Penghambatan Jalur JNK/Bim oleh Hsp70 Mencegah Aktivasi Bax pada Apoptosis yang Dipacu oleh UV

Abstrak

Di sini kita mempelajari mekanisme yang mana Hsp70 mencegah aktivasi Bax selama apoptosis yang dipicu oleh UV. Pemberian UV menyebabkan fosforilasi JNK, redistribusi Bim dan selanjutnya aktivasi Bax.Penipisan Bim menyebabkan pengurangan lebih kecil pada apoptosis bila dibandingkan dengan menghambat JNK, menunjukkan bahwa aktivasi Bim tidak sepenuhnya bertanggung jawab untuk memicu apoptosis dan mekanisme lain yang terlibat. Melemahkan Hsp70 mengakibatkan teraktivasinya JNK dan Bax pada tingkatan tinggi, sementara ekspresi yang berlebihan Hsp70 menghambat proses ini. Temuan ini menunjukkan bahwa Hsp70 mencegah aktivasi Bax dengan cara menghambat jalur JNK / Bim. Bersamaan, peningkatan pengikatan Hsp70 ke Bax telah diamati. Secara kolektif, hasil kami untuk pertama kalinya menunjukkan bahwa Hsp70 mencegah aktivasi Bax baik dengan menghambat jalur JNK / Bim dan berinteraksi dengan Bax pada apoptosis yang dipicu oleh UV.

Kata Kunci

Hsp70; Bax; JNK; BimL; UV irradiasi

1. Pengantar

Apoptosis dapat dimulai dengan beragam bentuk stres sel seperti heat shock dan radiasi sinar ultraviolet (UV) [1]. Bcl-2 memainkan peran penting dalam mengatur apoptosis [2] . Bcl-2 terdiri dari tiga subfamilies: (a) anggota antiapoptosis, seperti Bcl-2/Bcl-XL, (b) anggota proapoptosis, seperti Bax, Bak, dan Bok, dan (c) BH3-protein, seperti Bid, Bim, Puma, dan BMF [3] . Protein Bax proapoptosis memainkan peran penting dalam apoptosis [4] . Selain itu, jalur sinyal c-Jun N-terminal kinase (JNK) mempromosikan aktivasi Bax dengan fosforylasi Bim, menunjukkan Bim yang menyediakan hubungan molekular antara jalur sinyal JNK dan mesin Bax-dependent apoptosis mitokondria [5] .Setelah paparan stimulus apoptosis, Bax mengalami perubahan konformasi, menyebabkan terpaparnya N-dan C-termini dan penargetan mitokondria nya. Dalam membran mitokondria, oligomerized Bax memfasilitasi permeabilisasi membran mitokondria, yang mengarah ke sitokrom c pelepasan dari mitokondria [4] dan

[6] . Namun, sel memiliki sistem perbaikan diri untuk menekan apoptosis dalam kondisi berbahaya, yang dapat dicapai oleh anggota keluarga heat shock protein [7] .

Protein heat shock (Hsps) adalah seperangkat protein yang sangat dilindungi dan mereka berfungsi sebagai molekul chaperone. Sebuah subkelompok baik ditandai dari Hsps adalah keluarga heat shock protein 70 (Hsp70) [8] . Ada beberapa anggota keluarga Hsp70, termasuk stres-inducible Hsp70, konstitutif Hsp70 (Hsc70), mitokondria Hsp75, dan GRP78 [9] . Ekspresi Hsp70 dapat disebabkan oleh berbagai stres, termasuk heat shock, radiasi UV dan stres oksidatif [8] . Hsp70 telah dilaporkan dapat melindungi sel dari apoptosis yang diinduksi oleh berbagai stres dan agen [10]. Hal ini dapat menghambat jalur apoptosis pada tingkat yang berbeda [11] . Yang paling penting, studi terbaru menunjukkan bahwa Hsp70 mencegah translokasi Bax ke mitokondria dan menghalangi permeabilisasi membran mitokondria [12] , [13] , [14] dan [15] , meskipun mekanisme molekulernya masih belum jelas sampai saat ini.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki bagaimana Hsp70 menghambat aktivasi Bax dalam apoptosis yang diinduksi oleh sinar UV. Untuk menentukan mekanisme molekular yang terlibat dalam proses ini, studi ini berfokus pada: (i) aktivasi jalur sinyal JNK / Bim / Bax setelah terpapar radiasi sinar UV, (ii) penghambatan efek Hsp70 pada jalur JNK / Bim / Bax pada apoptosis yang diinduksi oleh sinar UV, (iii) interaksi antara Hsp70 dan Bax.

2. Bahan dan metode

2.1. Bahan dan plasmid

Kami menggunakan antibodi terhadap Hsp70, JNK dan Bax (Teknologi sinyal sel) dan p-JNK (BD Biosciences). CFP-Bax diberikan oleh Drs. Streuli dan Gilmore (Universitas Manchester), YFP-Hsp70 adalah hadiah dari Dr Morimoto dari Universitas Northwestern, dan pDsRed-Mit disediakan oleh Dr Gotoh (Universitas Tokyo). Hsp70 short hairpin RNA (shRNA) dan Scr diberikan oleh Dr Tolkovsky [16] . Oligonukleotida untuk shRNA Bim dibeli dari GenePharma (Shanghai, Cina), dan digunakan sebagai dijelaskan sebelumnya [17] . GFP-BimL dihasilkan sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [18] .Bahan kimia lainnya yang dibeli dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO).

2.2. Kultur sel dan perlakuan

Sel Adenokarsinoma paru-paru manusia (ASTC-a-1) dikultur dalam DMEM dilengkapi dengan 15% serum janin anak sapi (FCS), Penisilin (100 unit / ml), dan Streptomisin (100 mg / ml) pada 37°C dengan 5% CO2 dalam inkubator yang dilembabkan. Transfeksi dilakukan dengan Reagen Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) sesuai dengan protokol produsen.Sel diperiksa pada 24-48 jam setelah transfeksi.Sebelum pengobatan sinar UV 120 mJ / cm2, media telah dihapus dan dikumpulkan, kemudian sel itu dibilas dengan dapar garam fosfat.Media dipulihkan setelah pengobatan.Untuk percobaan dengan inhibitor, sel-sel pra-perawatan dengan 20 mM SP600125 (inhibitor spesifik dari JNK, Sigma, St Louis, MO, USA) selama 1 jam sebelum radiasi sinar UV. SP600125 disimpan di dalam medium selama proses eksperimental.

2.3. Tes Viabilitas sel

Sel ASTC-a-1 dikultur dalam microplate 96-well dengan densitas 5 × 103

sel /well selama 24 jam. Viabilitas sel dinilai dengan Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Laboratorium Dojindo, Kumamoto, Jepang) pada waktu yang ditentukan setelah pengobatan sinar UV. OD450, nilai absorbansi pada 450 nm, dibacakan dengan sebuah pembaca 96-well plate (DG5032, Huadong, Nanjing, Cina), untuk menentukan kelangsungan hidup dan proliferasi sel.

2.4. Arus cytometry

Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC, 0,1 mcg / ml) digunakan untuk penilaian paparan phosphatidylserine. Propidium iodida (PI, 0,5 mcg / ml) digunakan untuk analisis viabilitas sel. Kematian sel diukur dalam FACSCanto ™ II cytofluorimeter (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Kompensasi digunakan bila diperlukan.

2.5. Fraksinasi Subseluler

Fraksi sitosol dan mitokondria-yang diperkaya disusun dengan menggunakan Kit Ekstraksi subselular proteome (ProteoExtract ™, Calbiochem, Darmstadt, Jerman) sesuai dengan instruksi dari pabriknya.

2.6. Analisis perubahan Bax secara konformasional

Sel yang segaris dengan ice-cold lysis buffer(150 mM NaCl, 10 mM HEPES (pH 7,4), 1% asam 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic, dan 100 mcg / ml PMSF) yang mengandung protease inhibitor. Untuk immunopresipitasi, 2,5 mcg anti-Bax antibodi monoklonal 6A7 (Abcam, Cambridge) ditambahkan ke dalam 500 ug sel Lysate. Para kompleks imun yang diperoleh menjadi sasaran analisis western blotting dengan anti-Bax antibodi poliklonal.

2.7. LCSM dan Fluorenscence resonance energy transfer (FRET) akseptor teknik pemutihan foto

Fluoresensi cyan fluorescent protein (CFP), green fluorescent protein(GFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (DsRed), dan Mitotracker dimonitor confocally dengan LCSM, menggunakan panjang gelombang eksitasi yang berbeda dan filter deteksi sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya [19 ] .

Akseptor FRET pemutihan-foto dilakukan pada LCSM untuk mendeteksi interaksi antara YFP-Hsp70 dan CFP-Bax. Untuk eksitasi, 458 nm garis argon-ion laser telah dilemahkan dengan filter acousto-optik merdu dan dipantulkan oleh cermin dichroic (main beam splitter HFT458), dan terfokus melalui Plan-Neofluar 40 × / 1,3 NA objektif minyak DIC (Carl Zeiss) ke dalam sampel. CFP (donor) dan YFP (FRET akseptor) emisi dikumpulkan melalui 470-500 dan 535-545 nm filter band pass lulus, masing-masing. YFP terksitasi pada 514 nm, dan emisi terdeteksi pada 565-615 nm band-pass (YFP channel). Kami putihkan sinyal YFP (akseptor) di daerah tertentu di dalam sel (diidentifikasi oleh persegi panjang) pada 514 nm dari garis-ion argon laser pada 100% tenaga untuk 300 iterasi.

2.8. Tes Translokasi CFP-Bax dan GFP-BimL

Untuk memantau translokasi Bax di dalam sel hidup, sel transfected dengan CFP-Bax dan ternoda oleh MitoTracker untuk pelabelan mitokondria.Sel-sel menunjukkan pewarnaan yang kuat dari CFP, yang mana saling tumpang tindih dengan distribusi MitoTracker, dihitung sebagai sel dengan Bax mitochondrially lokal. Analisis translokasi mitokondria GFP-BimL adalah mirip dengan Bax.

2.9. Co-immunopresipitasi dan tes western blotting

Sel yang segaris dengan ice-cold lysis buffer (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, 1 × TritonX-100, 100 mcg / ml PMSF dan Protease Inhibitor Cocktail Set I) selama 45 menit di dalam es. Setelah sentrifugasi, supernatan diinkubasi dengan antibodi terhadap Bax dan kemudian dengan protein A-Sepharose (50% slurry) pada suhu 4°C semalam. Setelah dicuci lima kali, pelet itu digantungkan kembali dengan volume yang sama dari buffer sampel SDS, dan direbus untuk menghilangkan manik-manik Sepharose. Kemudian sel lisat dan immunoprecipitasi dianalisis dengan western blotting [20] .

3. Hasil

3.1. Hsp70 memberikan perlawanan terhadap apoptosis yang dipicu oleh UV

Untuk mempelajari ekspresi Hsp70 setelah radiasi sinar UV, analisis western blotting dilakukan. Hasil menunjukkan bahwa ekspresi Hsp70 meningkat secara bertahap ( Gambar 1. A). Untuk menyelidiki fungsi sitoprotektif dari Hsp70 setelah radiasi sinar UV, viabilitas sel dianalisis menggunakan CCK-8. Hsp70 diekspresikan dengan jelas mengurangi tingkat kematian sel, dibandingkan dengan pengobatan sinar UV saja ( Gambar 1. B). Selain itu, western blotting dilakukan untuk mengkonfirmasi ekspresi berlebih Hsp70 ( Gambar 1. B).

Kami melanjutkan studi apoptosis sel menggunakan flow cytometry setelah merobohkan pendekatan Hsp70 memanfaatkan interferensi RNA. Scr digunakan sebagai kontrol. Data menunjukkan bahwa menghilangkan Hsp70 meningkatkan apoptosis sel ( Gambar 1. C). Hasil statistik dari sel apoptosis di bawah perlakuan yang berbeda diberikan dalam Gambar. S1 (Informasi Tambahan) blotting juga dilakukan untuk mengkonfirmasi turunnya Hsp70 ( Gambar. S1 ). Hasil ini jelas menunjukkan bahwa Hsp70 memiliki fungsi sitoprotektif yang berbeda dalam apoptosis yang dipicu oleh UV.

3.2. Hsp70 mencegah translokasi Bax mitokondria

Umumnya, aktivasi Bax disimpulkan oleh translokasi dari sitosol ke mitokondria.Translokasi Bax mitokondria yang diinduksi sinar UV, serta aktivasi Bax, diteliti menggunakan analisis western blotting.Konformasional perubahan Bax dideteksi menggunakan antibodi monoklonal 6A7, yang selektif bisa

mengenali teraktivasinya Bax. Hasil menunjukkan bahwa translokasi Bax ke mitokondria setelah radiasi sinar UV dengan cara tergantung pada waktu. Bersamaan dengan itu, Bax yang teraktivasi pada mitokondria meningkat secara bertahap ( Gambar 2. A). Untuk menentukan dampak dari Hsp70 pada translokasi Bax setelah radiasi sinar UV, digunakan analisis sel tunggal real-time. Sel transiently ditransfeksikan dengan CFP-Bax sendiri atau co-transfected dengan CFP-Bax dan YFP-Hsp70. MitoTracker digunakan untuk label mitokondria. CFP-Bax memiliki distribusi menyebar keseluruh sitosol dalam sel-sel yang tidak diobati ( Gambar 2. B, panel kiri). Setelah radiasi sinar UV, hampir semua CFP-Bax ditranslokasi dari sitosol ke mitokondria, menunjukkan aktivasi Bax ( Gambar 2. B, panel kanan). Namun, ketika sel-sel yang diekspresikan berlebihan dengan YFP-Hsp70,translokasi Bax yang diinduksi sinar UV ke mitokondria adalah jelas tertunda ( Gambar. 2 C). Rincian perjalanan waktu intensitas CFP-Bax mitokondria fluoresensi setelah perlakuan yang berbeda ditunjukkan pada Gambar. S2 (Informasi Tambahan) .Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa translokasi Bax adalah tergantung oleh waktu setelah pengobatan sinar UV dan ekspresi berlebihan dari Hsp70 dapat menunda translokasi.Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa Hsp70 dapat menghambat translokasi Bax dalam apoptosis yang dipicu oleh UV.

3.3. Hsp70 mencegah aktivasi Bax yang dipicu oleh UV dengan menghambat jalur sinyal JNK / Bim

Hasil kami menunjukkan bahwa Hsp70 dapat menghambat redistribusi Bax setelah penyinaran UV. Namun, bagaimana hal ini terjadi masih belum diketahui. Kami berhipotesis bahwa Hsp70 mencegah aktivasi Bax melalui penghambatan JNK dalam apoptosis yang diinduksi oleh sinar UV.Untuk menguji hipotesis ini, western blotting dilakukan untuk mendeteksi tingkat fosforilasi JNK. Hasil menunjukkan bahwa JNK teraktivasi setelah terpapar sinar UV ( Gambar. S3, informasi Tambahan ), dan ekspresi berlebihan dari Hsp70 menurunkan tingkatan JNK yang terfosforilasi ( Gambar 3. A). Untuk lebih menentukan peran Hsp70 dalam menonaktifkan JNK, kami mendeteksi tingkat fosforilasi JNK setelah melemahkan Hsp70. Hasil menunjukkan bahwa menipisnya Hsp70 mengakibatkan teraktivasinya JNK pada tingkat tinggi ( Gambar 3. A). Hasil ini menunjukkan bahwa Hsp70 dapat menghambat aktivasi JNK dalam apoptosis yang dipicu oleh UV.

Untuk menentukan peran JNK dalam mempromosikan aktivasi Bax setelah paparan sinar UV, sel pre perlakuan dengan 20 mM SP600125 selama 1 jam sebelum paparan sinar UV. Adanya kehadiran SP600125, translokasi Bax mitokondria jelas tertunda bila dibandingkan dengan perlakuan sinar UV saja ( Figs S4 dan S5, informasi Tambahan. ). Selanjutnya, data kami menunjukkan bahwa tingkat teraktivasi Bax menurun secara paralel dengan JNK yang terfosforilasi ketika Hsp70 diekspresikan secara berlebihan ( Gambar. 3 A). Sebaliknya, jumlah teraktivasinya Bax meningkat ketika Hsp70 dihabiskan oleh shRNA ( Gambar 3. A). Hasil di atas menunjukkan bahwa Hsp70 dapat mencegah aktivasi Bax melalui penghambatan JNK dalam apoptosis yang diinduksi sinar UV.

Kui Lei et al. melaporkan bahwa JNK adalah sinyal hulu dari Bim [5] . Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa BimL, salah satu isoform penting Bim, dapat mempromosikan aktivasi Bax via menetralkan Bcl-xL secara langsung [17] dan [21] . Di sini, kita bertanya apakah Hsp70 bisa menghambat jalur sinyal JNK / Bim untuk mencegah aktivasi Bax.Peranan Bim pada apoptosis yang diinduksi sinar UV ditentukan oleh sitometri setelah menghilangkan Bim menggunakan pendekatan interferensi RNA. Data menunjukkan bahwa penipisan Bim serta penghambatan JNK oleh SP600125 menurunkan sel apoptosis bila dibandingkan dengan perlakuan sinar UV saja ( Gambar 3. B). Hasil statistik dari sel apoptosis di bawah perlakuan yang berbeda diberikan dalam Gambar. S6 (Informasi Tambahan) . Selanjutnya, western blotting dilakukan untuk mengkonfirmasi Bim yang nonaktif, dan shRNA NC digunakan sebagai kontrol ( Gambar S6. ).

Pengaruh dari Hsp70 pada jalur JNK / Bim dideteksi dengan menggunakan analisis real-time-sel tunggal. Sel ditransfeksi dengan GFP-BimL untuk mengikuti migrasi BimL dengan pencitraan fluoresensi, dan DsRed-Mit ditransfeksi ke label mitokondria. GFP-BimL memiliki penyebaran distribusi di seluruh sitoplasma sel kontrol non-apoptosis ( Gambar. 3C , panel kiri). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3C (panel tengah), BimL dengan jelas ditranslokasi ke mitokondria setelah pemberian sinar UV. Di hadapan SP600125, BimL sebagian besar tetap dalam sitoplasma selama periode observasi setelah terpapar UV ( Gambar 3C. , panel sebelah kanan), menunjukkan bahwa aktivasi JNK diperlukan untuk translokasi Bim mitokondria. Sel-sel transiently co-transfeksi dengan GFP-BimL dan YFP-Hsp70. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3D , ekspresi berlebihan Hsp70 menghambat translokasi BimL

mitokondria seefektif dengan penghambatan JNK dengan SP600125 setelah penyinaran UV. Paruh waktu yang terinci dari intensitas GFP-BimL mitokondria fluoresensi setelah perlakuan yang berbeda diberikan dalam Gambar. S7 (Informasi Tambahan) . Bersama dengan hasil di atas, kami menyimpulkan bahwa Hsp70 dapat mencegah aktivasi Bax dengan menghambat jalur sinyal JNK / Bim pada apoptosis yang diinduksi UV.

3.4. Interaksi langsung antara peningkatan Hsp70 dan Bax setelah penyinaran UV

Bukti visual langsung dari FRET dalam sel hidup dapat diperoleh dengan pemutihan daerah tertentu dari akseptor dan pencitraan sesuai peningkatan fluoresensi dari donor di wilayah tersebut. Hal ini terjadi karena energi dari donor tidak lagi ditransfer di tempat di mana akseptor telah efektif dihancurkan. Untuk menentukan apakah Hsp70 berinteraksi dengan Bax di ASTC-a-1 sel, percobaan FRET akseptor foto-pemutihan dilakukan. Sel-sel transiently co-transfeksi dengan CFP-Bax dan YFP-Hsp70. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4A , setelah foto-pemutihan YFP-Hsp70 di daerah yang ditunjukkan (ditunjukkan oleh persegi panjang) baik dalam sel kontrol dan sel yang terpapar UV, fluoresensi YFP-Hsp70 di saluran YFP dan di saluran FRET berkurang, akan tetapi dari CFP-Bax di saluran CFP meningkat, menunjukkan bahwa ada interaksi langsung antara Hsp70 dan Bax. Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut hasil di atas, dipergunakan co-immunopresipitasi. Data menunjukkan bahwa jumlah Hsp70 yang mengikat Bax meningkat setelah penyinaran UV ( Gambar. 4B ). Hasil ini menunjukkan bahwa Hsp70 dapat mencegah aktivasi Bax tidak hanya dengan menghambat jalur sinyal JNK / Bim, tetapi juga berinteraksi secara langsung dengan Bax pada apoptosis yang diinduksiUV. Sebuah model Hsp70 mencegah translokasi mitokondria Bax pada apoptosis yang diinduksi UV yang ditunjukkan pada Gambar. S8 (Informasi Tambahan).

4. Diskusi

Hsp70 telah diusulkan untuk menjadi regulator negatif yang menentukan jalur apoptosis mitokondria dan dapat mencegah apoptosis pada tingkatan yang berbeda: pada tahap premitochondrial dengan menghambat sinyal yang merangsang stres, pada tahap mitokondria dengan mencegah permeabilisasi membran mitokondria melalui penghambatan aktivasi Bax , di tingkat postmitochondrial berinteraksi dengan AIF dan Apaf-1 [ 11 ]. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa Hsp70 dapat mengikat langsung Apaf-1,

sehingga mencegah pengambilan procaspase-9 ke apoptosome [ 22 ]. Lainnya menunjukkan bahwa Hsp70 berinteraksi dengan procaspase-3 dan procaspase-7 dan mencegah pematangan mereka [ 23 ]. Selain itu, Hsp70 bisa berinteraksi langsung dengan AIF, menyebabkan penghambatan kondensasi kromatin yang diinduksi AIF [ 24 ]. Laporan ini telah jelas menetapkan fungsi anti-apoptosis awal Hsp70 mitokondria. Namun, mekanisme bagaimana Hsp70 menghambat aktivasi Bax untuk mencegah apoptosis pada tahap mitokondria tidak jelas. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa Hsp70 dapat menghambat aktivasi JNK untuk mencegah sinyal apoptosis hulu dari mitokondria pada apoptosis yang diinduksi oleh panas [ 13 ]. Fei Guo et al. melaporkan bahwa Hsp70 dapat meningkatkan tingkat Bcl-xL untuk meningkatkan aktivitas antiapoptosis nya melalui upregulation STAT5 di BCR-ABL-sel leukemia [ 15 ]. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa Hsp70 mengatur aktivitas Bcl-2 melalui interaksi dengan Bag-1 [ 25 ]. Oleh karena itu, kinerja bagaimana Hsp70 mencegah sinyal apoptosis hulu dari mitokondria begitu kompleksnya, mungkin tergantung pada model eksperimental. Dalam studi ini, kami meneliti fungsi sitoproteksi dari Hsp70 dalam apoptosis yang diinduksi oleh UV, dengan fokus khusus pada bagaimana Hsp70 mencegah aktivasi Bax. Hasil menunjukkan bahwa penyinaran UV diinduksi oleh fosforilasi JNK, yang mengarah translokasi Bim ke mitokondria, dan menyebabkan aktivasi Bax pada mitokondria selanjutnya ( gambar 2-3), menonaktifkan Hsp70 mengakibatkan tingkat tinggi fosforilasi JNK dan aktivasi Bax, sedangkan ekspresi berlebihan Hsp70 menghambat proses ini ( Gambar. 3A ). Temuan ini menunjukkan bahwa Hsp70 mencegah aktivasi Bax via penghambatan jalur JNK / Bim selama apoptosis yang diinduksi UV.

Peran aktivasi Bim pada apoptosis yang diinduksi UV diselidiki dengan melemahkan Bim menggunakan pendekatan interferensi RNA. Data kami menunjukkan bahwa penipisan Bim dapat menurunkan apoptosis sel ( Gambar 3B. dan Gambar. S6 ). Namun, penurunan apoptosis dengan cara menghilangkan Bim lebih sedikit bila dibandingkan dengan penghambatan JNK ( Gambar 3B. dan Gambar. S6 ). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi Bim tidak sepenuhnya bertanggung jawab untuk induksi apoptosis dan mekanisme lainnya yang terlibat. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa Bmf, anggota dari sub kelompok BH3 satu-satunya dari protein terkait Bcl2, dapat terfosforilasi oleh JNK dan memainkan peran dalam mempromosikan aktivasi Bax [ 5 ]. Penelitian lain telah menunjukkan bahwa fosforilasi 14-3-3 oleh JNK mengeluarkan proapoptosis Bad. Sebagai konsekuensinya, Bad yang di defosforilasi dan translokasi ke mitokondria,

mengerahkan fungsi proapoptosis [ 26 ]. Oleh karena itu, aktivasi Bim tidak sepenuhnya bertanggung jawab untuk induksi apoptosis, mekanisme lain juga terlibat, seperti BMF-dimediasi jalur apoptosis.

Fosforilasi oleh JNK mengaktifkan baik BimL dan BimEL dan meningkatkan aktivitas apoptosis mereka dengan cara melibatkan jalur apoptosis mitokondria [ 5 , 27 ]. Dalam studi ini, kami berfokus pada BimL karena studi kami sebelumnya telah membuktikan bahwa BimL dapat mempromosikan aktivasi Bax dengan cara menetralkan langsung Bcl-xL [ 17 , 21 ]. Karena BimEL juga dapat terfosforilasi oleh JNK dan mempromosikan apoptosis, kami akan melakukan studi di masa depan mengenai dampak BimEL.

Telah dilaporkan bahwa teraktivasinya Bax mengalami perubahan konformasi dan diberikannya aktivitas proapoptosis [ 4 , 6 ]. Penelitian terbaru melaporkan bahwa Hsp70 dapat berinteraksi langsung dengan Bax, mencegah Bax dari merubah menjadi konformasi proapoptosis dan dengan demikian dapat menghambat apoptosis [ 12 , 14 , 15 ]. Namun, interaksi antara Hsp70 dan Bax tidak terdeteksi pada lini sel T manusia lymphoblastic akut selama apoptosis yang diinduksi oleh panas [ 13 ]. Hal ini mungkin dikarenakan perbedaan antara garis sel yang mengarah ke hasil yang berbeda. Dalam penelitian ini, teknik FRET, alat yang ampuh untuk mengungkapkan aktivitas dinamis interaksi antar protein [ 20 , 28 , 29 ], yang digunakan untuk mendeteksi hubungan antara Hsp70 dan Bax. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada interaksi langsung antara Hsp70 dan Bax ( Gambar 4A. ). Eksperimen Co-immunopresipitasi juga menegaskan seperti interaksi dan peningkatan mengikat Hsp70 ke Bax telah terdeteksi ( Gambar. 4B ). Karena ekspresi tinggi Hsp70 dalam kanker telah berkorelasi dengan hasil pasien miskin [ 30 ], itu akan sangat membantu untuk terapi kanker jika beberapa inhibitor bisa memblokir aktivitas Hsp70 secara efektif.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan bahwa Hsp70 dapat mencegah aktivasi Bax baik dengan menghambat jalur JNK / Bim dan dengan berinteraksi dengan Bax pada apoptosis yang diinduksi oleh UV. Dengan Mempertimbangkan bahwa Hsp70 yang berlimpah disajikan pada kebanyakan sel kanker [ 31 ], dengan demikian mungkin menjadi sasaran terapi untuk pencegahan dan pengobatan kanker.