BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan rancangan penelitian

Jenis dan rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian isolasi dan identifikasi

bakteri resisten antibiotik dari sampel tanah di Rumah Sakit Umum Daerah Margono Soekarjo

Purwokerto adalah non eksperimental deskriptif.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah tabung erlenmeyer (Pyrex ®), tabung reaksi (Pyrex ®),

beaker glass (Pyrex ®), pipet ukur (Pyrex ®), gelas ukur (Pyrex ®), jarum ose, cawan petri

(Pyrex ®), spatula, bunsen, timbangan analitik (AND GD-200), batang pengaduk, rak tabung,

laminar air flow (Mascotte Model LV-S), autoklaf (UL Model 25X-2), pipet tetes, mikroskop

(XSZ 107BN), obyek glass, pinset, gunting, masker, mikropipet (Nichipet EX, Japan), jangka

sorong (Vernier Lakiper, China), oven kering (Memmert, USA), Penangas air (REC), Inkubator

(Memmert, USA).

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian adalah sampel tanah, medium nutrient agar

(Merck, Germany), medium TSA (OXOID, England), Medium MR-VP (OXOID, England),

Medium TSIA (Merck, Germany), pepton (OXOID, England), Ekstrak daging (Merck,

Germany), Agar (Merck, Germany), aquadest steril, kapas (Bunga biru), label, kasa (Mawar

biru), zat untuk pewarnaan gram (Merck, Germany), Reagen Uji Biokimia (Merck, Germany),

antibiotik Oksitetrasiklin (Terramycin, PT Pfizer Indonesia), Kloramfenikol (Colsancetin, Sanbe

Farma), Gentamisin (Indofarma), Amoksisilin (Kalmoxilin, PT Bernofarma Pharmaceutical),

Siprofloksasin (PT Ferron Pharmaceuticals).

C. Cara penelitian

1. Tahap persiapan

a. Pengambilan Sampel

14

15

Sampel tanah diambil dari lingkungan Rumah Sakit Umum Daerah Margono Soekarjo

Purwokerto. Sampel diambil di antara kamar Bugenvil dan kamar Cempaka, sampel diambil 5

kali secara acak dengan jarak yang tidak terlalu dekat. Sampel diambil pada kedalaman 15 cm

dengan panjang 30 cm (diambil dari arah kanan ke kiri), masing-masing tempat diambil sampel

sebanyak 1 gram. Langkah selanjutnya kelima sampel dicampur menjadi satu, kemudian sampel

secepatnya diisolasi karena waktu yang digunakan untuk menyelesaikan penelitian

bakteriologi biasanya tidak melebihi 2 sampai 3 jam (Mudryk et al, 2009). 

b. Sterilisasi Alat dan Bahan

Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan

steril. Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia

tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas

tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan

membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya

bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan

mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering (Waluyo,

2004). Sterilisasi dilakukan di dalam autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit (Hadioetomo,

1993).

c. Pembuatan Medium Agar

Nutrien agar dibuat dari 14 g campuran medium yang berisi ekstrak daging 1,5 g; pepton

2,5 g; dan agar 10 g ke dalam 500 ml aquades, lalu dipanaskan di atas penangas air (water bath)

selama 20-30 menit sambil diaduk. Volume medium yang hilang selama pemanasan diganti

dengan penambahan aquades sampai volume 500 ml. Dalam keadaan panas, medium disaring

dengan kertas saring yang bersih kemudian 12 ml medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi

steril. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121oC selama 15 menit

(Hadioetomo, 1993).

d. Isolasi Bakteri

Suspensi sampel tanah dibuat dengan cara 5 g sampel tanah di campur dengan 10 ml

aquadest, kemudian diencerkan sampai konsentrasi 10-5. Sebanyak 0,5 ml suspensi sampel tanah

16

diambil dan dicampur dengan 12 ml medium Nutrient Agar lalu tuang ke dalam cawan petri

steril. Permukaan cawan petri tersebut diratakan dengan glass spreader lalu diinkubasi pada suhu

kamar selama 24 jam. Setelah diinkubasi maka akan dihasilkan beberapa koloni bakteri. Medium

agar steril yang kosong sebanyak koloni yang terbentuk disiapkan lalu koloni-koloni bakteri

tersebut diisolasi dengan teknik streaking plate. Alat yang dipakai adalah ose tumpul yang telah

disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala bunsen. Setelah itu, masing-masing cawan petri

diberi etiket dan cawan petri tersebut dibalik kemudian dibungkus dengan kertas koran. Medium

tersebut diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.

e. Perhitungan Jumlah Sel Bakteri

Medium cair dibuat dengan bahan-bahan 1,5 g ekstrak daging; 2,5 g pepton dicampur dan

dilarutkan dalam air suling sebanyak 500 ml. Sebanyak 5 ml medium cair dimasukkan ke dalam

tabung reaksi steril. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121 oC

selama 15 menit (Hadioetomo, 1993).Medium cair disiapkan sebanyak koloni bakteri hasil isolat.

Setelah itu, satu ose tumpul koloni bakteri hasil isolat diambil dan ditumbuhkan dalam medium

cair. Tabung reaksi tersebut ditutup dengan kapas dan diinkubasi selama 24 jam.

Jumlah bakteri yang digunakan untuk uji adalah sebanyak ∞ 3x108 sel/ml (OD600 = 0,1).

Suspensi bakteri tersebut dibaca di spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 600 nm.

Apabila serapannya 0,1 maka suspensi tersebut bisa langsung dipakai untuk uji resistensi bakteri,

tapi apabila serapannya belum 0,1 dilakukan pengenceran sampai didapatkan serapan 0,1. Semua

koloni bakteri diberi perlakuan yang sama.

2. Tahap pelaksanaan

a. Uji Resistensi Bakteri

Pengujian resistensi bakteri dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan kertas

cakram. Medium Nutrien Agar yang berisi bakteri uji hasil isolasi disiapkan. Kertas cakram

sebanyak 5 buah di pasang di atas medium padat tersebut, kemudian antibiotik yang akan

diujikan (Siprofloksasin, Oksitetrasiklin, Kloramfenikol, Gentamisin, Amoksisilin) diteteskan

menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Cakram yang diletakkan pada media agar yang telah

ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Masing-masing koloni

bakteri diberi perlakuan yang sama, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 oC.

17

Diameter hambatan diukur dan resistensi bakteri uji ditentukan kemudian. Area jernih

mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada

permukaan media Agar (Pratiwi, 2008).

Untuk biakan bakteri yang resisten terhadap banyak antibiotik dilakukan uji-uji biokimia

selanjutnya untuk diidentifikasi jenis bakterinya.

b. Pembuatan Stok Kultur

Sebanyak 1 ml suspensi bakteri yang sudah dibaca serapannya dimasukkan ke dalam

mikrotube dan dicampur dengan 1 ml gliserol 40%. Mikrotube tersebut ditutup dan disimpan

lemari pendingin pada suhu 5o C.

c. Pengamatan karakteristik mikroskopik bakteri

Pengamatan karakteristik mikroskopik bakteri dapat dilakukan dengan pewarnaan gram

dan pewarnaan endospora. Pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bentuk sel dan sifat

Gram bakteri.Pewarnaan dilakukan dengan membuat apusan bakteri terlebih dahulu. Apusan

dibuat dari satu ose bakteri hasil isolasi diletakkan di atas kaca objek lalu dipijarkan diatas api

bunsen. Langkah selanjutnya yaitu kristal ungu diteteskan pada apusan dan didiamkan selama 1

menit. Zat warna dicuci menggunakan air mengalir, kemudian kalium iodida diteteskan pada

apusan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit, setelah itu dicuci dengan air mengalir.

Alkohol aseton diteteskan pada apusan bakteri tersebut dan didiamkan selama 30 detik,

kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian safranin diteteskan pada apusan bakteri

tersebut, lalu didiamkan selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir. Setelah itu preparat

diamati menggunakan mikroskop (Irianto, 2006). Bakteri yang berwarna ungu digolongkan ke

dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram

negatif (Pratiwi, 2008). Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang lain.

3. Identifikasi Bakteri

Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan buku identifikasi bakteri dari Holt dkk

(1994) dalam Bergey’s Manual Of Determinative Bacteriology 9th.

a. Pembuatan Medium Trypton Soya Agar (TSA)

18

Sebanyak 7,5 g trypycase; 2,5 g phytone; 2,5 g sodium chloride; 6 g agar dicampur lalu

dilarutkan dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan

sampai larut. Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi

masing-masing tabung reaksi sebanyak 7 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas

steril lalu medium tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o C tekanan 2 atm selama 15

menit. Kemudian setelah medium disterilkan, tabung yang berisi medium tersebut dimiringkan

tapi jangan sampai medium yang didalam tabung menyentuh sumbat, biarkan medium sampai

memadat.

b. Pembuatan Medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Sebanyak 10 g polipepton; 5 g laktosa; 5 g sukrosa; 5 g glukosa; 2,5 g NaCl; 0,1 g

feroamonium sulfat; 0,1 g Na thiosulfat; 0,0125 g fenol red; 6 g agar dicampur lalu dilarutkan

dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan sampai larut.

Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi masing-masing

tabung reaksi sebanyak 5 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas steril lalu

medium tersebut disterilkan di autoklaf pada suhu 121o C tekanan 2 atm selama 15 menit.

Kemudian setelah medium disterilkan, tabung yang berisi medium tersebut dimiringkan tapi

jangan sampai medium yang didalam tabung menyentuh sumbat, biarkan medium sampai

memadat.

c. Pembuatan Medium MR-VP

Sebanyak 3,5 g polipepton; 2,5 g glukosa; 2,5 g Kalium dihidrogen fosfat dicampur dan

dilarutkan dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan

sampai larut. Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi

masing-masing tabung reaksi sebanyak 5 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas

steril lalu medium tersebut disterilkan di autoklaf pada suhu 121o C tekanan 2 atm selama 15

menit.

d. Uji Biokimia (Barrow, 1993; Irianto, 2006)

19

1. Uji Katalase

Pengujian katalase dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat menghasilkan enzim

katalase. Uji katalase dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSA miring terlebih dahulu, satu

medium untuk uji satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSA miring

tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian reagen

H2O23% diteteskan ke koloni. Hasil uji katalase positif jika timbul gelembung-gelembung gas

pada koloni. Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang lain.

2. Uji Oksidase

Pengujian oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya enzim oksidase pada bakteri. Uji

oksidase dilakukan dengan menyiapkan medium TSA miring terlebih dahulu. Bakteri

diinokulasikan ke medium TSA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam.

Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose biakan bakteri diambil lalu dioleskan ke kertas saring

kemudian ditetesi dengan reagen oksidase. Hasil uji oksidase positif jika muncul warna biru

kehitaman pada olesan bakteri tersebut. Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang

lain.

3. Uji fermentasi karbohidrat

Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSIA miring

terlebih dahulu, satu medium untuk diuji satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke

medium TSIA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Pengujian

dilakukan dengan mengamati adanya perubahan warna medium pada bagian permukaan dan

bagian dasar medium. Cara yang sama juga dilakukan untuk biakan bakteri yang lain. Bagian

permukaan medium disebut slant, sedangkan bagian dasar medium disebut butt. Perubahan

warna medium tersebut adalah sebagai berikut:

• Slant dan butt tidak mengalami perubahan warna, menunjukan tidak terjadi fermentasi

karbohidrat.

• Slant berwarna merah, sedangkan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas.

Kondisi tersebut menunjukkan telah terjadi fermentasi glukosa.

20

• Slant dan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi tersebut

menunjukkan telah terjadi fermentasi sukrosa dan laktosa.

• Butt berwarna kehitaman menunjukkan adanya produksi gas H2S.

4. Uji methyl red

Pengujian methyl red dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri

memfermentasikan glukosa untuk menghasilkan asam. Uji methyl red dilakukan dengan

menyiapkan 2 medium MR-VP terlebih dahulu, satu tabung sebagai kontrol satu tabung untuk

uji. Bakteri diinokulasikan ke medium MR-VP tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37o C selama

24 jam. Pengujian dilakukan dengan menuangkan sepertiga suspensi biakan ke dalam tabung

reaksi yang lain, kemudian reagen methyl red diteteskan sebanyak 2 tetes ke dalam biakan. Uji

positif jika terbentuk cincin berwarna merah pada permukaan medium. Cara yang sama juga

dilakukan untuk biakan bakteri yang lain.

5. Uji voges proskauer

Pengujian voges proskauer dilakukan untuk menentukan bakteri yang mampu

menghasilkan acetymethyl carbinol dan fermentasi glukosa. Uji voges proskauer dilakukan

dengan menggunakan dua pertiga sisa biakan pada uji methyl red. Pengujian dilakukan dengan

cara reagen α-naftol sebanyak 15 tetes dan 40% KOH sebanyak 10 tetes diteteskan ke biakan

tersebut, kemudian biakan tersebut dikocok. Uji positif jika terjadi warna merah pada suspensi

biakan. Cara yang sama dilakukan juga untuk biakan bakteri yang lain.

 

21