo del presente lavoro:

Testare in Medicina Veterinaria ed in particolare in Medicina Equina,

l'effetto del REAC sulla morfologia degli spermatozoi di stalloni

infertili e, di conseguenza, il suo eventuale ruolo come trattamento

dello stallone infertile con il protocollo di trattamento noto come

Ottimizzazione Neuro Psico Fisica Veterinaria (VNPPO).




L’Ottimizzazione Neuro Psico Fisica Veterinaria (Veterinary Neuro Psycho

Physical Optimization - VNPPO).

Rientra nell'ambito delle tecniche di "brain stimulation - neuro enhancing“ è

finalizzate alla neuro modulazione in ambito neurologico, e nella

riabilitazione neuro psicofisiologica.

Il protocollo di VNPPO viene somministrato sulla zona cranio cervicale con

sonde laminari di alluminio (comprese nei claims brevettuali) flessibili e

plastiche in modo da potersi adattare al profilo delle superfici da trattare.

Prevede 18 sedute, ciascuna delle quali consiste in 100 impulsi da 250 ms

separati da un intervallo di 2,5 s. specifiche




Protocollo di Veterinary Neuro Psycho Physical Optimization: VNPPO




Il protocollo REAC-VNPPO ha il compito di ottimizzare

progressivamente ed efficacemente i meccanismi di gestione neuro

psico fisica del soggetto in trattamento.

Le risposte terapeutiche consentite dal REAC-VNPPO sono è in grado

di ridurre progressivamente il complesso delle disfunzioni adattative.

Tale protocollo è indolore, non invasivo, ed è privo di effetti collaterali.

Inoltre, il trattamento REAC-VNPPO non interferisce con l'uso

concomitante di altre terapie farmacologiche.




Il protocollo VNPPO è preceduto da un

altro protocollo di brain stimulation

denominato Ottimizzazione Neuro

Posturale (Neuro Postural Optimization-

NPO)

Il protocollo NPO viene somministrato sul

padiglione auricolare destro alla base

del trago e consiste in un unico impulso

di 250 ms assolutamente indolore e

non invasivo e privo di qualsiasi effetto

collaterale.




Materiali e Metodi:

11 stalloni, 7 ipofertili e 4 fertili.

Differenti razze (Throughbred., BWP, SBS, Holstein, SF, AA-Arabian)

Età 12 - 24 anni

Ospitati nello stesso Centro di Riproduzione.

Lo sperma è stato raccolto tre volte alla settimana da marzo a luglio, attraverso l’uso di un fantoccio e di una vagina artificiale di tipo INRA modificata.




Parametri seminali esaminati:

Volume, Concentrazione, Colore, Consistenza, pH, Motilità totale e

Motilità progressiva.

La morfologia dello sperma è stata valutata mediante microscopia

elettronica a trasmissione (TEM).

Le caratteristiche del seme sono state monitorate per più di tre mesi

per un totale di cinque eiaculati per ogni stallone.

Campioni di sperma di stalloni fertili sono stati utilizzati per il confronto

con quelli degli animali trattati.




I prelievi sono stati effettuati il 1° gg Time 0, al 14 Giorno, al 28 Giorno,

al 58 giorno (un mese più tardi) e il giorno 118° (tre mesi dopo).

Nell'infertilità degli stalloni oggetto del lavoro non vi erano motivazioni

nè anatomiche nè batteriologiche.

Le caratteristiche submicroscopiche dello sperma sono state effettuate

da esaminatori esperti in cieco.




Analisi dei dati

I dati delle caratteristiche dello sperma e degli

spermatozoi degli stalloni trattati sono espressi come

media e scarto interquartile (IQR 25 ° -75° percentile).




TEM micrographs of stallion spermatozoa. A) Longitudinal section of a normal sperm with well shaped acrosome (nA), nucleus (N) with condensed chromatin end regular assembly of axonemal structures and mitochondrial helix. Mitochondria (M), axoneme(AX). Bar 1µm. B,C) Sections of sperm with altered acrosomes (arrows), reacted (B) and swollen (C). Nucleus (N); cytoplasmic residue (CR). B) Bar 0,5µm; [70X198 mm (300X300 DPI)]

BA




TEM micrographs of stallion spermatozoa. C) Bar 1µm. D) Cross section of altered sperm with marginated chromatin (mCh); cytoplasmic residues (CR); coiled axoneme (cAX). Bar 1µm. [70X198 mm (300X300 DPI)]

C D




Abbiamo voluto supportare il lavoro in vivo con una ricerca della

possibile azione del REAC in vitro su sperma refrigerato valutando la

quanti tà di ATP espressa in mmol\ml




1 Emettitori2 Cavi di connessione3 Morsetti4 Sonda Laminare

5 Sperma refrigerato6 Refrigeratore a 4°C EMF Emissione

Setting




Controlli Trattati




Anche nello stallone situazioni ambientali sfavorevoli possono influenzare

il comportamento sessuale e le caratteristiche del seme.

Dal momento che le cause della ipofertilità degli stalloni non erano

conosciute, come ben descritto in molte altre specie animali (Mason and

Veasey, 2010), abbiamo considerato come possibili elementi lo stress e

le condizioni ambientali.

Infatti l’interazione tra stress e sistema nervoso autonomo condiziona la

concentrazione degli spermatozoi (Giblin, 1988), il volume e la motilità

spermatica (Schneeider-Kofman and Sheiner, 2005) e la loro morfologia

(Pook, 2004).




I dati in vivo dimostrano un progressivo effetto positivo della REAC-VNPPO

sulla qualità del seme degli stalloni ipofertili particolarmente evidente un

mese dopo la fine della terapia, esito legato al ciclo della spermatogenesi.

I dati in vitro dimostrano inoltre un significativo incremento percentuale

della presenza dell’ATP ed un contemporaneo rallentamento della

diminuzione della quantità di ATP nello sperma nell’arco delle 48 ore,

macroscopicamente evidente rispetto ai controlli dove tende allo 0




Al TEM le alterazioni ultrastrutturali intracellulari sono decisamente

maggiori negli stalloni ipofertili rispetto ai normali.

Le anomalie dell’acrosoma sono descritte come possibili cause di

disordini riproduttivi nello stallone (Pesch, 2006)

L’effetto positivo della REAC-VNPPO è verificabile attraverso la

riduzione delle alterazioni dell’acrosoma, dei nuclei con cromatina

marginata e dei residui citoplasmatici.




Il miglioramento delle caratteristiche ultrastrutturali della coda dello

spermatozoo può spiegare, almeno in parte, l’incremento della

motilità.

Nell’uomo, infatti sono stati ipotizzati anche altri meccanismi quali

l’influenza negativa sulla motilità dello spermatozoo esercitata dallo

stress mentale e dal conseguente aumento della superossido

dismutasi (Eskiokac, 2005).

I dati della nostra esperienza sono in sintonia con quanto riportato in

Medicina Umana. In uno studio sull’infertilità idiopatica, dopo analogo

trattamento REAC si assisteva ad un aumento della motilità

spermatica e ad una riduzione dell’apoptosi.




Questi risultati, confermano come il trattamento REAC VNPPO possa essere

un trattamento utile nei casi di ipofertilità idiopatica:

Migliorando il processo di spermatogenesi (Collodel, 2008),

Limitando le risposte disadattative alla interazione ambientale

Ottimizzando il benessere psico fisico dell’animale




Dopo VNPPO con il REAC abbiamo notato un progressivo aumento e

una stabilizzazione della motilità degli spermatozoi e nella qualità

morfologica complessiva nel gruppo degli stalloni ipofertili.

A causa del numero dei campioni i dati delle caratteristiche dello

sperma e degli spermatozoi degli stalloni trattati sono espressi come

media e scarto interquartile (IQR 25 ° -75° percentile).




Ogni tecnologia sufficentemente avanzata è indistinguibile dalla magia. (Arthur C. Clarke)




Grazie

per la cortese attenzione

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