izoenzimi 2014

1

IzoenzimiIzoenzimi

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

2

Ciljevi predavanjaCiljevi predavanja

• Definicija izoenzima

• Osnovne karakteristike izoenzima

• Genetske osnove izoenzima

• Genetski polimorfizam enzima

• Izoforme enzima

• Makroenzimi

• Hibridni enzimi

• Filogenetski razvoj enzima

• Tehnike razdvajanja izenzima i izoformi

3

Multiple forme enzimaMultiple forme enzimaIzoenzimiIzoenzimi iliili izozimiizozimi

Definicija:

Izoenzimi su grupa srodnih enzima koji katalizuju istu reakciju, ali imaju

različite molekulske strukture i karakterišu se različitim fizičkim, biohemijskim i imunološkim svojstvima.

• Izoenzimi imaju isti EC broj po nomenklaturi

• Izoenzimi su multiple molekularne forme jednog enzima koje se javljaju u jednoj individui ili u različitim članovima jedne vrste

• Izoenzimi se mogu javiti u istom organu ili čak u jednom tipu ćelije

• IUB (International Union of Biochemistry) preporučuje korišćenje pojma izoenzimi za forme koje potiču od gena koji kodiraju strukture enzimskog proteina.

4

Razlike izmeñu izoenzimaRazlike izmeñu izoenzima

1. Razlike u enzimskim svojstvima – katalitičkim svojstvima– Osetljivosti na specifične inhibitore

– Različite Km vrednosti

– Reaktivnost prema različitim supstratima

2. Razlike u fizičkim karakteristikama– Stabilnost

– Izoelektrična tačka

3. Razlike u strukturi – aminokiselinama i– Imunološkoj reaktivnosti

5

Razlike izmeñu izoenzima Razlike izmeñu izoenzima (izozima)(izozima)

• Izoenzimi se mogu razdvojiti na osnovu razlika u fizičkim i hemijskim osobinama:– elektroforetskoj pokretljivosti

– hemijskoj inaktivaciji

– toplotnoj inaktivaciji

• Izoenzimi obično imaju znatne kvantitativne razlike u katalitičkim svojstvima, ali sve forme jednog enzima zadržavaju sposobnost katalize iste karakteristične reakcije.

• Postojanje multiplih formi enzima u humanom tkivu našlo je svoju primenu u izučavanju bolesti i razumevanju organ specifičnog metabolizma.

6

Izoenzimi ili izozimiIzoenzimi ili izozimi

Uzroci pojave izoenzima• Genetski• Negenetski

Genetski uzroci• Pojava multiplih genskih lokusa koji kodiraju sintezu strukturno

različitih polipeptidnih lanaca enzima

• Pojava multiplih genskih alela (multipli alelizam) na jednom genskom lokusu koji kodiraju sintezu strukturno različitih verzija polipeptidnog lanca.

• Razlika u izoenzimima koji su posledica multiplog alelizma i multiplih lokusa– Multipli alelizam – razlike izmeñu individua jedne vrste

– Multipli lokusi – uobičajeni za sve jedinke

7

ZnaZnaččaj multiplih formi enzimaaj multiplih formi enzimau enzimologijiu enzimologiji

Značaj postojanja izoenzima u našem organizmu

1. Prisustvo izoenzima u različitim organima sa različitim svojstvima pomaže

u razumevanju specifičnosti metabolizma u pojedinim organima

2. Genetske determinisane varijacije u enzimskoj strukturi izmeñu individua

su odgovorne za osetljivosti na lekove ili razlike u metabolizmu (kod uroñenih grešaka metabolizma)

3. U dijagnostičkoj enzimologiji, postojanje multiplih formi enzima, bilo da se

genetski ili negenetski uzroci, pruža mogućnost:

– Povećane dijagnostičke specifičnosti i osetljivosti odreñivanja enzima u

uzorcima bioloških tečnosti

4. Svaki izoenzim treba posmatrati kao poseban antigen

izoenzimi dovode do produkcije različitih specifičnih antitela

– Imunohemijske metode su važne za analizu smeše izoenzima

– Primena monoklonalnih antitela povećava se specifičnost

8

Genetsko poreklo enzimskih varijantiGenetsko poreklo enzimskih varijanti

•• Multipli genski lokusiMultipli genski lokusi

• Pravi izoenzimi su rezultat postojanja više od jednog genskog lokusa koji

kodira strukturu enzima-proteina.

– Mnogi humani enzimi (verovatno više od trećine) se zna da su odreñeni sa više od

jednog genskog lokusa.

– Geni na različitim lokusima podvrgnuti su različitim modifikacijama u toku evolucije,

tako da su enzimi-proteini kodirani sa ovim lokusima različite strukture, mada su

dosta slični

• Multipli geni koji odreñuju grupu izoenzima ne moraju uvek da budu vezani za

jedan hromozom.

– Geni humane salivarne i pankreasne amilaze su locirani na istom hromozomu 1

– Geni mitohondrijalne i citoplazmatske malat dehidrogenaze su locirani na različitim

hromozomima 2 i 7

9

Enzim se sastoji iz dva tipa subjedinica M i H (formalno A i B) koji su kodirani različitim genima (M je za mišić, a H za srce).

•M subjedinica je kodirana sa LD A lociranim na hromozomu 11p15.4

•H subjedinica je kodirana sa LD B lociranim na hromozomu 12p12.2-p12.1

Klinički značajni enzimi koji su prisutni u vidu izoenzima, ali sa različitim

multiplim genskim lokusima su laktat dehidrogenaza, kreatin kinaza,

alfa-amilaza i neke forme alkalne fosfataze.

Izoenzimi laktat dehidrogenaze (LD) su rezultat postojanja dva genska

lokusa


Supstrat Koenzim

10


•• Multipli genski aleliMultipli genski aleli• Enzim može postojati u molekularnim formama koje se razlikuju od

jedne do druge individue zbog postojanja alternativnih alela koji se nasleñuju prema Mendel-ovim zakonima. Ovo dovodi do stvaranja genskih produkata sa istim funkcijama.

• Izoenzimi koji su posledica postojanja alelnih gena se nazivajualoenzimi ili alozimi.

• Postoje značajne razlike u izoenzimskim

profilima zbog ovih razlika u alelima

S F

F F

F F

F FS F S F

11


•• Multipli genski aleliMultipli genski aleli• Broj alelnih varijanti i frekvencija pojedinih alela u jednoj populaciji varira od

jednog enzima do drugog. – Tako na primer vrlo su retke varijacije u dva genska lokusa koji odreñuju humanu

laktat dehidrogenazu (LD).

– Za razliku od LD, placentarna alkalna fosfataza pokazuje velike varijacije u genskom lokusu za placentarnu alkalnu fosfatazu odnosno postoje mutantni aleli na ovom lokusu.

– Postoji više od 400 mutacija gena glukoze-6-fosfat dehidrogenaze na X-hromozomu.

• Podaci za mutacije enzima i proteina se mogu dobiti od baze podataka OMIM Online Mendelian Inheritance in Man ima stranica na web-u.

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim• Neki aleli su ekstremno retki, dok se neki javljaju sa značajnom frekvencijom u

odreñenoj populaciji ili geografskom području.

• Kada su izoenzimi zbog značajne razlike alelne frekvencije na genskom lokusu prisutni u humanoj populaciji kažemo da je ta populacija polimorfna u odnosu na odreñeni izoenzim.

12


•• Asocijacije izoenzimaAsocijacije izoenzima

• Druga kategorija multiplih molekularnih formi mogu se javiti kada su enzimi oligomerni i postoje u vidu molekula sa više subjedinica. Asocijacija različitih tipova subjedinica u raznim kombinacijama postoji kod niza aktivnih enzimskih molekula.

•• Hibridni izoenzimiHibridni izoenzimi

• Hibridni molekuli sastavljeni od izoenzima produkata različitih strukturnih gena- multipli lokusi ili multipli aleli.

• Sposobnost stvaranja hibridnih izoenzima je zbog strukturnih sličnosti izmeñu različitih subjedinica.

• Hibridni izoenzimi se mogu stvoriti in vitro, ali nastaju i in vivo u ćelijama pri čemu različiti tipovi subjedinica se nalaze u istom subcelularnom prostoru.

13

Hibridni izoenzimi Hibridni izoenzimi

Poreklo izoenzimaDva različita genska lokusa a i bDva polipeptidna lanca A i BDva protomera (subjedinice) A i B

Aktivan enzim je polimer•Dimerni enzimi

•Dva homopolimera•Jedan heteropolimer

•Tetramerni enzim•2 homopolimerna izoenzima•3 heteropolimerna izoenzima

14

Primeri hibridnih izoenzima Primeri hibridnih izoenzima

Izoenzimi kreatin kinazeDimerni enzimDve subjediniceTri izoenzima

Izoenzimi laktat dehidrogenazeTetramerni enzimDve subjedinicePet izoenzima

15

Negenetski uslovljene multiple forme enzimaNegenetski uslovljene multiple forme enzimaSekundarni izoenzimiSekundarni izoenzimi--IzoformeIzoforme

• Post-translacione modifikacije enzima dovode do stvaranja multiplih

formi

• Modifikacije ostataka polipeptidnih lanaca dešavaju se u ćeliji i

dovodi do stvaranja multiplih formi.

• Hemijske modifikacije

– Amidacija, acetilacija, oksidacija sulfhidrilnih grupa, adicija fosfatnih

grupa, uklanjanje ugljovodoničnih lanaca, uklanjanje dela proteina

proteolitičkim enzimima, agregacija i polimerizacija

– Uklanjanje amidne grupe alfa amilaze i karboanhidraze

16

Negenetski uslovljene multiple forme enzimaNegenetski uslovljene multiple forme enzimaSekundarni izoenzimiSekundarni izoenzimi--IzoformeIzoforme

• Modifikacija u toku izolacije tj ekstrakcije

– eritrocitni enzimi sadrže sulfhidrilne grupe koje su podležne oksidaciji

– adenozin dezaminaza, kisela fosfataza, fosfoglukomutaza

– oksidacija u hemolizatima – efekat oksidovanog glutationa

– intaktne ćelije su zaštićene sa redukovanim glutationom

– varijante enzimske molekule se mogu javiti sa različitim naelektrisanjem

molekule.

• Modifikacije u toku klirensa enzima

– Serumske izoforme kreatin kinaze

– Karboksipeptidaza uklanja ostatke lizina sa C-terminalnog kraja

– Izoforme CK-MM i CK-MB (CK-MB1 i CK-MB-2)

17

Negenetski uslovljene multiple forme enzimaNegenetski uslovljene multiple forme enzima

18


• Modifikacija neproteinskih komponenti enzimskih molekula

– Mnogi enzimi su glikoproteini i varijacije u ugljenohidratnim bočnim lancima su

uobičajeni uzroci nehomogenosti enzima.

– Ugljenohidratni ostaci poput N-acetilneuraminske kiseline (sijalinska kiselina) su

jonizovani i utiču na neka svojstva enzimske molekule.

– Uklanjanje sijalinske kiseline na alkalnoj fosfatazi (jetrenoj i koštanoj fosfatazi) sa

neuraminidazom značajno redukuje elektroforetsku pokretljivost.

• Agregacija enzimskih molekula jedan sa drugim ili sa neenzimskim proteinima

– Multiple forme koje se mogu razdvojiti tehnikama koje zavise od razlika u

molekulskim masama.

– Tako na primer četiri katalitički aktivne komponente holinesteraze sa Mm od 80 000

do 340 000 se nalaze u većini seruma, sa najtežom komponentom C4 koja sadrži

veći deo enzimske aktivnosti. Serumska holinesteraza je vezana za različite

stupnjeve agregacije jednog monomera.

19


Makroenzimi• Specifična interakcija izmeñu enzimske molekule i neenzimskih proteina je uzrok

neuobičajene enzimske komponente koja je uočena tokom elektroforeze ili frakcionisanja hromatografijom.

• Kombinacija normalne enzimske molekule ili izoenzimske molekule sa plazmatskim imunoglobulinima. Ovi enzim-proteinski kompleksi (makrokompleks) mogu biti heterogeni.

• Prvi makroenzim koji je identifikovan bila je makroamilaza, a kasnije i drugi makrokreatin kinaza, makrolipaza, makro-laktat dehidrogenaza i makro-alkalna fosfataz, itd.

Konformeri• Pojedinačni polipeptidni lanac u teoriji postoji u velikom broju različitih konformacija.

Obično je jedna konformacija najstabilnija sa datom sekvencom aminokiselina.

• Ova mogućnost je pre svega pripisana heterogenosti koja postoji kod citoplazmatičnih i mitohondrijalnih enzima malat dehidrogenaze i kod multiplih elektroforetskih zona eritrocitne kisele fosfataze. Meñutim nije sa sigurnošću utvrñeno da su multiple enzimske forme posledica konformacionog izomerizma.

20

Primer kompleksnih formi enzimaPrimer kompleksnih formi enzimaIzoenzimi i izoforme alkalne fosfataze

Distribucija alkalne fosfataze u organima

Izoenzimi• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza hromozom 1• Intestinalna hromozom 2• Placentalna hromozom 2• Fetalna intestinalna hromozom 2

Izoforme• Tkivno nespecifična alkalna fosfataza 3 izoforme

– Jetrena– Koštana– Bubrežna

• Jedan genski lokus• Ove forme su N-glikozilirane i samo jetrena ALP ne sadrži 0-vezane

glikane.

21

ZakljuZaključčakakRazlike i sliRazlike i sliččnosti izoenzima i izoforminosti izoenzima i izoformi

• Izoenzimi• Izoenzimi pokazuju razlike u:• katalitičkim svojstvima• imunohemijskim svojstvima• stabilnosti• naelektrisanju• vrlo male razlike u Mm

• Izoforme• Nema razlike u katalitičkim

svojstvima• imunohemijski su slični• male razlike u stabilnosti• razlike u naelektrisanju• velike razlike u Mm

22

Distribucija izoenzima i drugih multiplih formi enzimaDistribucija izoenzima i drugih multiplih formi enzima

• Postojanje multiplih genskih lokusa i odgovarajućih izoenzima je rezultat evolucije u

odreñenim vrstama i postali su deo njihovog metabolizma.

• Neke od ovih adaptacija su rezultat raspodele funkcije izmeñu i unutar različitih

tipova specijalizovanih ćelija i tkiva.

• Distribucija izoenzima nije uniformna kroz celo telo i postoje mnoge varijacije u

aktivnostima različitih izoenzima u pojedinim organima, ćelijama i na subcelularnom

nivou.

• Lokalna ekspresija multiplih genskih lokusa• Izoenzim alkalne fosfataze koji se nalazi u humanoj placenti je produkt jednog

strukturnog genskog lokusa koji je odvojen, različit u odnosu na druge lokuse koji

odreñuju strukturu drugih izoenzima ALP.

• Produkt placentarnog ALP genskog lokusa se normalno detektuje samo u placenti. • Primer lokalne ekspresije multiplih genskih lokusa su i različiti izoenzimi koji se

javljaju u specifičnim subcelularnim organelama.

• Postoje mitohondrijalni i citoplazmatični izoenzimi su funkcionalni analozi kao što je to

slučaj sa AST i MD.

23

Promene u distribuciji izoenzima u toku razvojaPromene u distribuciji izoenzima u toku razvoja

• U toku rasta i razvoja organizma može doći do promene u raspodeli

izoenzima u tkivima kod mnogih vrsta.

• Mišićno tkivo– U toku embrionalnog razvoja skeletne muskulature, proporcija elektroforetski više

katodnih enzima i LD i CK progresivno se povećava u tkivima u toku 6 meseca

intrauterinog života, kada je taj uzorak sličan izdiferenciranom mišiću.

• Jetra

– Jetra isto tako pokazuje karakteristične promene u uzorcima nekoliko izoenzima u

toku embriogeneze.

• Aldolaza

– U ranom fetalnom razvoju, postoje tri izoenzima aldolaze A,B i C- zajedno sa

raznim hibridnim tetramerima koji se nalaze u izolovanom tkivu. Nakon roñenja postoji samo aldolaza B koja je predominantna forma.

• Alkohol dehidrogenaza

– Značajne promene u distribuciji izoenzima alkohol dehidrogenaze humane jetre

se takoñe javljaju u prenatalnom razvoju.

24

Promene u distribuciji izoenzima u toku razvojaPromene u distribuciji izoenzima u toku razvoja

• Promene u izoenzimskom profilu u toku razvoja rezultat su promena u relativnim aktivnostima genskih lokusa u ćelijama u razvoju (na primer mišićne ćelije).

• Druge varijacije u balansu izoenzima u celom organizmu mogu proisteći iz promene u broju aktivnih ćelija koje sadrže velike količine karakterističnih izoenzima.

– Primer za ovo je povećan broj i aktivnost osteoblasta koji su odgovorni za mineralizaciju skeleta izmeñu ranog postnatalnog perioda i početka treće dekade života.

– Višak alkalne fosfataze iz aktivnih osteoblasta ulaze u cirkulaciju gde se oni mogu identifikovati na osnovu karakterističnih osobina i gde povećavaju ukupnu aktivnost alkalne fosfataze kod mladih osoba iznad nivoa alkalne fosfataze odraslih.

• Alkalna fosfataza iz jetre takoñe pokazuje porast sa godinama koji je mali ali progresivno se odvija. Razlozi ovih promena sa starošću se ne znaju, ali su rezultat povećane sinteze izoenzima u hepatocitima kao odgovor na stalnu izloženost indukujućih faktora.

25

Promene u distribuciji izoenzima u bolestimaPromene u distribuciji izoenzima u bolestima

• Neke bolesti poput progresivne mišićne distrofije, onemogućavaju normalan

razvoj odreñenih tkiva ili nemaju sposobnost da održe normalno stanje.

• Ćelije kancera progresivno gube strukturu i metabolizam zdravih ćelija. • Izoenzimski profil u takvim tkivima je promenjen u zrelim, diferenciranim

tkivima tako da se mogu javiti i promene u izoenzimskom profilu.

• Mišićna distrofija– Distribucija izoenzima aldolaze, LD i CK u mišićima kod pacijenata sa

progresivnom mišićnom distrofijom je slična onoj u ranim stupnjevima razvoja

mišića fetusa.

– Abnormalnosti izoenzima u mišićnoj distrofiji se opisuju kao nesposobnost ili poremećaj da se dostigne normalan stepen diferencijacije mišićnog tkiva.

• Tkivo koje se regeneriše takoñe može da pokazuje neka svojstva fetalnog

tkiva i distribucije izoenzima. – Promena kontrolnog sistema u ćelijama koje se brzo dele i mogu biti odgovorni

za neke promene u izoenzimima (na primer mišići u akutnom poliomiozitisu).

26

Promene u distribuciji izoenzima u bolestimaPromene u distribuciji izoenzima u bolestima

• Onkofetalni proteini i enzimi• Pojava fetalnih uzoraka distribucije izoenzima je pojava maligne

transformacije u mnogim tkivima. Ovaj fenomen je najpre izučavan u slučaju laktat dehidrogenaze.

• Maligni tumori u načelu pokazuju značajan pomak u ravnoteži izoenzima ka elektroforetski više katodnim formama poput LD-4 i LD-5. Pad aktivnosti izoenzima LD-1 i LD-2 rezultuje pojavom profila koji je reminiscencija enzimskog profila u embrionalnom tkivu.

• Tumori prostate, cerviksa, dojki, mozga, želuca, kolona, rektuma, bronha i limfnih žlezdi pokazuju ove transformacije. Suprotno ovome, benigni gliomi pokazuju relativni porast u anjonskim izoenzimima.

27

Primeri razlika u distribuciji izoenzima laktat dehidrogenaze u srcu i jetri kod odraslih i fetusa

28

Razlike u osobinama multiplih formi enzimakoje se koriste u razdvajanju izoenzima

• Katalitičke razlike– Izoenzimi sa multiplim genskim lokusima

• Km za supstrate se razlikuje

• Osetljivost na inhibitore

• Aktivnost sa analozima supstrata

– Izoenzimi nastali post traslacionim modifikacijama• Slične katalitičke aktivnosti

• Antigenska svojstva

• Rezistencija na denaturaciju– Toplotom

– Koncentrovanim rastvorima ureje

• Naelektrisanju molekule– Zonska elektroforeza

– Jonoizmenjivačka hromatografija

– Izoelektrofokusiranje

• Molekulskoj veličini– Molekularno prosejavanje

• Gel filtracija

29

Izoenzimi u kliniIzoenzimi u kliniččkoj praksikoj praksi

• Specifičnost tkivne distribucije izoenzima i drugih

multiplih formi enzima predstavlja bazu za organo

specifičnu dijagnostiku kroz odreñivanje izoenzima

• Bez obzira na mehanizam nastanka izoenzimi pružaju

povećane mogućnosti u diferencijalnoj dijagnostici

različitih bolesti !!!

izoenzimi 2014

Health & Medicine