jean weissenbach (genoscope – centre national de séquençage) saint-pères 15 juin 2008 la...
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Jean Weissenbach
(Genoscope – Centre national de séquençage)
Saint-Pères 15 Juin 2008
La génomique nouvel observatoire du monde microbien
Université de tous les savoirs
Quelques dates de l'histoire de la microbiologie
1684 Antonie van Leeuwenhoek
Quelques dates de l'histoire de la microbiologie
1684 Antonie van Leeuwenhoek
1838 Schwann (levure ferment vivant)
1857 Pasteur (fermentation lactique)
1860 Pasteur (fermentation alcoolique)
1864 Pasteur (génération spontanée)
1881 Koch (cultures pures)
Postulats de Koch
Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des
organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes
Au cours des années 70 Carl Woese procède à
des comparaisons systématiques de séquences
d ’ARN des ribosomes de bactéries
TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG
TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG
TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG
TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG
TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA
TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA
TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA
a
b
c
d
e
f
g
f g
e
a c b
d
Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces
ADN
Ext
ract
ion
Echantillon de l'environnement
PCR
gènes d‘ARNr 16S
amplifiés
Clona
ge d
ans E
. col
i
Clones
séqu
ença
ge
sequences d‘ARNr 16S
Analyse de séquences
Inventaire moléculaire de la diversité d‘espèces
ADN
Ext
ract
ion
séqu
ença
ge
PCR
gènes d‘ARNr 16S
amplifiés
Clona
ge d
ans E
. col
i
Clones
sequences d‘ARNr 16S
Analyse de séquences
3 5 5 P D (2 c lo n e s )2 8 3 P D (1 )
B a ctero id e s the ta io ta o m icro n3 9 6 P D (4 )
B a ctero id e s o v a tu s2 6 0 P D (1 )
B a ctero id e s c a cca e0 5 1 J 7 (3 )
0 1 2 5 C (2 )B a ctero id e s fra g ilis
B a ctero id e s u n ifo rm is
2 3 9 P D (1 0 )1 0 2 5 C (2 )
B a ctero id e s e g g er th iiB a ctero id e s s te rc o r is
P rev o te lla h ep a rin o ly tica
0 6 1 J 7 (2 )2 6 2 5 C (2 )
4 8 2 5 C (2 )3 6 7 P D
3 4 3 P D (6 )B a ctero id e s v u lg a tu s
2 5 5 P D (1 )1 2 2 5 C (1 )
2 %
Ext
ract
ion
Echantillon de l'environnement
Par cette approche Norman Pace observe dans les
années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent
pas à des espèces connues cultivées.
Minimum Optimum Maximum
Température élevée thermophile Pyrolobus fumarii 90°C 106°C 113°C
basse psychrophile Polaromonas vacuolata 0°C 4°C 12°C
pH acide acidophile Picrophilus oshimae 0,06 0,7 (60°C) 4
alcalin alcalinophile Natrialba magadii 8,5 9 12
pression élevée barophileMT41 (Mariana Trench)11033 mètres de profondeur
500 atm700 atm
4°C> 1000 atm
salinité élevée halophileHalobacterium salinarum
15 % 25 %32 %
(saturation)
Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières …
Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources
• énergie
• matières premières (minérales ou organiques)
Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à
l'innovation
1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières
2) en s'adaptant à des environnements particuliers
• énergie• oxydoréductions chimiques
• différents oxydants, différents réducteurs• lumière
• plusieurs utilisations de la lumière• avec ou sans production d'O2
• matières premières (minérales ou organiques)• C minéral (CO2 ou organique)• N atmosphérique ou sels
• conditions du milieu• température• pH• ions
Streptococcus pneumoniae
Vibrio cholerae
Streptococcus pyogenes
Salmonella
Pseudomonas
Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage
Chondromyces
Habitat Nombre de bactéries % de bactéries cultivables
Sol 1010 - 1013 / kg 0,01 - 0,1
Rivières, lacs 109 - 1010 / l 0,01 - 0,1
Océans (surface) 107 - 109 / l 0,001 - 0,1
Océans (profondeur) 107 - 108 / l indéterminé
Océans (sédiments) 109 - 1012 / l < 1 %
Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours
Sols 107 à 1010 bactéries / g
Eaux potable en général maximum 1000 bactéries / mL
bassin de natation 100 bactéries / mL
mer peu polluée 10.000 bactéries / mL
Aliments lait stérilisé maximum 100 bactéries / mL
viande hachée 106 bactéries / g
Corps humain sain et propre
peau du dos 100 à 1000 bactéries / cm2
peau des aisselles ou du pubis
106 bactéries / cm2
fèces 50 % de la masse soit 1011 bactéries / g
Les bactéries sont partout et nombreuses ...
La flore intestinale humaine
Cent mille milliards de bactéries !!!
Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive.
Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie.
Les interactions entre l’organisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé.
Au niveau de la planète
la biomasse microbienne représente
plus de la moitié de la biomasse terrestre
0,01 0,1 1 10 100
100
10
1
0,1
Si
Mg
O
Ca
Na
P
NC
S
H
Croûte terrestre
Biomasse
D'où vient le carbone ?
Carbone minéral : CO2 (bactéries autotrophes :chimiolithotrophes, phototrophes)
Carbone organique (bactéries hétérotrophes)
0,01 0,1 1 10 100
100
10
1
0,1
Si
Mg
O
Ca
Na
P
NC
S
H
Croûte terrestre
Biomasse
D'où vient l'azote ?
Azote atmosphérique N2
Composés minéraux de l'azote (NH4+, NO2
-, NO3-)
Le rôle de l'infiniment petit dans la nature
est infiniment grand
Louis Pasteur
Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines d’espèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées
Moins de 1% des bactéries sont cultivées
Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré
La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement
A ce jour
De nombreuses raisons de s'intéresseraux communautés bactériennes
- impact sur les équilibres biogéochimiques- quels sont les acteurs ?- nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments
- impact sur la santé (flores microbiennes humaines)
- modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes)
- utilisation de la biodiversité à des fins d'applications- substances thérapeutiques- substances d'intérêt industriel- enzymes utiles pour la chimie de synthèse- bioremédiation
- nouveaux éclairages sur l'évolution
Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ?
- rDNA 16S
- FISH
- métagénomique
- techniques sur cellules isolées
- culture
ADN
Ext
ract
ion
séquençageClonage dans E. coli Clones sequences
d‘ADN Analyse de séquences
Ext
ract
ion
Echantillon de l'environnement
La métagénomique
Tous les génomes de bactéries possèdent au moins une copie du gène rouge
Ce gène rouge présent chez toutes les bactéries est en fait composé - de parties communes retrouvées dans ce gène dans toutes les bactéries- de parties qui sont propres à une seule espèce de bactéries
Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des
- parties communes (noir) qui sont présentes sur la séquence de ce gène dans toutes les bactéries
ceci permet de le retrouver à partir d'un mélange des ADN extraits de bactéries vivant dans un environnement particulier
Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des
- parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries
ceci permet de distinguer ce gène chez une espèce du même gène chez les autres espèces du mélange
Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des
- parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries
ceci permet aussi savoir quelles espèces connues et inconnues sont dans le mélange et d'avoir une idée du nombre d’espèces de bactéries qui sont dans le mélange et de leur abondance
Résultats : Hybridation in situ sur les boues
10 µm
10 µm
Floc du bassin aérobie (BA)photo CLSM (gross. 630)
hybridation avec sonde :
- groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5
- sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3
- superposition Pla46F et 322R
- autofluorescence
Problèmes d'analyses des données d'un métagenome
• Données très fragmentaires
• Liens perdus avec les cellules d'origine
• La grande majorité de ces cellules sont inconnues
Quelques résultats de la métagénomique
- reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs
bactéries non cultivables
- présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine
dans les bactéries
- découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction
inconnue
- association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité