jtsarsrnntutaddlnrtnr nlsfidmlqfn5biotech.dld.go.th/webnew/data/document_announces/... · 2.2...
TRANSCRIPT
JTsarsrnnTuTaddlnrtnrnlsfidmlqfn5
ในปี 2558 อาเซียนจะรวมตัวเป็นประชาคมเศรษฐกิจอาเซียน มีเป้าหมายเพื่อส่งเสริมให้อาเซียนเป็นตลาดและฐานการผลิตร่วมกัน (Singlemarketandsingleproductionbase)มีการเคลื่อนย้ายสินค้าบริการ การลงทุน แรงงานมีฝีมืออย่างเสรี และเงินทุนอย่างเสรีมากขึ้น (freeflowsofgoods,services,investment,andskilledlabors,andfreerflowofcapital) ผลที่จะเกิดขึ้นหลังจากเป็นAECประกอบด้วยการยกเลิกภาษีศุลกากรสำหรับสินค้าการลดขั้นตอนพิธีการศุลกากรอนุญาตให้ผู้ส่งออกรับรองถิ่นกำเนิดสินค้าด้วยตนเอง(SelfCertification)ตลอดจน ลดเลิกข้อจำกัด / อุปสรรคในการให้บริการทุกรูปแบบ มีการเปิดเสรีการลงทุน คุ้มครองการลงทุน สง่เสรมิและอำนวยความสะดวกการลงทนุครอบคลมุธรุกจิ5ภาคไดแ้ก่เกษตรประมงปา่ไม้เหมอืงแร่และภาคการผลิตรวมถึงบริการที่เกี่ยวเนื่องนำไปสู่การเพิ่มขีดความสามารถในการแข่งขันของอาเซียน มีการพฒันาเศรษฐกจิระหวา่งประเทศสมาชกิที่เสมอภาคยิง่ขึน้ทำให้กำลงัซือ้ของประเทศเพือ่นบา้นดีขึน้ ขยายโอกาสการสง่ออกและการลงทนุของไทยและมีการเชือ่มโยงกบัประเทศภายนอกโดยเฉพาะประเทศคู่เจรจาของอาเซียน(+6)เป็นการเพิ่มโอกาสการค้าและการลงทุน
ในด้านปศุสัตว์ประเทศไทยมีข้อได้เปรียบประเทศในเขตอาเซียนทั้งด้านพันธุกรรมโคเนื้อคุณภาพและ เทคโนโลยีการผสมเทียม ซี่งเป็นสองปัจจัยหลักในการผลิต สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ จึงได้พัฒนาโครงการเพื่อเตรียมความพร้อมขยายการผลิตโคเนื้อคุณภาพ เพื่อรองรับการเปิดตลาดเนื้อโคคุณภาพในอาเซียน ประกอบด้วย “โครงการสร้างพันธุ์โคเนื้อคุณภาพไทย-แบล็ค” และ“โครงการเรง่รดัการผลติโคเนือ้คณุภาพสงูโดยวธิีการผสมเทยีม”ซึง่ทำให้สามารถจดัระเบยีบฟารม์ในประเทศไทยโดยจำแนกเป็น Breeding และ Fattening Farm ด้วยการสร้างระบบการผสมพันธุ์ที่ชัดเจนมีรูปแบบ เพื่อให้เกษตรกรสามารถบริหารจัดการฟาร์มได้อย่างเหมาะสมและมีประสิทธิภาพ นำไปสู่การเป็นศูนย์กลางผลิตพันธุ์โคเนื้อและผลิตภัณฑ์เนื้อโคคุณภาพในอาเซียนในอนาคตอันใกล้
ทั้งนี้สำนักฯ ยังมุ่งมั่นพัฒนางานเพื่อให้ไทยสามารถคงความเป็นผู้นำด้านปศุสัตว์ในอาเซียนด้วยการสง่เสรมิสรา้งสรรงานวจิยัและเผยแพร่ในวารสารเทคโนโลยีชวีภาพการผลติสตัวอ์ยา่งตอ่เนือ่งเปน็ประจำทุกปีเพื่อให้เกิดการแลกเปลี่ยนเรียนรู้นำไปสู่การพัฒนาต่อไป
(นายสัตวแพทย์จีระศักดิ์พิพัฒนพงษ์โสภณ)
ผู้อำนวยการสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
สาสน์จากบรรณาธิการบริหาร
2
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
วัตถุประสงค์1. ส่งเสริมการศึกษาค้นคว้าและวิจัยด้านการผลิต
และขยายพันธุ์สัตว์
2. รวบรวมเผยแพร่ความรู้ด้านการผลิตและ
ขยายพันธุ์สัตว์โดยเทคโนโลยีชีวภาพ
3. ส่งเสริมความสัมพันธ์และความร่วมมือระหว่าง
นักวิชาการและสถาบันต่างๆ
เจ้าของสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
สำนักงานสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมือง
จ.ปทุมธานี12000
โทร/โทรสาร0-2501-2116
กำหนดออกปีละ1ฉบับ
คณะที่ปรึกษาผชช.พรรณพิไลเสกสิทธิ์
ดร.ณชัยศราธพันธุ์
ดร.มาลีอภิเมธีธำรง
บรรณาธิการบริหารน.สพ.จีระศักดิ์พิพัฒนพงศ์โสภณ
บรรณาธิการสพญ.กัลยาเก่งวิกย์กรรม
ผู้ช่วยบรรณาธิการนสพ.วิษณุไพศาลรุ่งพนา
กองบรรณาธิการนสพ.ไกรวรรณหงษ์ยันตรชัย
นสพ.สาโรชงามขำ
สพญ.รพีพรรณเอื้อเวชนิชกุล
นสพ.รัตน์ฉายารัตนศิลป์
สพญ.นุสสราวัฒนกุล
นสพ.วิบูลย์เยี่ยงวิศวกูร
นางจุรีรัตน์แสนโภชน์
นายสายัณห์บัวบาน
ผู้จัดการวารสารนางจุรีรัตน์แสนโภชน์
นายวิบูลย์เยี่ยงวิศวกูร
นางสาวทัศนีย์พูนขำ
3
Journal of Biotechnology in Livestock Production
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
เป็นวารสารทางวิชาการของสำนักเทคโนโลยีชีวภาพ
การผลติปศสุตัว์กรมปศสุตัว์กำหนดออกปีละ1ฉบบั
คือเดือนกรกฎาคมวารสารนำลงบทความผลงาน
ค้นคว้าวิจัยด้านการผลิตปศุสัตว์ ทั้งด้านการพัฒนา
และปรับปรุงพันธุ์ การจัดการอาหาร สุขภาพ และ
ระบบสืบพันธุ์ ตลอดจนการขยายพันธุ์ และการใช้
เทคโนโลยีชีวภาพที่ก้าวหน้าในการปรับปรุงและเพิ่ม
ประสิทธิภาพการผลิตปศุสัตว์ด้านต่างๆ ที่กล่าวมา
ข้างต้น คณะผู้จัดทำวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการ
ผลิตปศุสัตว์ ยินดีรับเรื่องจากทุกท่านที่ส่งมาเพื่อ
เผยแพร่ และเพื่อความสะดวกในการพิจารณา
ขอเสนอแนะดังนี้
1. เรื่อง ที่ จะ นำ ลง
1.1 งานทดลองวจิยัทางวชิาการ(Technical/
Researchpapers)หรือวิทยานิพนธ์เป็นการเสนอ
ผลการวิจัยที่ผู้เขียนได้ทำขึ้นเอง
1.2 บทความ (Articles) และย่อเอกสาร
(Literaturereviewed)ทางวชิาการที่รวบรวมขอ้มลู
ความคิดเห็นและประสบการณ์ของผู้เขียน
1.3 เรื่องอื่นๆ ที่คณะผู้จัดทำพิจารณาเห็น
สมควร
2. ต้นฉบับ
2.1 ต้นฉบับที่ส่งมาพิมพ์ ในวารสารเทคโนโลยี
ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ ไม่ควรเป็นเรื่องที่เคยพิมพ์
หรือ กำลังอยู่ระหว่างการพิจารณาเพื่อลงพิมพ์
วารสารอื่น
ข้อแนะนำสำหรับผู้เขียน
2.2 ต้นฉบับเป็นภาษาไทยหรือภาษาอังกฤษ
พิมพ์บนกระดาษเอ4จำนวนไม่เกิน12หน้าโดย
จัดพิมพ์ด้วยMicrosoftWordforWindowsหรือ
ใช้ชนิดและขนาดตัวอักษรตามที่กำหนด
2.3 ไม่มีการส่งคืนต้นฉบับ
3. การ ลำดับ เรื่อง ใน ต้นฉบับ
เพือ่ให้ขบวนการการพจิารณาผลงานวชิาการและ
การดำเนนิการจดัพมิพ์วารสารเปน็ไปอยา่งเรยีบรอ้ย
รวดเร็วและถูกต้องจึงจำเป็นต้องให้ผู้เขียนผลงาน
วิชาการปฏิบัติตามข้อกำหนดอย่างเคร่งครัดดังนี้
3.1 ให้ส่งต้นฉบับผลงานวิชาการจำนวน 1ชุด
และยังไม่ต้องส่งแผ่นบันทึกข้อมูล(Diskette)
3.2 ต้นฉบับผลงานวิชาการที่ส่งมา ให้ตรวจ
ความถูกต้องของตัวสะกด รูปแบบการจัดพิมพ์ผล
งานวิชาการให้ถูกต้องตามที่กำหนด
3.3 ส่งแผ่นบันทึกข้อมูลมาให้ เมื่อผลงาน
วิชาการนั้นได้ผ่านการพิจารณาจากคณะกรรมการ
วิจัยสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ แล้ว
เท่านั้น โดยเลขาคณะกรรมการวิจัยฯ จะแจ้งกลับ
ไปยังเจ้าของผลงานวิชาการพร้อมส่งต้นฉบับเพื่อ
ให้แก้ ไขตามที่คณะกรรมการวิจัยสำนักเทคโนโลยี
ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ ให้ข้อเสนอแนะ
บันทึกผลงานวิชาการที่แก้ ไข ถูกต้องแล้ว
ตามขอ้แนะนำของคณะกรรมการวจิยัสำนกัเทคโนโลยี
ชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ลงในDisketteขนาด3.5
นิ้วหรือCD-ROMใช้โปรแกรมMicrosoftWord
forWindowsโดยมีรายละเอยีดบนสติกเกอร์ตดิหนา้
DisketteหรือCD-ROMดังนี้
4
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ชื่อผลงานวิชาการ..............................................
ชื่อเจ้าของผลงาน..............................................
ชื่อไฟล์..............................................................
ที่อยู่เบอร์ โทรศัพท์/E-Mail...............................
หรือส่งทางInternet
มายัง[email protected]
3.4 ต้นฉบับผลงานวิชาการที่ ส่งให้คณะ
กรรมการวิจัยสทป.พิจารณาจะเป็นบทความที่จัด
รูปแบบได้ถูกต้องตามที่กำหนดเท่านั้น หากผลงาน
วิชาการที่ส่งมาให้ไม่ถูกต้องตามข้อกำหนดจะจัดส่ง
คืนให้เจ้าของผลงานวิชาการกลับไปแก้ไขให้ถูกต้อง
3.5 ตน้ฉบบัที่จดัสง่มาตอ้งชดัเจนทัง้เนือ้หาและ
รูปภาพประกอบผลงานวิชาการโดยส่งมาที่
3.6 หรือติดต่อสอบถามได้ที่
นางจุรีรัตน์แสนโภชน์
สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมือง
จ.ปทุมธานี12000
โทรศัพท์02-967-9791หรือ02-967-9792
โทรสาร.02-5011386
ดูขอ้มลูรายละเอยีดเกี่ยวกบัขอ้แนะนำสำหรับผู้เขียน
ผลงานที่ ได้http://www.dld.go.th/biotech
4. การ ลำดับ เรื่อง
4.1 ชื่อเรื่อง (Title) ควรต้องชื่อให้สั้นและสื่อ
ความหมายให้ดี และพิมพ์ โดยใช้ขนาดตัวอักษร 18
และตัวหนา
4.2 ชื่อผู้เขียนและผู้ร่วมงาน(Authorandco
- workers) เขียนชื่อนามสกุลเต็มทั้งภาษาไทยและ
ภาษาอังกฤษวางกึ่งกลางใต้ชื่อเรื่องพร้อมทั้งสถาน
ที่ทำงานที่ติดต่อได้สะดวกพิมพ์ไว้ ใต้ชื่อคณะผู้วิจัย
โดยใช้ขนาดตัวอักษร16และตัวปกติ
4.3 บทคดัยอ่(Abstract)เขยีนสัน้ๆได้เนือ้ความ
คลุมวัตถุประสงค์วิธีการและผลการทดลองความ
ยาวไม่ควรเกิน3%ของตัวเรื่องบทคัดย่อต้องมีทั้ง
ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ แยกหน้าต่างหากจาก
กันส่ง บรรณาธิการวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการ
ผลติปศสุตัว์สำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์
ถ.ติวานนท์ต.บางกะดีอ.เมืองจ.ปทุมธานี12000
4.4 คำสำคัญ (Key words) เป็นคำหรือข้อ
ความสั้นๆ ที่มีความหมายแสดงถึงความเป็นไปของ
การทดลองนั้นๆ รวมกันแล้วไม่เกิน 5 คำ หากไม่
สามารถแปลเปน็ภาษาไทยได้ ให้ ใช้ภาษาองักฤษแทน
โดยการพิมพ์อยู่ใต้บทคัดย่อ(ขึ้นบรรทัดใหม่)
4.5 เนื้อหา (Text) สำหรับงานวิจัยประกอบ
ด้วย
4.5.1 บทนำ(Introduction) อธิบายถึง
ปัญหาและวัตถุประสงค์และควรมีการตรวจเอกสาร
(literaturereview)
4.5.2 อุปกรณ์และวิธีการ (Materials
and Methods) อธิบายเครื่องมือ อุปกรณ์ที่ ใช้ ใน
การทดลองวธิีการที่ ใช้ถา้คดิคน้ขึน้ควรอธบิายอยา่ง
ละเอียด แต่ถ้าเป็นที่ทราบกันโดยทั่วไปให้เขียนใน
ลักษณะอ้างอิงถึง ถ้าเป็นเครื่องหมายตราหรือชื่อ
การคา้ควรทำเปน็footnoteไว้ที่ดา้นลา่งของหนา้นัน้
4.5.3 ผล (Results) รายงานผลการ
ทดลองเปน็คำบรรยายให้ละเอยีดและเขา้ใจงา่ยโดย
แบ่งเป็นหลายๆ ย่อหน้า และจัดข้อความที่มีเนื้อหา
เดียวกันไว้ด้วยกัน หากเป็นไปได้ควรเสนอในรูปของ
ตารางหรือรูปภาพ หรือกราฟพร้อมทั้งบรรยาย
ประกอบ ทั้งนี้ตาราง รูป หรือกราฟ ไม่ควรแสดง
ผลที่เหมือนกัน
-ตาราง(Tables)ควรพมิพ์ให้ชดัเจนเหมาะ
กับหน้าต้องมีความหมายในตัวเองและมีคำอธิบาย
ตารางอยู่เหนือตารางนั้นๆ
5
Journal of Biotechnology in Livestock Production
-รปูภาพ(Figures)ควรเปน็ภาพขาว–ดำ
ภาพสีหากจำเปน็ผู้เขยีนตอ้งเสยีคา่ใช้จา่ยเองอธบิาย
รายละเอียดไว้ ใต้รูปนั้นๆ
4.5.4 วิจารณ์ (Discussion) เป็นการ
วิจารณ์ผลการทดลอง โดยมีจุดมุ่งหมาย เพื่อให้
ผู้อื่นเห็นคล้อยถึงหลักการที่แสดงออกมาจากผลการ
ทดลอง หรือเพื่อสนับสนุน หรือคัดค้านทฤษฏีที่มี
ผู้เสนอมากอ่นหรอืเพือ่เปรยีบเทยีบกบัผลการทดลอง
และการตีความหมายของผู้อื่น ผู้เขียนควรพยายาม
เน้นถึงปัญหาหรือข้อโต้แย้งในสาระสำคัญของเรื่อง
ที่กำลงักลา่วถงึตลอดจนขอ้เสนอแนะเพือ่การวจิยัใน
อนาคตและลู่ทางที่จะนำผลไปใช้เป็นประโยชน์
4.5.5 สรปุ(Conclusion)เขยีนใจความที่
สำคัญและคุณค่าของงานเพื่อให้ผู้อ่านเข้าใจง่ายขึ้น
4.5.6 กิตติกรรมประกาศ (Acknowl-
edgement)ควรมีในกรณีที่ ได้รบความชว่ยเหลอืหรอื
ความร่วมมือที่สนับสนุนงานค้นคว้าวิจัยนั้นๆ
4.5.7 เอกสารอ้างอิง(References)
ก. กรณีที่อ้างอิงในเนื้อเรื่อง ควรอ้างอิง
ดังนี้คือ
1. กรณีที่อ้างจากการตรวจเอกสาร โดย
ผู้อื่นๆให้ ใช้คำว่าอ้างถึงโดย(citedby)
2.กรณีผู้รายงานเอกสารเป็นคนไทยเมื่อ
เป็นประธานของประโยค ใช้ “วิบูรณ์ และ จุรรัตน์
(2549),เลศิชยัและคณะ(2549)กลา่ววา่.......”หรอื
เมื่อรายงานอยู่กลางหรือท้ายประโยคใช้ (วิบูรณ์,
2549)หรือมีเอกสารอ้างอิงในเรื่องเดียวกันมากกว่า
1ฉบับให้ ใช้(ถาวรและคณะ,2547;นริศและสิน
สมุทร,2543.....)
3. กรณีผู้รายงานเอกสารเป็นชาวต่าง
ประเทศเมื่อเป็นประธานของประโยคใช้“Rudbeck
andDissing(1998),Kashietal.(1990)กล่าว
ว่า......... “ หรือเมื่อผู้รายงานอยู่ระหว่างกลางหรือ
ท้ายประโยค ใช้ (Rudbeck andDissing, 1998;
Kashietal.,1990.............)
4. กรณีอ้างถึงบุคคลหรือเรื่องที่ ไม่เคยลง
พิมพ์มาก่อน (personal communication) ให้อ้าง
เฉพาะในเนื้อเรื่องเท่านั้น ไม่ต้องนำไปลงในรายชื่อ
เอกสารอา้งองิเชน่....similarresults(Walker,J.M.,
unpublished data), .......for other protocols
(Walker,J.M.,personalcommunication)
ข.การเขียนเอกสารอ้างอิงท้ายเรื่องควร
ขึ้นต้นเอกสารอ้างอิงภาษาไทยก่อน เขียนเรียงตาม
ลำดับพยัญชนะของผู้เขียน ถ้าเป็นภาษาอังกฤษใช้
ชื่อสกุลตามด้วยชื่อย่อของผู้แต่งแล้วตามด้วยปีชื่อ
เรื่องชื่อหนังสือหรือชื่อย่อวารสารปีที่ฉบับที่และ
หน้าที่อ้างอิงดังตัวอย่าง
วิบูรณ์ตุลารักษาและจุรีรัตน์แสนโภชน์2549
การสกัดดีเอ็นเอเซลล์รากขนในโคนมไทยโฮลสไตน์
การประชุมวิชาการสัตวศาสตร์ ครั้งที่ 2 “ก้าวทัน
สมัยกับปศุสัตว์ไทย”วันที่24มกราคม2549โรง
แรมโซฟิเทลขอนแก่น.หน้า452-463
เลิศชัยจินตพิทักษ์สกุลรพีพรรณเอื้อเวชนิชกุล
และกัลยาเก่งวิกย์กรรม2549การประเมินวิธีสกัด
แยกดีเอ็นเอจากเลือด น้ำเชื้อ และเซลล์รากขนของ
พ่อพันธุ์ โค.สัตวแพทย์สาร56(3):68-79
Jason,R.H.andCallings,D.F.1971.Trans-
placental infection of pigletswith a porcine
parvovirus.Res.Vet.Sci.12:570-572.
กรณีอา้งองิจากตำราให้ระบุชือ่ผู้เขยีนปีที่ตีพมิพ์
ชือ่เรือ่งชือ่ตำรา(พมิพ์ครัง้ที่เทา่ใดและบรรณาธกิาร
หากมี) สำนักพิมพ์ เมืองที่พิมพ์ หน้าแรกและหน้า
สุดท้ายที่อ้างถึงดังตัวอย่าง
Allison,P.D.2005.Survivalanalysisusing
SAS: A practical guide 8 th edition. SAS
instituteInc.,Cary,NC,USA.292pp.
6
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
VanOirschot,J.T.1986.HogCholera.In:
DiseaseofSwine,6thed.Leman,A.D.ed.
LowastateuniversityPress.lowa.p.293-297.
กรณีอา้งองิจากเวบไซด์(Onlinereferences)ดงั
ตัวอย่าง
Weeden,N.F. 1993.ComparisonofDNA
extractionprotocols.[Online]http://home.twony.
rr.com/protocol.htmAccess29/10/2005.
จันทราแป้นตุ้มจุฑาพรศรีวิพัฒน์วรวิทย์แสง
สิงแก้ว และพึ่งพิศดุลยพัชร์. 2541. อาหารจาก
ข้าวโพด.คู่มือการส่งเสริมการเกษตรที่ 43. แหล่ง
ที่มา:http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm.
27มีนาคม2541.
5. การ พิมพ์ ผล งาน ทาง วิชาการ
ตัวพิมพ์ให้พิมพ์ดีดหรือใช้เครื่องพิมพ์(Printer)
หมึกพิมพ์ต้องเป็นสีดำ คมชัด สะดวกแก่การอ่าน
และใช้ตัวพิมพ์แบบเดียวกันทั้งฉบับ กรณีใช้เครื่อง
คอมพิวเตอร์พิมพ์เนื้อความให้ ใช้ตัวอักษร Ang-
sanaUPC 16 ตัวปกติ เท่านั้น ยกเว้นหัวข้อใหญ่
เช่น ชื่อเรื่อง บทคัดย่อ บทนำ อุปกรณ์และวิธีการ
ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศและเอกสาร
อ้างอิงพิมพ์ โดยใช้ตัวอักษรแบบหนา(Bold)ขนาด
18ส่วนหัวข้อย่อยเช่นชื่อผู้วิจัยและคณะคำสำคัญ
ตารางรปูภาพเปน็ตน้พมิพ์ โดยใช้ตวัอกัษรแบบหนา
(Bold)ขนาด16กระดาษที่ ใช้พมิพ์ให้ ใช้กระดาษขาว
ไม่มีบรรทัดขนาดมาตรฐานA4(210X297มม.)
ใช้เพียงหน้าเดียว
การเว้นที่ว่างขอบกระดาษ
-ตั้งกั้นหน้าบนและซ้ายไว้ที่2.5เซนติเมตร
- ด้านขวาและด้านล่างไว้ที่ 2.0 เซนติเมตร
การเว้นระยะในการพิมพ์
- การเว้นระยะระหว่างบรรทัดและการย่อหน้า
ควรจัดตามความสวยงาม
- กรณีคำสุดท้ายไม่จบบรรทัดนั้นๆ ให้ยกคำนั้น
ทัง้คำไปพมิพ์ ในบรรทดัตอ่ไปไม่ควรตดัสว่ยทา้ยของ
คำไปพิมพ์ ในบรรทัดใหม่เช่นกระบือปลักไม่ให้แยก
เป็นกระบือ-ปลักเป็นต้นจุลชีพเช่นEscherichia
coliหรือพิมพ์ตัวเอนEscherichiacoli
-หลังเครื่องหมาย.และ,หรือ;เคาะ1เคาะ
พืช เช่น Oryza sativa หรือพิมพ์ตัวเอน Oryza
sativa
- ระหว่างคำสุดท้าย กับเครื่องหมาย . และ ,
ไม่เว้นช่องว่าง
สัตว์เช่นBostaurusหรือพิมพ์ด้วยตัวเอนBos
taurus
-ไม่ต้องเว้นช่องว่างระหว่างวงเล็บและคำข้าง
ในวงเล็บเช่น(รพีพรรณและคณะ)
การลำดับหน้า
-ลำดับหน้าโดยใช้หมายเลข1,2,3......ที่กึ่งกลาง
หน้ากระดาษ
ตารางรูปภาพแผนภูมิกราฟ
- ตารางประกอบด้วย เลขที่ของตาราง (table
number)ชือ่ของตาราง(tabletitle)หวัตาราง(table
heading)และที่มาของตาราง(ถ้ามี)โดยให้ทำเป็น
ภาษาองักฤษหรอืภาษาไทยทัง้ตารางพมิพ์อยู่ในหนา้
เดียวกันทั้งหมด
-กรณีตารางมีความยาวมาก ไม่สามารถสิ้นสุด
ในหน้าเดียวได้ ให้พิมพ์ส่วนที่เหลือในหน้าถัดไปโดย
พิมพ์เลขที่ตารางและตามด้วยคำว่า(ต่อ)
- กรณีรูปภาพแผนที่ แผนภูมิ กราฟควรเป็น
ภาพขาวดำและใช้แนวทางข้างต้น
การพิมพ์ชื่อวิทยาศาสตร์ของสิ่งมีชีวิตให้ ใช้ตาม
ประมวลนามศาสตร์สากล (International code of
nomenclature)คือขีดเส้นใต้หรือพิมพ์ด้วยตัวเอน
ชื่อวิทยาศาสตร์เป็นไปตามการตั้งชื่อ
7
Journal of Biotechnology in Livestock Production
สารบัญ
8
10
18
29
37
44
52
65
75
85
94
• โครงการเร่งรัดผลิตโคเนื้อคุณภาพสูงโดยวิธีการผสมเทียม
• การศึกษารูปแบบของยีนCD18ที่ก่อโรคBovineLeukocyteAdhesion
Deficiency(BLAD)ในโคไทยโฮลสไตน์ด้วยเทคนิคPCR
• ระดับแอนติบอดีของเชื้อโบวายน์ไวรัลไดอะเรียและอุบัติการณ์เกิดโรคในโค
ในพื้นที่ปศุสัตว์เขต123และ7ของประเทศไทย
• ผลของระดับฮอร์โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน
• ผลความเข้มข้นของCysteineในน้ำยาเจือจางEggYolkTris
ต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม
• ผลการเสริมกลูตามีนและไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม
ภายหลังการละลาย
• สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันในภาคใต้ของประเทศไทย
• อิทธิพลของพลังงานเชิงลบช่วงหลังคลอดต่อความสมบูรณ์พันธุ์ในแม่โคนม
ลูกผสมไทยโฮลสไตน์
• การพัฒนาชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอ
ชนิดไมโครแซทเทิลไลท์เพื่อเพิ่มความเชื่อมั่น
• ความสัมพันธ์ระหว่างสนิปของยีนเลปตินกับคุณภาพซากในโคเนื้อ
ลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%
• อิทธิพลสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาตินต่อลักษณะความนุ่ม
ของเนื้อในโคลูกผสมแองกัส50%(Thai-Black)
หน้า
8
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
การเลีย้งโคเนือ้เปน็อาชพีทางการเกษตรที่สำคญัและเกีย่วขอ้งกบัเกษตรกรไม่นอ้ยกวา่ลา้นครอบครวั
การเลี้ยงโคเนื้อของเกษตรกรไทย ที่เคยใช้ประโยชน์เป็นแรงงานทำการเกษตรเป็นหลักนั้น ปัจจุบันความ
เจริญเติบโตของประชากรในประเทศที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว การใช้ประโยชน์ ในที่ดินทำกินมีจำกัด ต้องใช้
เกิดประโยชน์คุ้มค่าพื้นที่สาธารณะประโยชน์ที่เคยมีพืชอาหารสัตว์กระจายอยู่ทั่วไปก็ลดลงอย่างเห็นได้ชัด
เกษตรกรจำนวนมากต้องเลิกเลี้ยงโคเนื้อแบบเลี้ยงปล่อยมีการสูญเสียแม่พันธุ์ โคไปเป็นจำนวนมากแนวโน้ม
การเลี้ยงโคเนื้อต้องเปลี่ยนเป็นการเลี้ยงเพื่อจำหน่าย และเพื่อผลิตเนื้อโค ทั้งนี้เพราะความต้องการบริโภค
เนื้อสัตว์เพิ่มขึ้นทั้งจากความต้องการของประชากรในประเทศเองและนักท่องเที่ยวจากต่างประเทศตลอด
จนความต้องการของตลาดต่างประเทศยิ่งไปกว่านั้นการรวมตัวของประเทศในอาเซียนเกิดเป็นประชาคม
เศรษฐกิจอาเซียน ซึ่งจะเริ่มทำการค้าเสรี ตั้งแต่ปี พ.ศ.2558 เป็นต้นไปนั้น การเลี้ยงโคเนื้อจำเป็นต้อง
เปลีย่นรูปแบบเป็นฟาร์มที่มีมาตรฐานการเลีย้งที่สากลยอมรับการผลิตเนือ้โคคุณภาพสูง(PremiumGrade)
ซึ่งประเทศไทยมีโอกาสและศักยภาพสูง เมื่อเปรียบเทียบกับประเทศต่างๆ ในเขตเอเชียตะวันออกเฉียงใต้
(ASAEN)มีความสามารถที่จะผลติโคเนือ้คณุภาพสงูเพือ่การบริโภคภายในประเทศและสง่ออกไปจำหนา่ย
ต่างประเทศได้ ซึ่งผลจากข้อตกลงเขตการค้าเสรีอาเซียน (AFTA)ซึ่งมีผลตั้งแต่วันที่ 1มกราคม2553
ประเทศไทยเริ่มส่งออกโคเนื้อไปต่างประเทศเพิ่มมากขึ้น
กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ได้จัดทำแผนยุทธศาสตร์ โคเนื้อ ดำเนินการระหว่างปี
พ.ศ.2555–2559เพื่อเป็นแผนแม่บทและใช้เป็นแนวทางในการกำหนดนโยบายของรัฐบาลในการผลิต
โคเนือ้ในประเทศโดยรฐับาลได้บรรจุ“โครงการ เรง่รดั การ ผลติ โค เนือ้ คณุภาพ”ไว้ ในแผนบรหิารราชการ
แผ่นดิน(4ปี)แล้วโดยหวังว่าจะให้การเลี้ยงโคเนื้อเป็นอาชีพที่ทำรายได้ ให้เกษตรกรอย่างสมํ่าเสมอ
โครงการเร่งรัดการผลิตโคเนื้อคุณภาพสูงโดยวิธีการผสมเทียมได้รับการจัดสรรงบประมาณดำเนิน
การระยะ4ปีระหว่างปีงบประมาณพ.ศ.2555-2558โดยสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์เป็น
ผูร้บัผดิชอบดำเนนิการผสมเทยีมแม่โคเนือ้พืน้ฐานในประเทศคอืพนัธุ์พืน้เมอืงพนัธุ์ลกูผสมบราห์มนัให้ได้ลกู
เกิดโคเนื้อคุณภาพสูงสายเลือด50%ของพันธุ์ชาร์ โรเลย์หรือพันธุ์แองกัสในเบื้องต้นโดยมีวัตถุประสงค์
เพื่อยกระดับคุณภาพการผลิตโคเนื้อคุณภาพและเพิ่มรายได้ ให้กับเกษตรกรรายย่อยผู้เลี้ยงโคเนื้อเพื่อสนอง
ตอบความต้องการของตลาดโคเนื้อคุณภาพที่ขยายตัวอย่างรวดเร็วและเพื่อปรับเปลี่ยนทัศนคติผู้บริโภคให้
นิยมบริโภคเนื้อคุณภาพเพิ่มขึ้นเป้าหมายผสมเทียมแม่โคเนื้อในประเทศจำนวน600,000ตัวผลิตลูกเกิด
โคเนื้อคุณภาพดีจำนวน180,000ตัว
โครงการเร่งรัดการผลิตโคเนื้อคุณภาพโดยวิธีการผสมเทียม
นายรัตน์ ฉายารัตนศิลป์
9
Journal of Biotechnology in Livestock Production
เกษตรกรเปา้หมายคอืเกษตรกรตน้นำ้ผลติโคเนือ้คณุภาพปอ้นสู่ตลาดเกษตรกรกลางนำ้คอืกลุม่
โคเตรยีมขนุและหรือเกษตรกรปลายนำ้กลุม่โคขนุและเชื่อมโยงกบัผู้ประกอบการเนื้อโคคณุภาพตอ่ไปโดย
คาดว่าเกษตรกรต้นน้ำจะสามารถผลิตลูกเกิดโคเนื้อคุณภาพตอบสนองความต้องการของตลาดในประเทศ
ได้จำนวน180,000ตัวในช่วงเวลา4ปี(ปี2556-59)และมีกำไรตอบแทนจากการผลิตลูกโคเนื้อคุณภาพ
ตัวละ5,500บาทตั้งแต่ปีที่2ของโครงการฯจากผลผลิตจำนวน60,000ตัวเป็นเงิน564ล้านบาท
กลไกการขบัเคลือ่นโครงการมีการจดัตัง้และขึน้ทะเบยีนกลุม่ผสมเทยีมโคเนือ้คณุภาพผา่นศนูยว์จิยั
การผสมเทยีมและเทคโนโลยีชวีภาพทัง้10ศนูย์การให้ผสมเทยีมแม่โคของกลุม่เกษตรกรฯการตดิตามตรวจ
ท้องติดตามลูกเกิดการบันทึกข้อมูลประวัติการผสมเทียมและการรับรองพันธุ์เพื่อการจำหน่ายโคหย่านม
ของกลุ่มเกษตรกรฯการปรับปรุงพันธุ์ โคเนื้อคุณภาพสูงใช้หลักการปรับพันธุ์แบบTerminalCrossBreed
ซึ่งช่วยให้เกิดHybridVigorที่ ได้ประโยชน์สูงโดยการผสมข้ามสายเลือดระหว่างโคสายเลือดBosIndicus
ได้แก่โคพันธุ์ลูกผสมพื้นเมืองโคพันธุ์ลูกผสมบราห์มันกับโคสายเลือดBosTaurusได้แก่โคพันธุ์ชาร์ โรเลย์
หรือแองกัสเป็นต้น
สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์กำหนดแผนภูมิภาพการปรับปรุงพันธุโดยวิธีการผสมเทียม
เพื่อมุ่งเน้นการผลิตลูกโคขุนคุณภาพในฟาร์มเกษตรกรรายย่อย (รุ่น F1) ที่เกิดจากแม่พันธุ์ โคพื้นเมือง
ผสมเทียมกับน้ำเชื้อโคพ่อพันธุ์ ชาร์ โรเลย์ หรือแองกัส ซึ่งตรงตามความต้องการของกลุ่มผู้ประกอบการ
โคขุน โดยเกษตรกรสามารขายลูกโค รุ่น F1 นี้ ได้ทั้งตัวผู้และตัวเมีย ในราคาที่ ใกล้เคียงกัน สำหรับ
ลูกโครุ่นF1เพศเมียที่เกษตรกรต้องการเลี้ยงไว้ทำพันธุ์ต่อไปนั้นสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ไม่แนะนำให้ผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อโคพ่อพันธุ์ชาร์ โรเลย์อีก แต่สามารถผสมพันธุ์กับน้ำเชื้อพ่อโคพันธุ์ตากหรือ
พันธุ์กำแพงแสนจะได้ลูกเกิดรุ่นF2และรุ่นF3ที่สามารถขายให้กับผู้ประกอบการโคขุนได้แต่การเลี้ยง
การจัดการอาจยุ่งยากขึ้นไม่เหมาะสำหรับเกษตรกรรายย่อยทั่วไป
จากผลการดำเนินโครงการในปีแรกของปีงบประมาณ 2555 เกษตรกรทั่วไป ได้รับโอกาสในการ
เชิญชวนเข้าร่วมโครงการและผสมเทียมแม่โคไปแล้วจำนวน41,713ตัวคิดเป็นร้อยละ84ของเป้าหมาย
แม่โคและลูกโคที่เกิดจะได้รับการติดหมายเลขประจำตัว (NID= National livestock Identification and
Registrationsystem)และการรับรองพันธุ์เพื่อการซื้อขายที่ ได้มูลค่าที่สูงขึ้น
ปีงบประมาณ ผสมเทียมแม่โค ตรวจท้อง ลูกเกิด ลูกโคผู้ ลูกโคเมีย
2555 50,000 45,000 - - -
2556 100,000 90,000 30,000 15,000 15,000
2557 200,000 180,000 60,000 30,000 30,000
2558 250,000 225,000 120,000 60,000 60,000
2559 0 0 150,000 75,000 75,000
รวม 600,000 540,000 360,000 180,000 180,000
10
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทคัดย่อ โรคBovineLeukocyteAdhesionDeficiency (BLAD) เป็นโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากยีน
ด้อย CD18 ชนิดโฮโมไซกัส (homozygous) ทำให้เป็นโรคบกพร่องภูมิคุ้มกัน และขาดความสมบูรณ์พันธุ์
พบในโคนมสายพันธุ์ โฮลสไตน์ และมักจะตายตั้งแต่อายุน้อย 1-2 เดือน แต่โคนมที่มียีนด้อย แบบเฮเทอ
โรไซกัส (heterozygous) จะมีอาการปกติ และเป็นตัวที่แพร่ยีนด้อยนี้ ไปในฝูงโคนมที่มีสายเลือดโฮลสไตน์
มีการค้นพบครั้งแรกในสหรัฐอเมริกา ว่าโคนมพ่อพันธุ์ โฮลสไตน์ เป็นพาหะของ โรคนี้ (BLAD carrier)
และต่อมาพบพาหะโรคBLADเพิ่มขึ้นในประเทศบราซิลและประเทศญี่ปุ่นจากรายงานที่พบมากขึ้นผู้วิจัย
จึงเริ่มทำการศึกษาเรื่องนี้ในปีพ.ศ.2554ขึ้นเป็นครั้งแรกในประเทศไทยและได้นำเทคนิคPCR-RFLP
ซึง่ให้ผลการตรวจที่รวดเรว็มาใช้เพราะมีความเทีย่งตรงมากกวา่การตรวจนบัเมด็เลอืดขาวซึง่เปน็การตรวจ
แบบดัง้เดมิการศกึษารปูแบบยนีCD18ครัง้นี้ได้นำตวัอยา่งดเีอน็เอซึง่สกดัจากเลอืดของฝงูโคนมลกูผสมไทย
โฮลสไตน์จำนวน220ตัวของเกษตรกรที่เกิดมาจากน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ โคนมโฮลสไตน์ของอเมริกาและ
ตรวจเช็คความแม่นยำของชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตัดด้วยเอ็นไซมด้วยการวิเคราะห์ลำดับเบส (DNA sequencing)
ด้วยเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติพบว่าในจำนวนโคทั้งหมด(220ตัวอย่าง)มีโคที่เป็นพาหะโรคนี้จำนวน1ตัว
และมีรูปแบบยีนCD18คือ156bp,201bpและ357bpแต่ตัวอย่างของยีนCD18ในโคนมอีกจำนวน199
ตัวที่ ไม่เป็นพาหะโรคนี้มีรูปแบบของยีนCD18คือ156bpและ201bpจากการศึกษาพบว่าprevalence
rateของการพบพาหะโรคนี้มีค่าเท่ากับ0.045%และมีความถี่ของยีนCD18เท่ากับ0.094แสดงว่าพาหะ
ของโรคนี้ยังมีจำนวนน้อยอยู่
คำสำคัญ:รูปแบบของยีนCD18,BovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)โคไทยโฮลสไตน์
เทคนิคPCR
กัลยา เก่งวิกย์กรรม1, ณชัย ศราธพันธุ์1, ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 และ สายใจ ชื่นสุข1 1สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์
การศึกษารูปแบบของยีน CD18 ที่ก่อโรค BovineLeukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) ในโคไทยโฮลสไตน์ด้วยเทคนิคPCR
11
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Abstract BLAD isaspecificHolsteinautosomal recessivegeneticdisordercharacterizedby
immuno-deficiency,recurrentinfectionsandinfertilityresultingindeathofhomozygousanimals
attheearlyage(1-2months).Heterozygouscowsandbullsareclinicallynormalbuttheyhave
achanceofproducinghomozygouscalvesaffectedbythedisease.Itwasfirstlyidentifiedin
HolsteinsiresofNorthAmerican,thenBrazilandJapan.Accordingtothosereportsoffinding
BLADcarriersfrommanycountriesusingdeepfrozensemenofAmericanBLADcarriersires,
in2011PCR-RFLPwaschosentoidentifygenotypesofgeneCD18forthefirsttimeinThai-
land.BloodsamplesofThaiHolsteincattlepopulation(n=220)tofindoutBLADcarriers.The
PCR–RFLPprocedureandDNAsequencingwereadjustedforoptimumconditions.Theresults
showedthatthegenotypeofBLADcarrierhasthreefragmentsof156bp,201bpand357bp
whereasunaffectedcattlehaveonlytwofragmentsof156bpand201bp.Allgenotypeswere
confirmedbyDNAsequencingmethod.TheprevalencerateoftheBLAD-carrierwere0.045%
andallelicfrequencyofCD18,wasonly0.094.ItwasconcludedthattheprevalentofCD18
genemutationinThaiHolsteincattlewasstillverylow.
Keywords:Genotyping,GeneCD18,BovineLeukocyteAdhesionDeficiency,BLAD,
ThaiHolsteincattle,PolymeraseChainReaction,PCR
Kalaya Kengvikkum1, Nachai Sarataphan1, Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Saijai Cheunsuk1
1Bureau of Biotechnology in Livestock Production Department of Livestock Development
Genotyping of Gene CD18 Causing BovineLeukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) inThai Holstein Cattle using Polymerase ChainReaction(PCR).
12
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Introduction BLADisaspecificHolsteinautosomalrecessivegeneticdisorderandresultsindeathofhomozygousanimalsattheearlyage(1-2months).ItwasfirstlyidentifiedinNorthAmeri-canHolstein(Shusteretal1992).BLADcarrierswereamongthemostpopulartopbullsoftheHolsteinbreedsuchasOsborrndaleIvanhoe,PenstateIvanhoeStar,andCarlin-MIvanhoeBell(Shusteretal1992,Powelletal1996).WidespreaduseofArtificialinsemination(AI)andmultipleovulationembryotransfer(MOET)techniquescauseddemandingsemenfromthoseeliteHolsteinbulls.AffectedcattlewithBLADwerelinkedtocommontheancestorsiresthatwereprovedtobecarriers(Shusteretal1992,Jørgensenetal1993).ThaiHolsteincattleinheriteddisorderbyautosomalrecessivegeneandexpressedasadiseasedphenotypeifbothallelesarepresent(Homozygous).Homozygousindividualscanbeidentifiedbydifferentmethodssuchasclinicalexamination,analysisofenzymeactivityinbloodandgenomicanalysis.Withthemolecularbasis,thescreeningofcarriers(Heterozygous)ispossibleatthedirectgeneticde-tection.ThisstudyaimstodevelopthePCR-RFLPconditionsandestimatetheBLADallelein220ThaiHolsteincattle.
MaterialandMethods Bloodsampleswerecollectedfrom220cattleofThaiHolsteincattle’sjugularveinintoEDTAcontainingtubes.DNAwasisolatedusingAxyprepBloodGenomicDNAMiniprepKitandstoredat4°Cuntilanalysis.
GenotypingforBLADwascarriedoutusingPCR-RFLPmethods.PCRwasmadein20µlreactionmixturecontaining1µlGenomicDNA,1UTaqpolymerase,0.2mMdNTP,5µMofeachprimer(F:5’GAATAGGCATCCTGCATCATATCCACCA3’R:5’CTTGGGGTTTCAGGGGAAGATGGAGTAG3’)TheprimersweredesignedtoamplifyaDNAfragmentof357bp.(Meydan,etal.2010)ThecyclingreactionwereperformedinaPersonalThermalCycler(MJMini™)withaninitialdenaturationfor3minat96๐Cfollowedbythethermalcyclesasfollows:denaturationstepat94๐Cfor30s,annealingstepat66๐Cfor30s,andanelongationstepat72๐Cfor30s.Thereactionwascompletedwithafinalelongationstepat72๐Cfor5minPCRproductswereanalyzedwith2%agarosegel.The357bpDNAfragmentwasamplifiedbyPCR.Aliquotsof2µlofPCRproductweresubjectedtorestrictiondigestionwithTaqIina10µlreactionvolume.Using0.2µlTaqIrestrictionendonucleasewithBSAperonesample,themixturewasincubatedat65oCfor3hr.ThedigestedamplifiedPCRproducton2%agarosegelyieldedtwobandsof201and156bpfornormalanimalsandthreebandsof201,156and357bpforcarriers.TheamplifiedPCRproductof357bpwasfortheBLADlocus.
13
Journal of Biotechnology in Livestock Production
OneDNAofknowncarrierofBLADasacontrolwasobtainedfromDr.IstvanAnton,ResearchInstituteforAnimalBreedingandNutrition(ATK)Herceghalom,Hungary.Allgeno-typeswereconfirmedbyDNAsequencingtechnique.Aftergelelectrophoresis,theampliconswerepurifiedusingNucleoSpin®ExtractIIandsequencedbyBigDyeTerminatorchemistryonanABI3130AutomatedDNASequencing.
AllelicFrequencyestimate
ThegenefrequencyestimateoftheCD18wascalculatedbasedontheHardy-Weinberglawasfollow:p=2(AA) + (Aa) q=1-p(Crow,JF.1999). 2N
Wherep=normalallelefrequency,q=mutantallelefrequency,N=totalnumberofanimaltested,AA=numberofBLAD-freecattle,andAa=numberofBLADcarriers.
Results
TheprimermentionedabovesuccessfullyamplifiedtheDNAfragmentsof357bpforBLAD.Infigure1,therewerefiveBLADcarriers:anexamplefromHungaryasacontrolandfoursamplesinThaiHolsteinhavethreefragmentsof156bp,201bpand357bpwhereasunaffectedcattlehaveonlytwofragmentsof156bpand201bp.TheBLADpositiveandnega-tivesamplesweresequencedbyBigDyeTerminatorchemistryonanABI3130AutomatedDNAsequencing(AppliedBiosystems,USA).TheDNAsequenceswereanalyzedusingtheSequencingAnalysisSoftwareVersion3.3(AppliedBiosystems).Amongfivecarriers’allele,therewereonly twomutantalleles:acontrolsampleDNAfromHungaryandonesamplefromThaiHolsteinbull.Theotherthreealleles(Figure1:inthecolumn5,6,7)werefoundtobefalsepositivewhenconfirmedbyDNAsequencingmethod.ToimprovethatPCR-RFLPanalysisshouldbeastrongandreliablemethodforidentificationofBLAD.ManytrialshavebeendoneinbothPCRandofTaqIenzymeconditionsinordertofindtheoptimumprocedure.Finally,aproperconditionofTaqIenzymewasfoundbyaddingBSA1µl(0.1%)andreducingDDW(deionizeddistilwater)from6.8µlto5.8µlintotalsolution10µl.DNAsamplesfromThaiHolsteincattleincolumn5,6,and7inFigure1weretrulyfalsepositivewhencheckingsequences.(Figure2)
14
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Figure1: VisualizationofrestrictionfragmentsproducedbyTaqIenzymeonthePCRproducts.ColumnM:100bpladder.
Column 1-2: Positive control DNA from Hungary cow and positive sample of Thai Holsteincattlerespectively.
Column 3-4:NegativeDNAsamples
ofThaiHolsteincattle
Column 5, 6, 7:(false)positiveDNAsamplesofThaiHolsteincattle
Figure 2: Visualization of restriction frag-mentsproducedbyTaqIenzymeonthePCRproducts.
Column M:100bpladder.
Column 1-2: Positive control DNA from Hungary cow and positive sample of ThaiHolsteincattle
Column 3, 4, 5, 6, 7:NegativeDNAsamplesofThaiHolsteincattle
Theresultsfrom220DNAsamplesshowedthattherewereonlytwogenotypes.Onetypewasofknowncarrier(heterozygous;Aa)andtheotherwasofnormalcow(homozygous;AA).ThehomozygousofrecessivegeneofCD18cannotbefound.Allgenotypeswereconfirmedbysequencingmethod.ThenucleotidesequencewasintheGenBankwithaccessionnumberFJ853493forBLAD.TheresultofsequencingforthemutantBLADallelewasconfirmedasinglepointmutationatthenucleotide383intheCD18geneastheotherreports(Figure3)(Kriegesmann,etal1997,Meydan,etal.2010).Inthispaper:theprevalenceofBLADcarriersinThaiHolsteincattlewasfound0.045%andthegenefrequencyofCD18,calculatedaccordingtotheHardy-WeinbergLawwasonly0.01inthe220samples.TheotherincidenceofBLADcarriersamongTopsireswasalsofoundtobe23%inU.S.A.(Shusteretal1992),10%inFrance(Tainturieretal1995),16%inJapan(Nagaharaetal1995),3.33%inIran(Norouzyetal2005)and4.76%(Pateletal2011)
15
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Figure 3 AlignmentofBLADsequencesfromnormalThaiHolsteincow(greenpeakpointedby the arrow represented theA/A bp),mutant1 (positive controlDNA fromHungary; twopeakspointedbythearrowrepresentedtheA/Gbp)andmutant2fromnormalThaiHolstein (positiveBLAD-DNAfromaThaisample;twopeakspointedbythearrowrepresentedtheA/Gbp)onthesecondandthirdrowsrespectively.Themutationconsistsofasinglepointmutationofnucleotide383intheCD18gene.Theboxindicatesthesinglepointmutationsite(AtoG)
16
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Discussion ThePCR-RFLPprocedurewasadjustedbyourteamtoeliminatethefalsepositive.Finally,therestrictionenzymeTaqIdigestedthePCRproductintotwofragmentsof156bpand201bp(Figure2,lane3,4,5,6and7)innormalhomozygote.Heterozygoteanimalsgavethreefragmentsof156bp,201bpand357bp(Figure2,lane1and2).ItwasthesameasotherexperimentsthatnormalunaffectedBLADcattlehavetwofragmentsofallelesandthecarriershadthreefragmentsinPCR-RFLPmethod.Ribeiro,etal(2000)surveyedBLADinHolsteinandGircattleinBrazilandusedtheenzymeTaqItodigestthePCRproduct.Innormalhomozygotethereweretwofragmentsof26and32bpandinBLADcarrierhadthreefragmentsof58,26and32bp.Meyden,etal(2010)usedPCR-RFLPmethodandDNAsequencingforscreeninggenotypingBLADof350HolsteincowsinSouthEastAnatoliainTurkeybetweentheyears2007-2009.ThenormalunaffectedBLADcattleallelesproducedtwofragmentsof156bpand201bp.BLADcarriersexhibitedthreefragmentsof156,201and357bp.
TheprevalenceofBLADinthispaperisstilllowat0.045%andallelicfrequencyofCD18,wasonly0.094.Itwasbecauseofsmallinvestigatednumberofsamplesandcouldbehigherinthecomingyears.AstheselectionwithinHolsteinbreed,its’crossesandAIprogramsareofmajor factors tospreadofundesirablegeneticdisorderofBLAD.RoutinecheckingofbullsanddamsbytheRealtimePCRisrequiredtoreducetherecessivelethalgeneinThaiHolsteincattlepopulation.
Acknowledgements TheauthorwishtothankDr.IstvanAnton,ResearchInstituteforAnimalBreedingandNutrition(ATK)Herceghalom,HungaryforgivingDNAofknowncarriesofBLAD.
References Crow,JamesF.(1999).“Hardy,Weinbergandlanguageimpediments”.Genetics152(3): 821–825.PMC1460671.PMID10388804.[Online]
http://www.genetics.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=10388804.Access10/1/2011.
Jørgensen,C.B.,AgerholmJ.S.,PedersenJ.andThomsen,P.D.1993.Bovineleukocyte adhesiondeficiency inDanishHolstein-Friesiancattle. I.PCRscreeningand allelefrequencyestimation.Acta.Vet.Scand.1993;34(3):231-6.
17
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Meydan, H., Yildiz, A.M. and Agerholm, J. 2010. Screening for bovine leukocyte adhesiondeficiency,deficiencyofuridinemonophossynthase,complexvertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factorXI deficiency inHolstein cows rearedinTurkey.Acta.VeterinariaScandinavica.52:56
Kriegesmann,B.,Jansen,s.,BaumgartnerB.G.andBrening,B.1997.Partialgenomic structureofthebovineCD18geneandtherefinementoftestforbovineleukocyte adhesiondeficiency.J.DairySci.80:2547-2549
Nagahara,H.,TamotoK.,Noda,H.andKociba,G.J. 1995.Expressionand roleof adhesionmoleculeCD18onbovineneutrophils.Can.J.Vet.Res.59:1-7
NorouzyA.,Nassiry,M.R.,Eftekharishahrody,F.,Javadmanesh,A.,MohammadAbadi, M.R.andSulimova,G.E.2005. Identificationofbovineleukocyteadhesion deficiency(BLAD)carriersinHolsteinBrownSwissAIbullsinIran.Russ.J.Gen. 41(12):1679-1701
Patel,M.,Patel,R.K,Sing,K.M.,Rank,D.N.,Thakur,M.C.andKhan,A.2011.Detection ofgeneticpolymorphisminCD18geneincattlebyPCR-RFLP.WayambaJournal ofAnimalScience.http://www.Wayambajournal.com
Powell,R.L.,Norman,H.D.andCowan,C.M.1996.Relationshipofbovineleukocyte adhesion deficiency with genetic merit for performance traits. J. Dairy Sci. 79:895-899.
Ribeiro,L.A.,Baron,E.E.,Martinez,M.L,andCoutinho,L.L.2000.PCRscreening andallele frequencyofbovine leukocyte inHolsteinandGircattle inBrazil. GeneticsandMolecularBiology,234,831-834
Shuster,D.E.,Kehrli,M.E.JR,Ackermann,M.R.andGilbert,R.O.1992.Identification andprevalenceofageneticdefectthatcausesleukocyteadhesiondeficiencyin Holsteincattle.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9225-9229
Tainturier,D.,Grobet, L.,Brouwers,B.,Bruyas, J.F.,Fieni,F.,Battut, I., Lecoanet, J.,Douart,A.,Breton,I.andDuclos,P.1995.Observationsonthreecasesof bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD)Revue-deMedecineVeterinaire 146(3):189-195
18
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทคัดย่อ การศึกษาความชุกของโรคไวรัสโบวายน์ไวรัลไดอะเรีย (Bovine Viral Diarrhea: BVD)
ในเขตพื้นที่ปศุสัตว์เขต 1, 2, 3 และ 7 ของประเทศไทย โดยเก็บตัวอย่างเลือดจากฟาร์มโคนมลูกผสม
โฮลสไตน์-ฟรีเชี่ยน 108 ฟาร์ม จำนวน 3,380 ตัวอย่างและเจาะเก็บตัวอย่างเนื้อเยื่อหูจาก 89 ฟาร์ม
จำนวน2,679ตัวอย่างตรวจแอนติบอดีโดยใช้PrioCHECK®BVDVAbและตรวจแอนติเจนจากเนื้อเยื่อ
หนังหูโดยใช้ PrioCHECK® BVDV AgPIfocus ซึ่งเป็นชุดตรวจอีไลซ่าสำเร็จรูป ของประเทศเนเธอร์แลนด์
ผลการตรวจแอนติบอดีพบว่าพื้นที่ปศุสัตว์เขต7มีจำนวนฟาร์มที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสบีวีดีสูงสุด
เป็นร้อยละ83.9ขณะที่พื้นที่เขต3,1และ2พบร้อยละ72.0,62.5และ53.6ตามลำดับและพบว่าโคใน
พื้นที่ปศุสัตว์เขต7มีจำนวนโคนมที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัสบีวีดีสูงสุดเช่นกันคิดเป็นร้อยละ30.21
ขณะที่พื้นที่ปศุสัตว์เขต3,1,และ2พบร้อยละ20.05,14.97และ2.86ตามลำดับพบระดับแอนติบอดี
ในฟาร์มที่มี และไม่มีประวัติแท้งลูกหรือลูกตาย ทั้ง 4 เขต เป็นร้อยละ 71.43 และ 64.44 ตามลำดับ
และพบระดับแอนติบอดีในกลุ่มแม่โคโคสาวและลูกโคเป็นร้อยละ20.79, 10.88และ10.36ตามลำดับ
สำหรับผลการตรวจแอนติเจนเนื้อเยื่อหนังหู ในระดับฟาร์มพบในฟาร์มของพื้นที่ปศุสัตว์เขต 2, 3 และ 7
คิดเป็นร้อยละ4.5,5.6และ6.9ตามลำดับแต่ไม่พบในพื้นที่ปศุสัตว์เขต1อัตราการพบในโคเพศเมียของ
พื้นที่ปศุสัตว์เขต2,3,และ7เป็นร้อยละ0.2,0.2,และ0.2ตามลำดับไม่พบในโคของพื้นที่ปศุสัตว์เขต1
และตรวจพบแอนติเจนเฉพาะในฟาร์มที่มีประวัติแท้งลูกหรือลูกตาย เป็นร้อยละ6.45 โดยพบแอนติเจนใน
กลุ่มแม่โคโคสาวเป็นร้อยละ0.11,0.52ตามลำดับไม่พบในลูกโคผลจากการศึกษาครั้งนี้จะเป็นประโยชน์
ในการวางมาตรการควบคุมและกำจัดโรคบีวีดีไม่ให้แพร่กระจายต่อไป
คำสำคัญ:โบวายน์ไวรัลไดอะเรียไวรัสบีวีดีโคนมแอนติบอดีแอนติเจน
ไกรวรรณ หงษ์ยันตรชัย1 อรุณ จันทร์กระจ่าง1 พรรณพิไล เสกสิทธิ์2
1ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสระบุรี จ. สระบุรี 2สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ จ. ปทุมธานี 12000
ระดับแอนติบอดีของเชื้อโบวายน์ไวรัลไดอะเรียและอุบัติการณ์เกิดโรคในโคในพื้นที่ปศุสัตว์เขต123และ7ของประเทศไทย
19
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Abstract AprevalencestudyofBovineViralDiarrhea(BVD)bydetectingBVDVantibodiesand
antigensincattlewasconducted.Atotalof3,380bloodand2,679earnotchtissuesamples
werecollectedfromfemalecrossbredHolstein-Friesianof108farmsintheareasofLivestock
Region(LR)1,2,3and7ofThailand.Thebloodsampleswerescreenedforantibodiesagainst
BVDVusingELISAtestkit:PrioCHECK®BVDVAb,whileearnotchtissuesamplesweretested
forBVDVantigensusingPrioCHECK®BVDVAgPIfocus.ResultsofBVDVantibodyprevalence
showedthatthefarmsinLR7hadhighestseroprevalenceof83.9%followedbyLR3,1,2,
(72%,62.5%and53.6%,respectively).Thenumberofcattlewithseroprevalencewasalso
highestinLR7(30.21%)followedbythesamesequenceofLR3,1,2,(20.05%,14.97%and
2.86%,respectively).Inaddition,thefarmswithhistoryofabortionhadhigherseroprevalence
thanthosewithouthistoryones(71.43%and64.44%,respectively).Whilecowshadhigher
seroprevalencethanheifersandcalves(20.70%,10.88%and10.36%,respectively).Resultsof
BVDVantigensdetectionfrom89farms,therewerepositiveinLR2,3and7(4.5%,5.6%and
6.9%,respectively)butnotinLR1.Whilethenumberofpositiveantigendetectedfrom2,679
cattleinLR1,2,3and7were0%,0.2%,0.2%,and0.2%,respectively.Thepositiveantigen
wasdetectedonlyinthefarmswithabortionhistory(6.45%)butnot inthefarmswithout
abortion.Thepositiveantigensprevalenceincows,heifersandcalveswere0.11%,0.52%and
0%,respectively.Thisstudyprovidesbeneficialinformationfordairycattlereproductiveherd
healthmanagementplanningandBVDpreventionprogram.
Keywords:Bovineviraldiarrhea,BVDV,cattle,antibody,antigen
Kriwon Hongyuntarachai1 Arun Chungrachang1 Panpilai Sekasiddhi2
1Saraburi Artificial Insemination and Biotechnology Research Center, Saraburi 182602The Bureau of Biotechnology in Livestock Production,
Department of Livestock Development, Pathumthani.
SeroprevalenceagainstBovineViralDiarrheainCattlein4LivestockRegionsofThailand
20
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Introduction InThailand,artificialinseminationactivitymainlysupportedbytheBureauofBiotechnology inLivestockProduction(BBLP)hastakenamajorroleinlivestockimprovementespeciallyindairycattle.Normally,dairyfarmersprefertogethighproductionbygainingacalf/yearandminimizingday-openperiod.Somecowsabortedatthefirst3monthsorthe3monthsof midtermoratthelate3monthsofgestationperiod.Theabortionsincludedearlyembryonicdeathandmummification.Anycowthathadanearlyembryonicdeathcouldbeonheatasusual.Asaresult,theownermightthinkaboutinfertilityproblemoranaccidentincaseofabortion.Somenewborncalvesdiedofweaknesswithunknowncause.Therefore,infectiousdiseasesthoseresultinabortion,forexample,bovineviraldiarrhea(BVD)shouldnotbeexcluded.
TheBVDV,distributedworldwide, isaheterogeneousgroupofvirusesbelongingtogenuspestivirus,familyflaviviridae(Becheretal.,2002).Itexistsasacytopathogenic(CP)andnoncytopathogenic(NCP)biotype,basedonthepresenceorabsenceofvisiblecytopathiceffectsinthecellculture(Dubovi,1990).Fetusesinfectedwithnon-cytopathogenicbiotypeofBVDVintheperiodofbetween30to120daysofgestationdevelopimmunetoleranceandwillbepersistentlyinfected(PI).ThesePIcalvesarehighlysusceptibletootherdiseases.AsthePIanimalshaveveryhighandpersistentviremia,consequently,theywereprimaryreservoirofBVDVandcandisseminateinfectionbysheddingthevirusthroughnasaldischarge,saliva,semen,urine,feces,tearandmilk(Brock,1995).
ThereisnoadequateinformationaboutprevalenceofBVDVpersistencyinThailand. Therefore, the present study was aimed to survey the prevalence of PI animals among HolsteindairycattleherdsintheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thofThailand.Thedesignof effectivecontrolanderadicationstrategydependsontheknowledgeofepidemiologicalparameters,includingtheprevalenceofPIanimalswhichreflectedfromtheantibodyandantigendetection.
MaterialandMethods Thestudycomprisedof22monthsperiodfromOctober2009–July2011.Atotalof3,380animalsfrom108farmsintheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thnon–vaccinatedwithanyBVDvirusvaccines,wererandomlypurposivesampling.Bothserumandearnotchbiopsysamplesweretakenfromeachanimalthathashistoryrecordsuchasabortion,bearing weakcalfandinadditionwithcompletehistory:age,breedoftheanimals,totalnumberofanimalsonafarm,pregnancystatus,andpreviousdiseases.Thebloodsampleswereanalyzed forthepresenceofBVDVantibodiesusinganELISAtestkit,PrioCHECK®BVDVAb,whileearnotchtissuesamplesweretestedforBVDVantigensusingPrioCHECK®BVDVAgPIfocusattheBBLPcentrallab,Pathumthaniprovince.Thekitdetectedthehighlystablevirusprotein,
21
Journal of Biotechnology in Livestock Production
whichwassecretedextracellularlyduringvirusreplication.Thesensitivity(Se)andspecificity (Sp) of the testswere 98% and 99% forBVDV antibodies, 100% and 99.4% forBVDV antigens,respectively,asindicatedbythemanufacturer.
Statisticanalysis.Alldatawerecalculatedinto4aspectsasfollows;
1. Theprevalence=numberofinfectedcattle
2. PercentageoffarmswithpositivetoBVDVantibodies
3. Percentageofheadsofcattlewithpositiveantibodies
4. PercentageoffarmsandheadsofcattlewithpositivetoBVDVantigen
Results Table 1 showed that a total of 3,380 cows within 108 dairy cattle herds in the LivestockRegion1st,2nd,3rdand7ththerewere108farms(68.5%)positivetoantibodyagainstBVDV.Amongthosefarmsintheregions,itwasfoundthatfarmsinLR7thhadthehighestantibodyprevalenceof83.9%,followedbythe,farmsintheLR3rd,1stand2nd(72%,62.5%and53.6%,respectively).Alsotheprevalenceofcattle(heads)inLR7thhavingtheantibodywashigher(30.21%)thanthatofcattleinLR1st(14.97%),2nd(2.86%)and3rd(20.05%).
Table2showedthatthecowshadthehigherprevalenceofserumantibody(20.79%)thanheifers(10.88%)andyoungcalves(10.36%)
Table3showedthedetectionofBVDVantigenfromearnotchbiopsysamplesof4LivestockRegions,byPrioCHECK®BVDVAgPIfocusELISAtestkit.Itwasfoundthattherewere4infectedfarmslocatedinLR2nd(1farms),LR3rd(1farms),andLR7th(2farms).ThefarmshavingprevalenceofabortionwerefoundBVDVantigenpositivetestat6.45%.WhiletherewerenoprevalenceBVDVantigenpositiveinthefarmswithoutprevalenceofabortion.
Table4showedthatoutof1,849cowsand389heifers,BVDVantigendetectionwaslowerincowsthanheifers(0.11%and0.52%,respectively).WhereastherewasnoBVDVantigenpositivein441samplesfromcalves.
Table 5 showed status of farms and cattle with positive antibody detected byPrioCHECK®BVDVAbandpositiveantigenbyPrioCHECK®BVDVAgPIfocus.Thereare4farmsand4cattlewithantigenpositive,2farmsinLR7,onefarmLR3andLR2.Farm1-3hadhighantibodyprevalence(83.9%,97.6%and97.1%,respectively)inallcattleand6-12monthscattle(100%,75%and100%, respectively),except for farm4 thathad lowantibodyandantigenprevalence(8.3%and0%,respectively).Mostofthecattlethatpositiveantigendetection(3/4),hadnegativeantibody.
numberofcattleexamined
22
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
DiscussionandConclusion ThedetectionofBVDVantigenandantibodyhadbeendoneinfarmlevelandcattlein4importantLivestockRegions.TheresultsshowedthatthefarmsintheLivestockRegion7th(LR7)hadhighestprevalenceofbothBVDVantibodyandantigen.PhysicallytheLR7oc-cupiedlargeareawiththemostcongestedfarmsandpopulationofdairycattle(DLD,2012).Aiumlamaietal.(1992)reported4.4%prevalenceofBVDVantibodyfrombulkmilktanksofdairyfarmsintheMuaglekarea,whileVirakuletal.(1997)reportedat15.8%,39.6%32.9%and11.2%inLR1,2,3,and7,comparedwiththisreport(Table1)at62.5%,53.6%,72.0%and83.9%respectively,inthesameregions.The2reportsshowedthatBVDVspreadedrapidlyinallstudiedregions.Everycattleinthisstudywerenon-vaccinatedherd.Therefore,theantibody,foundineverycattlewasactiveimmunity.Howevertheantibodyofcalvesmightbethepassiveimmunederivedfromtheirdamsorbetheimmunityproducingbythemselveswhentheywere125daysembryofacingtheBVDV(Kampa,2008).ItisdifficulttopreventandcontrolBVDdiseaseeffectively.ThereforetheoutbreakofBVDdiseasecanhappenrapidlyandwidely.
The antibody prevalence was not so different between farms with and without abortions (71.43% vs. 64.44%).So, BVDV antibodymight not influence on abortion. It is generallyconsideredthatserologicallypositive;nonviremiccattleare‘safe’,providingthattheyarenotpregnant(Drew,2008).
FromTable2,accordingtopositiveantibodyprevalenceofcows,heifersandyoungcalves(20.79%,10.88%and10.36%)comparedtothestudyofAjariyakhajornetal.(2000)inmilkingcows,drycows,heifersandcalves(66.1%,82.4%,54.2%and43.3%,respectively).Thepositiveantibodyprevalencewasthesamesequencebyadultcattlehadhighestantibodyprevalence,thenheifersandcalves.Transmissionismostefficientbydirectcontact.However,as infectionshavebeenobserved inclosed,non-pasturingherds,othertransmissionroutesseemlikelytohavesomepracticalimportance,DifferencesinBVDVprevalenceamongregionsorintroductionofvirusinherdspreviouslyfreeofBVDVareoftenassociatedwithparticularepidemiologicaldeterminantssuchascattlepopulationdensity,animaltradeandpasturingprac-tices(Houe,2003).
Inthisstudy,thetotalprevalenceofantigendetectionfiguresfromfarmsandcattlewere4.5%and0.1%respectively(Table3).Thestatusofantigenpositivecattlewasacute infectiousorPIcattle.PIcattlearethemainsourcefortransmissionofthevirus.However,acutelyinfectedcattleaswellasotherruminants,eitheracutelyorpersistentlyinfected,maytransmitthevirus(Houe,2003).Ingenerally,therewere1-2%PIcattlewithinthecattlepopulationandsuchanimalshadnoorlowantibodiestoBVDV(Drew,2008).Groom(2005)reportedthathighBVDVtiterinnon-vaccinatedcalves6-12monthofagehadbeenshowedtobeareliable
23
Journal of Biotechnology in Livestock Production
indicatorthatcattlepersistentlyinfectedwithBVDVwerepresentintheherd.SinceBVDVantigenwasfoundinonlyfarmsthathadabortion(6.45%)butnotinthefarmswithoutabortion.ItmightbeconcludedthatBVDVisoneofthecausesofabortionsonthosefarms.
Fromtable4,therewasnopositiveantigendetectioninyoungcalves, inconsistentwithpositiveantibodyintable2.Itmightbeduetothelastlongingofmaternalantibodyincolostrumswhichcouldbelastedfor13monthsforBVD(Virakuletal.,1997).Coriaand McClurkin(1978)studiedthedurationofactiveandcolostrum-derivedpassiveantibodiestobovineviraldiarrheavirusin14calves.FivecalvesbornwithactivelyinducedantibodiestoBVDVretainedhightitersduringtheyearofobservation.Colostrum-derivedantibodiestoBVDVinninecalvesdeclinedatanexpectedrateforthefirstfourtosixmonthsofage.However,titersofsixof thesecalves increasedatfive toeightmonthsofageandeither remained constantorincreasedthroughoneyearofage.
Fromtable5,mostofthefarms(3outof4)hadhighprevalenceofBVDVantibodies(83.9%,97.6%and97.1%),butonlyfarm4thatlocatedinLR2ndhadlowprevalence(8.3%).Itmightbeduetothefirstinfectioninthefarm,theimmunityinthecowcoulddevelopatthethirdweekafterinfection,stablein10th-13thweekthenalittledeclineandstillinlonglife(Kampa,2008).The12-yearoldcowwithpositiveantibodyandantigenandhistoryofrepeatbreedwasstillpregnancyat3.5months(Farm1),accordingtoDrew(2008)reportedthatthedamwouldoftenhavehighantibodytitres(›1/2000)toBVDV,whichwassuggestionoffetalinfectionandwasprobablyduetothefetusprovidingthedamanextendedchallengeofvirus.Theproblemmightoccurwhentheantigenpositivepregnantcowinfarm1mightserveasreservoiranimalthathadapotentialtotransferringBVDVtoherfetusorothercattleonfarm(MoenningandLiess,1995).Mostofthe6-12monthcattle(farm1,2and3)hadhighprevalenceofantibodyagainstBVDV(100%,75%and100%,respective).Thehighantibodyinnonvaccinatedyoungcalvesagedat6-12monthsindicatedviruspersistencyinherds(Groom,2005).
Basedontheresultsobtainedfromthisstudy,antibodiesprevalencecanbefoundincattle,etherinfarmswithorwithoutabortions.However,antigenprevalencewasneitherfoundinfarmswithoutabortionnorincalves.AccordingtothereportsofAiumlamaietal.(1992),Virakuletal.(1997),Kampaetal.(2004)antibodiesprevalencecanbefoundingenerallyandshouldbetestedforPIcattle.WhenBVDVstillcirculatesinthoseareas,itmaycauselossesinThaidairyproductioninthefuture(Kampaetal.,2011).
TogetridofPIbyapropercountry-controlplan,DepartmentofLivestockDevelopmentshouldeducatethedairyfarmers,dairycooperativesandthegovernmentofficersinordertocorporateandinvestigatetheinfectedfarmsandcattle.
24
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
References Aiumlamai,S.,Alenius,S.andNithichai,K.1992.Prevalenceofantibodiestovarious bovine viruses in bulk tank samples from dairy herds in theMuaglek area. ThaiJVetMed.22:113-120.
Ajariyakhajorn,K.,Boonserm,T.,Inchaisri,C.,Oraveerakul,K.andManeechaiwongse, K.2000.Epidemiologyofbovineviraldiarrheavirus(BVDV)infectioninbulktank milkantibodypositivedairyherds.pp.75-82I.Proceedingsofthe26thVeterinary Medicine and Livestock Development Annual Conference; Miracle Grand Convention,Bangkok,Thailand.
Becher,P.,Thiel,H.J.,Collins,M.,Browlie,J.andOrlich,M.2002.Cellularsequences pestivirusgenomesencodinggamma-aminobutyricacid(A)receptor-associated proteinandGolgi-assosiatedATPaseenhancerof16kilodaltons.J.Virol.76:13069- 13076.
Brock,K.V.1995.Diagnosisofbovineviraldiarrheainfections.Vet.Clin.NorthAm. 11:549-561.
Coria,M.F. and McClurkin,A.W. 1978.Duration of active and colostrum-derived passiveantibodiestobovineviraldiarrheavirusincalves.CanJCompMed. 42(2):239–243.
DepartmentofLivestockDevelopment(DLD),2012.Availablesource:http://dld.go.th/ ict/th/images/stories/stat_web/yearly/2554/gis54/dairy_den54.pdf. Access:September17,2012.
Drew,T.2008.Bovineviraldiarrhea.Availablesource:http://www.oie.int.Access: September17,2012.
Dubovi,E.J.1990.TheDiagnosisofbovineviraldiarrheainfection.Vet.Med.85:1133-1139. Grooms,D.L.2005.DiagnosisofBovineViralDiarrheaVirus:Akeycomponentofa comprehensive BVDV control program. Available source:http://ars.usda.gov/ SP2UserFiles/Place /36253000 /BVD2005/ Produce 2_Grooms_Hout.pdf. Access:September11,2012.
Houe,H.2003.Epidemiological featuresandeconomical importanceofbovinevirus diarrheavirus(BVDV)infections.Vet.Microbiol.93:275-276.
Kampa,J.2004.BVDVandBHV-1InfectionsinDairyHerdsinNorthernandNorth EasternThailand.Actavet.Scand.45:181-192.
Kampa,J.2008.BovineViralDiarrhoea.KKU.Vet.J.18(1):54-67.
25
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Kampa,J.,Sigh-na,U.,Kanistanon,K.andAiumlamai,S.2011.Reproductivelossdue to Pestivirus infection in dairy cattle herds in Thailand. Thai J. Vet. Med. 41(4):409-415
Moennig,V.andLiess,B.1995.Pathogenesisofintrauterineinfectionwithbovine viraldiarrheavirus.VeterinaryClinicsofNorthAmerica:foodanimalpractice. 11:477-487.
Virakul,P.,Suadsong,S.,Suwimonteerabutr,J.andSinglor,J. 1997.Prevalenceof infectiousbovinerhinotracheitis(IBR),bovineviraldiarrhea(BVD),parainfluenza –3(PI3)andbovinerespiratorysyncytial(BRS)virusesinThaidairyfarms. ThaiJ.Vet.Med.27(3):295-313.
26
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
No.farms
BVDpositive(farms)
Prevalence(%)
No.cattle(heads)
BVDpositive(heads)
Prevalence(%)
No.farmsprevalenceofabortion
BVDpositiveinfarms(prevalenceofabortion).
Prevalence(%)infarms(prevalenceofabortion).
No.farmsnoprevalenceofabortion
BVDpositiveinfarms(noprevalenceofabortion).
Prevalence(%)infarm(noprevalenceofabortion).
cows heifers Youngcalves
LR No. positive prevalence No. positive prevalence No. positive prevalence
(head) (head) (%) (head) (head) (%) (head) (head) (%)
LR1st 453 88 19.4 110 10 9.1 132 6 4.5
LR2nd 652 19 1.4 113 4 3.5 109 2 1.8
LR3rd 495 121 24.4 140 13 9.3 163 26 16.0
LR7th 724 255 35.2 152 29 19.1 137 22 16.1
Total 2,324 483 20.79 515 56 10.88 541 56 10.36
theLivestockRegion(LR)
LR1st
24
15
62.5
695
104
14.97
10
6
60.0
14
9
64.29
LR2nd
28
15
53.6
874
25
2.86
15
8
53.33
13
7
53.85
LR3rd
25
18
72.0
798
160
20.05
13
10
76.92
12
8
66.67
LR7th
31
26
83.9
1,013
306
30.21
25
21
84.00
6
5
83.33
Total
108
74
68.5
3,380
595
17.60
63
45
71.43
45
29
64.44
Table 1 TheprevalenceofBVDVantibodydetectedbyandPrioCHECK®Abin3,380cattlefrom
108farmsselectedoutoftheLivestockRegion(LR)1st,2nd,3rdand7th
Table 2 TheprevalenceofAntibodyagainstBVDVinserumofcows,heifersandyoungcalves
selectedoutoftheLivestockRegion1st,2nd,3rdand7thdetectedbyELISAPrioCHECK®BVDV
Ab
27
Journal of Biotechnology in Livestock Production
No.farms
BVDpositive(farms)
Prevalence(%)
No.cattle(heads)
BVDpositive(heads)
Prevalence(%)
No.farmsprevalenceofabortion
BVDpositiveinfarms(prevalenceofabortion).
Prevalence(%)infarms(prevalenceofabortion).
No.farmsnoprevalenceofabortion
Prevalenceinfarms(noprevalenceofabortion).
BVDpositive(%)infarm(noprevalenceofabortion).
cows heifers Youngcalves
LR No. positive prevalence No. positive prevalence No. positive prevalence
(head) (head) (%) (head) (head) (%) (head) (head) (%)
LR1st 379 0 0 82 0 0 120 0 0
LR2nd 429 1 0.2 82 0 0 86 0 0
LR3rd 378 0 0 96 1 1 115 0 0
LR7th 663 1 129 1 0.8 120 0 0
Total 1,849 2 0.11 389 2 0.52 441 0 0
theLivestockRegion(LR)
LR1st
20
0
0
581
0
0
10
0
0
10
0
0
LR2nd
22
1
4.5
597
1
0.2
15
1
6.67
7
0
0
LR3rd
18
1
5.6
589
1
0.2
13
1
8.33
5
0
0
LR7th
29
2
6.9
912
2
0.2
25
0
8.00
4
0
0
Total
89
4
4.5
2,679
4
0.1
6326
6.45
26
0
0
Table 3 TheprevalenceofBVDVantigendetectedbyPrioCHECK®AgPIfocus fromearnotch
samplesselectedoutoftheLivestockRegion(LR)1st,2nd,3rdand7th
Table 4 The prelalence of BVDV antigen from ear notch samples of cows, heifers and
youngcalvesselectedout of theLivestockRegion 1st, 2nd, 3rd and7th detectedbyELISA
PrioCHECK®AgPIfocus
28
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Table 5 StatusoffarmsandcattlewithpositiveantibodydetectedbyPrioCHECK®BVDVAb
andpositiveantigenbyPrioCHECK®BVDVAgPIfocus
Farm1inLR7
Farm2inLR7
Farm3inLR3
Farm4inLR2
Farm
47/56(83.9%)*
40/41(97.6%)*
34/35(97.1%)*
3/36(8.3%)*
Positiveantibody
prevalenceinadult
cattle
11 112yearsoldcowwith3.5
monthpregnancy,repeat
breederandpositiveantibody
detection
12 22.5years,positiveantigen
butnegativeantibodyheifer.
13 33years,positiveantigen
butnegativeantibodyheifer.
14 48yearsoldscow,repeat
breeder,postantigenbut
negativeantibody.
Nopositive
antigencattle
1/1(100%)*
3/4(75%)*
5/5(100%)*
0/0(0%)
Positiveantibody
prevalencein
6-12mo.cattle
*No.ofpositive/Totalno.inthefarm(%)
29
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อเปรียบเทียบขนาดฮอร์ โมน เอฟ เอส เอช (FSH; Follicle
stimulatinghormone)2ระดับคือ150และ200มิลลิกรัมในการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมือง
อสีานโคให้ตวัออ่นเปน็โคพืน้เมอืงอสีานที่มีสขุภาพแขง็แรงสมบรูณ์และมีวงจรการเปน็สดัปกติอายุประมาณ
3-5 ปี นํ้าหนักระหว่าง 250-350 กิโลกรัม ทำการเหนี่ยวนำการเป็นสัดด้วยฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรน
ชนิดสอดในช่องคลอด (CIDR-B®) และกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ โดยใช้ฮอร์ โมน FSH (Folltropin-V®,
Australia) แบ่งกลุ่มแม่โคแบบสุ่มเป็น2กลุ่มๆละ5ตัว วางแผนการทดลองแบบcrossover design
ทำซ้ำ 4 ครั้ง โคกลุ่มที่หนึ่ง ใช้ฮอร์ โมน FSH ขนาด 150 มิลลิกรัม ต่อตัว และกลุ่มที่สอง ใช้ฮอร์ โมน
FSHขนาด200มิลลิกรัมต่อตัวโดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นห่างกัน12ชั่วโมงและฉีดติดต่อกันแบบ
ลดขนาดลงทุกวันเป็นเวลา3วันร่วมกับการฉีดพรอสต้าแกรนดิน (Estrumate,NewZealand)ขนาด
500 ไมโครกรัม เข้ากล้ามเนื้อบันทึกเวลาและอาการเป็นสัดหลังจากนั้นผสมเทียมในแม่โคตัวให้พร้อมกับ
ฉีดฮอร์ โมน gonadotrophic releasing hormone (Receptal®, Germany) ขนาด 100 ไมโครกรัม
เข้ากล้ามเนื้อผลการทดลองในกลุ่มที่ 1ได้อัตราการเก็บตัวอ่อนได้80%(76/95)เป็นตัวอ่อนที่มีคุณภาพ
ย้ายฝากได้(เกรดA,B,C)จำนวน35ตัวอ่อนเฉลี่ย(mean±SE)2.00±1.6ตัวอ่อน/ตัวแม่โคในกลุ่ม
ที่2ได้ตัวอ่อนที่มีคุณภาพย้ายฝากได้(เกรดA,B,C)จำนวน26ตัวอ่อนเฉลี่ย1.53±1.48ตัวอ่อน/ตัว
อัตราการเก็บตัวอ่อนได้66.31%(63/95)ขนาดฮอร์ โมนFSH150และ200มิลลิกรัมให้จำนวนCL
เฉลี่ย(mean±SE)ต่อตัว(5.94±2.14และ5.6±1.00)และจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ไม่แตกต่างกันอย่าง
มีนัยสำคัญทางสถิติ (P>0.05) จำนวนตัวอ่อนเกรด A, B, C และ D+UFO ไม่มีความแตกต่างอย่างมี
นัยสำคัญระหว่างกลุ่มที่ 1 และ2คือ เกรดA= 1.29±1.08และ 1.0±0.47, เกรดB=0.53±0.44
และ0.13±0.07,เกรดC=0.24±0.22และ0.18±0.16,D+UFO=1.88±1.25และ1.76±1.57ตามลำดับ
(P>0.05)ผลการศึกษานี้แสดงว่าขนาดฮอร์ โมนFSH150มิลลิกรัมหรือ200มิลลิกรัมให้ผลไม่แตกต่าง
กันอย่างมีนัยสำคัญต่อการตอบสนองต่อฮอร์ โมนสำหรับกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน
คำสำคัญ:โคพื้นเมืองอีสานฮอร์ โมนเอฟเอสเอชการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่
ณรงค์กร เกษมสุข1 อนนท์ เทืองสันเทียะ2 ณรงค์ เลี้ยงเจริญ2 บรรลือ กล่ำพูล2 และมาลี อภิเมธีธำรง3
1 ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพอุบลราชธานี2 ศูนย์พัฒนาเทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อน จ.นครราชสีมา
3 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์กรมปศุสัตว์
ผลของระดับฮอร์โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองสายอีสาน
30
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Abstract Theobjectiveofthisstudywastocomparetheefficacyofdifferentfolliclestimulating
hormone (FSH)doses;150and200mg.onsuperovulatory response innorth-easternThai
native cattle (Bos indicus). Cyclic donor cows (n = 10) were assigned randomly into 2
treatmentgroups(n=5ineachgroup)withacrossoverdesign,4replications.Theywere3-5
yearsofageandliveweight250-350kg.Estroussynchronizationwasdoneinalldonorswith
CIDR-B®andProstaglandinF2α.ThentheywereinjectedwithFolltropin®-V(FSH)twicedaily
for3daysindecreasingdosesaccordingtoitsdoseassignment,150(Group1)or200mg.
(Group2).OnthelastdayofFSHinjection,PGF2αwasgivenandCIDR-B®wasremoved.
Onstandingheat,cowswereartificialinseminated(AI)withsamefrozensemenbatchofa
north-easternThainativebullandinjectedi.m.with100µggonadotrophicreleasinghormone
(Receptal®, Germany). Numbers of corpora lutea were determined by rectal palpation and
embryoswerecollectedonday7afterAI.DatawereanalyzedbyStudent,sttest.InGroup1,
atotalof35transferableembryos(A,B,Cgrades=2.00±1.6,mean±SE)werecollected,
forarecoveryrateof80%(76/95).InGroup2,atotalof26transferableembryos(1.53±1.48,
mean±SE)werecollected,forarecoveryrateof66.31%(63/95).Nosignificantdifferencein
thenumbersofCLandtransferableembryos(mean±SE)werefoundbetweenGroup1and
Group2(5.94±2.14and5.6±1.0;2.00±1.6and1.53±1.48,respectively,P>0.05).Therewere
alsonosignificantdifferencesinthenumbersofembryogradeA,B,C,andD+UFObetween
twotreatmentgroups(Agrade=1.29±1.08and1.0±0.47,Bgrade=0.53±0.44and0.13±0.07,
Cgrade=0.24±0.22and0.18±0.16,andD+UFO=1.88±1.25and1.76±1.57,forGroup1and
2,respectively,P>0.05).Thisstudydemonstratedthat150or200mgofFSHdidnotgive
differentresultsonsuperovulatoryresponseinnorth-easternThainativecattle.
Keywords:north-easternThainativecows,FSH,superovulation
Effect of FSH Dosages on SuperovulatoryResponseinNorth-EasternThaiNativeCows
Narongkorn Kasemsuk1 Anone Thuangsanthia2 Narong Liengchareon2 Bunleu Glamphu2 and Malee Apimeteetumrong3
1Ubonratchathani Artificial Insemination and Biotechnology Research Center2Embryo Transfer Technology Research Center
3Bureau of biotechnology in Livestock Production
31
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทนำ โคพื้นเมืองของเมืองไทย จัดเป็นโคกลุ่ม Bos indicus เป็นโคที่เลี้ยงง่าย ใช้งานได้ดี ทนต่อโรค
แมลง อากาศร้อน มีความสมบูรณ์พันธุ์สูง เป็นสัดเร็ว ผสมติดง่าย และให้ลูกอย่างสม่ำเสมอตลอดทั้งปี
ทั้งที่ ไม่ได้รับอาหารที่สมบูรณ์นัก ปัญหาและอุปสรรคในการเลี้ยงโคพื้นเมือง ได้แก่ มีพื้นที่เลี้ยงน้อยลง
ขาดการปรับปรุงพันธุ์ จำนวนประชากรโคลดลง มีการเลี้ยงตัวผู้และตัวเมียรวมกัน ความหลากหลาย
สายพันธุ์ลดลง ทำให้เกิดสายเลือดชิด ลูกเกิดมาแคระแกรนไม่แข็งแรง อีกทั้งผู้เลี้ยงไม่ค่อยเลี้ยงดูและ
เอาใจใส่เกี่ยวกับสุขภาพเท่าที่ควร นอกจากนี้ โคพื้นเมืองมักถูกนำไปผสมกับโคสายพันธุ์ต่างประเทศอื่นๆ
ทั้งพันธุ์เนื้อและนม เพื่อใช้ ในการปรับปรุงพันธุ์ โดยอาศัยข้อดีของโคพื้นเมือง ทำให้โคพื้นเมืองสายพันธุ์
ไทยแท้ๆกลายเป็นโคลูกผสมไปเป็นจำนวนมากและเมื่อผสมกับโคสายพันธุ์อื่นไปหลายๆรุ่นผลที่ตามมาคือ
ระดบัสายเลอืดของโคพืน้เมอืงไทยจะลดนอ้ยลงเรือ่ยๆและในอนาคตอาจหาโคพืน้เมอืงพนัธุ์แท้ของไทยไม่ได้
หากไม่มีการดำเนินงานด้านการอนุรักษ์สายพันธุ์อย่างจริงจังการพัฒนาโคพันธุ์ ใหม่ที่ต้องอาศัยพันธุ์พื้นฐาน
จากพันธุ์พื้นเมืองก็จะกระทำได้อย่างลำบาก
การอนุรักษ์พันธุกรรมสัตว์ สามารถดำเนินการได้สองแนวทางคือ การอนุรักษ์ ในสภาพธรรมชาติ
และนอกสภาพธรรมชาติการอนุรักษ์ ในสภาพธรรมชาติหมายถึงการเลี้ยงดูที่มีการจัดการฝูงการจัดแผน
ผสมพันธุ์เพื่อให้ดำรงสายพันธุ์และรักษาระยะห่างทางพันธุกรรม ซึ่งมีหน่วยงานของกรมปศุสัตว์ดำเนินการ
อยู่ส่วนการอนุรักษ์นอกสภาพธรรมชาติหมายถึงการเลี้ยงดูในสวนสัตว์การเก็บรักษาพันธุกรรมในรูปของ
เซลล์สืบพันธุ์และตัวอ่อนโดยเก็บในสภาพแช่แข็งสามารถนำไปผสมเทียมหรือฝากตัวอ่อนเพื่อให้มีลูกเกิดได้
ในอนาคตทั้งนี้พบว่าอัตราการตั้งท้องจากการผสมเทียมและย้ายฝากตัวอ่อนไม่แตกต่างกันเมื่อตรวจณวัน
ที่28หลังการเป็นสัด(Demetrio,2007)ปกติโคพื้นเมืองของไทยจะถูกเลี้ยงอยู่กระจายทั่วประเทศมีหลาย
ชื่อเรียกมักเรียกชื่อตามถิ่นที่อยู่เช่นโคขาวลำพูนโคพื้นเมืองสายอีสานโคพื้นเมืองภาคใต้โดยจะมีลักษณะ
ปรากฏตา่งกนักรมปศสุตัว์โดยสำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์ได้เริม่ศกึษาการอนรุกัษ์ โคพืน้เมอืง
ภาคใต้และโคขาวลำพนูโดยเทคโนโลยีการยา้ยฝากตวัออ่น(อนนท์และคณะ,2547;ณรงค์และคณะ,2550)
พบว่าโคทั้งสองสายพันธุ์มีการตอบสนองต่อฮอร์ โมนกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ไม่เท่ากันแม้ว่าจะใช้ขนาดฮอร์ โมน
เท่ากัน(150-200มิลลิกรัมFolltropin-V®,BionicheAnimalHealth(A/Asia)Pty.Ltd.,Australia)
การใช้ขนาดฮอร์ โมนสูงเกินไป (260 มิลลิกรัม) ทำให้เกิดการตอบสนองมากเกินไป (overstimulation)
มีไข่ไม่ได้รับการผสมจำนวนมากและได้ตัวอ่อนน้อยมีรายงานว่าBosindicusมีการตอบสนองต่อฮอร์ โมน
FSH มากกว่า Bos Taurus และสามารถใช้ฮอร์ โมนในขนาดที่น้อยกว่าที่ ใช้ ใน Bos Taurus 25-30%
(Lewis,1992)วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้เพื่อเปรียบเทียบขนาดของฮอร์ โมนFSH2ระดับคือ
200และ150มิลลิกรัมในการกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ในโคพื้นเมืองอีสาน
32
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
อุปกรณ์และวิธีการ 1. คดัเลอืกแม่โคพืน้เมอืงอสีานที่เปน็ตวัให้ตวัออ่น(Donor)จำนวน10ตวัมีสขุภาพแขง็แรงสมบรูณ์
และมีวงจรการเป็นสัดปกติอายุประมาณ3–5ปีมีน้ำหนักระหว่าง250–350กิโลกรัม
2.แม่โคพื้นเมืองสายอีสานทุกตัว จะได้รับการเหนี่ยวนำการเป็นสัดด้วยฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์
โรนชนิดสอดในช่องคลอด (CIDR-B®, InterAg,NewZealand) และกระตุ้นเพิ่มการตกไข่โดยใช้ฮอร์ โมน
FSH (Folltropin-V®,BionicheAnimal Health (A/Asia) Pty. Ltd.,Australia) โดยแบ่งกลุ่มแม่โค
พืน้เมอืงภาคตะวนัออกเฉยีงเหนอืแบบสุม่เปน็2กลุม่ๆละ5ตวัวางแผนการทดลองแบบcrossoverdesign
ทำซ้ำ4ครั้งกลุ่มที่หนึ่งใช้ฮอร์ โมนFSHขนาด150มิลลิกรัมต่อตัวและอีกกลุ่มหนึ่งใช้ฮอร์ โมนFSH
ขนาด200มิลลิกรัมต่อตัวซึ่งจะเริ่มฉีดในวันที่9หลังใส่ฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรนชนิดสอดในช่องคลอด
โดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นห่างกัน12ชั่วโมงและฉีดติดต่อกันแบบลดขนาดลงทุกวันเป็นเวลา3วัน
3.ในวันที่ 3 ของการฉีดฮอร์ โมนกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ ฉีดสารพรอสต้าแกรนดิน (Estrumate®,
Cloprostenol,Schering-PloughAnimalHealth,NSW,Australia) ขนาด2ml. (500 ไมโครกรัม)
เข้ากล้ามเนื้อเช้า-เย็นร่วมกับการถอดฮอร์ โมนโปรเจสเตอร์ โรน
4.บันทึกเวลาและอาการเป็นสัด หลังจากนั้นผสมเทียมในแม่โคตัวให้ จำนวน 4 ครั้ง ห่างกัน
12ชั่วโมงโดยใช้น้ำเชื้อแช่แข็งของพ่อพันธุ์ โคพื้นเมืองที่ผ่านการทดสอบคุณภาพหลังการละลายแล้วพร้อม
กับฉีดฮอร์ โมนgonadotrophicreleasinghormone(Receptal®,IntervetInternationalB.V.,Holland)
ขนาด100ไมโครกรัมเข้ากล้ามเนื้อให้กับแม่โคตัวให้หลังจากผสมเทียมครั้งแรก
5.ในวนัที่7หลงัอาการสดัลว้งตรวจและบนัทกึการตอบสนองตอ่การกระตุ้นการตกไข่โดยการนบั
จำนวนคอร์ปัสลูเทียม (Corpus lutium : CL) บนรังไข่ทั้ง 2 ข้าง จากนั้นทำการเก็บตัวอ่อนจากแม่โค
ตัวให้ โดยใช้น้ำยาชะล้างตัวอ่อน (Emcare®, Har-vet, New Zealand) ชะล้างตัวอ่อนออกจากปีกมดลูก
ทั้ง 2 ข้าง ด้วยน้ำยาข้างละ 500 ml. โดยใช้ชุดสายยางสำหรับชะล้างตัวอ่อน (flushing set) ต่อกับ
ท่อสวนตามวิธีของSaito(1994)และปล่อยน้ำยาไหลผ่านถ้วยกรองตัวอ่อน
6.นำถ้วยกรองตัวอ่อนไปตรวจหาตัวอ่อน และประเมินคุณภาพตัวอ่อนภายใต้กล้องจุลทรรศน์
สเตอริโอ บันทึกจำนวน และคุณภาพตัวอ่อนที่เก็บได้ โดยการประเมินคุณภาพตัวอ่อนที่เก็บได้ ตามวิธีของ
LinderและWright(1983)ตามรายละเอียดดังนี้
เกรด A ตัวอ่อนคุณภาพดีมาก มีพัฒนาการปกติ ลักษณะของเซลล์ตัวอ่อนหรือบลาสโตเมียร์
ต้องเป็นทรงกลมเกาะกันแน่นไม่มีเซลล์แตก
เกรด B ตัวอ่อนคุณภาพดี มีพัฒนาการปกติ ลักษณะของตัวอ่อนเป็นทรงกลม มีบางเซลล์
แยกออกจากเซลล์กลุ่มใหญ่10-20%ของเซลล์ทั้งหมด
เกรด C เป็นตัวอ่อนคุณภาพพอใช้ตัวอ่อนอาจมีรูปร่างเป็นทรงกลม มีการเสื่อมของเซลล์ประมาณ
30-40%
33
Journal of Biotechnology in Livestock Production
เกรดDเป็นตัวอ่อนที่มีการเสื่อมสลายของเซลล์มากมีเซลล์ที่ยังเกาะแน่นต่ำกว่า40%หรือ
เป็นตัวอ่อนที่มีพัฒนาการช้ากว่าปกติและหยุดเจริญหรือไข่ที่ยังไม่ได้รับการผสม(UFO;unfertilizedova)
ตัวอ่อนเกรด A, B และ C เป็นตัวอ่อนคุณภาพที่สามารถนำไปฝากให้ตัวรับได้ (Transferable
embryo)และตัวอ่อนเกรดAและBเป็นตัวอ่อนที่นำไปแช่แข็งได้
7. รวบรวมผลการดำเนินการและนำข้อมูลไปวิเคราะห์ผลโดยใช้Student’sttest
ผลการทดลอง ตารางที่ 1 (Table 1) แสดงจำนวนCLที่ตรวจพบบนรังไข่ จำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีย้ายฝากได้
จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ทั้งหมดตารางที่2เปรียบเทียบจำนวนCLที่ตรวจพบจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้เกรด
ต่างๆกันจำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีที่ย้ายฝากได้ต่อตัว/ครั้ง
a = ตัวเลขที่มีตัวอักษรกำกับเหมือนกันในคอลัมน์เดียวกันคือไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่
ระดับความเชื่อมั่น95%
Dataareshownasmean±SE.
UFO:unfertilizedova
Transferableembryos:ตัวอ่อนเกรดA,BและC
ผลการทดลอง ไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P>0.05) ของ จำนวน CL ที่ตรวจพบ
จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้จำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้เกรดA,B,C,D-UFOและตัวอ่อนที่คุณภาพที่ย้ายฝากได้
(Transferableembryos,A+B+Cgrades)
FSHLevel No. No. No.recoveredova/embryo %Recoveryrate
session (range) (range)
150mg 16 95(3-17) 76(0-11) 80.0%(76/95)
200mg 17 95(3-17) 63(0-13) 66.3%(63/95)
FSHmg CL A B C D+UFO transferable
(n) embryos
150(n=16) 5.94±2.14a 1.29±1.08a 0.53±0.44a 0.24±0.22a 1.88±1.25a 2.00±1.6a
200(n=17) 5.6±1.00a 1.0±0.74a 0.13±0.07a 0.18±0.16a 1.76±1.57a 1.53±1.48a
Table 1 EffectsofFSHonCLandembryonumbers
Table 2 Effects of FSH on CL number and embryo quality
34
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
วิจารณ์ จากการศึกษาครั้งนี้ พบว่าจำนวน CL ที่ตรวจพบไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (P>0.05)
ในโคพื้นเมืองอีสานที่ ได้รับฮอร์ โมน FSH ขนาด 150 หรือ 200 มิลลิกรัม ตัวอ่อนคุณภาพที่ย้ายฝากได้
(Transferableembryos,จำนวนรวมตัวอ่อนเกรดA,BและC)จากทั้ง2กลุ่ม (Table2)ก็ให้ผลไม่
แตกต่างกันทางสถิติ(เฉลี่ย2.00±1.60และ1.53±1.48ตัวอ่อน)ที่ระดับความเชื่อมั่น95%(P<0.05)
อยา่งไรกต็ามมีแนวโนม้ที่การใช้FSHขนาด150มลิลกิรมัจะได้จำนวนตวัออ่นคณุภาพที่ยา้ยฝากได้มากกวา่
การใช้FSH200มลิลกิรมัซึง่อาจเกดิจากการที่ โคพืน้เมอืงอสีานมีนำ้หนกัตวันอ้ยการใช้FSHปรมิาณเทา่กบั
โคสายพันธุ์อื่นอาจจะกระตุ้นรังไข่มากเกินไป เช่นเดียวกับรายงานของ Barati et al. (2006) รายงานว่า
FSHขนาด250มิลลิกรัมทำให้รังไข่ได้รับการกระตุ้นมากเกินไปและมีจำนวนฟอลลิเคิลที่ ไม่มีการตกไข่
จำนวนมากและรายงานของBarrosetal.(2003)ที่พบว่าขนาดฮอร์ โมนFSH200มิลลิกรัมมีแนวโน้ม
ให้ผลจำนวนตัวอ่อนคุณภาพดีมากกว่าขนาด 120 มิลลิกรัม แต่เมื่อทดลองใช้ขนาด 250 มิลลิกรัม
พบว่าทำให้มีการตอบสนองมากเกินไป (overstimulation) จากจำนวนตัวอ่อนที่เก็บได้ซึ่งแยกตามคุณภาพ
ของตัวอ่อนคือเกรดA,B,C,D+UFOและTransferableแสดงในตารางที่2ซึ่งจะเห็นว่าจำนวนตัว
อ่อนในกลุ่มคุณภาพA,B,CและD+UFOไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มที่1และ2
คือเกรดA=1.29±1.08และ1.0±0.47,เกรดB=0.53±0.44และ0.13±0.07,เกรดC=0.24±0.22
และ0.18±0.16,D+UFO=1.88±1.25และ1.76±1.57ตามลำดับ(P>0.05)
พบว่าจำนวนCLที่ตรวจพบทั้งจากการใช้FSHขนาด150และ200มิลลิกรัม(5.94±2.14
และ5.6±1.00)ต่ำกว่าในรายงานของโคขาวลำพูน(ณรงค์และคณะ,2549)และแตกต่างกันกับรายงาน
การใช้ ในโคพืน้เมอืงภาคใต้(ชาญยทุธและคณะ,2551)โดยใช้ขนาดฮอร์ โมนเทา่กนัจงึเปน็ไปได้วา่รงัไข่ของ
โคพื้นเมืองอีสานอาจจะมีการตอบสนองต่อฮอร์ โมน FSH ต่างจากโคขาวลำพูนและโคพื้นเมืองภาคใต้หรือ
อาจมาจากปัจจัยด้านอื่นเช่นน้ำหนักตัวหรือสภาพแวดล้อม และเมื่อเปรียบเทียบกับโคสายพันธุ์ยุโรปตาม
รายงานของ Hasler (1992) ที่ว่าโคในกลุ่ม Bos indicus ให้การตอบสนองมากกว่า Bos taurus เมื่อ
เหนี่ยวนำการตกไข่โดยใช้FSHในปริมาณเท่ากันทั้งได้ด้านปริมาณตัวอ่อนและคุณภาพตัวอ่อน
พิจารณาจากอัตราการเก็บตัวอ่อนได้(Recoveryrate,Table1)ทั้งสองกลุ่มคือFSH150และ
200มิลลิกรัมคือ80%(76/95)และ66.3%(63/95)ใกล้เคียงกับรายงานในโคพื้นเมืองSistanicattle
(Bosindicus)ของอิหร่าน(Baratietal.,2006)ที่ ได้อัตราการเก็บเฉลี่ย61-84%เมื่อให้ฮอร์ โมนFSH
ขนาด160-200มิลลิกรัมในขณะที่มีตัวอ่อนคุณภาพที่นำไปย้ายฝากได้(รวมเกรดA,B,C)จำนวน35
และ26ตัวอ่อน(Table1)นับว่าได้น้อยกว่า50%เมื่อเทียบกับจำนวนไข่และตัวอ่อนที่เก็บได้ทั้งหมดคือ76
และ63ใบ/ตัวอ่อน(FSH150มิลลิกรัมได้46.1%,35/76และFSH200มิลลิกรัมได้41.3%,26/63)
ทั้งนี้อาจมีสาเหตุจากคุณภาพของน้ำเชื้อแช่แข็งมีความแปรปรวนมาก การทดลองครั้งนี้ ใช้น้ำเชื้อโคพื้นเมือง
อสีาน100%ซึง่รดีเกบ็มาแลว้นานกวา่สบิปีและมีประวตักิารเปลีย่นสถานที่จดัเกบ็บอ่ยครัง้จากการสุม่ตรวจ
พบอัตราการเคลื่อนที่(motility)15-35%ในชุดการผลิตเดียวกันเพื่อป้องกันความผิดพลาดจากคุณภาพ
35
Journal of Biotechnology in Livestock Production
น้ำเชื้อจึงได้ทำการผสมเทียมให้กับแม่โค 4 ครั้งๆ ละ 2 โด๊ส พร้อมกับสุ่มตรวจคุณภาพน้ำเชื้อก่อนการ
ผสมเทยีมดว้ยในปจัจบุนัมีนำ้เชือ้โคพืน้เมอืงอสีานเหลอือยู่นอ้ยแลว้ดงันัน้หากจะมีการดำเนนิงานยา้ยฝากตวั
อ่อนในโคพื้นเมืองอีสานต่อไปในอนาคต ควรมีการรีดเก็บน้ำเชื้อจากโคพื้นเมืองอีสานเพิ่มเติม เพื่อให้การใช้
ประโยชน์เทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อนมีประสิทธิภาพสูงสุด
จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าขนาดฮอร์ โมนFSH150มิลลิกรัมให้ผลเทียบเท่าและมีแนวโน้มให้ผล
สูงกว่าขนาด 200 มิลลิกรัม แสดงให้เห็นว่า ปริมาณฮอร์ โมนมาก ก็ไม่ได้ส่งผลดีเสมอไป ซึ่งนับว่ามีข้อดี
เนื่องจากสามารถใช้ฮอร์ โมนในขนาดที่น้อยลงแต่ได้ผลเท่าเทียมกันหรือดีกว่าทำให้ประหยัดค่าใช้จ่ายจาก
การใช้ฮอร์ โมนเหนี่ยวนำการตกไข่เป็นผลดีต่องานอนุรักษ์ โคพื้นเมืองอีสานต่อไป
กิตติกรรมประกาศ คณะผู้วิจัยขอขอบคุณ นายสัตวแพทย์อยุทธ์ หรินทรานนท์ ผู้อำนวยการสำนักเทคโนโลยีชีวภาพ
การผลิตปศุสัตว์ที่สนับสนุนการดำเนินงานนายสัตวแพทย์กมลชนกสร้อยเพชรนายสัตวแพทย์ระดับ
ชำนาญการที่ชว่ยวเิคราะห์ขอ้มลูขา้ราชการและพนกังานราชการของศนูยว์จิยัการผสมเทยีมและเทคโนโลยี
ชีวภาพอุบลราชธานี และศูนย์วิจัยเทคโนโลยีย้ายฝากตัวอ่อน ที่ช่วยให้การศึกษาครั้งนี้สำเร็จได้ด้วยดี
งานวิจัยนี้ ได้รับการสนับสนุนจากสำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ(วช.)
เอกสารอ้างอิง ณรงค์เลี้ยงเจริญอนนท์เทืองสันเทียะวิบูลย์เยี่ยงวิศวกูรและมาลีอภิเมธีธำรง2549ผลของ
ขนาดฮอร์ โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่และจำนวนตัวอ่อนในโคขาวลำพูนการประชุม
สัมมนา Enhancement Of Reproductive Efficiency and Production of Livestock in
Thailandในโอกาสครบรอบ50ปีงานผสมเทียมในประเทศไทยวันที่14-16ธันวาคม2549
โรงแรมเชียงใหม่ฮิลล์จ.เชียงใหม่
ชาญยุทธกาพลอนนท์เทืองสันเทียะณรงค์เลี้ยงเจริญและมาลีอภิเมธีธำรง2551ผลของ
ขนาดฮอร์ โมนเอฟเอสเอชต่อการเพิ่มการตกไข่และจำนวนตัวอ่อนในโคพื้นเมืองภาคใต้
อนนท์เทืองสันเทียะวิบูลย์เย่ียงวิศวกูรณรงค์เล้ียงเจริญกีรติธิแจ้บุญชูศรีสุขและจุรีย์รัตน์
สำเร็จประสงค์2547การตอบสนองของโคพันธุ์ขาวลำพูนต่อการกระตุ้นการตกไข่การประชุม
วิชาการสัตวแพทย์และการเลี้ยงสัตว์ ครั้งที่ 30 วันที่ 10-12 พฤศจิกายน 2547
กรุงเทพมหานคร
Barros, C.M., Porto, L.P.C., and Noguera, M.F.G. 2003. Dose-response trial in
BostaurusvsBosindicuscowssuperovulatedwithFSH,assiatedwithcontrolled
LHsurgeandfixedtimeartificialinsemination.Theriogenology59:524(abstr.).
36
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Barati,F.,Niasari_Naslaji,A.,Bolourchi,M.,Sarhaddi,F.,Razavi,K.,Naghzali,E.and
Thatcher,W.W.2006.SuperovulatoryresponseofSistanicattletothreedifferent
dosesofFSHduringwinterandsummer.Theriogenology.66:1149-1155.
Demetrio,D.G.B.,Santos,R.M.Santos,R.M.,Santos,R.M.,Demetrio,C.G.B.and
Vasconcelos,J.L.M.2007.Factorsaffectingconception rates followingartificial
inseminationorembryotransferinlactatingHolsteincows.J.DairySci.90(11):
5073-5082.
Hasler,J.F. 1992.Currentstatusandpotential of embryo transferand reproductive
technologyindairycattle.J.DairySci.75(10):2857-2879.
Lewis,I.1992.Programmingdonorsandrecipients.In:Embryotransferandpregnancy
diagnosis. NSW: Post Graduate Committee in Veterinary Science, University of
Sydney.pp.69-88.
Linder, G.M. and Wright, R.W. 1983. Bovine embryo morphology and evaluation.
Theriogenology.20:407-416.
Saito, N. 1994. Manual of embryo transfer and in vitro fertilization in cattle.
NationalLivestockBreedingCenter,MAFF,Japan,September.pp.132.
37
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทคัดย่อ การเปรียบเทียบผลของการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนที่ระดับความเข้มข้น 5 10 และ15 มิลลิโมล
ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อโคนม Egg Yolk Tris ต่อคุณภาพของอะโครโซม เยื่อหุ้มตัวอสุจิ และอัตราการมี
ชีวิตของตัวอสุจิภายหลังการแช่แข็งด้วยเครื่องflowcytometerและCASA(computerizedautomatic
semen analyzer) วางแผนการทดลองแบบ RCBD โดยรีดเก็บน้ำเชื้อจากโคนมทรอปิคอลโฮลสไตน์
จำนวน 5 ตัวด้วย Artificial vagina สัปดาห์ละครั้งต่อเนื่องกัน 5 สัปดาห์ ในแต่ละสัปดาห์น้ำเชื้อของ
พ่อพันธุ์ โคนมถูกแบ่งออกเป็น 4 ส่วนตามทรีตเมนต์ที่วางแผนทดลอง ได้แก่ กลุ่มควบคุม เสริมซิสเตอีน
ที่ระดับ 5, 10 และ15 มิลลิโมล ผลการศึกษาคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งด้วยเครื่อง CASA พบว่าน้ำเชื้อที่
เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนทั้ง สามระดับมีอัตราการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิร้อยละ 51.62±2.03, 49.12±1.83
และ 47.52±2.43 ตามลำดับ สูงกว่ากลุ่มที่ ไม่เสริมซิสเตอีนอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) ซึ่ง
มีอัตราการเคลื่อนที่ร้อยละ 40.03±1.78 ลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริม
กรดอะมิโนซิสเตอีนคือลักษณะ Beat frequency (BCF), Linearity (LIN) และStraightness (STR)
สูงกว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.01) ลักษณะ
ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และโครโซมของอสุจิภายหลังการแช่แข็งพบว่าแตกต่างกันอย่างไม่มีนัยสำคัญ
ทางสถิติ (P<0.05) ผลจากการศึกษาแสดงว่าการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ
Egg Yolk Tris สามารถเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนม ซึ่งการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีน 5 มิลลิโมล
มีอัตราการเคลื่อนที่สูงที่สุด ส่วนการเสริมกรดอะมิโนซิสเตอีน 10 มิลลิโมลมีลักษณะความสมบูรณ์ของ
เยื่อหุ้มเซลล์และโครโซมสูงที่สุด
คำสำคัญ:พ่อโคนม,EggYolkTris,ซิสเตอีน
สุดา จันทาสี1 และ จตุพร พงษ์เพ็ง1 1 ศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมลำพญากลาง
ผลความเข้มข้นของ Cysteine ในน้ำยาเจือจาง EggYolkTrisต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนม
38
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Abstract ThisstudywasperformedtoevaluatetheeffectofcysteineconcentrationinEggYolk
Trisondairycattlesemenquality.SemenfromfiveTropical–Holsteinbullswerecollectedand
frozenonceaweekforfiveconsecutiveweeks.EachBull´ssemensamplewasaccessed
weeklyfor4treatedgroups:non-cysteinetreated(control)andsupplementtreatedwith5,10
and15mMofcysteine.Percentageofmotilityoffrozen-thawedsemenextenderwithcysteine
treated groups showed highly significant (P<0.05) compared to control group (51.62±2.03,
49.12±1.83,47.52±2.43and40.03±1.78respectively).ForKineticmovementofspermatozoa:
BCFLINandSTR,allcysteinetreatedgroupsshowedhighlysignificant(P<0.01).However
percent of spem membrane and acrosome integrity was not significant different (P>0.05).
TheresultsfromthisstudyindicatedthatcysteinetreatedinEggYolkTrisimprovedafterthaw
motilityofbullspermatozoawhich5mMofcysteineshowedthehighestresponsewhereas
10mMofcysteineshowedthehighestliveacrosomeintact(LAI).
Keywords:dairybull,DFS,EggYolk,Cysteine
Suda Chuntasee1 and Jatuporn Pongpeng1
1 Lamphayaklang Livestock Semen Production Center, Lamsonthi, Lopburi, 15190, Thailand
EffectofCysteineConcentrationsinEggYolkTrisonDairyCattleSemenQuality
39
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทนำ การผสมเทยีมให้เกดิความสำเรจ็นัน้ตอ้งอาศยัปจัจยัหลายประการเชน่การจบัสดัการผสมเทยีมในชว่งเวลาที่เหมาะสมเและคณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็ที่ ใช้ผสมเทยีมเปน็ตน้คณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็มีความสำคญัเนื่องจากมีกระบวนการและขั้นตอนในการผลิตที่ต้องอาศัยเทคนิควิชาการและความชำนาญในการผลิตและควบคุมคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งตั้งแต่ขั้นตอนการรีดเก็บน้ำเชื้อสดจากพ่อโคการตรวจประเมินคุณภาพน้ำเชื้อเบือ้งตน้การควบคมุอณุหภมูิและลดอณุหภมูินำ้เชือ้การเจอืจางนำ้เชือ้การบรรจุในหลอดนำ้เชือ้การแช่แขง็น้ำเชื้อและการตรวจคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็ง(ปริฉัตร,2544)เพื่อให้ได้น้ำเชื้อแช่แข็งที่มีคุณภาพดีมีศักยภาพในการผสมติดดีที่สุด
ในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งต้องใช้สารcryoprotectantซึ่งทำหน้าที่ช่วยป้องกันและลดความเสียหายที่เกิดกับอสุจิจากการลดอุณหภูมิในขณะทำการแช่แข็ง (Foote, 1970) สารที่กล่าวถึงนี้ ได้แก่ กลีเซลรอลเป็นต้น ปัจจุบันมีการศึกษาผลของการใช้กรดอะมิโนเพื่อช่วยลดความเสียหายจากกระบวน การแช่แข็งน้ำเชื้อพ่อพันธุ์ ในสัตว์หลายชนิด เช่น น้ำเชื้อกระบือ El-Sheshtawy at el. (2008) ได้ทำการศึกษาพบว่า การเติม glutamine glycine alanine และ cystein ในน้ำยาเจือจางทำให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งดีขึ้น โดยการเติม cysteine ความเข้มข้น 5 mM สามารถรักษาความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิ (Membrane Integrity) ได้ดีที่สุดคือ 53.90% น้ำยาเจือจางปกติที่ ไม่ได้เติมคือ 41.10% ส่วนในแกะ Uysaletal. (2007)รายงานว่าการเติมcysteineความเข้มข้น10mMช่วยเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ และอัตราการมีชีวิตสูงสุดของตัวอสุจิในขณะที่อัตราความผิดปกติของตัวอสุจิต่ำกว่าการไม่เสริมcysteineคือ9.8%เปรียบเทียบกับ30.1%
ดังนั้น การศึกษาเปรียบเทียบคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโค โดยใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ egg yolk tris ที่เติมcysteieปริมาณ0mM,5mM,10mMและ15mMเพื่อทำหน้าที่เป็นสารเสริมจะช่วยให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังขบวนการแช่แข็งมีชีวิตรอดมากขึ้นและมีประสิทธิภาพมากขึ้น
อุปกรณ์และวิธีการการทดลอง
1. รีดน้ำเชื้อพ่อพันธุ์ โคนมทรอปิคอลโฮลสไตน์อายุประมาณ5-6ปีจำนวน5ตัวที่น้ำเชื้อมี ความเข้มข้นของตัวอสุจิไม่น้อย กว่า 500 ล้านตัว/มล. ตัวอสุจิมีชีวิตไม่น้อยกว่า 70% ตัวอสุจิมีความ ผิดปกติส่วนหัว และส่วนหางไม่เกิน 10% และ 5% ตามลำดับ สัปดาห์ละ 1 ครั้ง 5 สัปดาห์ติดต่อกัน โดยใช้โยนีเทียม(ArtificialVagina:AV)
2.ตรวจคุณภาพน้ำเชื้อเบื้องต้นดังนี้ ปริมาตร สี ความหนืด การเคลื่อนไหวหมู่ และตรวจนับ ความเข้มข้นของน้ำเชื้อโดยใช้spectrophotometer(Model:REFZ160,Minitube,Germany)
3.นำน้ำเชื้อมาแบ่งเป็น 4 ส่วนเท่าๆ กัน เจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจาง ให้มีจำนวนตัวอสุจิ 96ล้านตัว/มล.ด้วยน้ำยาเจือจางดังนี้
40
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
1. น้ำยาเจือจางeggyolktris
2. น้ำยาเจือจางeggyolktrisเสริมcysteine5mM
3. น้ำยาเจือจางeggyolktrisเสริมcysteine10mM
4. น้ำยาเจือจางeggyolktrisเสริมcysteine15mM
4.นำน้ำเชื้อที่เจือจางแล้วไปทำการบรรจุและพิมพ์หลอดที่อุณหภูมิ25oCแล้วนำไปลดอุณหภูมิที่4°Cนาน4ชั่วโมง
5.แช่แข็งน้ำเชื้อด้วยเครื่องแช่แข็งน้ำเชื้ออัตโนมัติ(Digitcool5300ZH350&UE350with900 HP programmer French) โดยเรียงน้ำเชื้อบนแท่นเรียงน้ำเชื้อแล้วนำไปวางเรียงในเครื่องแช่แข็ง น้ำเชื้ออัตโนมัติอุณหภูมิ-140°Cนาน6นาทีจากนั้นนำหลอดน้ำเชื้อแช่ในไนโตรเจนเหลวทันทีเมื่อครบ24ชั่วโมงนำมาตรวจคุณภาพน้ำเชื้อดังนี้
ตรวจร้อยละตัวอสุจิมีชีวิต(%livingsperm)อัตราการเคลื่อนที่(%motilityและอัตราการเคลื่อนที่ไปข้างหน้า(%progressivemotility)ในน้ำเชื้อแช่แข็งโดยใช้เครื่องCASA(computerassistedsemenanalyzer)(HamiltonThornMotilityAnalyzer,IVOS12.3)โดยตั้งค่าเพื่อการตรวจดังนี้FramesPerSec.50Hz,No.ofFrames30,minimumcontrast60,minimumcellsize5pix,Pathvelocity,VAP55ul/s,STR50%,cellIntensity55,VAPcutoff21.9u/s,VSLcutoff6u/s
ตรวจร้อยละความสมบูรณ์ของผนังเซลล์และอะโครโซมของตัวอสุจิในน้ำเชื้อแช่แข็ง ตรวจคุณภาพ น้ำเชื้อหลังจากแช่แข็งอย่างน้อย 24 ชั่วโมง โดยตรวจร้อยละของความผิดปกติของเยื่อหุ้มตัวอสุจิและ อะโครโซมในน้ำเชื้อแช่แข็งโดยใช้เครื่องFlowCytometer
การวิเคราะห์และประมวลผลวางแผนการทดลองแบบRCBDเปรียบเทียบร้อยละความผิดปกติของอะโครโซมและเยือ่หุม้ตวัอสจุิในนำ้เชือ้แช่แขง็และเปรยีบเทยีบรอ้ยละอสจุิมชีวีติในนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้ทัง้4ชนิดวิเคราะห์ความแปรปรวนโดยวิธีANOVAเปรียบเทียบความแตกต่างของtreatmentsโดยDMRT(Duncan’sMultipleRangetest)
ผลการทดลอง ผลการศกึษาคณุภาพนำ้เชือ้แช่แขง็พอ่พนัธุ์ โคนมที่เจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EggYolkTrisที่เสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน515และ15มิลลิโมลภายหลังการแช่แข็งน้ำเชื้อและนำน้ำเชื้อที่แช่แข็งมาละลายด้วยน้ำอุณที่อุณหภูมิ37องศาเซลเซียลเป็นเวลา30วินาทีพบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิที่เสริมน้ำยาเจือจางEggYolkTrisด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีนมีอัตราการเคลื่อนที่สูงกว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิที่ ไม่เสริมน้ำยาเจือจางEggYolkTrisด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน(51.62±2.03,49.12±1.83,47.52±2.43,40.03±1.78)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(P<0.05)ส่วนลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนมีลักษณะBeatfrequency(BCF)Linearity;(LIN)และStraightness(STR)สงูกวา่อสจุิในนำ้ยาเจอืจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนอยา่งมีนยัสำคญัทางสถติ(ิP<0.01)แต่ความเรว็ในการเคลื่อนที่เป็นเส้นตรงStraight-linevelocity(VSL)พบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนสูงกว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโนซิสเตอีนคือ71.10±1.63µm/s,66.34±1.02µm/s,66.34±1.02µm/sและ66.96±1.08µm/sตามลำดับ(ตารางที่1)
41
Journal of Biotechnology in Livestock Production
1/:a,b:อักษรที่เหมือนกันในแถวเดียวกันไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)
เมื่อศึกษาความสมบูรณ์ของอะโครโซมและเยื่อหุ้มตัวอสุจิในน้ำเชื้อแช่แข็งโคนมที่ผลิตโดยใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris เสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน 5 15 และ 15 มิลลิโมล ด้วย เครื่องflowcytometerแสดงในตารางที่2โดยพบว่าไม่แตกต่างกันทางสถิติ(p<0.05)แต่น้ำเชื้อที่เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEggYolkTrisเสริมด้วยกรดอะมิโนซิสเตอีน10มิลลิโมลมีเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซม สมบูรณ์สูงที่สุดคือร้อยละ 44.65±6.39 เมื่อเทียบกับไม่เสริมกรดอะมิโน และการเสริมcysteine 5 และ 15มิลลิโมล(40.07±2.25,42.00±3.57และ38.66±4.30ตามลำดับ)
Motility(%)
Progressivemotility(%)
ความเร็วในการเคลื่อนที่(µm/s)
Curvilinearvelocity;VCL(µm/s)
Straight-linevelocity;VSL(µm/s)
Averagepathvelocity;VAP(µm/s)
Amplitudeoflateralheaddisplacement;
ALH(µm/s)
ลักษณะการเคลื่อนที่
Beatfrequency;BCF(Hz)
Linearity;LIN(%)
Straightness;STR(%)
40.03b±1.78
26.58±1.24
151.06b±3.65
71.10a±1.63
88.43±1.94
6.89b±0.16
26.58a±0.62
48.12a±0.80
79.18a±0.89
0mM
49.12a±1.83
26.20±1.20
166.53a±4.19
67.83b±1.14
92.10±1.99
8.13a±0.15
21.80b±0.41
43.17b±1.00
73.20b±0.64
10mM
51.62a±2.03
26.05±1.19
163.22a±3.55
66.34b±1.02
90.82±1.69
7.81a±0.09
22.98b±0.43
42.22b±0.64
72.54b±0.79
5mM
น้ำยาเจือจางEggYolkTrisที่มีความเข้มข้นCysteineลักษณะการเคลื่อนที่
47.52a±2.43
24.82±1.31
164.57a±2.65
66.96b±1.08
89.42±1.25
8.01a±0.13
22.42b±0.41
41.58b±0.64
73.05b±0.78
15mM
ตารางที่ 1 แสดงค่าเฉลี่ย±SEของร้อยละของตัวอสุจิมีชีวิตและการเคลื่อนที่ทางkineticของตัวอสุจิ
ภายหลังการแช่แข็งในน้ำเชื้อโคนมที่มีน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEggYolkTris
42
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Dead-acrosomeintact(%)
Dead-acrosomedamage(%)
Live-acrosomeintact(%)
Live-acrosomedamage(%)
32.39±2.82
28.39±2.34
40.07±2.25
0.03±0.01
0mM
30.67±2.94
25.13±2.14
44.65±6.39
0.03±0.01
10mM
31.72±3.09
25.20±2.41
42.00±3.57
0.007±0007
5mM
น้ำยาเจือจางEggYolkTrisที่มีความเข้มข้นCysteineลักษณะของอะโครโซมของอสุจิ
34.70±3.17
26.25±2.49
38.66±4.30
0.02±0.01
15mM
ตารางที่ 2 ร้อยละของความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มตัวอสุจิและอะโครโซมภายหลังการแช่แข็งของอสุจิใน
น้ำเชื้อแช่แข็งโคนมในน้ำยาเจือจางEggYolkTrisเสริมด้วยกรดอะมิโนcysteine510และ15มิลลิโมล
เมื่อตรวจด้วยเครื่องFlowCytometer(ค่าเฉลี่ย±SE)
1/:a,b:อักษรที่เหมือนกันในแถวเดียวกันไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)
วิจารณ์ ผลการศึกษาคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนมที่ ใช้น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris เสริมด้วย กรดอะมิโน cysteine 5 10 และ 15 มิลลิโมล พบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของกลุ่มที่เสริมด้วยกรดอะมิโนcysteine สูงกว่ากลุ่มที่ ไม่เสริมโดยน้ำยาเจือจางที่เสริมกรดอะมิโน cysteine 5 มิลลิโมล สูงที่สุด แต่ ความสมบูรณ์ของอะโครโซมและเยื่อหุ้มตัวอสุจิพบว่าทั้งสองกลุ่มไม่พบความแตกต่าง เนื่องจาก cysteine เป็นกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบของ glutatthione และ glutathione สามารถป้องกัน reduction of fertilitypotentialหลังการแช่แข็ง(Kaeoketatal.,2008)นอกจากนี้cysteineยังป้องกันสารออกซิเจนที่เป็นพิษต่อตัวอสุจิจากขบวนการเมตาบอลิซึม (toxicoxygenmetabolites)ซึ่งเป็นสาเหตุทำให้plasmamembranes ของตัวอสุจุเสียหาย (Meister and tate, 1976)ซึ่งแตกต่างกับการทดลอง Tuncer และ คณะ(2010)พบว่าการเสริมcysteine5มิลลโมลในน้ำยาเจือจางLaiciphose®ไม่ทำให้อัตราการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิโคนมเพิ่มขึ้นแต่สามารถลดความเสียหายของ DNA ได้นอกจากนี้ยังมีรายงานการทดลองใน สัตว์หลายชนิดที่ ให้ผลใกล้เคียงกัน เช่นAndreeaและคณะ (2010)พบว่าการเสริมcysteineที่ระดับ10 มิลลิโมล ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อแพะเพิ่มอัตราการการเคลื่อนที่ อสุจิมีชีวิต และความสมบูรณ์ของ เยื่อหุ้มเซลล์ที่ดีที่สุด รายงานในหมูพบว่าการเสริม cysteine ที่ระดับ 5 มิลลิโมลสามารถเพิ่มอัตรา การเคลื่อนที่ดีที่สุด(ChanapiwatP.atal,2008)
จากผลการศึกษาแสดงว่าการเสริมซิสเตอีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris ที่ระดับ ความเข้มข้น 5 มิลลิโมลให้อัตราการเคลื่อนที่ดีที่สุด ทำให้มีประโยชน์ที่จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของน้ำเชื้อดียิ่งขึ้น
43
Journal of Biotechnology in Livestock Production
กิตติกรรมประกาศ คณะผู้วิจัยขอขอบคุณนายสัตวแพทย์ภาณุพันธ์ พงษ์เพ็ง ที่ ให้การสนับสนุนงานวิจัย ดร.จำเนียรสายขุน และอาจารย์กรชัย กรแก้วรัตน์ ที่ ให้ความอนุเคราะห์เครื่องมือและช่วยเหลือการตรวจคุณภาพ น้ำเชื้อนายนรินทร์จารีนางสายแก้วแก้วเกิดและเจ้าหน้าที่ของศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมที่ ให้ความช่วยเหลือการศึกษาครั้งนี้
เอกสารอ้างอิง ปริฉัตรสุขโต.2544.เทคโนโลยีชีวภาพทางวิทยาการสืบพันธ์เพื่อการผลิตปศุสัตว์.71-77.
Andreea,A.,StelaZ.,Coprean,D.andDorina,M.2010.Theeffectsofantioxidantson thecytologicalparametersofcryopeservedbucksemen.RomanianBiotechnological Letters.15:26-32.
Chanapiwat, P., Kaeoket, K. and Tummaruk, P. 2008. L-cysteine supplementation improved qualities of cryopreserved boar semen.Proceedings the 15th of FAVA. p.165-167.
El-Sheshtawy,R.I.,El-Sisy,G.A.andEl-Nattat,W.S.2008.Useofselectedamino acids to improve buffalo bull semen cryopreservation. Global Veterinaria. 2(4): 146-150.
Foot,R.H. 1970. Fertility of bull semenat highextension rates in tris–buffered extender.J.DairySci.53:1475-1477.
Kaeoket,K.,Tantiparinyakul,K.,Kladkaew,W.,Chanapiwat,P.andTechakumphu.M. 2008.Effectofdifferentantioxidantsonqualityofcryopreservedboarsemenin breeds.ThaiJournalofAgriculturalSci.41:1-9.
Meister,S.,andTate,S.S.1976.Glutathioneandrelatedgamma-glutamylcompounds, Biosyntehesisandutilization.Annu.Rev.Biochem.45:559-604.
UsalBucak,M.N.2007,Effectofoxidixedglutathione,bovineserumalbumin,cysteine and lycopene on the quality of frozen thawed ram semen,Acta Vet. Brno. 76: 383-390.
44
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทคัดย่อ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเปรียบเทียบการเสริมกรดอะมิโนสองชนิดคือ กลูตามีน
และไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ Egg Yolk Tris (EYT) ต่อคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งโคนม วางแผนการ
ทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์(randomizedcompleteblockdesign:RCBD)ใช้พ่อโคนมทรอปิคอลโฮลไสตน์
จำนวน5ตัว(บล็อก)ทำการรีดน้ำเชื้อสัปดาห์ละ1วันเป็นเวลา5สัปดาห์(ซ้ำ)ในแต่ละสัปดาห์น้ำเชื้อ
ถูกแบ่งออกเป็น4ส่วนสำหรับการทดลอง4กลุ่มคือกลุ่มที่1เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEYTที่ ไม่เสริม
กรดอะมิโน,กลุ่มที่2เสริมกลูตามีน50mM,กลุ่มที่3เสริมไกลซีน50mMและกลุ่มที่4เสริมกลูตา
มีน25mMร่วมกับไกลซีน25mMผลการศึกษาพบว่าอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิในกลุ่มที่เจือจางด้วย
น้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEYTไม่แตกต่างกับกลุ่มที่เสริมกลูตามีนหรือไกลซีนและกลุ่มที่เสริมกลูตามีนร่วมกับ
ไกลซีน (P>0.05) แต่ความเร็วในการเคลื่อนที่ของอสุจิพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจาง EYT ที่เสริม กลูตามีน
ร่วมกับไกลซีนมีความเร็วที่ ใช้ ในการเคลื่อนที่วิถีตรง(straight-linevelocity:VSL)ต่ำที่สุดคือ64.07±2.19
µm/s (P<0.05) ในขณะที่ลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน
มีความกว้างในการส่ายหัวมากที่สุด(amplitudeoflaterealheaddisplacement:ALH)คือ6.80±0.11µm
เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่เสริมกรดอะมิโน กลูตามีน หรือไกลซีน และกลูตามีนร่วมกับไกลซีน โดยมี
ค่า 6.56±0.11, 6.66±0.08 และ 6.40±0.12 µmตามลำดับ (P<0.05) ส่วนลักษณะความสมบูรณ์ของ
เยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมภายหลังการแช่แข็ง พบว่าเมื่อเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT
ที่เสริมกลูตามีนอสุจิมีเยื่อหุ้มเซลล์และชอะโครโซมสมบูรณ์สูงกว่ากลุ่มไม่เสริมกรดอะมิโน (P<0.05)
แต่ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมไกลซีน หรือเสริมกลูตามีน
ร่วมกับไกลซีน คือมีค่าร้อยละ 52.90±2.45, 42.72±3.30, 48.66±3.53 และ 44.17±2.80 ตามลำดับ
จากการศึกษาแสดงว่าการเสริมกลูตามีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT สามารถช่วยเพิ่มคุณภาพของน้ำเชื้อ
โคนมภายหลังการแช่แข็งโดยทำให้อสุจิมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมสูงสุด
คำสำคัญ:กลูตามีนไกลซีนน้ำเชื้อโคนมม
เลขทะเบียนผลงานวิจัย:54(1)-0408-032
ภาณุพันธ์ พงษ์เพ็ง1 สุดา จันทาสี1 กุลณสรรค์ สายขุน2 จตุพร พงษ์เพ็ง1
1ศูนย์ผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ผสมเทียมลำพญากลาง อ.ลำสนธิ จ.ลพบุรี 151902สถาบันวิจัยและพัฒนาวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล อ.ศาลายา จ.นครปฐม 73170
ผลการเสริมกลูตามีนและไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อต่อคุณภาพน้ำเชื้อโคนมภายหลังการละลาย
45
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Abstract Thisstudywasperformedtoevaluatetheeffectsofglutamine,glycineandglutamine+glycine
addedinEggYolkTris(EYT)extenderoncryopreservationofdairybullsemen.Semenwas
collectedatfiveweeklyintervalsfromfivematurecrossbreedHolstein-Friesianbulls.Eachbull
semensample(n=4)wasaccessedweeklyfortreatedgroups:non-aminoacidtreated(control)
andsupplementedwith50mMofglutamine,glycineand25mMglutamine+25mMglycine.
Aminoacidtreatedgroupsshowednosignificantdifferent(P>0.05)post-thawingsperm
motilitycomparedtothecontrolgroup.However,forthespermvelocity,theglutamine+glycine
addedgrouphadtheloweststraight-linevelocity(VSL)(P<0.05).Forthekineticmovement,
the control group had the highest amplitude of lateral head displacement (ALH) compared
withtheaminoacidtreatedgroups(P<0.05).Additionally,thestatisticallysignificant(P<0.05)
spermmembraneandacrosomeintegrityaslive-acrosomeintact(LAI)wasobservedonlyin
the glutamine added group as52.90±2.45%vs42.72±3.30, 48.66±3.53 and44.17±2.80%
forthecontrol,theglutamineandtheglutamine+glycineaddedgrouprespectively.
TheresultsfromthisstudyindicatedthatadditionofglutamineinEYTextenderenhanced
post-thawedsemenquality,intermsofimprovedmembraneandacrosomeintegrityofdairybull
frozensemen.
Keywords:Glutamine,Glycine,Semenquality,Dairybulls
Researchprojectno.:54(1)-0408-032
Panupan Pongpeng1 Suda Janthasi1 Kunasan Saykhun2 Jatuporn Pongpeng1
1Lamphayaklang Livestock Semen Production Center, Lamsonthi, Lopburi 151902Institute of Science and Technology for Research and Development, Mahidol University,
Salaya, Nakhornpathom 73170.
EffectofGlutamineandGlycineSupplementsinExtendersonPost-ThawSemenQualityofDairyBulls.
46
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทนำ ในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งอาจมีความเสียหายเกิดขึ้นกับตัวอสุจิจากปัจจัยหลายอย่าง เนื่องจากอสุจิ
มีความไวต่อการเปลี่ยนแปลงของสารเคมี การลดอุณหภูมิขณะทำการแช่แข็ง ในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อมีสาร
ที่สำคัญคือสาร cryoprotectants ที่ช่วยป้องกันอสุจิเสียหายหรือตายระหว่างการลดอุณหภูมิขณะแช่แข็ง
(McLaughlinetal.,1992)โดยช่วยป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งในเซลล์(Curry,2000)ลดความเสียหาย
ของผนังอสุจิ(PetersandBall,1995)ซึ่งถ้าผนังเซลล์อสุจิเสียหายจะส่งผลให้เกิดความเสียหายต่อเยื่อหุ้ม
อสุจิและอะโครโซมซึง่เปน็สว่นสำคญัที่อสจุิใช้เจาะผา่นผนงัเซลล์ไข่ถา้หากอะโครโซมเสยีหายหรอืไม่สมบรูณ์
ถึงแม้ว่าอสุจิไม่ตายแต่ก็ไม่สามารถปฏิสนธิกับไข่ได้(Januskauskasetal.,2003)
เมือ่อณุหภมูิเยน็จดัสตัว์และพชืหลายชนดิจะมีการสะสมกรดอะมิโนไว้ ในเซลล์รวมทัง้ในนำ้เชือ้ดว้ย
เชื่อว่าสามารถช่วยป้องกันอันตรายให้กับเซลล์ได้(El-Sheshtawyetal.,2008)และกรดอะมิโนกลูตามีน
ก็เป็นกรดอะมิโนที่พบมากที่สุดประมาณร้อยละ 90 ของกรดอะมิโนทั้งหมด รองลงมาได้แก่ ไกลซีนและ
อะลานนีในนำ้เชือ้พอ่พนัธุ์ โคยงัพบกรดอะมิโนในรปูแบบของสารประกอบไนโตรเจนอืน่ๆดว้ยซึง่สารประกอบ
เหล่านี้ทำหน้าที่เป็นสารเสริมช่วยป้องกันความเสียหายให้แก่ตัวอสุจิในกระบวนการแช่แข็ง (Brown and
White, 1974) และยังมีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการเปลี่ยนน้ำตาลโมเลกุลเดี่ยวให้เป็นพลังงานเพื่อใช้ ใน
กิจกรรมของเซลล์และการเคลื่อนที่ของอสุจิอีกด้วย (Bhargava et al., 1959) อย่างไรก็ตามกลไกทาง
สรีรวิทยาของกรดอะมิโนเหล่านี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด (El-Sheshtawy et al., 2008) แต่มีการศึกษา
ชนิดของกรดอะมิโนที่นิยมใช้เสริมในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งของสัตว์ชนิดต่างๆ ได้แก่
การเสริมกลูตามีนไกลซีนและโปรลีน 100-150 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิภายหลังการ
แช่แข็งน้ำเชื้อ หรือการเสริมกลูตามีน 80 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิมนุษย์และอสุจิม้า
ภายหลังการแช่แข็ง(Renardetal,1996;Scanchez-Partidataetal,1992)ส่วนEl-Sheshtawyet
al. (2008) ทำการศึกษาในน้ำเชื้อกระบือพบว่าการเสริมกลูตามีน ไกลซีน อะลานีนและซีสเตอีนในน้ำยา
เจือจางน้ำเชื้อมีผลทำให้คุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งแตกต่างกัน และอธิบายว่าการเสริมไกลซีนที่
ความเข้มข้น 25 mM สามารถรักษาความสมบูรณ์ของอะโครโซมได้ดีที่สุดคือ 61.30% เปรียบเทียบกับ
น้ำยาเจือจางปกติที่ ไม่ได้เสริมซึ่งมีความสมบูรณ์ของอะโครโซม 50.30% ในขณะที่การเสริม กลูตามีนที่
ระดับ 25 mM สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิเป็น 42.50% เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่
ไม่เสริมมีอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิ32.50%และAmirat-Briandetal. (2009)ก็ทำการศึกษาเสริม
กลูตามีนขนาด10mMในน้ำยาเจือจางEYTที่ ใช้lowdensitylipoproteins(LDL)แทนไข่แดงพบว่า
สามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิโคให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกลูตามีน
ดังนั้นจึงทำการศึกษาการเสริมกรดอะมิโน 2 ชนิด คือกลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับ
ไกลซีนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อโคนมเพื่อเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็ง
47
Journal of Biotechnology in Livestock Production
อุปกรณ์และวิธีการ วางแผนการทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์(randomized complete block design:RCBD) กำหนด
ให้น้ำเชื้อพ่อพันธุ์ โคทรอปิคอลโฮลสไตน์ อายุประมาณ 3-5 ปีจำนวน 5 ตัวเป็นบล็อก รีดเก็บน้ำเชื้อด้วย
artificialvaginaสัปดาห์ละ1ครั้ง โดยกำหนดให้น้ำเชื้อต้องมีอัตราการเคลื่อนที่ของอสุจิไม่ต่ำกว่า70%
รีดเก็บติดต่อกัน5สัปดาห์ โดยแบ่งน้ำเชื้อออกเป็น4ส่วนเท่าๆกันทำการเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจาง
ในแต่ละกลุ่มทดลองดังนี้กลุ่มที่1เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางEYT(tris30.28g,citricacid17g,fructose
12.5g,deminralisedwater920.0ml.,glycerol80ml.,eggyolk250ml.,penicillinGsodium
1,000,000 IU และstreptomycinsulfate 1 g) ที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน กลุ่มที่2 น้ำยาเจือจาง EYT
เสริมกลูตามีน50mMกลุ่มที่3น้ำยาเจือจางEYTเสริมไกลซีน50mMและกลุ่มที่4น้ำยาเจือจางEYT
เสริมกลูตามีน25mMร่วมกับไกลซีน25mMโดยคำนวณให้มีจำนวนอสุจิ96ล้านตัว/ml
การบรรจุและการแช่แข็งบรรจุน้ำเชื้อใน French ministraw 0.25ml ด้วยเครื่องบรรจุน้ำเชื้อ
(Typemachine MRS3,CodeYC250, IMV,France)นำไปบ่มไว้ที่อุณหภูมิ 4oC เป็นเวลา4ชั่วโมง
จากนั้นทำการแช่แข็งน้ำเชื้อด้วยเครื่องแช่แข็งน้ำเชื้ออัตโนมัติ (Digitcool 5300, ZH 350 & UE 350
with900HPprogram3TSoftware,IMV,France)และเก็บไว้ ใต้ระดับไนโตรเจนเหลวในถังเก็บน้ำเชื้อ
การตรวจวิเคราะห์คุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็ง ทำการละลายน้ำเชื้อแช่แข็งด้วยน้ำอุ่น 37oC เป็นเวลา
30วินาทีเช็ดให้แห้งตัดปลายหลอดให้น้ำเชื้อหยดลงในหลอดแก้วเล็กทำการตรวจคุณภาพน้ำเชื้อทันที
การตรวจวิเคราะห์ด้วยเครื่องCASA(computerassistedsemenanalysis)โปรแกรมIVOS
motilityanalyzerversion12.0(Hamilton-Thorne,Biosciences,MA,USA.)ทำการตรวจวิเคราะห์
ดังนี้
- การเคลื่อนที่(motility)และการเคลื่อนที่ ไปข้างหน้า(progressivemotility)
- ความเร็วในการเคลื่อนที่ ได้แก่ pathvelocity (VAP), straight-line velocity (VSL)
และcurvilinearvelocity(VCL)
- ลักษณะการเคลื่อนที่ ได้แก่ amplitude of lateral headdis placement (ALH),
beatcrosfrequency(BCF),straightness(STR)และlinearity(LIN)
การตรวจความผิดปกติของอะโครโซม (acrosome integrity) โดยย้อมสี FITC-PNA
(fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin) และตรวจความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์
(plasmamembraneintegrity)โดยย้อมด้วยสีPI(propridiumiodide)วิธีการคือทำการละลายน้ำเชื้อแช่
แข็งที่37oCนาน30วินาทีเจือจางด้วยHepes-bufferedmodifiedTyrodemedium(CaCl22.0mM,
KCl3.1mM,MgCl20.4mM,NaCl 100mM,NaHCO325mM,NaH2PO40.3mM,sodium
pyruvate 1.0mM,sodium lactate21.6mM,Hepes 10.0mMและBSA6.0mg/ml)ปริมาตร
10เท่าของน้ำเชื้อที่อุณหภูมิ37oCกรองผ่านnylonmeshขนาด41µm(Spectrum,LosAngeles,CA,
USA)จากนั้นย้อมด้วยสีFITC-PNAโดยใช้น้ำเชื้อ440µlผสมกับสีFITC-PNA50µl (10mg/ml)
48
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
นำไปไว้ที่อุณหภูมิ37oCนาน30นาทีจากนั้นย้อมด้วยสีPIก่อนนำไปตรวจด้วยเครื่องflowcytometer
รุ่นFACScaliber(BectonDickinson,NJ,USA.)
การวิเคราะห์และแปลผล วิเคราะห์ค่าตัวชี้วัดต่างๆ ด้วยAnalysis of Variance และวิเคราะห์
ความแตกต่างของค่าเฉลี่ยด้วยวิธีDuncan’sMultipleRangeTest
ผลการทดลองและวิจารณ์ การศึกษาเปรียบเทียบคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งพ่อพันธุ์ โคนมที่เจือจางด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ
EggYolkTrisที่เสริมกรดอะมิโนต่างๆได้แก่กลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับไกลซีนพบว่าอัตรา
การเคลื่อนที่ (motility) และอัตราการเคลื่อนที่ ไปข้างหน้า (progressive motility) ของอสุจิในกลุ่มที่
เจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EYTไม่แตกตา่งกบักลุม่ที่เสริมกลตูามนีไกลซนีและกลูตามนีรว่มกบัไกลซนี
(P>0.05)ซึ่งแตกต่างกับน้ำเชื้อกระบือที่การเสริมกลูตามีนในน้ำยาเจือจางสามารถเพิ่มอัตราการเคลื่อนที่
ของอสุจิให้สูงขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนแต่เมื่อเพิ่มถึงระดับ100mMกลับ
ทำให้อัตราการเคลื่อนที่ลดลง (El-Sheshtawy et al., 2008) แสดงว่าการเสริมกรดอะมิโนสามารถเพิ่ม
คุณภาพน้ำเชื้อสัตว์หลังการแช่แข็งได้หลายชนิดแต่การเสริมอาจมีระดับที่จำกัดแตกต่างกันในสัตว์แต่ละชนิด
ส่วนความเร็วในการเคลื่อนที่ของอสุจิ (velocity) ซึ่งเป็นตัวชี้วัดที่ ให้ทราบถึงความสามารถในการ
เคลื่อนที่ของอสุจิในช่วงเวลาหนึ่งได้แก่VAPเป็นความเร็วในการเคลื่อนที่จริงในหนึ่งวินาทีส่วนVCL(การ
เคลื่อนที่วิถีโค้ง)เป็นการคำนวณแนวโน้มของการเคลื่อนที่เฉลี่ยใน1วินาทีและVSL(การเคลื่อนที่วิถีตรง)
เปน็การคำนวณจากจดุหนึง่ไปยงัอกีจดุหนึง่ในแนวเสน้ตรงในชว่งระยะเวลา1วนิาทีซึง่ความเรว็ในการเคลือ่นที่
ของอสจุิที่มีคา่มากแสดงวา่อสจุินา่จะมีความสามารถในการเคลือ่นที่ ได้ดีซึง่มีความสมัพนัธ์กบัความสามารถ
ในการผสมติด(กิตติศักดิ์และคณะ2551)จากการทดลองพบว่าอสุจิในน้ำยาเจือจางEYTที่เสริมกลูตามีน
ร่วมกับไกลซีนมีความเร็วที่ ใช้ ในการเคลื่อนที่วิถีตรง(VSL)ต่ำที่สุดคือ64.07±2.19µm/sเทียบกับกลุ่มที่
ไม่เสริมกลุ่มที่เสริมกลูตามีนและกลุ่มที่เสริมไกลซีนเพียงอย่างเดียว(P<0.05)ซึ่งมีค่าเท่ากับ72.15±1.23,
69.55±1.13และ68.82±1.39µm/sตามลำดับในทำนองเดียวกับความเร็วในการเคลื่อนที่วิถีโค้ง(VCL)
อสุจิในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่เสริมกลูตามีนร่วมกับไกลซีนให้ค่าต่ำที่สุดเมื่อเทียบกับไม่เสริมอะมิโนหรือเสริ
มกลูตามีนหรือเสริมไกลซีนเพียงอย่างเดียว(P<0.05)ซึ่งมีค่าVCLเท่ากับ139.45±2.45,150.42±2.51,
145.57±2.57และ142.46±2.84µm/sตามลำดับ
สว่นลกัษณะการเคลือ่นที่(kineticmovement)เปน็ตวัชี้วดัที่บอกให้ทราบวา่ในการเคลือ่นที่ของอสจุิ
มีลักษณะการส่ายของหัวมากน้อย ซึ่งลักษณะการเคลื่อนที่ของอสุจิควรมีการส่ายน้อยๆหรือมีการเคลื่อนที่
ได้ตรงที่สุดซึ่งมีความเกี่ยวข้องกับคุณสมบัติของผนังเซลล์และการควบคุมการผ่านเข้าออกของสารและองค์
ประกอบของผนังเซลล์ (Shannon and Vishwanath, 1995) และผลกระทบจากการเปลี่ยนสถานะของ
สารละลายอันเนื่องมาจากการแช่แข็ง(HoltandNorth,1994)เมื่อเจือจางน้ำเชื้อด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ
ที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนพบว่าอสุจิมีช่วงกว้างขณะส่ายหัว(ALH)มากที่สุดคือ6.80±0.11µmเมื่อเปรียบ
เทียบกับกลุ่มที่เสริมกรดอะมิโนกลูตามีนไกลซีนและกลูตามีนร่วมกับไกลซีน(P<0.05)โดยมีค่า6.56±0.11,
6.66±0.08 และ 6.40±0.12 µmตามลำดับ (Table 1) แสดงว่าน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อที่เสริมกรดอะมิโนมี
ส่วนช่วยลดผลกระทบจากการแช่แข็งได้ดีกว่า
49
Journal of Biotechnology in Livestock Production
ลักษณะความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซมภายหลังการแช่แข็ง พบว่าเมื่อเจือจางน้ำเชื้อ
ด้วยน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ EYT ที่เสริมกลูตามีน มีผลทำให้อสุจิที่มีชีวิตมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและ
อะโครโซมสูงกว่า อสุจิในน้ำยาเจือจางที่ ไม่เสริมกรดอะมิโน (P<0.05) แต่ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ
เมื่อเปรียบเทียบกับอสุจิในน้ำยาเจือจางที่เสริมไกลซีน หรือที่เสริมกลูตามีนร่วมกับไกลซีน คือมีค่าร้อยละ
52.90±2.45,42.72±3.30,48.66±3.53และ44.17±2.80ตามลำดับ(Table2)ซึ่งมีผลการทดลองเป็น
ไปในทำนองเดียวกับEl-Sheshtawyetal.(2008)พบว่าการเสริมไกลซีนในน้ำยาเจือจางสามารถรักษา
ความสมบูรณ์ของอะโครโซมได้ดีกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับน้ำยาเจือจางที่ ไม่ได้เสริมกรดอะมิโน
Motility(%)
Progressivemotility(%)
Velocity
Averagepathvelocity:VAP(µm/s)
Straight-linevelocity:VSL(µm/s)
Curvilinearvelocity:VCL(µm/s)
Kineticmovement
Amplitudeoflateralhead:ALH(µm)
Beatcrossfrequency:BCF(HZ)
Straightness:STR(%)
Linearity:LIN(%)
Dead-acrosomeintact(DAI)
Dead-acrosomedamage(DAD)
Live-acrosomeintact(LAI)
Live-acrosomedamage(LAD)
50.85±1.17
32.45±0.95
113.56±24.58
72.15a±1.23
150.42a±2.51
6.80a±0.11
27.07±0.53
79.29±0.62
48.49±0.59
29.13bc±1.86
28.12±2.97
42.72a±3.30
0.05±0.01
Control
Control
51.00±2.17
30.68±1.46
85.07±1.55
68.82a±1.39
142.46b±2.84
6.66ab±0.08
26.61±0.45
79.77±0.65
49.69±0.72
26.16ab±1.19
25.18±3.46
48.66ab±3.53
0.03±0.01
Glycine
Glycine
52.58±2.41
32.67±1.55
86.36±1.36
69.55a±1.13
145.57ab±2.57
6.56ab±0.11
27.18±0.56
79.40±0.72
49.14±0.68
24.70a±1.50
23.14±2.72
52.90b±2.45
0.06±0.02
Glutamine
Glutamine
Post-thawingsemeninEYTsupplements
Post-thawingsemeninEYTsupplements
Spermqualityparameters
Spermqualityparameters(%)
49.59±2.14
30.69±1.45
82.46±1.48
64.07b±2.19
139.45b±2.45
6.40b±0.12
26.77±0.61
78.77±0.74
48.46±0.72
31.00c±1.77
24.76±2.99
44.17ab±2.80
0.04±0.01
Glutamine+Glycine
Glutamine+Glycine
Table 1 Post-thawingspermqualityparameterswereexaminedbyCASA
Table 2 Post-thawingspermqualityparametersexaminedbyFlowCytometer
abตัวอักษรที่แตกต่างกันอยู่ในแถวเดียวกันมีความแตกต่างกันทางสถิติ(P<0.05)
abตัวอักษรที่แตกต่างกันอยู่ในแถวเดียวกันมีความแตกต่างกันทางสถิติ(P<0.05)
50
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
สรุปผลการทดลอง ผลจากการศึกษาสามารถสรุปได้ว่าการเสริมกรดอะมิโนในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อ สามารถช่วยเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อภายหลังการแช่แข็งได้ โดยสามารถช่วยลดผลกระทบจากการแช่แข็ง และช่วยเพิ่มความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และอะโครโซมให้สูงขึ้นแต่ไม่ทำให้อัตราการเคลื่อนที่และความเร็วในการเคลื่อนที่แตกตา่งกบัการเจอืจางดว้ยนำ้ยาเจอืจางนำ้เชือ้EYTที่ ไม่เสริมกรดอะมิโนและจากผลการทดลองการเสริม กลูตามีน50mMในน้ำยาเจือจางน้ำเชื้อEYTสามารถช่วยเพิ่มคุณภาพน้ำเชื้อแช่แข็งได้อสุจิมีความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มอสุจิและอะโครโซมสูงขึ้น
เอกสารอ้างอิง กิตติศักดิ์แสงสกุลสราวุธฉายประสาทเลิศชัยจินตพิทักษ์สกุลและมุขดารัตนภาสกร.2551. ความสัมพันธ์ระหว่างอัตราการตกลูกและลักษณะการเคลื่อนที่ของตัวอสุจิของน้ำเชื้อแช่แข็งโค. วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์.ปีที่3ฉบับที่1มิถุนายน2551.
Amirat-Briand, L., Bencharif, D., Vera-Munoz, O., Bel Hadj Ali, H., Destrumelle, S.,Desherces,S.,Schmidt,E.,Anton,M.,andTainturier,D.2009.Effectofglutamine onpost-thawmotilityofbullspermatozoaafterassociationwithLDL(lowdensity lipoproteins)extender:Preliminaryresults.Theriogenology.71(8):1209-1214.
Bhargava,P.M.,Bishop,W.H.andWork,T.S.1959.Thechemicalcompositionofbull semenwithspecialreferencetonucleicacids,freenucleotidesandfreeaminoacids. BiochemicalJournal.73(2):242-247.
Brown-Woodman,P.D.andWhite,I.G.1974.Aminoacidscompositionofsemenand the secretions of the male reproductive tract. Australian Journal of Biological Sciences.27(4):415-422.
Curry,M.R. 2000. Cryopreservation of sperm from domestic livestock. Reviews of Reproduction.5:46-52.
El-Sheahtawy,R.I.,El-Sisy,G.A.andEl-Nattat,W.S.2008.UseofSelectedamino acidstoimprovebuffalobullsemencryopreservation.GlobalVeterinaria.2(4):146-150. Holt,W.V. and Nort, R.D. 1994. Effects of temperature and restoration of osmotic equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane damage in cryopreservedramspermatozoa.BiologicalReproduction.51:414-424.
Januskauskas,A.,Johannisson,A.andRodriguez-Martinez,H.2003.Subtlemembrane changes in cryopreserved bull semen in relation with sperm viability, chromatinstructure,andfieldfertility.Theriogenology.60:743-758.
51
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Khlifaoui, M., Battut, I., Bruyas, J. F., Chatagnon, G., Trimeche, A. and Tainturier, D. 2005.Effect of glutamine on post-thaw motility of stallionspermatozoa: an approach of the mechanism of action at spermatozoa level. Theriogenology. 63(1):138-149.
McLaughlin,E.A.,Ford,W.C.andHull,M.G.1992.Thecontributionofthetoxicityof aglycerol-eggyolk-citratecryopreservativetothedeclineinhumanspermmotility duringcryopreservation.JournalofReproductionandFertility.95:749-754.
Peters,A.R.andBall,P.J.H.1995.ReproductioninCattle.2ndEd.BlackwellScience Ltd.P.82-84.
Phetudomsinsuk,K.,Sirinarumitr,K.,Choothesa,A.,Suthanmapinunt,P.,Kornkaewrat, K.,Laikul,A.,Amornsak,S.andPinyopummin,A.2009.ThaiJournalVeterinarian Medicine.39(2):105-114.
Renard,P.,Grizard,G.,Griveau,J.F.,Sion,B.,Boucher,D.andLeLannou,D.1996. Improvement of motility and fertility potential of post-thaw human sperm using aminoacids.Cryobiology.33:311-319.
Scanchez-Partidata, L.G., Maxwell, W.M.C., Paleg, L.G. and Setchell, B.P. 1992. Proline and glycine brtaine in cryoprotective diluent for ram spermatozoa. ReproductionandfertilityDevelopment.4:113-118.
Shannon, P. and Vishwanath, R. 1995. The effect of optimal and suboptimal concentration of sperm on the fertility of fresh and frozen bovine semen and atheoreticalmodeltoexplainthefertilitydifferences.AnimalReproductiveScience. 39:1-10.
52
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทคัดย่อ ศึกษาสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ โคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อย
ทางภาคใต้ของประเทศไทย ใช้ข้อมูลผสมเทียมรายตัวของโคที่รวบรวมไว้ ในระบบฐานข้อมูลของศูนย์วิจัย
การผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานีกรมปศุสัตว์ในช่วงปีพ.ศ.2548-2553จำนวน8,095
บันทึก มีการตรวจสอบความถูกต้องจากบัตรบันทึกผสมเทียม (ผท.2) ประจำหน่วยผสมเทียม แบ่งกลุ่ม
พันธุ์ โคออกเป็น 5 กลุ่ม คือ AB75%xNA25%, AB50%xNA50%, AB50% xCHA50%, AB25%
xCHA50%xNA25%และNA100%และแม่โคแบ่งออกเป็น2กลุ่มคือโคสาว(Heifer)และแม่โค
(PrimiparousและMultiparous)สมรรถภาพการสืบพันธุ์ที่วิเคราะห์ได้ดังนี้อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก(AFC)
จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) และระยะอุ้มท้อง (GL) ในโคสาว มีค่าเท่ากับ 38.84+0.29
เดือน 1.56+0.08 ครั้งและ 282.02+0.02 วัน ตามลำดับ ส่วนระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก
(PTF) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (DO) ระยะอุ้มท้อง
(GL) และช่วงห่างการคลอดลูก (CI) ของในกลุ่มแม่โค มีค่าเท่ากับ 148.59+4.02 วัน 1.43+0.03ครั้ง
174.82+5.76 วัน 282.25+0.10 วัน และ 465.56+4.43 วัน ตามลำดับ กลุ่มโคที่มีระดับสายเลือด
บราห์มันจะให้ผลการวิเคราะห์ตัวชี้วัดของ AFC, PTF, SPC, DO และ CI สูงกว่ากลุ่มแม่โคพื้นเมือง
ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (p<0.01) โดยเฉพาะกลุ่ม AB75%xNA25% จะให้ค่าเฉลี่ยของ
ตัวชี้วัดเหล่านี้สูงสุด แม่โคในกลุ่ม Primiparous ทุกระดับสายเลือดมีประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ โดยเฉลี่ย
ต่ำกว่ากลุ่ม Multiparous มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (p<0.01) ยกเว้น SPC และ GL เมื่อมี
การเลี้ยงดูภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย
คำสำคัญ:โคเนื้อลูกผสมบราห์มันสมรรถภาพทางการสืบพันธุ์
จิตศักดิ์ เมืองเขียว1 และ ธวัชชัย โพธิ์คำ1
1 ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานี อ.พุนพิน จ.สุราษฎร์ธานี
สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันในภาคใต้ของประเทศไทย
53
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Abstract Themainobjectiveofthisstudywastodeterminereproductiveperformancesofmixed
breedbeefcattleundersmallfarmholdermanagementinSouthernThailand.Between2005
to2010,8,095AIrecords(AI2form)fromAIunitsofSurathaniArtificialInseminationand
Research Center, Department of Livestock Development. were checked and analyzed. The
beefcattleontheAIrecordsweredividedaccordingtotheirbreedpercentageinto5groups
asfollows;AB75%xNA25%,AB50%xNA50%,AB50%xCHA50%,AB25%xCHA50%
xNA25% andNA100%. These female beef cattlewere also divided into heifer and cow
groups.ThecowgroupwasthensubdividedintoPrimiparousandMultiparous.Reproductive
performancesstudiedinheifergroupwereAgeatFirstCalving(AFC),ServiceperConception
(SPC)andGestationLength(GL)whichtheresultsshowed38.84±0.29months,1.56±0.08
servicesand282.02±0.02days,respectively.WhereasresultsofDayfromparturitiontofirst
service(PTF),ServiceperConception(SPC),DaysOpen(DO),GestationLength(GL)and
CalvingInterval(CI)inthecowgroupwere148.59±4.02days,1.43±0.03services,174.82±5.76
days,282.25±0.10daysand465.56±4.43days,respectively.StudyinmixedBrahmancattle
grouprevealedsignificantsuperiorperformancesintermofAFC,PTF,SPD,DOandCIto
Nativecattle(p<0.01)whichthebestperformanceindexwasfromAB75%xNA25%group.
Cowsinprimiparousgroupofanybreedpercentageshowedsignificantlyinferiorintermofall
reproductiveperformanceindexestothemultiparousgroupexceptSPCandGL(p<0.01).
Keywords:Brahmancrossbred,reproductiveperformance
Jitthasak Maungkhiow1 and Tawutchai Pothkom1
1 Suratthani Artificial Insemination and Biotechnology research Centre, Punpin District, Suratthani
ReproductivePerformancesofBrahmanCrossbredsinSouthernThailand
54
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทนำ การเลีย้งโคเนือ้ในพืน้ที่ภาคใต้สว่นใหญ่เปน็เกษตรกรรายยอ่ยใช้หญา้ตามธรรมชาติและผลพลอยได้
ทางการเกษตรเป็นแหล่งอาหารหยาบ อาจมีการสร้างแปลงพืชอาหารสัตว์ขนาดเล็กและมีการเสริมวัตถุดิบ
อาหารสัตว์บ้างในบางราย โดยมีวัตถุประสงค์ของการเลี้ยงเพื่อขายลูกโคและนำเนื้อมาบริโภค นอกจากนี้
มูลโคยังเป็นผลพลอยได้ที่สำคัญใช้เป็นปุ๋ยบำรุงดินให้กับพืชเศรษฐกิจหลัก ทั้งยางพาราและปาล์มน้ำมัน
ทั้งนี้ยังรวมถึงโคพื้นเมืองภาคใต้ที่ผ่านการคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์ โดยภูมิปัญญาในท้องถิ่นมายาวนาน
จนเกดิ “กฬีา ชน โค”ซึง่แสดงความเปน็เอกลกัษณ์ของโคทางภาคใต้สิง่เหลา่นี้แสดงให้เหน็วา่การเลีย้งโคเนือ้
มีบทบาทต่อวิถีชีวิตสังคมและวัฒนธรรมของคนทางภาคใต้เป็นอย่างมาก
จากรายงานของกรมปศสุตัว์ระยะเวลา10ปีที่ผา่นมาปรมิาณโคเนือ้ในพืน้ที่ภาคใต้มีทศิทางที่เพิม่ขึน้
โดยในปี2542มีจำนวนโคเนื้อเท่ากับ685,669ตัว(กองแผนงาน,2542)และในปีพ.ศ.2552มีจำนวน
โคเนื้อเท่ากับ 776,019 ตัว (ศูนย์สารสนเทศ, 2553) ส่วนใหญ่เป็นโคลูกผสมที่เกิดจากการใช้โคพื้นเมือง
เป็นแม่โคพื้นฐานผสมเทียมด้วยน้ำเชื้อโคพันธุ์แท้จากต่างประเทศ โดยเฉพาะน้ำเชื้อจากโคพันธุ์บราห์มัน
และโคพันธุ์ชาร์ โรเลส์สำหรับผลิตโคเนื้อคุณภาพ โคเพศผู้จะนำไปเลี้ยงเป็นโคขุนหรือเลี้ยงเป็นโคเนื้อส่ง
โรงฆ่าส่วนโคเพศเมียจะเลี้ยงไว้เป็นแม่โคเพื่อผลิตลูกในรุ่นต่อๆไป
สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ เช่น อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก (Age at first calving) ระยะเวลา
อุ้มท้อง (Gestation length) ช่วงห่างของการคลอดลูก (Calving interval) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึง
ผสมครั้งแรก(Calvingtofirstserviceinterval)ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด(Daysopen)อัตรา
การผสมติดครั้งแรก (First service conception rate) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (Service per
conception)เป็นต้นเป็นตัวชี้วัดประสิทธิภาพการผลิตโคที่สำคัญโดยทั่วไปแม่โคที่มีประสิทธิภาพการผลิต
ที่ดีควรจะให้ลูกปีละตัวคือแม่โคต้องได้รับการผสมพันธุ์และผสมติดภายใน60-90วัน(สุณีรัตน์,2550)
แต่ข้อมูลทางด้านสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ ของแม่โคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการเลี้ยงของเกษตรกร
รายยอ่ยและสภาพแวดลอ้มทางภาคใต้ของประเทศไทยมีผู้ศกึษานอ้ยและไม่ครอบคลมุทัว่ทกุจงัหวดัในพืน้ที่
จึงมีความจำเป็นที่จะต้องศึกษาทางด้านนี้เพื่อเป็นข้อมูลพื้นฐานในการจัดการเลี้ยงดู วางแผนปรับปรุงพันธุ์
และวางแผนส่งเสริมในการผลิตต่อไป
ในการศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมบราห์มันใน
ภาคใต้ของประเทศไทยภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกรรายย่อย
55
Journal of Biotechnology in Livestock Production
อุปกรณ์และวิธีการ 1. ข้อมูลและการจัดการข้อมูล
เป็นการศึกษาข้อมูลสมรรถนะการสืบพันธุ์จากฐานข้อมูลผสมเทียมรายตัวโคเนื้อของศูนย์วิจัยการ
ผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสุราษฎร์ธานีกรมปศุสัตว์ในช่วงปีพ.ศ.2548-2553โดยมีการตรวจสอบ
ความถูกต้องจากบัตรผสมเทียม(ผท.2)ประจำหน่วยผสมเทียมจำนวน8,095บันทึก
โคเนื้อในฟาร์มของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย ที่มีการเลี้ยงดูโดยใช้พืชอาหาร
สัตว์จากแปลงขนาดเล็กที่ปลูกเองและหญ้าตามธรรมชาติรวมทั้งผลพลอยได้จากพืชผลทางการเกษตร
เป็นแหล่งอาหารหยาบ
สมรรถนะภาพทางการสืบพันธุ์ที่ ใช้เป็นตัวชี้วัดในโคสาวประกอบด้วย อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก
(Ageatfirstcalving,AFC)จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด(Serviceperconception,SPC)และ
ระยะอุ้มท้อง(Gestationlength,GL)
ในแม่ โคประกอบด้วยระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (Days open, DO) ระยะอุ้มท้อง
(Gestation length, GL) และช่วงห่างการคลอดลูก (Calving interval, CI) ระยะเวลาจากคลอดถึง
ผสมครั้งแรก (Day from parturition to first service, PTF) และจำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด
(Serviceperconception,SPC)
การจัดการข้อมูลการผสมเทียมเบื้องต้นจะประยุกต์ตามวิธีการของ Kadarmideen and Coffey
(2001)ที่กำหนดให้ระยะเวลาการตั้งท้องอยู่ในช่วง268-296วันส่วนข้อจำกัดและเกณฑ์ในการตรวจสอบ
ความถูกต้องและความน่าเชื่อถือของข้อมูลการผสมเทียมเพิ่มเติมได้มีข้อกำหนดดังนี้
-อายุเมื่อคลอดลูกตัวแรกอยู่ในช่วง18-52เดือน
-ช่วงห่างจากคลอดถึงการผสมเทียมครั้งแรกจะต้องอยู่ในช่วง20-240วัน
-จำนวนครั้งการผสมเทียมต่อการผสมติดจะต้องบันทึกอยู่ในช่วง20-340วันหลังคลอด
-ค่าเฉลี่ยจำนวนครั้งการผสมเทียมต่อการผสมติดของฝูงจะต้องอยู่ในช่วง1.5-3.5ครั้ง
-ช่วงห่างการคลอดลูกจะต้องอยู่ในช่วง290-630วัน
จำแนกปัจจัยหลักที่เป็นกลุ่มได้คือ
กลุ่มพันธุ์จำแนกออกเป็น5กลุ่มคือAB75%xNA25%,AB50%xNA50%,AB50%xCHA50%,
AB25%xCHA50%xNA25%และNA100%
กลุ่มแม่โคแบ่งออกเป็น2กลุ่มคือโคสาว(Heifer)และแม่โคแบ่งเป็น2กลุ่มย่อยคือแม่โคมีลูก
แล้ว1ตัว(Primiparous)และแม่โคมีลูกมากกว่า1ตัว(Multiparous)
เดอืนที่ผสมเทยีมและเดอืนที่คลอดในแตล่ะปีแบง่เปน็2ฤดูคอืฤดูรอ้นตัง้แต่ธนัวาคมถงึพฤษภาคม
และฤดูฝนตั้งแต่มิถุนายนถึงพฤศจิกายน(จิตศักดิ์,2550)
ปีของการผสมเทียมและการคลอดจำนวน5ปีคือปีพ.ศ.2548-2553
56
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
2.การวิเคราะห์ข้อมูล
วิเคราะห์ข้อมูลด้วยGLMprocedureที่มีตัวแบบดังต่อไปนี้
Y=µ+bAgeBi+Hr
j+Yb
k+Db
1+BG
m+e(โคสาว)
Y=µ+bAgeCi+Hr
j+Yc
k+Dc
1+BG
m+CG
n+(BGxCG)o+e(แม่โค)
เมื่อ: Y = ค่าสังเกตจากโคสาวหรือแม่โคสำหรับลักษณะข้อมูลต่อเนื่อง
µ = ค่าเฉลี่ย
bAgeBi = สัมประสิทธิ์การถดถอยเชิงเส้นตรงของอายุของโคสาวเมื่อผสม
เทียมครั้งแรก
bAgeCi = สัมประสิทธิ์การถดถอยเชิงเส้นตรงของอายุของแม่โคเมื่อคลอดลูก
Hrj = ปัจจัยคงที่ของฝูง
Ybk = ปัจจัยคงที่ของปีเกิด
Db1 = ปัจจัยคงที่ของฤดูกาลที่เกิด
Yck = ปัจจัยคงที่ของปีที่คลอดลูก
Dc1 = ปัจจัยคงที่ของฤดูกาลที่คลอดลูก
BGm = ปัจจัยคงที่ของระดับสายเลือดโค
CGn = ปัจจัยคงที่ของกลุ่มแม่โค
(BGxCG)o = ปัจจัยคงที่ของการปฏิสัมพันธ์ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โค
e = ค่าความคลาดเคลื่อน
ผลการศึกษา ค่าสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อ
จากผลการวิเคราะห์ค่าเฉลี่ย สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการ
ของเกษตรกรรายย่อยทางภาคใต้ของประเทศไทย อายุเมื่อให้ลูกตัวแรก (AFC) จำนวนครั้งที่ผสมต่อการ
ผสมติด(SPC)และระยะอุ้มท้อง(GL)ในโคสาว5กลุ่มมีค่าเท่ากับ38.84+0.29เดือน1.56+0.08ครั้ง
และ 282.02+0.02 วัน ตามลำดับ ส่วนระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก (PTF) จำนวนครั้งที่ผสม
ต่อการผสมติด (SPC) ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด (DO) ระยะอุ้มท้อง (GL) และช่วงห่างการ
คลอดลูก (CI) ของในแม่โค 5 กลุ่มมีค่าเท่ากับ 148.59+4.02 วัน 1.43+0.03 ครั้ง 174.82+5.76 วัน
282.25+0.10วันและ465.56+4.43วันตามลำดับ(ตารางที่1-6)
อิทธิพลของระดับสายเลือดในโคสาว
จากการวเิคราะห์อทิธพิลของระดบัสายเลอืดในโคสาวตอ่สมรรถนะทางการสบืพนัธุ์พบวา่คา่AFC
มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญยิ่ง (P<0.01) ส่วนค่า SPC และ GL ไม่มีความแตกต่างทางสถิติ
(P>0.05)ดังที่แสดงไว้ ในตารางที่1
57
Journal of Biotechnology in Livestock Production
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Overallmeans
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Cowgroupmeans
41.88±0.83a
40.82±0.41a
40.88±0.93a
39.20±0.41b
38.21±0.54b
38.84±0.29
186.02±15.15aA
182.55±4.53aA
171.68±12.17abA
184.40±8.90aA
142.96±3.37bA
173.52±4.60A
AFC(month)
Primiparous
282.97±0.58
282.01±0.29
282.71±0.64
282.55±0.37
281.93±0.29
282.02±0.11
176.41±9.07a
169.47±2.61a
161.81±7.47b
169.34±5.50a
135.60±1.85c
148.59±4.02*
GL(day)
1.54±0.11
1.52±0.05
1.51±0.12
143±0.07
1.41±0.54
1.56±0.83
166.80±9.89aA
156.38±2.40aB
151.95±8.43aA
154.30±6.19aB
128.25±1.40bB
151.53±3.00B
SPC(service)
Multiparous
Leastsquaremeans+SE
Cowgroups
Breedgroups
Breedgroups Breedgroupmeans
Table 1 LeastsquaremeansandstandarderrorforAFCSPCandGLofheiferindifferent
breedgroups.
Table 2 LeastsquaremeansandstandarderrorforPTFindifferentbreedgroupsandcow
groups.
abLeastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifference. (P<0.01)
abcLeastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent.(P<0.01)ab Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent.(P<0.01)*Overallmeans
อิทธิพลของระดับสายเลือดกลุ่มแม่โคและปฏิสัมพันธ์ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โค
จากการวเิคราะห์ปจัจยัที่มีผลกระทบตอ่สมรรถภาพทางการสบืพนัธุ์ ในกลุม่แม่โคและการปฏสิมัพนัธ์
ระหว่างระดับสายเลือดกับกลุ่มแม่โคพบว่าทุกปัจจัยมีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญยิ่งต่อPTF,SPC,DO,
GLและCI(P<0.01)(ตารางที่2-6)
58
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Cowgroupmeans
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Cowgroupmeans
1.42±0.15
1.38±0.05
1.61±0.12
1.50±0.08
1.39±0.03
1.46±0.04
242.31±17.62aA
204.82±5.27aA
212.06±14.16aA
218.90±10.35aA
162.73±3.91bA
208.16±5.34A
Primiparous
Primiparous
1.54±0.09
1.40±0.03
1.52±0.08
1.48±0.05
1.37±0.01
1.43±0.03*
223.75±10.54a
192.95±3.03b
191.72±8.68b
201.49±6.39b
155.53±2.15c
174.82±5.76*
1.66±0.10ab
1.41±0.02ab
1.42±0.08ab
1.45±0.06ab
1.36±0.14b
1.46±0.03
205.20±11.50aA
181.09±2.80aB
171.39±9.81abB
184.08±7.20aB
148.33±1.63bB
178.02±3.48B
Multiparous
Multiparous
Cowgroups
Cowgroups
Breedgroups
Breedgroups
Breedgroupmeans
Breedgroupmeans
Table 3 LeastsquaremeansandstandarderrorforSPCindifferentbreedgroupsandcow
groups.
Table 4 LeastsquaremeansandstandarderrorforDOindifferentbreedgroupsandcow
groups
ab Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)* Overallmeans
abc Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)AB Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent. (P<0.01)* Overallmeans
59
Journal of Biotechnology in Livestock Production
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Cowgroupmeans
AB75%xNA25%
AB50%xNA50%
AB50%xCHA50%
AB25%xCHA50%xNA25%
NA100%
Cowgroupmeans
280.54±0.86abA
282.37±0.25abA
283.15±0.69abA
283.77±0.52aA
281.61±0.19bA
282.29±0.86A
522.84±17.65aA
487.83±5.28aA
495.21±14.18aA
502.67±10.36aA
444.34±3.92bA
490.45±5.36A
Primiparous
Primiparous
281.59±0.52b
282.42±0.14a
282.70±0.43ab
282.87±0.32a
281.74±0.10b
282.25±0.10*
505.34±10.54a
475.38±3.04a
474.42±8.70a
484.36±6.41a
437.27±2.15b
465.56±4.43*
282.53±0.57abA
282.46±0.13aA
282.25±0.48abA
281.97±0.35abB
281.85±0.08bA
282.23±0.57A
487.83±11.52aA
463.56±2.80aB
453.64±9.83aA
466.05±7.21aB
430.19±1.63aB
460.25±3.50B
Multiparous
Multiparous
Cowgroups
Cowgroups
Breedgroups
Breedgroups
Breedgroupmeans
Breedgroupmeans
Table 5 Leastsquaremeansandstandarderror forGLindifferentbreedgroupsandcow
groups.
Table 6 Leastsquaremeansandstandarderror forCI indifferentbreedgroupsandcow
groups
abc Leastsquaremeanswithdifferent letterswithin thecolumnaresignificantlydifferent (P<0.01)AB Least square means with different letters within the row are significantly different (P<0.01)* Overallmeans
abc Leastsquaremeanswithdifferentletterswithinthecolumnarehighsignificantlydifferent (P<0.01)AB Leastsquaremeanswithdifferentletterswithintherowarehighsignificantlydifferent (P<0.01)* Overallmeans
60
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
วิจารณ์ ผลการวิเคราะห์สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคเนื้อลูกผสมภายใต้สภาพการจัดการของเกษตรกร
รายย่อยในภาคใต้ของประเทศไทย พบว่าโคลูกผสมบราห์มันมีค่าเฉลี่ยของตัวชี้วัดสูงกว่าโคพื้นเมือง
โดยเฉพาะโค AB75%xNA25% จะมีค่าเฉลี่ยของตัวชี้วัดสูงสุดแสดงว่ามีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์
ต่ำกว่า สอดคล้องกับ Tamwasorn et al. (1982) ที่ศึกษาในฟาร์มทดลองโคเนื้อกำแพงแสนพบว่าโคพื้น
เมืองมีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ดีกว่า โคลูกผสมบราห์มันxพื้นเมืองและโคลูกผสมชาโรเลส์xพื้นเมือง
นอกจากนี้ผลการวเิคราะห์พบวา่แม่โคกลุม่Primiparousมีคา่เฉลีย่ของตวัชี้วดัสงูกวา่แม่โคกลุม่Multiparous
สอดคล้องกับการศึกษาในโคนมของ ชาลีและคณะ (2549) และรายงานในต่างประเทศก็พบว่าแม่โคกลุ่ม
Primiparous มีประสิทธิภาพการสืบพันธุ์ต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับแม่โคกลุ่ม Multiparous (Kinsel and
Etherington,1998)เนื่องจากสารอาหารที่แม่โคกลุ่มPrimiparousได้รับเข้าไปร่างกายจำเป็นต้องมีการ
แบ่งส่วนสารอาหาร (partition) ไปเพื่อการเจริญเติบโตในสัดส่วนที่สูงเมื่อเทียบกับแม่โคกลุ่มMultiparous
(BellowsandShort,1978)ดงันัน้แม่โคกลุม่Multiparousแบง่สว่นสารอาหารเพือ่การสบืพนัธุ์จงึมีสดัสว่น
สงูกวา่แม่โคกลุม่Primiparousนอกจากนี้อาจเปน็ไปไดท้ี่วา่เกษตรกรได้ทยอยขายแม่โคที่มีความสมบรูณ์พนัธุ์
ต่ำออกไปทำให้เหลือแม่โคกลุ่มที่มีความสมบูรณ์พันธุ์สูงในฝูง
เมื่อพิจารณาแยกตามตัวชี้วัดที่ทำการศึกษาปรากฏดังนี้
อายุเมือ่ให้ลกูตวัแรก(AFC)พบวา่โคลกูผสมที่มีระดบัสายเลอืดอเมรกินับราห์มนัตัง้แต่50%ขึน้ไป
มีอายุเมื่อให้ลูกตัวแรกสูงกว่าโคที่มีระดับสายเลือดอเมริกันบราห์มันต่ำกว่า50%และโคพื้นเมืองสอดคล้อง
กับTamwasornetal.(1982)และรายงานในเม็กซิโก(MaganaandSegura,1997)แต่ต่ำกว่าโคบราห์มัน
พันธุ์แท้ (AB100%) ที่เลี้ยงในศูนย์ฯ / สถานี ซึ่งมีค่าเท่ากับ 3.91 ปี หรือประมาณ 46.92 เดือน
(กองบำรงุพนัธุ์สตัว,์2545)ทัง้นี้เปน็ผลมาจากโคพนัธุ์บราห์มนัมอีายุการเปน็หนุม่สาวชา้ประกอบกบัอายุการเปน็
หนุ่มสาวของโคพันธุ์บราห์มันมีค่าอัตราพันธุกรรมสูง ทำให้โคลูกผสมที่มีระดับสายเลือดบราห์มันสูงมีอายุ
เมื่อให้ลูกตัวแรกช้าตามไปด้วย(Nogueira,2004)
ระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรก (PTF) พบว่าแม่โคที่มีสายเลือดอเมริกันบราห์มันจะมีค่า
PTF ยาวนานกว่าแม่โคพื้นเมืองเนืองจากลูกผสมบราห์มันมีโครงสร้างของรูปร่างใหญ่กว่าโคพื้นเมืองจึงมี
ความตอ้งการอาหารเพือ่การดำรงชพีและสบืพนัธุ์สงูกวา่HentgesandHowes(1963)รายงานวา่ในสภาพ
การเลีย้งของเกษตรกรรายยอ่ยใช้หญา้ตามธรรมชาติและผลพลอยได้ทางการเกษตรเปน็แหลง่อาหารหยาบ
จึงมีแนวโน้มให้โคลูกผสมบราห์มันได้รับอาหารไม่เพียงพอทำให้กลับมาเป็นสัดช้ากว่าโคพื้นเมือง
แม่โคกลุ่มPrimiparousมีค่าPTFยาวนานกว่ากลุ่มMultiparousวันสอดคล้องกับNaharet
al.(1992)ที่ทำการศึกษาสมรรถนะแม่โคสายพันธุ์ซีบู(Zebutype)พบว่าช่วงระยะเวลาจากคลอดถึงผสม
ครั้งแรกของกลุ่มแม่โคลำดับท้องที่2(151.97+14.44วัน)ยาวนานกว่ากลุ่มแม่โคลำดับท้องที่3(127+
10.22 วัน) อย่างไรก็ดีจากการศึกษาในครั้งนี้พบว่าช่วงระยะเวลาจากคลอดถึงผสมครั้งแรกของโคลูกผสม
บราห์มันและโคพื้นเมืองสูงกว่าค่าทางอุดมคติที่ว่าแม่โคต้องได้รับการผสมพันธุ์และผสมติดภาย90-100
วันหลังคลอดทั้งนี้เนื่องมาจากการเลี้ยงโคเนื้อในภาคใต้เป็นเกษตรกรรายย่อยและเลี้ยงโคเป็นอาชีพเสริม
ทั้งขาดแคลนอาหารหยาบคุณภาพดีและขาดการจัดการฟาร์มที่ดี โดยเฉพาะไม่มีการจัดการหย่านมลูกโค
61
Journal of Biotechnology in Livestock Production
มีผลทำให้แม่โคไม่กลับสัดหลังคลอดนานประมาณ7-8 เดือน (Morrowetal, 1969)ซึ่งSpicerand
Echternkamp (1986) รายงานว่าแม่โคที่ลูกดูดนมต่อเนื่องและยาวนาน จะมีผลไปยับยั้งการเจริญของ
กระเปาะไข่และกระบวนการตกไข่นา่จะเปน็เหตผุลสำคญัประการหนึง่ที่ทำให้การกลบัสดัในแม่โคหลงัคลอด
ยาวนานออกไป
จำนวนครั้งที่ผสมต่อการผสมติด (SPC) พบว่าระดับสายเลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มัน รวมทั้ง
ลำดับการให้ลูกไม่มีผลต่อSPCแต่ในกลุ่มMultiparousพบว่าแม่โคพื้นเมืองมีค่าSPCเท่ากับ1.36ต่ำ
ที่สุดสอดคล้องกับการศึกษาของTamwasornetal.(1982)และณัฐพรและคณะ(2549)ซึ่งค่าSPCที่
วัดได้จากการศึกษาในครั้งนี้อยู่ในเกณฑ์ดีมากซึ่งกรมปศุสัตว์(2545)แนะนำไว้คือ1.5ครั้ง
ระยะเวลาตั้งแต่คลอดถึงผสมติด(DO)พบว่าค่าDOจะผันแปรโดยตรงกับระดับสายเลือดอเมริกัน
บราห์มันของแม่โค แสดงว่าแม่โคที่มีระดับสายเลือดอเมริกันบราห์มันสูงจะมีค่า DO มากกว่า สอดคล้อง
กับที่Roberts(1986)สำหรับลำดับการตั้งท้องพบว่าแม่โคกลุ่มPrimiparousมีค่าDOมากกว่าแม่โค
กลุ่ม Multiparous สอดคล้องกับพิพัฒน์และคณะ (2541) ที่ศึกษาในโคออสเตรเลี่ยนบราห์มันรายงานว่า
ค่าเฉลี่ยระยะเวลาท้องว่างของแม่โคให้ลูกระหว่างตัวที่ 1 - 2 (247.89+8.71วัน) นานกว่าระยะเวลา
ท้องว่างของแม่โคให้ลูกระหว่างตัวที่2–3(148.91+13.98วัน)
เป็นที่น่าสังเกตว่าจากค่าดัชนีชี้วัดPTFและSPCที่ปรากฏจะเห็นว่าการที่แม่โคมีระยะเวลาท้อง
วา่งหรอืระยะเวลาตัง้แต่คลอดถงึผสมตดิยาวมิได้มีสาเหตุมาจากการที่แม่โคผสมตดิยากหากเปน็ผลจากคา่
PTFที่นานมากกว่านั้นคือการที่แม่โคมีระยะการกลับสัดหลังคลอดหรือการกลับมามีวงรอบการทำงานของ
รังไข่อีกครั้งหลังคลอดยาวนาน
ระยะอุ้มท้อง(GL)พบว่าโคสาวมีระยะอุ้มท้องเฉลี่ย282.02+0.11วันและระดับสายเลือดของแม่
โคลูกผสมมีผลต่อระยะเวลาการตั้งท้องโดยพบว่าโคทีมีสายเลือดชาร์ โรเลย์มีแนวโน้มมีค่าGLนานกว่าสาย
เลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มันและพันธุ์พื้นเมืองโดยลำดับการตั้งท้องมีค่าGLไม่แตกต่างกัน
ช่วงห่างการคลอดลูก (CI) พบว่าระดับสายเลือดลูกผสมอเมริกันบราห์มันไม่มีผลต่อระยะห่างการ
คลอดลูกแต่มีค่ามากกว่าของแม่โคพันธุ์พื้นเมืองซึ่งสอดคล้องกับ Tamwasorn et al. (1982) และจิตศักดิ์
และคณะ(2550)
อย่างไรก็ตามช่วงห่างการคลอดลูกของแม่โคเป็นตัวชี้วัดประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ที่ดีที่สุดที่บ่ง
ชี้ถึงประสิทธิภาพการผลิตของสัตว์ทั้งหมดของฝูง(Mukasa-Mugerwa,1989)จากการศึกษาในครั้งนี้พบ
ว่าสูงกว่าค่าที่ยอมรับได้ ในโคเนื้อเขตร้อนที่ 410 - 440 วัน ทั้งนี้เพราะมีหลายปัจจัยมากระทบทั้ง สภาพ
แวดล้อมการจัดการและพันธุกรรม(Lôboetal.,1988)
สรุปผล สมรรถนะทางการสืบพันธุ์ของโคลูกผสมบราห์มันและชาร์ โรเล่ย์มีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ต่ำ
กว่าโคพื้นเมืองและแม่โคกลุ่มPrimiparousมีประสิทธิภาพทางการสืบพันธุ์ต่ำกว่ากลุ่มแม่โคMultiparous
นอกจากนี้ยงัพบวา่ชว่งระยะเวลาจากคลอดถงึผสมครัง้แรกของโคลกูผสมบราห์มนัและโคพืน้เมอืงสงูกวา่คา่
ทางอดุมคติที่วา่แม่โคตอ้งได้รบัการผสมพนัธุ์และผสมตดิภาย90-100วนัหลงัคลอดมีผลทำให้แม่โคในภาค
ใต้มีช่วงห่างการคลอดลูกของแม่โคยาวส่งผลถึงประสิทธิภาพการผลิตโคเนื้อโดยรวมของเกษตรกรรายย่อย
62
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ข้อเสนอแนะ ระยะเวลาจากคลอดถงึผสมครัง้แรกเปน็ชว่งสำคญัทีส่ดุแม่โคตอ้งการอาหารคณุภาพดีโดยเฉพาะ
โคลกูผสมบราห์มนัที่มีโครงสรา้งใหญ่และการหยา่นมลกูโคจะเปน็ประโยชน์อยา่งยิง่กบัแม่โคในชว่งที่อาหาร
สัตว์ไม่สมบูรณ์โดยสามารถหย่านมได้ตั้งแต่ลูกโคอายุ6–7เดือนหรือใช้การหย่านมแบบชั่วคราวคือ
การแยกแม่โคกับลูกเป็นชั่วเวลาสั้นๆ เพื่อไม่ให้ลูกโคดูดนมต่อเนื่องนานเกินไป จะช่วยแม่โคกลับมาเป็น
สัดหลังคลอดเร็วขึ้นทั้งนี้ควรพิจารณาสุขภาพของลูกโคประกอบการหย่านม
กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณนายสัตวแพทย์ชาญยุทธ กาพล ผู้อำนวยการศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยี
สุราษฎร์ธานี เจ้าหน้าที่ผสมเทียมประจำหน่วย เจ้าหน้าที่ของศูนย์ฯ ผสมเทียมสุราษฎร์ธานีทุกท่านที่ช่วย
ตรวจสอบความถูกต้องของข้อมูล คุณจุรีรัตน์ แสนโภชน์ และคุณสายัณห์ บัวบาน นักวิชาการสัตวบาล
ชำนาญการพเิศษสำนกัเทคโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์กรมปศสุตัว์ที่ ให้คำแนะนำในการวเิคราะห์ขอ้มลูและ
ตรวจแก้ไขต้นฉบับ
เอกสารอ้างอิง กรมปศุสัตว์2545คู่มือสำหรับเจ้าหน้าที่ผสมเทียมเล่ม5กรุงเทพ:กระทรวงเกษตรและสหกรณ์
กองบำรุงพันธุ์สัตว์2545คู่มือการปฏิบัติงานผลิตและวิจัยโคเนื้อในศูนย์วิจัยฯ/สถานีบำรุงพันธุ์สัตว์
กองบำรุงพันธุ์สัตว์กรมปศุสัตว์กรุงเทพฯ290หน้า
กองแผนงาน ข้อมูลจำนวนปศุสัตว์ ในประเทศไทย ปี 2542 กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตร
และสหกรณ์-กรุงเทพฯ376หน้า
จิตศักดิ์ เมืองเขียว และ ชาญยุทธ กาพล 2550 ปัจจัยที่มีผลกระทบต่อช่วงห่างการให้ลูกของ
โคพืน้เมอืงและลกูผสมชาร์ โรเลส์วารสารเทคโนโลยีชวีภาพสรุาษฎรธ์านีปีที่2ฉบบัที่1สงิหาคม
2550
ชาลีลีละสิริสายัณห์บัวบานและจุรีรัตน์แสนโภชน์2549สมรรถภาพการสืบพันธุ์ โคนมลูกผสม
ระดับสายเลือดต่างๆของเกษตรกรรายย่อยในประเทศไทยวารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิต
ปศุสัตว์ปีที่1ฉบับที่1สิงหาคม2549
ณัฐพร จุ้ยจุลเจิม สมพงษ์ เทศประสิทธ์ และศิริชัย ศรีพงศ์พันธุ์ 2549 สมรรถภาพทางการ
สบืพนัธุ์บางประการของโคพืน้เมอืงเพศเมยีในจงัหวดัชมุพรและระนองรายงานการประชมุวชิาการ
สัตวศาสตร์ ภาคใต้ ครั้งที่ 4ณมหาวิทยาลัยสงขลานครรินทร์ วิทยาเขตหาดใหญ่ จังหวัด
สงขลาระหว่าง15–16สิงหาคม2549หน้า354-363
ณัฐพร จุ้ยจุลเจิม 2550 สมรรถภาพทางการสืบพันธุ์บางประการของโคพื้นเมืองเพศเมียทาง
ภาคใต้ตอนบนของไทยจากฐานข้อมูลซึ่งบันทึกโดยเจ้าหน้าที่ผสมเทียมของรัฐวิทยานิพนธ์วิทยา
ศาสตรมหาบัณฑิตมหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์95หน้า
63
Journal of Biotechnology in Livestock Production
พิชิตชูเสนสมมาตรสุวรรณมาโจและสุวิชบุญโปร่ง2548ความสมบูรณ์พันธุ์บางประการของ
โคพนัธุ์บราห์มนัที่เลีย้งในศนูยว์จิยัและบำรงุพนัธุ์สตัว์ทบักวาง.[online]http://www.dld.go.th/
research-AHD/research/Webpage/Research_2548_1.html
พพิฒัน์สมภารกญัจนะมากวิจติร์ศรเทพธมัวาสรบณัฑติธานนิทร์ธราธารและนนัทาวาณชิยเศรษฐกลุ
2541 การปรับปรุงความสมบูรณ์พันธุ์ภายหลังคลอดของแม่โคพันธุ์ออสเตรเลียนบราห์มันใน
สภาพการเลี้ยงระดับหมู่บ้านในจังหวัดอ่างทองและอุทัยธานี ประชุมทางวิชาการ ครั้งที่ 36:
บทคัดย่อ3-5กุมภาพันธ์2541มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์297หน้า
ศูนย์สารสนเทศ 2553 ข้อมูลสถิติปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ [Online]
http://www.dld.go.th/ict/stat_web/yearly/yearly52/stock52/region/table2.pdf
สุณีรัตน์ เอี่ยมละมัย 2550 การจัดการและการดูแลสุขภาพโคเนื้อเบื้องต้น วารสารศูนย์บริการ
วิชาการมหาวิทยาลัยขอนแก่น15(3):41-45
สมบัติ ศรีจันทร์ 2542 อิทธิพลของฤดูกาลต่อการผลิตของลูกโคพันธุ์ออสเตรเลียนบราห์มันและ
โคพันธุ์ลูกผสม บราห์มัน เอกสารการประชุมสัมมนาทางวิชาการ สถาบันเทคโนโลยีราชมงคล
ครั้งที่16:เล่ม2สาขาเกษตรศาสตร์หน้า251-285
Bellows,R.A.andShort,R.E.1978.Effectsofprecalvingfeedlevelonbirthweight,
calvingdifficultyandsubsequentfertility.J.Anim.Sci.46:1522-1528.
Hentges,J.F.Jr.andHowes,J.R.,1963.Milkproduction.In:T.J.Cunha,M.Koger
andA.C.Warnick(Ed.)CrossbreedingBeefCattle.Univ.ofFloridaPress,Gainesville.
p.93-97.
Kadarmideen,H.N.andCoffey,M.2001.Qualityandvalidationofinseminationdatafor
nationalgeneticevaluationsfordairycowfertilityintheUnitedKingdom.Interbull
Bulletin27.Proceedingsofthe2001InterbullMeetinginBudapest,Hungary,August
30-31,2001.
Kinsel,M.L.andEtherington,W.G.1998.Factorsaffectingreproductiveperformancein
Ontariodairyherds.Theriogenology.50:1221-1238.
Lôbo,R.B.,Reis,J.C.,Duarte,F.A.M.andWilcox,C.J.1988.Reproductiveperformance
ofPitangueirascattleinBrazil.BrazilJournalGenetics.11:51-61.
Magaña,J.G.andSegura,J.1997.Heritabilityandfactorsaffectinggrowthtraitsand
ageatfirstcalvingofzebuheifersinsouth-easternMexico.TropicalAnimalHealth
andProduction.29:185-192.
Morrow,D.A.,Roberts,S.J.andMcEntee,K.1969.Postpartumovarianactivityand
involutionoftheuterusandcervixindairycattleovarianactivity.CornellVeterinarian.
59:173-199.
Mukasa-Mugerwa,E.1989.AreviewofreproductiveperformanceoffemaleBosindicus
64
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
(zebu)cattle.ILCAmonographno.6.InternationalLivestockCentreforAfrica(ILCA).
AddisAbaba,ET.134p.
Nahar,T.N.,Islam,M.andHasnath,M.A.1992.Acomparativestudyontheperformance
of F1 crossbred cows, under rural conditions in and around the BAU campus,
Asian-AustralasianJournalofAnimalScience.5:35-438.
Nebel, R.L. and Jobst,S.M. 1998. Evaluation of systematic breeding programs for
lactatingdairycows.J.DairySci.81:1169–1174.
Nogueira,G.P.2004.Puberty inSouthAmericanBos indicus (Zebu)cattle.Animal
ReproductionScience.82–83:361–372.
Plasse,D.,Warnick,A.C.,Reese,R.E.andKoger,M.1968.Reproductivebehaviorof
Bosindicusfemalesinsubtropicalenvironment.II.GestationlengthinBrahmancattle.
J.Anim.Sci.27:101-104.
Roberts, S. J. 1986. Veterinary Obstetrics and Genital Diseases, 2nd ed. CBS
Publishers,NewDelhi,Lucknow.p.230-232
Sacco, R.E., Baker, J.F., Cartwright, T.C., Long, C.R. and Sanders, J.O. 1990.
Measurements at calving for straightbred and crossbred cowsof diverse types.
JournalofAnimalScience.68:3103-3108.
Spicer,L.J.andEchternkamp,S.E.1986.Ovarianfolliculargrowth,functionandturnover
incattle:Areview.JournalofAnimalScience.62:428-451
Tamwasorn,S.,Prucsasri,P.,Markvichitr,B.,Rengsirikul,P.andChantalakhana,C.1982.
ComparativeperformanceofThaiindigenousnative,BrahmanhalfbredandCharolais
halfbredcattleatKamphaengsaenanimalresearchstation.Proceedingoftheanimal
scienceresearch.The20thannualconference.KasetsartUniversity1–5February
1982.p.363-376.
65
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทคัดย่อ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินค่าพลังงานเชิงลบคือระดับความเข้มข้นของค่า
non – esterified fatty acid (NEFAs) และกลูโคสในซีรั่ม ที่มีผลต่อค่าสมรรถนะการสืบพันธุ์ คือ
ระยะคลอดถึงผสมครั้งแรก (days to first service) ระยะคลอดถึงผสมติด (days open) จำนวนครั้ง
ที่ผสมเทียมต่อการผสมติด (service per conception) อัตราการผสมติดจากการผสมเทียมครั้งแรก
(first service conception rate) รวมถึงความสัมพันธ์ระหว่างค่า NEFAs และกลูโคสกับค่าสมรรถนะ
การสืบพันธุ์ ในโคนมลูกผสมไทยโฮลสไตน์ช่วงก่อนและหลังคลอดจำนวน 69 ตัว ในอำเภอ ชัยบาดาล
และท่าหลวง จังหวัดลพบุรี โดยเก็บตัวอย่างเลือดที่ 2 สัปดาห์ก่อนคลอดและ หลังคลอด ผลปรากฏว่า
ระดับกลูโคสก่อนคลอดมีค่าเท่ากับ 34.90±1.65 mg/dL และหลังคลอดมีค่าเท่ากับ 26.17±1.47 mg/
dL ส่วนระดับ NEFAs ก่อนคลอดมีค่าเท่ากับ 0.398±0.035 mEq/L และหลังคลอด 0.475±0.049
mEq/Lและค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ได้แก่จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด(Daystofirstservice)
มีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันจำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(Daysopen)มีค่าเท่ากับ106.76±5.66วัน
จำนวนครัง้ที่ผสมตดิ(Serviceperconception)มีคา่เทา่กบั1.65±0.14ครัง้และอตัราการผสมตดิครัง้แรก
(Firstserviceconceptionrate)ร้อยละ47.62ซึ่งจะพบว่าแม่โคในฟาร์มดังกล่าวมีระดับของการเกิด
พลังงานเชิงลบโดยสังเกตจากระดับของกลูโคสที่ลดต่ำลงและระดับ NEFAs มีค่าสูงขึ้นในช่วงหลังคลอด
ซึ่งการเกิดสภาวะพลังงานเชิงลบดังกล่าวส่งผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธุ์ทำให้จำนวนวันผสมครั้งแรก
หลังคลอดยาวนานขึ้น
คำสำคัญ:กรดไขมันอิสระกลูโคสความสมบูรณ์พันธุ์พลังงานเชิงลบแม่โคนม
เลขทะเบียนผลงานวิจัย54(1)-0108–031
อรุณ จันทร์กระจ่าง1 ไกรวรรณ หงษ์ยันตรชัย1
1ศูนย์วิจัยการผสมเทียมและเทคโนโลยีชีวภาพสระบุรี จ. สระบุรี 18260
อิทธิพลของพลังงานเชิงลบช่วงหลังคลอดต่อความสมบูรณ์พันธุ์ในแม่โคนมลูกผสมไทยโฮลสไตน์
66
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Abstract The aim of this studywas to evaluate the effects of the negative energy balance
such as the concentration of non – esterified fatty acid (NEFAs) and serum glucose on
reproductiveperformanceincludingdaystofirstservice,daysopen,servicesperconception,
firstserviceconceptionrateaswellastherelationshipbetweenNEFAsandserumglucoseand
reproductiveperformance.Thestudywasperformedin69ThaiHolsteinCrossbreddairycows
atChaibadarnandThaluangdistrictinLopburiprovince.Bloodsampleswerecollectedtwo
timesattwoweeksprepartumandtwoweekspostpartum.Meansandstandarddeviationsof
glucosepreandpostpartumwere34.90±1.65mg/dLand26.17±1.47mg/dLwhereasNEFAs
preandpostpartumwere0.398±0.035mEq/Land0.475±0.049mEq/L.Meansandstandard
deviationsofdaystofirstservice,daysopen,servicesperconception,firstserviceconception
rate were 83.86±4.11 days, 106.76±5.66 days, 1.65±0.14 times and 47.62% respectively.
TheresultsshowedthatatpostpartumNEFAsincreasedsignificantly(p<0.05)whileglucose
decreased significantly (p< 0.05) compared to those of prepartum. It was concluded that
negativeenergybalancehadeffectonprolongingdaystofirstservice.
Keywords:Non–esterifiedfattyacid,Glucose,Fertility,NegativeEnergyBalance,Cows
Researchprojectno.54(1)-0108-031
Arun Chankrachang1 Kriwan Hongyantrachai1
1Saraburi Artificial Insemination and Biotechnology Research Center, Saraburi 18260
InfluenceofNegativeEnergyBalanceduringPostpartumonFertilityinThai-HolstienCows
67
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทนำ ความไม่สมบูรณ์พันธุ์ ในแม่โคนม เกิดจากปัจจัยหลายสาเหตุซึ่งเป็นปัญหาที่ก่อให้เกิดความสูญเสีย
ทางด้านเศรษฐกิจอย่างมากต่อเกษตรกรผู้เลี้ยงโคนม สาเหตุที่สำคัญประการหนึ่งคือ พลังงานเชิงลบ
(Negativeenergybalance,NEB)ในชว่งหลงัคลอดพลงังานเชงิลบหมายถงึภาวะที่รา่งกายได้รบัสารให้
พลงังานไม่เพยีงพอกบัที่รา่งกายตอ้งการใช้ซึง่เกดิจากความตอ้งการพลงังานเพิม่ขึน้รวมถงึการเปลีย่นแปลง
ทางสรีระและระดับฮอร์ โมนช่วงก่อนและหลังคลอดเป็นสาเหตุให้ร่างกายแม่โคนำไปสู่สภาวะที่มีพลังงาน
เชงิลบ(Harrisonetal.,1990)ระยะนี้แม่โคมีความอยากอาหารลดลงทำให้กนิได้นอ้ยจงึสญูเสยีนำ้หนกัตวั
และแสดงอาการตอบสนองต่อพลังงานเชิงลบโดยดึงพลังงานที่ร่างกายเก็บสำรองไว้มาใช้ได้แก่ไกลโคเจน
ไขมันและโปรตีนเพื่อชดเชยพลังงานที่ต้องการ(Rakkwamsuketal.,2006)การสลายไขมันที่สะสมใน
เนื้อเยื่อของไขมันทำให้ระดับnon–esterifiedfattyacid(NEFAs)ในเลือดสูงขึ้นส่งผลให้แม่โคมีปัญหา
การสะสมของไขมันในตับและรบกวนการทำงานของตับนำไปสู่ภาวะketosisและfattyliverรวมทั้งเป็นพิษ
ต่อรังไข่และฟอลลิเคิลและพลังงานเชิงลบจะทำให้ลดการหลั่งGnRHและLHส่งผลต่อวงรอบการเป็นสัด
(Butler and Canfield, 1989) ทำให้การตกไข่ครั้งแรกหลังคลอดล่าช้าออกไป (Staples et al., 1990)
และอัตราการผสมติดลดลง(Wathesetal.2003and2007)
ค่าที่บ่งชี้ถึงสภาวะพลังงานเชิงลบมี2ชนิด ได้แก่กลูโคสซึ่งเป็นแหล่งพลังงานหลักสำหรับรังไข่
และ NEFAs ในกระแสเลือด (Rabiee et al., 1999) ที่สะท้อนถึงสภาพการจัดการด้านโภชนาการใน
แม่โคนมทั้งก่อนและหลังคลอดของเกษตรกร ซึ่งสภาวะพลังงานเชิงลบในช่วงหลังคลอด จะเกิดขึ้นโดยปกติ
อยู่แล้ว(Butler,2006)ถ้าแม่โคที่มีร่างกายแข็งแรงและมีความสมบูรณ์ดีจะแก้ไขสภาพพลังงานเชิงลบและ
สามารถฟืน้ตวัได้เรว็โดยแม่โคสว่นใหญ่จะปรบัตวัจนเขา้สู่สภาวะสมดลุของพลงังานที่ประมาณ6-8สปัดาห์
หลังคลอด(Blocketal.,2001;Heueretal.,2001)โดยแม่โคที่ร่างกายไม่สมบูรณ์ต้องใช้ระยะเวลานาน
ในการปรบัตวัเขา้สู่สภาวะสมดลุของพลงังานการทดลองครัง้นี้เพือ่ศกึษาขอ้มลูของระดบักลโูคสและNEFAs
ในกระแสเลอืดที่ทำให้เกดิปญัหาพลงังานเชงิลบในแม่โคนมที่เลีย้งในฟารม์เกษตรกรรายยอ่ยจงัหวดัลพบรุี
และใช้เป็นแนวทางในการเฝ้าระวังป้องกันไม่ให้แม่โคเกิดปัญหาพลังงานเชิงลบภายหลังคลอด อันจะส่งผล
ให้แม่โคไม่กลับเป็นสัดตามปกติ มีปัญหาผสมติดล่าช้า มีจำนวนวันท้องว่างยาวนาน และลดผลกระทบต่อ
ประสิทธิภาพการผลิตจนเกษตรกรเกิดความสูญเสียทางด้านเศรษฐกิจ
68
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
อุปกรณ์และวิธีการ สัตว์ทดลอง
โคลูกผสมไทยโฮลสไตน์มีระดับสายเลือดตั้งแต่87.5–93.75เปอร์เซ็นต์แม่โคทั้งหมดมีสุขภาพ
สมบูรณ์อายุในช่วง3-7ปีเลี้ยงในฟาร์มโคนมของเกษตรกรรายย่อยในจังหวัดลพบุรีโดยแม่โคทั้งหมด
ได้รับการเลี้ยงดูและการจัดการที่คล้ายคลึงกันคืออยู่ในโรงเรือนแบบปล่อยตลอดเวลารีดนมวันละ2ครั้ง
พร้อมสังเกตการเป็นสัดคือช่วงเช้า06.00–07.00น.ในช่วงบ่าย14.00–15.00น.การให้อาหารข้น
โปรตีน16%วันละ2ครั้งโดยให้เป็นสัดส่วนคือให้อาหารข้น1กิโลกรัมต่อปริมาณน้ำนม2กิโลกรัม
ที่แม่โคผลิตได้ สำหรับอาหารหยาบช่วงเดือน มิถุนายน – ธันวาคมให้หญ้าสดเช่น หญ้าขน หญ้ารูซี่
หญ้าเนเปียร์ กินเต็มที่ สลับกับฟางวันละ 2 มื้อ ส่วนช่วงเดือนมกราคม-พฤษภาคมให้ฟางหรือฟางหมัก
วันละ2มื้อ
การเก็บตัวอย่าง
สุ่มตัวอย่างโคนมตั้งท้องจำนวน 69 ตัว จดบันทึกประวัติ และเก็บตัวอย่างเลือดตัวละจำนวน
10 ซีซี. ก่อนและหลังคลอด 2 สัปดาห์ ปั่นแยกซีรั่ม แช่แข็งไว้ส่งห้องปฏิบัติการเพื่อตรวจระดับ กลูโคส
และNEFAsสังเกตอาการเป็นสัดของแม่โคนมหลังคลอดและผสมเทียมโดยน้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์และชุดการ
ผลิตเดียวกันของกรมปศุสัตว์ โดยเจ้าหน้าที่ผสมเทียมที่มีความชำนาญเพียงคนเดียวจนกว่าจะผสมติดถ้า
แม่โคไม่กลับแสดงอาการเป็นสัดหลังการผสมเทียม 60 วัน จะตรวจการตั้งท้อง ติดตามและบันทึกข้อมูล
สมรรถนะทางการสบืพนัธุ์ไดแ้ก่ระยะคลอดถงึผสมครัง้แรก(daystofirstservice)ระยะคลอดถงึผสมตดิ
(days open) จำนวนครั้งที่ผสมเทียมต่อการผสมติด (service per conception) และอัตราการผสมติด
จากการผสมเทียมครั้งแรก(firstserviceconceptionrate)
การวิเคราะห์ข้อมูล
วิเคราะห์สถิติโดยใช้RegressionanalysisโดยมีIndependentvariableคือระดับกลูโคสกับ
NEFAsและDependentvariableคือ1.ระยะคลอดถึงผสมครั้งแรก2.ระยะคลอดถึงผสมติด3.จำนวน
ครั้งที่ผสมเทียมต่อการผสมติด4.อัตราการผสมติดจากการผสมเทียมครั้งแรกโดยแยกวิเคราะห์เฉพาะผล
ของกลูโคสกับNEFAsที่มีต่อค่าสมรรถนะทางการสืบพันธุ์ทั้ง4ค่าและวิเคราะห์Multipleregression
ของผลร่วมของกลูโคสกับNEFAsกับทั้ง4ตัวเพื่อดูความสัมพันธ์ระหว่างกลูโคสกับNEFAsว่าจะมี
Interactionกันหรือไม่
ผลการทดลองและวิจารณ์ ระดับกลูโคสในซีรั่มของแม่โคนมก่อนและหลังคลอดมีค่าดังนี้คือก่อนคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ
34.90±1.65mg/dLและหลังคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ26.17±1.47mg/dLซึ่งลดลงอย่างมีนัยสำคัญ
(P<0.05)ส่วนระดับNEFAsในช่วงก่อนคลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ0.398±0.035mEq/Lและหลัง
คลอด2สัปดาห์มีค่าเท่ากับ0.475±0.049mEq/Lซึ่งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ(P<0.05)ดังตารางที่1
69
Journal of Biotechnology in Livestock Production
และขอ้มลูสมรรถนะระบบสบืพนัธุ์ของแม่โคนมไดแ้ก่จำนวนวนัผสมครัง้แรกหลงัคลอด(Daystofirstservice)
มีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันจำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(Daysopen)มีค่าเท่ากับ106.76±5.66วัน
จำนวนครั้งที่ผสมติด(Serviceperconception)มีค่าเท่ากับ1.65±0.14ครั้งอัตราการผสมติดครั้ง
แรก(Firstserviceconceptionrate)มีค่าเท่ากับร้อยละ47.62ดังตารางที่2และจากผลการวิเคราะห์
ความสัมพันธ์ของค่ากลูโคสและ NEFAsพบว่าไม่มีความสัมพันธ์ ในทางสถิติกับค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์
(P>0.05)
NEFAs(mEq/L)
Glucose(mg/dL)
0.398a±0.035
34.90a±1.65
means±SD
0.475b±0.049
26.17b±1.47
means±SD
0.122-1.588
13.40-61.28
range
ก่อนคลอด หลังคลอด
0.096-2.371
7.505-51.812
range
ตาราง ที่ 1 แสดงระดับNEFAs (mEq/L) และGlucose (mg/dL) ในซีรั่มของแม่โคนมจำนวน69ตัว
ตรวจวัดระดับที่ก่อนคลอด2สัปดาห์(prepartum)และหลังคลอด2สัปดาห์(postpartum)
ตาราง ที่ 2 แสดงค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ของแม่โคนมที่ศึกษา
abc แสดงค่าเฉลี่ยของระดับ NEFAs และ Glucose ระหว่างก่อนและหลังคลอดที่ความแตกต่างอย่าง มีนัยสำคัญ(P<0.05)
* ค่าที่เหมาะสมของค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์ โคนม(Hermanetal.,1994และDahletal.,1991)
จำนวนโค(ตัว)
จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด(วัน)
จำนวนวันคลอดจนถึงผสมติด(วัน)
จำนวนครั้งที่ผสมติด(ครั้ง)
อัตราการผสมติดครั้งแรก(ร้อยละ)
69
83.86±4.11
106±5.66
1.65±0.14
47.62
means±SD
52-142
56-215
1-4
60
<100
<2.0
70
range ค่าที่เหมาะสม*ค่าสมรรถนะระบบสืบพันธุ์
ชว่งระหวา่งการคลอดคา่ชวีเคมีของเลอืดที่บง่ชี้ถงึสภาวะพลงังานเชงิลบถกูประเมนิโดยระดบักลโูคส
และNEFAsในกระแสเลอืด(Jimspain,2005)การศกึษานี้ระดบักลโูคสในซีรัม่ของแม่โคนมที่2สปัดาห์
หลังคลอด ลดลงจากที่ 2 สัปดาห์ก่อนคลอด อย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) สอดคล้องกับ Rukkwamsuk
(2010)ซึ่งชี้ ให้เห็นว่าแม่โคนมเข้าสู่ช่วงพลังงานเชิงลบหลังคลอดโดยเฉพาะช่วง2สัปดาห์ของการให้นม
การลดลงของระดับกลูโคสในกระแสเลือดจากผลของการเกิดพลังงานเชิงลบในช่วงหลังคลอดนี้
จะทำให้แม่โคนมมีการเพิ่มการเคลื่อนย้ายของพลังงานสำรองโดยการเพิ่มขบวนการสลายไขมันจากเนื้อเยื่อ
ไขมัน (MacNamara, 1986 ; Rukkwamsuk et al., 1999) ส่งผลให้มีระดับ NEFAsในกระแสเลือด
มากขึ้นซึ่งNEFAsเป็นตัวบ่งชี้ถึงระดับของการเคลื่อนย้ายไขมันและสภาวะพลังงานเชิงลบ
70
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
ในช่วงการเจริญเติบโตของโอโอไซต์(oocyte)ระยะแรกกลูโคสและNEFAsสามารถผ่านเข้าไป
ในของเหลวในฟอลลิเคิล(follicularfluid)ได้ง่ายและมีผลต่อโอโอไซต์โดยตรง(Fernandezetat.,2006)
โดยระดับความเข้มข้นของกลูโคสในกระแสเลือดในช่วงสภาวะ NEB จะมีค่าลดลงอย่างมีนัยสำคัญและ
มีผลโดยตรงต่อระดับความเข้มข้นของกลูโคสในของเหลวในฟอลลิเคิล(Lopezetal.,2003;Martinet
al., 2008) มีผลทำให้ยับยั้งการเจริญเติบโตของ โอโอไซต์ เนื่องจากขาดกลูโคสซึ่งใช้เป็นแหล่งพลังงาน
ส่วน NEFAs ในกระแสเลือดจะเป็นพิษโดยตรงต่อฟอลลิเคิล ซึ่งจะชักนำให้ Cumulus cells ตาย และ
ฟอลลิเคิลหยุดการเจริญเติบโต(Jorritsmaetal.,2004;Friggens,2003;Bossaertetal.,2008)
การขาดพลงังานหลงัคลอดทำให้ไม่เกดิการตกไข่ซึง่ตอ่มาจะพฒันากลายเปน็ถงุนำ้ในรงัไข่(Boland
etal.,2001;Vanholderetal.,2006)และมีผลกระทบต่อการทำงานของคลอปัสลูเทียมและส่งผลถึง
การผลิตโปรเจสเตอโรน(VanKnegseletat.,2007;Vanholderetal.,2006)ซึ่งสภาวะเหล่านี้ทำให้
เยื่อบุมดลูกไม่มีการเปลี่ยนแปลงทั้งรูปร่างและการทำงานในช่วงการผสมครั้งแรกหลังคลอดและมีผลที่ ไม่ดี
ต่อสภาพแวดล้อมภายในมดลูกซึ่งจำเป็นต่อการฝังตัวของตัวอ่อน ทำให้การเข้าอู่ของมดลูกล่าช้าหลังคลอด
(30-40 วัน) และเป็นสาเหตุหลักของการเกิดมดลูกอักเสบในฝูง (Rossi et al., 2008; Huzzey et al.,
2007)เช่นเดียวกับJacksonetal.(2011)และLeBlancetal.(2010)รายงานว่าNEBก่อนคลอดมี
ความสมัพนัธ์กบัการเกดิendometritisและNEBหลงัคลอดสมัพนัธ์กบัการเกดิถงุนำ้ในรงัไข่และการทำงาน
ของคลอปัสลูเทียมที่ล่าช้า
ในชว่งกอ่นและหลงัคลอดเปน็จดุวกิฤติที่สำคญัตอ่สขุภาพและความสมบรูณ์พนัธุ์แม่โคสว่นใหญ่จะเกดิ
พลงังานเชงิลบสง่ผลถงึวงรอบการเปน็สดัปกติและอตัราการผสมตดิ(Wathesetal.,2009)ภาวะพลงังาน
เชิงลบ จะเริ่มเกิดประมาณ 1 สัปดาห์ก่อนคลอด เนื่องจากการกินได้ลดลงและยังคงดำเนินต่อไปมากกว่า
2-3สัปดาห์และถึงจุดสูงสุดที่ประมาณ2สัปดาห์หลังคลอด(Butler,2006)โคส่วนใหญ่จะปรับตัวจนเข้า
สู่ภาวะสมดุลของพลังงานที่ประมาณ6-8สัปดาห์หลังคลอด(Blocketal.,2001;Heueretal.,2001)
หรือ อาจเป็นระยะเวลานานหลายสัปดาห์ก่อนที่จะกลับเข้าสู่สภาวะปกติ (Wathes, 2008) ซึ่งระยะนี้อาจ
ยาวนานถ้าโคไม่ได้รับพลังงานจากสารอาหารเพียงพอ(Grummeretal.,2004)ความรุนแรงและระยะ
เวลาของการขาดพลังงาน มีผลต่อระบบสืบพันธุ์และความสมบูรณ์พันธุ์ (Pryce et at., 2001;Wathes,
2008)โดยปกติแล้วแม่โคควรได้รับการผสมครั้งแรกไม่เกิน60วันหลังคลอด(Dahletal.,1991)แต่จาก
การศึกษาครั้งนี้จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดมีค่าเท่ากับ83.86±4.11วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติแสดงให้
เห็นว่าภาวะดังกล่าวส่งผลกระทบต่อจำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอด ซึ่งมีค่าใกล้เคียงกับ Rukkwamsuk
(2010) รายงานว่า จำนวนวันคลอดถึงเป็นสัดครั้งแรกมีค่าเท่ากับ 72±65 วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติ
และสอดคล้องกับGeorge ที่รายงานว่าการเพิ่มภาวะพลังงานเชิงลบ อาจทำให้การตกไข่ครั้งแรกล่าช้า
ที่60-75วันหรือยาวนานกว่านั้น
จำนวนวันคลอดจนถึงผสมติดมีค่าเท่ากับ106.76±5.66วันซึ่งมีค่ามากกว่าปกติส่วนจำนวนครั้ง
ที่ผสมติดมีค่าเท่ากับ 1.65±0.14 ครั้งอาจเนื่องจากแม่โคสามรถกลับเข้าสู่สภาวะสมดุลของพลังงานและ
สภาพแวดล้อมภายในมดลูกพร้อมรับการผสมทำให้จำนวนครั้งที่ผสมติดมีค่าน้อยและอัตราการผสมติดครั้ง
แรกมีค่าเท่ากับร้อยละ 47.62 ซึ่งมีค่าน้อยกว่าปกติ ในขณะที่ Rukkwamsuk (2010) รายงานอัตราการ
71
Journal of Biotechnology in Livestock Production
ตัง้ทอ้งจากการผสมเทยีมครัง้แรกเทา่กบัรอ้ยละ28.6ซึง่การศกึษานี้แสดงให้เหน็วา่แม่โคนมในฟารม์ที่ศกึษา
มีระดบัการเกดิพลงังานเชงิลบแต่ไม่รนุแรงและเปน็ระยะเวลานานในการกลบัสู่สภาวะพลงังานสมดลุซึง่ภาวะ
ดังกล่าวทำให้ส่งผลกระทบต่อจำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดยาวนานขึ้น
แม่โคใกล้คลอดการกินได้จะลดลง25-40เปอร์เซ็นต์(Grummeretal.,2004)ซึ่งการลดการกิน
ได้ส่งผลกับการเกิดสภาวะNEB (Huzzey et al., 2007) ทำให้แม่โคสูญเสียคะแนนร่างกาย โดยสภาวะ
NEBสามารถสงัเกตจากการเปลีย่นแปลงคะแนนรา่งกายของแม่โคซึง่เปน็วธิีการที่ ใช้มากทีส่ดุเพือ่ใช้ประเมนิ
ค่าสมดุลของพลังงาน (Pryceetal.,2001)และสามารถใช้ ในการประเมินสภาวะการสลายไขมันที่สะสม
ในเนื้อเยื่อไขมันได้(Rukkwamsuketal.,2006)ถ้าคะแนนร่างกายลดลง0.5หน่วยระหว่างช่วงแห้งนม
และสัปดาห์แรกของการให้นมอัตราการผสมติดจะลดลง10เปอร์เซ็นต์(Butler,2003)และอัตราการผสม
ติดลดลงน้อยกว่าร้อยละ30เมื่อคะแนนร่างกายลดน้อยลงกว่า1หน่วย(Formigonietal.,2003)ดังนั้น
แม่โคควรจะสูญเสียคะแนนร่างกายประมาณ1หน่วยในช่วง4สัปดาห์หลังคลอดถ้าสูญเสียมากกว่านั้นจะ
ส่งผลต่ออัตราการผสมติดครั้งแรกลดต่ำลง
สรุปผลการทดลอง จากผลการทดลองนี้ชี้ ให้เห็นว่าแม่โคนมในฟาร์มเกษตรกรมีการเกิดสภาวะพลังงานเชิงลบที่ส่ง
ผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธุ์ทำให้จำนวนวันผสมครั้งแรกหลังคลอดยาวนานขึ้น ทำให้เราต้องใส่ใจใน
การป้องกันโดยเฉพาะการจัดการด้านโภชนาการและการกินได้ ในช่วงก่อนและหลังคลอด โดยการเพิ่ม
เข้มข้นของโภชนะในสูตรอาหารและความถี่ของการให้อาหารต่อวันให้มากขึ้นให้อาหารสดใหม่และเพียงพอ
กับระดับของพลังงานที่ โคต้องการ ทั้งนี้เกษตรกรผู้เลี้ยงโคนมควรหมั่นสังเกตคะแนนร่างกายของแม่โคนม
อย่างสม่ำเสมอเพ่ือใช้เป็นการเฝ้าระวังการเกิดปัญหาภาวะพลังงานเชิงลบท่ีจะส่งผลกระทบต่อความสมบูรณ์พันธ์ุ
นอกจากนี้ควรทำการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกลับเข้าสู่ภาวะพลังงานสมดุลของแม่โคนมหลังคลอดเพื่อ
นำไปใช้ประโยชน์ ในการวางแผนการจัดการเพิ่มประสิทธิภาพระบบสืบพันธุ์ต่อไป
กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณ รศ.ดร.น.สพ.ธีระ รักความสุข คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์
วิทยาเขตกำแพงแสน ที่ ให้ความอนุเคราะห์ ในการตรวจวิเคราะห์ค่ากลูโคสและNEFAs พร้อมทั้ง
สพ,ญ.กลัยาเกง่วกิย์กรรมและคณุสายณัห์บวับานสำนกัเทคโนโลยีชวีภาพการผลติปศสุตัว์ที่ ให้คำแนะนำ
ตลอดการทดลองนี้จนสำเร็จลุล่วงด้วยดี
72
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
เอกสารอ้างอิง Block,S.S.,Butler,W.R.,Ehrhardt,R.A.,Bell,A.W.,VanAmburgh,M.E.andBoisclair, Y.R.2001.Decreasedconcentrationofplasmaleptininperiparturientdairycowsis causedbynegativeenergybalance.J.Endocrinol.171(2):339-48.
Boland,M.P.,Lonegan,P.andO’Callaghan,D.2001.Effectofnutritionandandocrine parameters,ovarianphysiologyandoocyteandembryodevelopment.Theriogenology 55:1323-1340.
Bossaert,P.,Leroy,J.,DeVliegher,S.andOpsomer,G.2008.Interrelationsbetween glucoseinducedinsulinresponse,metabolicindicatorsandtimeoffirstovulationin high-yieldingdairycows.JournalofDairyScience91:3363-3371.
Butler,W.R.andCanfieldR.W.1989.Interrelationshipsbetweenenergybalanceand
postpartumreproduction.InProc.CornellNutritionConferenceforFeedManufacturers, October24-26,1989,CornellUniversity,Ithaca.
Butler,W.R.2003.Energybalancerelationshipswithfolliculardevelopment,ovulation andfertilityinpostpartumdairycows.LivestockProductionScience83:211-218.
Butler,W.R.2006.RelationshipsofNegativeEnergyBalancewithFertility.(Online)
http://WWW.altagenetics.com/English/Whatsnew/20060110NegativeEnergy. htm.5/1/2012
Dahl, J.C., Ryder, J.K., Holmes, B.J. andWollenzien,A.C.1991.An integrated and multidisciplinaryapproachtoimprovingadairy’sproduction.VetMed.86(2)
Fernandez, R., Martini, A.C, Navarro, V.M., Castellano, J.M., Dieguez, C., Aguilar, E.,Pinilla,L.andTena–Sempere,M.2006.Novelsignalsfortheintegration ofenergybalanceandreproduction.MolecularandCellularEndocrinology254–255: 127-132.
Formigoni, A. and Trevisi, E. 2003. Transition Cow : Interaction with Fertility. VeterinaryResearchCommunications.Volume27:143-152.
Friggens,N.C.2003.Bodylipidreservesandthereproductivecycle:towardsabetter understanding.LivestockProductionScience83:219-236.
George,J.NegativeEnergyBalanceandConceptionRates.(Online)http://www.uky.edu/ Ag/AnimalSciences/dairy/dairyrepro/rep024.pdf5/1/2012
Grummer, R.R., Mashek, D.G. and Hayirli, A. 2004. Dry matter intake and energy balanceinthetransitionperiod.VeterinaryClinics:FoodAnimalPractice20:447-470. Harrison, R.O., Ford, S.P., Young, J.W., Conley, A.J. and Freeman, A.E. 1990. Increasedmilkproductionversusreproductiveandenergystatusofhighproducing dairycows.J.DairySci.73:2749–2758.
73
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Herman, H.A., Mitchell, J.R. and Doak, G.A. 1994.The Artificail Insemination and Embryo transfer. A handbook of laboratory manual, Interstate Publishers, INC. p.198.
Heuer,C.,VanStraalen,W.M.,Schukken,Y.H.,Dirkzwager,A.andNoordhuizen,T.M. 2001. Prediction of energy balance in high yielding dairy cows with test-day information.JournalofDairyScience84(2):471-81.
Huzzey,J.M.,Veira,D.M.,Weary,D.M.andVonKeyserlingk,M.A.2007.Prepartum behavioranddrymatterintakeidentifydairycowsatriskformetritis.Journalof DairyScience90:3220-3233.
Jackson,R.A.,Wills,J.R.,Kendall,N.R.,Green,M.J.,Murray,R.D.andDobson,H.2011. Energy metabolites in pre – and postpartum dairy cattle as predictors of reproductivedisorders.VeterinaryRecord2011:168,562.
JimSpain.2005.ImplementingaNutritionalManagementStrategytoEnhanceFertility. AdvanceinDairyTechnology17:171.
Jorritsma,R.,Cesar,M.L.,Hermans,J.T.,Kruitwagen,C.L.J.J.,Vos,P.L.A.M.and Kruip,T.A.M.2004.Effectsofnon–esterifiedfattyacidsonbovinegranulosecellsand developmental potential of oocytes in vitro. Animal Reproduction Science 81: 225–235.
LeBlanc,S.J.,Dubuc,I.,Duffield,T.F.,Leslie,K.E.andWalton,J.S.2010.Riskfactors, impactandtreatmentofpostpartumuterinediseasesindairycows.Proceedingof the26thWorldBuiatricsCongress.Santiago,ChileNovember14to18,2010.
LopezGautius,F.,Yaniz ,J.andMadriles–Helm,D.2003.Effectofbodycondition score and score change on the reproductive performance of dairy cows: a meta–analysis.Theriogenology59:801–812.
Martin,B.,Golden,E.,Carlson,O.D.,Egan,J.M.,Mattson,M.P.andMaudsley,S.2008. Caloricrestriction:Impactuponpituitaryfunctionandreproduction.AgeingResearch Reviews7:209–224.
MacNamara, I.P. andHillers, J.K. 1986.Adaptations in Lipidmetabolism of bovine adiposetissueinlactogenesisandlactation.JournalofLipidResearch27:150-157. Patton, J., Kenny, D.A., McNamara, S., Mee, J.F., O’Mara, F.P., Diskin, M.G. and Murphy,J.J.2007.RelationshipsAmongMilkProduction,EnergyBalance,Plasma Analyses,andReproductioninHolstein–FriesianCows.JournalofDairyScience 90:649-658.
Pryce,J.E.,Coffey,M.P.andSim,G.2001.Therelationshipbetweenbodycondition scoreandreproductionperformance.JournalofDairyScience84:1508-1515.
Rabiee, A.R., Lean, I.J., Gooden, J.M. andMiller, B.G. 1999. Relationships among metabolitesinfluencingovarianfunctioninthedairycow.JournalofDairyScience 82:39-44.
74
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Rossi,F.,Righi,F.,Romanelli,S.andQuarantelli,A.2008.Reproductiveefficiencyof dairycowsundernegativeenergybalanceconditions.Ann.Fac.MedicVet.DiParma 28:173-180
Rukkwamsuk,T.,Kruip,T.A.M.andWensing,T.1999.Relationshipbetweenoverfeeding andoverconditioninginthedryperiodandtheproblemsofhighproducingdairycow duringtheperiparturientperiod.Veterinary.Quart21:71-77.
Rukkwamsuk,T.,Homwong,N.,Bunkhuntod,W.,Rohitakanee,P.andSukcharoen,R.2006. NegativeBalance inPeriparturientDairyCowsRaised inSmall-HolderFarms in Kamphaengsaen District , Nakhon Pathom Province. Kasetsart J. Nat.Sci. 40: 1000–1004.
Rukkwamsuk.2010.Afieldstudyonnegativeenergybalanceinperiparturientdairy cowskeptinsmall-holderFarms:Effectonmilkproductionandreproduction.African JournalofAgriculturalResearch5(23):3157–3163.
Spicer,L.J.,Francisci,C.C.,Jones,D.andWaldner,D.N.2002.Changesin Insulin andGlucoseConcentrationsDuringEarlyLactation inHolstein. http://wwwansi. okstate.edu/research/2002rr/33/index.htm5/1/2012
Staples,C.R.,Tucker,W.B.andAdams,G.D.1990.Relationshipbetweenovarianactivity andenergystatusduringtheearlypostpartumperiodofthehighproducingdairy cow.JournalofDairyScience73:938.
Vanholder,T.,Opsomer,G.,andDeKruie,A.2006.Aetiologyandpathogenesisofcystic ovarian follicles in dairy cattle: a review. Reproduction Nutrition, Development 46:105-119.
VanKnegsel,A.T.M.,VanDenBramd,H.,Dijkstra,J.andKemp,B.2007.Effectsof dietaryenergysourceonenergybalance,metabolitesandreproductionvariablesin dairycowsinearlylactation.Theriogenology685:274-280.
Wathes,D.C.,Taylor,V.J.,Cheng,Z.andMann,G.E.2003.Folliclegrowth,corpus luteumfunctionand theireffectsonembryodevelopment in thepostpartumcow. ReproductionSupplement61:219–237.
Wathes,D.C.,Fenwick,M.,Cheng,Z.,Bourne,N.,Llewellyn,S.,Morris,D.G.,Kenny, D.,Murphy,J.andFitzpatrick,R.2007. Influenceofnegativeenergybalanceon cyclicity and fertility in the high producing dairy cow. Theriogenology 68: S232–S241.
Wathes, D.C. 2008. Metabolic effects on the reproductive tract environment and conceptionratesinthedairycow.HavemeyerFoundMonogrSer21:15-19.
Wathes,D.C.,Fenwick,M.,Cheng,Z.Bourne,N.,Llewellyn,S.,Morris,D.G.,Kenny, D.,Murphy,J.andFitzpatrick,R.2009. Influenceofnegativeenergybalanceon cyclicityandfertilityinhighproducingdairycow.Theriogenology68:232-241.
75
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทคัดย่อ งานวิจัยนี้เพื่อพัฒนาชุดเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์ (ไพรเมอร์ 11 คู่)
สำหรับตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูก (parentage test) และเอกลักษณ์ (identification) ในโค เพื่อเพิ่ม
ความเชื่อมั่น จำนวน 11 ตำแหน่งในโครโมโซมคือ HEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005,
HEL13, BM1818, MM12, CSRM60, HEL9 และ ETH185 โดยเก็บตัวอย่างเลือดโคนมลูกผสม
ไทยโฮลสไตน์ จำนวนทั้งสิ้น 234 ตัว นำไปทดสอบด้วยชุดตรวจสอบที่พัฒนาขึ้นใหม่ พบว่าสามารถ
เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ สำหรับการตรวจสอบเอกลักษณ์ได้ ในตัวอย่างทั้งหมด 234 ตัว และสามารถตรวจ
สอบพ่อแม่ลูกได้ เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์ ทุกตำแหน่งแสดงรูปแบบความหลากหลาย
ของอัลลีล อยู่ระหว่าง 6 - 23 อัลลีล โดยมีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 12.09 อัลลีล ค่าเฮเทอโรไซโกซิตี้
(Heterozygosity)มีค่าเฉลี่ยของHo=0.6788(พิสัย0.444-0.902),ค่าเฉลี่ยของHeเท่ากับ0.7508
(พิสัย0.610 - 0.924) และค่าเฉลี่ยของโพลีมอร์ฟิก อินฟอร์เมชั่นคอนเทน (Polymorphic Information
Content;PIC)คือ0.7122(พิสัย0.535-0.924)และตำแหน่งที่ ใช้ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ ให้ผลแม่นยำสูง
คือHEL9(23alleles,Ho=0.902,He=0.924,PIC=0.917),BM1818(15alleles,Ho=0.762,
He=0.805,PIC=0.781)และETH185(14alleles,Ho=0.816,He=0.836,PIC=0.815)และCSRM60
(13alleles,Ho=0.833,He=0.801,PIC=0.776)ตามลำดบัผลการวเิคราะห์พบวา่ขอ้มลูทางพนัธกุรรม
หลายตำแหน่งร่วมกัน(CombinedExclusionProbability;CEP)ของ11markerkitที่พัฒนาเป็น2ชุด
multiplex PCR ใหม่ มีค่าความถูกต้องในการตรวจสอบสูงสุดที่ 0.999999 ให้ค่าความเชื่อมั่นสูงถึง
99.99% และพบค่า exclusion probability (PE) มีค่าอยู่ระหว่าง 8.86x10-12 จะเพิ่มความแม่นยำ
และความเชื่อมั่นสูงขึ้นในการตรวจพิสูจน์พ่อแม่ลูกโคและน้ำเชื้อปลอม
คำสำคัญ:ชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์
กัลยา เก่งวิกย์กรรม1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 และ บุหงา จินดาวานิชสกุล1
1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์
การพัฒนาชุดตรวจสอบความเป็นพ่อแม่ลูกโคด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดไมโครแซทเทิลไลท์เพื่อเพิ่มความเชื่อมั่น
76
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Abstract The objective of thisstudy is to develop newsets of bovine elevenmicrosatellite
markers; HEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005, HEL13, BM1818, MM12, CSRM60,
HEL9andETH185forevaluatingparentageverificationandidentitytest.Thebloodsamples
from234Holsteincrossbredcattle(Holstein–Thainativecattle)populationinThailandwere
extractedforgenotypingbyfourcapillaryelectrophoresisinjections.Allmarkerswerehighly
polymorphicwithameannumberof12.09allelesper locuswithrangeof6-23alleles.At
the11testedloci,atotalof133allelesweredetected.Anaverageobservedandexpected
heterozygositywas0.6788(withrange0.444-0.9020)and0.7508(withrange0.610-0.924)
respectively.AnaveragePolymorphicInformationContent(PIC)was0.7122andvaluesranged
0.535–0.917.ThehighpolymorphicmarkerswereHEL9(23alleles,Ho=0.902,He=0.924,
PIC=0.917),BM1818(15alleles,Ho=0.762,He=0.805,PIC=0.781)ETH185(14alleles,
Ho=0.816,He=0.836,PIC=0.815)andCSRM60(13alleles,Ho=0.833,He=0.801,PIC=
0.776)respectively.TheresultsofCombinedExclusionProbability;CEPforparentagetesting
washighat0.999999(99.99%)andtherangeofexclusionprobability(PE)was8.86x10-12.
Thepresentstudyconfirmsthatthenewtwosetsofmultiplexfor11microsatellitemarkersare
suitableforparentagetestingandidentificationinThaiHolsteinCrossbredcattle.
Keywords:Bovine,Parentagetestkit,MicrosatelliteDNAmarkers
Kalaya Kengvikkum1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Buh-nga Chindawanichsakul1
1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production Department of Livestock Development
DevelopmentofBovineParentageTestKitusingMicrosatelliteDNAMarkers
77
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Introduction Correctpedigreeinformationandidentificationareessentialforsuccessfulimprovement
ofproductivityandcattlebreedingprogram.Misidentificationcan lead to inaccurategenetic
evaluationandthestructureofselectionindexes(Rehoutetal.,2006).Cattleparentageanalysis,
using blood type showed a high frequency of incorrect paternity in Germany (4-23%)
(Geldermannetal.,1986)AdvancemoleculartechnologysuchasPolymeraseChainReaction
(PCR)developmentandthediscoveryofmanynewDNAmarkersforexampleMicrosatellite
havebeenusedtosolvethislimitation.Manymicrosatellitesmarkersareusefulinparentage
analysisbecauseitisduetotheirhighlypolymorphisms,simplenucleotiderepeatsknownas
ShortTandemRepeat(STR)(Divineetal.,2010,LewisJr.,2010)anddistributedthroughout
genome. In 2008, The International Society for Animal Genetics (ISAG) recommended 11
microsatelliteloci(TGLA227,Bm2113,ETH10,SPS115,TGLA126,TGLA122,INRA023,ETH225,
BM1824,ETH3,andTGLA53)astheInternationalPanelofMicrosatellitesforCattleParentage
Testing(ISAGPanel).Othercountriesdevelopedmoremicrosatellitemarkersfor theircattle
populations. (Carolino et al., 2009,Ozkanet al., 2009) To increaseefficacy in parentage
testingandidentification,additional11markers(HEL1,HEL5,ILSTS005,INRA063,INRA005,
HEL13,BM1818,MM12,CSRM60,HEL9และETH185)fromISAGpanelusingtwomultiplex
PCRwereevaluated.
MaterialsandMethods SamplecollectionandDNAextraction
GenomicDNAfrombloodsamplesof234ThaiHolsteincattlefromprivatefarmslocated
invariousregionsofThailandwereisolatedwithAxyPrepBloodGenomicDNAMiniprepKit
andkeptat4oC.DNAyieldwascheckedwithAgaroseGelElectrophoresis.
MultiplexPCRandGenotypedetermination.
ElevenmicrosatellitesusedinthisstudyasrecommendedbytheInternationalSociety
forAnimalGenetics(ISAGConference,2008)forcattlepaternitytestingweredividedinto2
sets.Thefirstmultiplexsethas6primersandanotherhas5primers.Allprimerswerelabeled
withfluorescencedye(Table1).DNAsampleswereamplifiedusing1XPCRbuffer,3mMMgCl,
200µMdNTP,0.1µMprimersand1UPlatinumTaq(InvitrogenTM)Thecyclingreactionswere
performedinaprogrammableMJMiniPersonalThermalcyclerwithaninitialdenaturationfor10
minat950Cfollowedbythethermalcyclesasfollows:denaturationstepat950Cfor45s,
annealingstep: thefirstmultiplexgroupat570Cand thesecondmultiplexgroupat620C
78
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
for45s,andanelongationstepat720Cfor1min.Thereactionwascompletedwithafinal
elongationstepat720Cfor60min.PCRproductswerecheckedwithGelElectrophoresis
(2%agarosegel),andstainedwithethidiumbromideandtookapicturewithUVlightofGel
Documentation.ThefluorescentlabeledPCRproductsweresubmittedtofragmentsanalysisby
fourcapillaryelectrophoresis,withanautomatedsequencer(3130GeneticAnalyzer:Applied
Biosystem)usingtheGeneScanTM-500ROXTMSizeStandard(AppliedBiosystem),according
to the manufacturer specifications. Results were read and interpreted using GeneScan®
andGeneMappersoftwarerespectively.
1
2
HEL1
(FAM)
HEL13
(FAM)
HEL5
(VIC)
MM12
(VIC)
INRA063
(PET)
INRA005
(FAM)
CSRM60
(PET)
HEL9
(NED)
ILSTS005
(NED)
BM1818
(FAM)
ETH185
(FAM)
98–118
177–197
151–181
107–133
175–188
137–143
93–111
143–171
181–193
252–272
220-238
F-CAACAGCTATTTAACAAGGA
R-AGGCTACAGTCCATGGGATT
F-TAAGGACTTGAGATAAGGAG
R-CCATCTACCTCCATCTTAAC
F-GCAGGATCACTTGTTAGGGA
R-AGACGTTAGTGTACATTAAC
F-CAAGAGAGGTGTTTCAATCT
R-ATCGACTCTGGGGATGATGT
F-ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC
R-AAACCACAGAAATGCTTGGAAG
F-CAATCTGCATGAAGTATAAATAT
R-CTTCGAGCATACCCTACACC
F-AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA
R-AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG
F-CCCATTCAGTCTTCAGAGGT
R-CACATCCATGTTCTCACCAC
F-GGAAGCAATGAAATCTATAGCC
R-TGTTCTGTGAGTTTCTAAGC
F-AGCTGGGAATATAACCAAAGG
R-AGTGCTTTCAAGGTCCATGC
F-TGCATGGACAGAGCAGCCTGGC
R-GCACCCCAACGAAAGCTCCCAG
KaukinenandVarvio1993
(15)
KaukinenandVarvio1993
(11)
KaukinenandVarvio1993
(21)
MommensandCoppieters1994(9)
Vaimanet al.1994
(18)
Vaimanet al.1992
(12)
Mooreet al.1994
(10)
KaukinenandVarvio1993
(8)
Brezinskyet al.1993
(10)
Bishopet al. 1994
(23)
Steffen,P.et al.1993(17)
MultiplexLocus(Dye)
Allelicrange(bp)
PrimerSequence(5’-3’)
Reference(chromosome)
Table 1 Compositionoftwomultiplexesforthenewbovinemicrosatellitelociexamined
79
Journal of Biotechnology in Livestock Production
KaukinenandVarvio1993
(15)
KaukinenandVarvio1993
(11)
KaukinenandVarvio1993
(21)
MommensandCoppieters1994(9)
Vaimanet al.1994
(18)
Vaimanet al.1992
(12)
Mooreet al.1994
(10)
KaukinenandVarvio1993
(8)
Brezinskyet al.1993
(10)
Bishopet al. 1994
(23)
Steffen,P.et al.1993(17)
Dataanalysis Standardstatisticalprocedureswereusedtoassesstheinformativenessofselected
microsatellite markers. The number of alleles (N), Heterozygosity (Ho, He), Polymorphism
InformationContent(PIC)accordingtoHardyWeinbergequilibrium,(Bosteinetal.,1980).The
CombinedExclusionProbability(CEP)andtheProbabilityofExclusion(PE)wasdefinedfor
twocases(JamisonandTaylor,1997)andtheprobabilityofIdentity(PI)wascalculatedforeach
microsatellitemarker.AllweredeterminedbytheCERVUS3.0software(Kalinowskietal.,
2007)
Results FromTable1,accordingtoABIPRISMGeneticAnalyzer3130(AppliedBiosystems),
genotypingdatawereanalyzedwithGeneMapper®version3.0software(AppliedBiosystems),
andweresizedduetoGeneScan™500ROX™SizeStandard,aninternallanesizestandard
developedfortheusewiththeAppliedBiosystemsfluorescence-basedDNA.Elevennew11
microsatellitemarkerswereevaluatedfortheiruseinparentageanalysis.
The results are presented in Table 2. Among the 11 microsatellite sequences, an
amplificationproductwasobtainedfor11loci.Allareeffectiveinparentagetestingandpedigree
verification depending on polymorphism (number of alleles), and their relative population
frequencies(Taylor,1997).Inthestudiedgroupof234cattle(N),theallelesperlocus(K)ranged
from6to23.ThemeanKperlocuswas12.09andthetotalnumberofalleleswas133.The
allelefrequencyperlocuswasshown.Hohadanaveragevalueat0.6788withrangefrom
0.444to0.902andHehadvaluesanaveragevalueat0.7508withrangefrom0.610to0.924.
PICvaluesrangedfrom0.535to0.917withthemeanvalueof0.712(Table2).
80
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Table 1 Compositionoftwomultiplexesforthenewbovinemicrosatellitelociexamined
HEL1(D15S10)**
INRA005(D9S1)***
HEL13(D11S15)
ETH185(D17S1)
BM1818(D23S21)
MM12(D9S20)*
HEL5(D21S15)
HEL9(D8S4)
ILSTS005(D10S25)***
CSRM60(D10S5)
INRA063(D18S5)***
Mean
12
6
8
14
15
11
13
23
9
13
9
12.09
234
234
234
234
231
234
234
234
124
233
232
0.662
0.641
0.637
0.816
0.762
0.564
0.611
0.902
0.444
0.833
0.595
0.6788
0.742
0.737
0.610
0.836
0.805
0.653
0.693
0.924
0.711
0.801
0.748
0.7508
0.704
0.689
0.535
0.815
0.781
0.594
0.645
0.917
0.670
0.776
0.707
0.712
(0.006-0.386)
(0.002-0.352)
(0.004-0.376)
(0.002-0.284)
(0.002-0.342)
(0.002-0.342)
(0.002-0.451)
(0.002-0.147)
(0.009-0.459)
(0.004-0.347)
(0.002-0.375)
K N Ho He PICAlleleFreqMarker/(Locus)/HWE
K Allelesperlocus,N-numberofindividuals,AlleleFreq–Allelefrequency, Ho-observedHeterozygosity,H
eExpectedHeterozygosityPIC–PolymorphismInformationContent.
*,**,***wereresultsofchisquaretest.
Highnumberofalleles,HeterozygosityandPICvalueswereobservedforHEL9,ETH185,
CSRM60, BM1818 and HEL1. In addition, those are the most informative markers among
testedlociinthisstudy.Theresultsofthechisquaretestofgoodness-of-fitrevealedthatthe
populationwasinHardy-WeinbergEquilibrium(HWE)proportionsforsixmicrosatelliteloci
(HEL13,ETH185,BM1818,HEL5,HEL9andCSRM60).TheremainingfiveLoci(HEL1,INRA005,
MM12, ILSTS005 and INRA063) showed significant from HWE. It might be attributed to
selection,mutation,geneticdriftandnullallele(notamplifyingalleles).
81
Journal of Biotechnology in Livestock Production
PE1 Probabilityofexclusion(bothparentsknown),PE2-Probabilityofexclusion(onlyone parentknown),PI Averageprobabilityoftwoindividualshaveidenticalgenotype,PI-Sib=Averageprobability oftwofullsiblingshasidenticalgenotypes.
The two sets of 11 markers in this study had similar exclusion probabilities and
probabilityofIdentity(PI)tothecommerciallyavailableStockMarks®kit.(AppliedBiosystems)
(ShowedinTable3)Bycomparingwiththeresultsusingother11microsatelliteloci:TGLA227,
Bm2113,ETH10,SPS115,TGLA126,TGLA122,INRA023,ETH225,BM1824,ETH3,andTGLA53
(the“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,
CA)(inFigure1)
11marker
(StockMarks®kit)
11newmarkerkit
0.9999999
0.999999
PE1
2.14x10-11
8.86x10-12
0.999821
0.97900
PE2
Combinedprobability
probabilityPI PI-Sib
exclusion
7.72x10-6
5.418x10-5
Table 3 Thecombinedexclusionprobabilityandmultilocusprobabilityofidentityestimationof
twomarkersets(commercialanddevelopedmarkerset)
Figure 1 Parentagetestingusingfragmentsanalysisby4capillaryelectrophoresis,withan
automatedsequencer(3130GeneticAnalyzer:AppliedBiosystems)usingtheGeneScanTM-500
ROXTMSizeStandard(AppliedBiosystem)
82
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Discussion Thecommercial“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”has11microsatellite
loci:TGLA227, Bm2113, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA023, ETH225, BM1824,
ETH3,andTGLA53 thathasbeenalreadyapprovedfor theiraccuracy.Thisstudytriedto
developmoremarkersetsofmicrosatellitelociandhadspenttimefindingoptimalconditions
inmultiplexPCRusingtheother11newmicrosatellitesmarkersalsorecommendedbyISAG.
TwosetsofmultiplexPCRhavetheoptimalconditionsasmentionabove.Every11microsatel-
litesHEL1, HEL5, ILSTS005, INRA063, INRA005, HEL13, BM1818, MM12, CSRM60, HEL9
and ETH185canamplifyDNAfragmentat11lociandshowedsimilarPEandPIinparentage
testingasusingthe“StockMarksforCattle®BovineGenotypingKit”(Figure3andTable3).
Theoretically,thePICvaluesshouldbehigherthan0.5.Inthisstudy,themeanPICvalueforall
lociwasfoundtobe0.712andrangedfrom0.535(HEL13)to0.917(HEL9)similartoZhang,
etal.,(2010),Rehout,etal.,(2006)andOzken,etal.,(2009).
Thehighgeneticvariabilityofmarkersindicatedtheirhigheffectivenessforparentage
testing.Thecombinedexclusionprobability(CEP)isameasureofabilityofmarkerstoidentify
geneticpaternityandexcludeallsuspectedcandidates.Theprobabilityofexclusionsisshown
inTable3.PE1estimatedtheprobabilityofexclusionofaparentwhengenotypesoftheoffspring
and two parents are known. PE2 estimated the probability of exclusion of parentage test
whengenotypesofoffspringandonlyoneparentwasknown,PI–Averageprobabilityoftwo
individualshaveidenticalgenotype,PI-Sib=Averageprobabilityoftwofullsiblingshasidentical
genotypes.InthisstudyPE1were0.999999forboththecommercialkitandnewtwosets
of11microsatellitekits.PE2ofthecommercialkitvalued0.999821andwas0.97900fornew
twosetsof11microsatellitekits.PIandPI-sibestimationswerehigh(2.14x10-11,7.72x10-6
and8.86x10-12,5.48x10-5respectively)inbothcommercialStockMarksandnew11markerkits.
PIindicatedhigheffectivenessinparentageanalysis.AllPE1PE
2,PIandPI-sibweresimilar
toZhang,et.Al.,(2010).
Inconclusion,thisstudydevelopedanewconvenientandefficienttwosetmultiplex
PCR(6and5microsatellitemarkers)forroutineidentificationandparentagetestingincattle
population.ByusingbothcommercialStockMarksandnewsetkitof11microsatellitemarkers
canbeusefulandincreasetheaccuracyinpedigreeandparentageanalysis.
83
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Acknowledgement TheauthorwouldliketoconveythankstotheDepartmentofLivestockDevelopment
forprovidingfinancialmeans.
References Bishop,M.D.andKappes,S.M.1994.Ageneticlinkagemapforcattle.Genetic.136
(5):619–639.
Botstein,D.,White,R.L.,Skolnick,M.andDavis,R.W.1980.Constructionofagenetic
linkagemapinmanusingrestrictionfragmentlengthpolymorphism.Am.J.Hum.
Genet.32(3):314-331.
Brezinsky L.S., Kemp, J. and Teale, A.J. 1993. ILSTS005: a polymorphic bovine
microsatellite.AnimalGenetics24:73.(2)
Carolino I., Sousa C.O., Ferreira S., Carolino N., Silva F. S., Gama L.T. 2009.
ImplementationofaparentagecontrolsysteminPortuguesebeef-cattlewitha
panelofmicrosatellitemarkers.GeneticsandMolecularBiology.32:306–311.
Divine, A.M, Edlund, H. andAllen,M. 2010. Forensic analysis of autosomalSTR
markersusingpyrosequencing.ForensicSci.Int-Gen.4:122-129.
Geldermann,H.,Pieper,U.andWeber,W.E.1986.Effectofmisidentificationonthe
estimationofbreedingvalueandheritabilityincattle.JournalofAnimalScience.
63(6):1759-1768.
ISAGConference.2008.Amsterdam,theNetherlands.CattleMolecularMarkersand
ParentageTestingWorkshop.[Online]http://www.isag.org.uk/ISAG/all/ISAG2008_
CattleParentage.pdf
Jakabova, D., Trandzik, J., Chrastina, J., Hudecova, L., Zetochova, E., Bulla, J.,
Bugarsky, A., Jakab, F. and Kozlik, P. 2002. Effectiveness of six highly
polymorphicmicrosatellitemarkersinresolvingpaternitycasesinThoroughbred
horsesinSlovakia.CzechJ.Anim.Sci.47:497-501.
Jamieson,A.andTaylor,S.C.S.1997.Comparisonsofthreeprobabilityformulaefor
parentageexclusion.Anim.Genet.28(6):397-400.
Kalinowski,S.T.,Taper,M.L.andMarshall,T.C.2007.Revisinghowthecomputer
programCERVUSaccommodatesgenotypingerrorincreasessuccessinpaternity
assignment.Mol.Ecol.16(5):1099-1006.
84
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Kaukinen,J.andVarvio,S.L.1993.Eightpolymorphicbovinemicrosatellites.Animal
Genetic.24(1):148.
Lewis,C,M,Jr.2010.Hierarchicalmodelingofgenome-wideshorttandemrepeat(STR)
markersinfersnativeAmericanprehistory.Am.J.Phys.Anthropol.141:281-289.
Mommens,G.W.andCoppieters,A.1994.Dinucleotiderepeatspolymorphismatthe
bovineMM12E6andMM8D3loci.AnimalGenetics25(6):368.
Moore. S.S., Byrne. K. 1994. Characterization of 65 bovine microsatellites.
MammalianGenome5(7):84–90.
Ozkan,E.,Soysal,M.I.,Ozder,M.,Koban,E.,Sahi,nO.andTogan,I.2009.Evaluation
of parentage testing in the Turkish Holstein population based on 12
microsatelliteloci.LivestockScience.124:101–106.
Rehout,V.,Hradecká,E.andCítek,J.2006.Evaluationofparentage testing in the
CzechpopulationofHolsteincattle.Czech.J.Anim.Sci.51(12):503-509.
Steffen,P.,Eggen,A.,Stranzinger,G.,Fries,R.,Dietz,A.B.andWomack,J.E.1993.
Isolationandmappingofpolymorphicmicrosatellitesincattle.AnimalGenetics.
24(2):121–124.
Taylor,G.R.1997.Laboratorymethodsforthedetectionofmutationsandpolymorphisms
inDNA.CRCPressInc.,BocaRaton,USA,333p.
Vaiman,D.,Merier,D.1994.Asetof99cattlemicrosatellites:characterization,synteny
mapping,andpolymorphism.MammalianGenome.5(3):288–297.
Vaiman,D.andOsta,D.1992.Characterizationoffivenewbovinemicrosatelliterepeats.
AnimalGenetics23(4):537.
Zhang,Y.,Wang,Y.,Sun,D.,Yu,Y.andZhang,Y.2010.Validationof17Microsatellite
MarkersforParentageVerificationandIdentityTestinChineseHolsteinCattle.
Asian-Aust.J.Anim.Sci.23(4):425–429.
85
Journal of Biotechnology in Livestock Production
บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ ในการศึกษาครั้งนี้ เพื่อตรวจหาความถี่ของการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์หนึ่ง
ตำแหน่ง(สนิป)ในส่วนโปรโมเตอร์ของยีนเลปติน(leptin5)และเพื่อหาหาความสัมพันธ์กับคุณภาพของซาก
รวมทั้งผลจากอัลตราซาวน์ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวน66ตัวอย่างของโคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%
ถูกนำมาเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยวิธี TaqMan probe real-time PCR และนำผลมาวิเคราะห์หาค
วามถี่ของอัลลิลและสนิปจี โนไทป์ของยีนเลปตินส่วนโปรโมเตอร์ที่ตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ 528 หมายเลข
ธนาคารยีน AB070368 ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงจากเบส C เป็น T ผลการวิเคราะห์พบว่า ความถี่ของ
อัลลิลC ในโคเพศผู้และเมีย เท่ากับ 0.79และ0.69ส่วนอัลลิล T เท่ากับ 0.21 และ0.31ตามลำดับ
สนิปจีโนไทป์CC,CTและTT ในโคเพศผู้เท่ากับ0.63,0.33และ0.04ส่วนในเพศเมียเท่ากับ0.47,
0.43 และ 0.10 ตามลำดับ ซึ่งพบว่าความถี่สนิปจี โนไทป์ของโคเพศผู้มีการกระจายอยู่ ในสัดส่วนของ
Hardy-Weinberg equilibrium คุณภาพซากจากผลอัลตราซาวน์พบว่าโคเพศเมียมีความหนาไขมันที่สะโพก
(RF) เท่ากับ 7.54±1.16 มม มากกว่าในเพศผู้ (3.91±1.53 มม) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05)
ในทางตรงกันข้าม ในโคเพศผู้มีเปอร์เซ็นต์ไขมันแทรกเนื้อ (IMF) เท่ากับ 3.56±0.24% มากกว่าในโคเพศ
เมีย(2.29±0.01%)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(p<0.05)ค่าเฉลี่ย(LSmean)ของคุณภาพซากของโคเพศ
ผู้และเพศเมียได้แก่พื้นที่หน้าตัดกล้ามเนื้อสันนอกส่วนริบอาย(REA)คะแนนไขมันแทรกเนื้อ(BMS)และ
ค่าแรงตัดผ่านเนื้อ(WBSF)เท่ากับ62.24ซม2,7.28มมและ14.63กกตามลำดับผลการวิเคราะห์
พบว่าเพศไม่มีอิทธิพลต่อREA(R2=0.25,p=0.827)และWBSF(R2=0.675,p=0.145)แต่มี
อิทธิพลต่อBF(R2=0.92,p=0.021)และBMS(R2=0.92,p=0.012)อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ
(p<0.05)นอกจากนี้พบว่าBMSได้รับอิทธิพลจากระยะเวลาการขุน(p<0.05)น้ำหนักสุดท้าย(p<0.05)
และยีน leptin5 (p<0.01) การศึกษานี้ ได้ผลที่น่าสนใจคือค่าBMSและWBSFมีความสัมพันธ์อย่าง
มีนัยสำคัญ(p=0.035)กับสนิปจีโนไทป์ของยีน leptin5โคที่มีสนิปจีโนไทป์CTมีค่าเฉลี่ยของBMS
สูงกว่า (3.42±0.47; 1.14±0.43)และมีค่าเฉลี่ยของWBSFต่ำกว่า (2.97±4.42; 14.86±1.91) โคที่มี
สนิปจีโนไทป์ CC อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) ผลการศึกษานี้สรุปได้ว่า สนิปจีโนไทป์ของยีน
leptin5มีความสัมพันธ์กับคะแนนไขมันแทรกเนื้อและความนุ่มของเนื้อ
คำสำคัญ:โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%คุณภาพซากสนิปจีโนไทป์เลปติน
ณชัย ศราธพันธุ์1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1 สายใจชื่นสุข1 และ กัลยา เก่งวิกย์กรรม1
1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์
ความสัมพันธ์ระหว่างสนิปของยีนเลปติน กับคุณภาพซากในโคเนื้อลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%
86
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Abstract The objective of this study was to determine frequency of a single nucleotide polymorphism (SNP) in the leptin promoter region (leptin5) and examine associations of ultrasoundandcarcassqualitytraits.Sixty-sixDNAsamplesfrom50%AngusxThai-nativecrossbredbeefwereanalyzedalleleandgenotypefrequencyofaSNPofleptingeneatthepromoterregion(g528C>T,AB070368)byTaqManprobereal-timePCR.FrequencyofalleleCwas0.79and0.69aswellasalleleTwas0.21and0.31inthemaleandfemaleanimals,respectively.ThegenotypefrequencyofCC,CTandTTwas0.63,0.33and0.04,aswellas0.47,0.43and0.10inmaleandfemaleanimals,respectively.Thegenotypefrequencyoftheleptin5SNPweredistributedaccordingtoHardy-Weinbergequilibriumproportionsinthemaleanimals.Thecarcassqualitytraitsofrumpfat(RF)fromultrasoundmeasurementwassignificantly higher in female (7.54±1.16 mm) than male (3.91±1.53 mm) animals (p<0.05).Incontrast, intramuscularfat(IMF) inmaleanimals(3.56±0.24%)wassignificantlyhigherthanfemale(2.29±0.01%)animals(p<0.01).Theleastsquaremeanofdependentvariableof carcassqualitytraitsincludedribeyearea(REA),backfat(BF),beefmarblingstandardscore(BMS;0-9)andWarner-BratzlerShearForce(WBSF)was62.24cm2,7.08(mm),2.28and14.63kgrespectively.TheresultshowedthatnoeffectofsexonREA(R2=0.25,p=0.827)andWBSF(R2=0.675,p=0.145)butithadsignificantlyeffectonBF(R2=0.92,p=0.021)andBMS(R2=0.92,p=0.012).TheBMSofthecarcasseswassignificantlyeffectedondurationoffattening(p<0.05),finalweight(p<0.05)andleptin5genotype(p<0.01).Interestingly,theWBSFofribeyesteakmusclewassignificantlyeffectedonleptin5genotype(p=0.035).Theeffectsofleptin5 genotypewereonlyfoundsignificantlyonBMSandWBSF.TheanimalscarriedCTgenotypehadsignificantlyhigherBMS(3.42±0.47;1.14±0.43)andlowerWBSF(2.97±4.42;14.86±1.91)thananimalscarriedCC leptin5genotype,respectively(p<0.05).TheresultsconcludedthattheSNPinbovine leptin5genehadhighlysignificantassociationwithbeefmarblingstandardscoreandalsoassociationwithmeattenderness.
Keywords:AngusxThai-native50%,Beef,Carcassqualitytraits,Genotype,Leptin,SNP
Nachai Sarataphan1 Saijai Cheunsuk1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 and Kalaya Kengvikkum1
1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Tiwanon Rd., Bangkadee, Muang, Pathumthani
AssociationofSNPintheBovineLeptinGenewithCarcassQualityTraitof50%AngusxThai–NativeCrossbredBeefCattle
87
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Introduction Leptinisa16-kDaproteinthatissynthesizedbyadiposetissueandisinvolvedin
regulationoffeedintake,energybalance,fertility,andimmunefunctions(Fruhbecketal.,1998).
Leptin binds to a receptormainly localized on neuropeptideY-neurons,which results in a
reductionoffeedintakeandanincreaseofenergyexpenditure.NeuropeptideYisalsoinvolved
inthecontrolofreproductivefunction(Magnietal.,2000).Althoughpoly-morphismsinthebovine
leptingenehavebeendescribed(Pompetal.,1997;Haegemanetal.,2000)andanassociation
withfatdepositioninbeefcattlewasreported(Fitzsimmonsetal.,1998).Thesephysiological
propertiessupportleptinasastrongcandidategeneforevaluationofgeneticpolymorphisms
thatcouldaffectcarcassfatcontentincattle.
PolymorphismsinthebovineleptinpromoterhadbeenreportedbyNkrumahetal.(2005).
ThestudyindicatedthatBos taurus x Bos tauruscrossbredcattlewiththeTTgenotypeat
nucleotideposition528accordingtoGenBankaccessionNo.AB070368show48and39%
increaseshighlysignificant inserumleptinconcentration,39and31%increasesinbackfat
thicknessand13and9% increasesignificant inmarblingscore,comparedwithCCorCT
genotypes,respectively.AssociationstudiesofSNPinthebovineleptinpromoterwithcarcass
qualitytraitshavenotbeenreportedyetinAngusxThai–native50%crossbredbeefcattle.
Theobjectiveofthisstudywastodeterminefrequencyofasinglenucleotidepolymorphism
(SNP) in the leptin promoter region (leptin5) and examine associations of ultrasound and
carcassqualitytraitsinAngusxThai–native50%crossbredbeefcattle.
MaterialandMethods Experimentalanimals
Sixty-six50%AngusxThainativecrossbredbeeffromtheprojectofahighquality
Thai-BlackbeefproductionundertheBureauofBiotechnologyinLivestockProduction(BBLP),
DepartmentofLivestockDevelopment(DLD)wereusedinthisstudy.Elevencastratedmale
ataverage1.71±0.08yrofagewith294.36±11.32kgand10femaleataverage1.66±0.07yrof
agewith295.10±15.37kgwereusedinexperimentofcarcassqualitytraits.Themalewere
fedwithstemsandsweetcornpulpsby-productofsweetcorncan.Fourteenpercentprotein
ofcommercialconcentratedfeedwereaddeddailyat4kgperanimal.Thefemaleanimalswere
fedwith14%proteinoftotalmixration(TMR)includingconcentratedanddryPangolahays.
88
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
DNAsamples
Bloodsamplesofeachanimalwerecollectedfromthejugularveininto6mlofEDTA
tube.Thebloodsampleswerekeptiniceboxandsubmittedtoourlaboratory.Twohundredml
ofeachbloodsamplewasextractedgenomicDNAbycommercialkit(AxyPrepBloodGenomic
DNAMiniprepkit:AxygenBioscience;USA).FrozensemensamplesofAngusbullwere
extractedDNAby thestandardphenol:chloroformmethod (Sambrooketal. 1989).Twenty
nanogramoftheDNAsampleswerepreparedfordetectingasinglenucleotidepolymorphism
(SNP)inthepromoterregionofbovineleptin(leptin5)gene.
SNPdetectionandgenotyping
ASNPof leptin5geneat thebovine leptinpromoteraccordingtoGenBankacces-
sionAB070368(g528C>T)wasamplifiedbyprimerandspecificprobes.Theforwardprimer:
5’-aggtgcccagggactca-3’,thereverseprimer:5’-caacaaaggccgtgtgaca-3’andtwoABITaqMan
fluorogenicprobes:Probe1,5’-caagctctagagcctGtgt-3’andProbe2,5’-aagctctagagcctAtgt-3’were
designedaccordingtoNkrumahetal.(2005).Theprobe1and2weretaggedwithVICand
FAMfluorescentdyeswhichshowedgreenandbluecolorofamplificationcurveinaresultof
analysisbyStepOnePlussoftware(StepOnePlus,ABI,USA).Aspecificmatchoftheprobe
sequencetothetargetsequencewillresultinamplification,duringwhichcleavageandrelease
ofthereporterdyeoccurs.Fluorescentsignalforoneortwodyesindicatedhomozygosityor
heterozygosityforaparticularalleleoftheSNP.
Ultrasoundforcarcassqualitytraits
At terminationof theexperiment, theanimal’sweightwere recorded.Mean±SE (n)
valuesofmaleandfemaleanimalswereaverage2.5±0.1and2.1±1.3yrofagewithliveweight
of425.4±17.7and400.9±22.1kg.Economicimportanttraitsforcarcassqualityincluding,rib
eyearea(REA)ofLongissimusdorsimuscle(cm2),backfat(BF)thickness(mm),lumpfat
(LF)thickness(mm)andpercentageofintramuscularfat(%IMF)weremeasuredatthe12th
and13thribinterface.Theultrasoundmeasurementwasdonebeforesubmittingtoslaughterby
real-timeultrasound(Aloka,Japan)witha17cm,3.5MHzlineararraytransducer.Thedata
wereanalyzedbyImageAnalysisSoftware(DesignerGenesTechnologies,Inc.,USA).
Carcassexamination
Ineachcarcass,ribeyeareamusclebetweenthe10thto13thribwerecutandsubmitted
toourlaboratoryfor14dofageing.OnehalfoftheREAmusclesampleswerecutinto250-300
gofribeyesteakforREA,backfatthicknessandbeefmarblingscore(BMS)measurement
(0-9)usingAustralian’scorecard.Theotherhalfofthecarcassesweredebonedandcut3x
2x5cmoflongitudinalLongissimusdorsimuscleforsubmittingtomeasureWarner-Bratzler
89
Journal of Biotechnology in Livestock Production
ShearForce(WBSF)usingthemachineofInstronModel1011(InstronCorporation,USA)at
theChiangMai’smeatlaboratoryundertheDLD.
Statisticalanalyses
Thegenotypeandallelefrequenciesofeachpolymorphismwereexaminedfordevia-
tionsfromHardy-Weinbergequilibrium(HWE)withinbothAngusxThainative50%crossbred
andAngus bull byX2 testwith statistic on 1 df. The carcass quality traits between the
experimentalmaleandfemaleanimalsaswellasgenotypesofleptin5genewerecompared
byPROCMEANS(leastsquaresmeans±standarderror).Co-variabledataeg.finalweight,
durationoffatteningwerealsocalculatedusingtheGLMprocedureofSASmanual.
ResultsandDiscussion SNPgenotypeandallelefrequencies
Expectedgenotypeandallelefrequenciesofleptin5geneinmaleandfemaleAngusx
Thai-native50%crossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-
of-fit revealed that themaleanimalswas inHardy-Weinbergequilibrium(HWE)proportions
(p=0.784).ButthefemaleanimalsshowedsignificantdeparturefromHWEproportions(p=0.048)
whichmightbetosystemicselectionforceinthepopulation.However,inbreedingcoefficient
(F)werenegativeFvalues(F<0)inbothmaleandfemaleanimalsindicatingtheabsenceof
inbreedingatthisgene.Incontrast,theresultofX2testofgoodness-offitinAngus100%
bullwasinHWEproportions(p=0.166)andFvaluewasbelowzeroindicatingoutbreedingin
thesebulls.ThefrequencyoftheTalleleofleptin5genewas0.21and0.31inmaleandfemale
AngusxThainative50%crossbredbeef,respectively.ThefrequencyoftheTallelewas0.40
inAngus100%bullwhichwashigherthantheAngusxThainative50%crossbredcattle.
ThefrequencyoftheTalleleofleptin5geneoftheanimalsinthisstudywasnearlysimilar
toexperimentalanimalsinastudyofNkrumahetal.(2005).TheTallelefrequency(0.11-0.26)
wassignificantdifferentamongcrossbredlinesusingAngus,HerfordandCharolaissires.
TheoverallaverageandstandarderrorsforthetraitstestedareinTable2.Ultrasound
rumpfatshowedsignificantdifferent(p=0.028)amongthemaleandfemaleanimals.Ultrasound
intramuscularfat(IMF,%)washighlysignificantdifferent(p=0.001)amongthemale(3.56±0.24)
and female (2.29±0.01) animals. Carcass back fat thickness was significant (p=0.021)
different among the male (3.83±2.01) and the female (13.58±2.06) animals. Carcass beef
marblingscore(BMS0-9)wasalsosignificant(p=0.012)differentamongthemale(2.74±0.18)
andthefemale(0.84±0.21)animals.Inaddition,durationoffatteningandfinalweightofthe
animalswassignificantly(p=0.010andp=0.023)associatedwithBMSasshownintable3.
90
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
SNPgenotypeeffects
Theleptin5genotypewashighlysignificant(p=0.005)associatedwithBMSandwas
significantly(p=0.035)associatedwithWBSFaspresentedinTable3.Theeffectsofleptin5
genotypeonthecarcassqualitytraitsanalyzedareshowninTable4.Theleptin5genotype
wasnotassociatedwithultrasoundandcarcassREA,BF,RFandIMF.TheBMSdiffered
(p<0.05)amonggenotypesandwashigherforanimalswithgenotypeCT(3.42±0.47)thanfor
animalswithgenotypeCC(1.14±0.43).ThesamplesizeofanimalwithgenotypeTTwastoo
smallforstatisticcomparisoninthisstudy.However,animalsinheritingwithgenotypeTThad
highlysignificantlyhigherultrasoundBFandBMS(p=0.01)comparedwithgenotypeCTorCC
(Nkrumahetal.,2005).Interestingly,animalswithCTgenotype(2.97±4.42kg)hadsignificant
(p<0.05) lowerWBSF compared with genotype CC (14.86±1.91 kg). The sample size of
animalwithgenotypeTTwastoosmallforstatisticcomparisoninthisstudy.Inpresentstudy
indicatedthatSNPgenotypiceffectofleptin5genewasindirectlyinfluencedonWBSFdueto
effectofleptin5genotypeonBMS.Inaddition,themeanvalueofBMSwasslightlyassociated
(r=-0.32)withWBSFvalue,thoseweresimilarlytothestudyof(Bertrandetal.,2001).It
indicatedthatgreatermarblingisslightlyassociatedwithgreatermeattenderness.Theresults
representtheinitialassociationsofleptin5genotypeswithcarcassqualitytraitsandfurther
effortsarerequiredtovalidatethesefindingsinotheranimalpopulationsbeforetheirapplication
inmarker-assistedselection.
References Bertrand,J.K.,Green,R.D.,Herring,W.O.andMoser,D.W.2001.Geneticevaluation
ofbeefcarcasstraits.J.Anim.Sci.79(SupplE):190–200.
Buchanan,F.C.,Fitzsimmons,C.J.,VanKessel,A.G.,Thue,T.D.,Winkelman–Sim,
C.andSchmutz,S.M.2002.Associationofamissensemutationinthebovine
leptingenewithcarcassfatcontentandleptinmRNAlevels.Genet.Sel.Evol.
34:105-116.
Fitzsimmons,C. J.,Schmutz,S.M.,Bergen,R.D. andMcKinnon, J. J. 1998.A
potentialassociationbetweentheBM1500microsatelliteandfatdepositionin
beefcattle.Mamm.Genome9:432–434.
Fruhbeck, G., Jebb, S. A. and Prentice, A. M. 1998. Leptin: Physiology and
pathophysiology.Clin.Physiol.18:399–419.
91
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Haegeman,A.,VanZeveren,A.andPeelman,L.J.2000.Newmutationinexon2of
thebovineleptingene.Anim.Genet.31:79.
Magni,P.,Motta,M.andMartini,L.2000.Leptin:Apossiblelinkbetweenfoodintake,
energyexpenditure,andreproductivefunction.Regul.Pept.92:51–56.
Nkrumah, J.D., Li, C., Yu, J., Hansen, C., Keisler, D.H. and Moore, S.S. 2005.
Polymorphisms in the bovine leptin promoter associated with serum leptin
concentration,growth,feedintake,feedingbehavior,andmeasuresofcarcass
merit.J.Anim.Sci.83:20-28.
Pomp,D.,Zou,T.,Clutter,A.C.andBarendse,W.1997.Rapidcommunication:mapping
ofleptintochromosome4bylinkageanalysisofaPCR-basedpolymorphism.
J.Anim.Sci.75:1427.
Table 1 ExpectedgenotypeandallelefrequencyoftheSNPleptin5genederivedfromHardy-
Weinbergequilibriumcalculationin50%AngusxThainative(TN)crossbredbeefandBlack
Angusbull
AngusxTN50%
-Male 29 0.63 0.33 0.04 0.79 0.21 0.07 0.784 -0.050
-Female 37 0.47 0.43 0.10 0.69 0.31 3.90* 0.048* -0.324
Angus100% 10 0.36 0.48 0.16 0.60 0.40 0.28 0.166 0.166
n CC CT TT C T x2 P F
Exp.GenotypeAllele
FrequencyofBreed
TestsfordeviationfromHardy-Weinbergequilibrium
X2 chi-square,P=Pearson’sgoodnessoffitchi-square,F=Inbreedingcoefficient,*p<0.05
92
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Ultrasound(n=30) 8 22
Ribeyeare(cm2) 79.15±6.4 73.59±4.87 0.388
Ribeyearea(cm2/100kgBW) 19.09±1.81 18.36±1.37 0.682
Backfat(mm) 3.17±1.21 5.35±1.21 0.085
Rumpfat(mm) 3.91±1.53 7.54±1.16 0.028*
Intramuscularfat(IMF,%) 3.56±0.24 2.29±0.01 0.001**
Carcass(n=26) 8 18
Ribeyearea(cm2) 67.28±12.81 70.54±9.83 0.818
Ribeyearea(cm2/100kgBW) 16.40±3.27 17.32±2.51 0.767
Backfat(mm) 3.83±2.01 13.58±2.06 0.021*
Beefmarblingstandardscore(0-9) 2.74±0.18 0.84±0.21 0.012*
Male Female
Mean±SECarcassqualitytraits
P
Table 2 Leastsquaresmeans±SEshowingtheeffectofsexonmusclequalitytraitsofmale
andfemale50%AngusxThainativecrossbredbeef
Table 3 Probabilityofdependentvariableofcarcassqualitytraitsassociatedwithco-variable
datain50%Angusxnativecrossbredbeef
*p<0.05,**p<0.01
*p<0.05,**p<0.01
Dependentvariableofcarcassqualitytraits
REA REA/100 Backfat BMS WBSF
Mean 62.24 15.26 7.08 2.28 14.63
R2 0.254 0.287 0.922 0.732 0.675
Probability(P)
Sex 0.827 0.767 0.021* 0.012* 0.145
Durationoffattening 0.287 0.322 0.062 0.010* 0.453
Finalweight 0.927 0.214 0.817 0.023* 0.089
Leptin5genotype 0.904 0.904 0.859 0.005** 0.035*
93
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Ultrasound(n=30) 14 15 1
Ribeyearea(cm2) 71.57±4.29 75.85±5.01 81.69±9.88
Ribeyearea(cm2/100kgBW) 18.74±2.73 18.42±1.01 19.02±2.07
Backfatthickness(mm) 5.20±0.85 4.59±0.94 2.97±1.86
Rumpfat(mm) 5.66±1.08 6.72±1.19 4.80±2.35
Intramuscularfat(%) 2.93±0.23 2.94±0.26 2.91±0.49
Carcass(n) 10 15 1
Ribeyearea(cm2) 69.59±9.91 64.92±10.85 72.23±17.62
Ribeyearea(cm2/100kgBW) 16.99±2.53 15.68±2.77 17.58±4.49
Backfatthickness(mm) 8.22±1.34 9.44±2.15 8.54±2.64
Beefmarblingscore(0-9) 1.14±0.43a 3.42±0.47b 0.81±0.77a
Warner-BratzlerShearForce(kg) 14.86±1.91* 2.97±4.42* nd
CC CT
Leptin5 genotypeCarcassqualitytraits
TT
Table 4 Mean±SEvaluesofcarcassqualitytraitsoftheanimalscarriedCC,CTandTTgeno-
typeoftheleptin5gene
a,b Withinthecarcassqualitytraitsinacolumn,genotypeswithoutacommonsuperscript letterdiffer(p<0.05),*p<0.05,nd=notdone
94
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
บทคัดย่อ วัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ เพื่อหาความถี่อัลลิลและสนิปจีโนไทป์ ในยีนคาลเปนและ
ยีนคาปาส ตาติน และหาความสัมพันธ์กับความนุ่มของเนื้อของโคลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง 50%
ตัวอย่างดีเอ็นเอจำนวน66ตัวอย่างได้นำมาวิเคราะห์ด้วยเครื่องหมายสนิปCAPN14751และCAST-
T1โดยเทคนิคTaqManProbereal-timePCRผลการศึกษาพบว่าตัวอย่างโคมีความถี่อัลลิลCและT
ของยีนคาลเปนเท่ากับ0.55และ0.45ในโคเพศผู้ส่วนในโคเพศเมียมีความถี่อัลลิลเท่ากับ0.42และ0.58
ตามลำดับความถี่สนิปจีโนไทป์CC,CTและTTเท่ากับ0.30,0.49และ0.21ในโคเพศผู้และเท่ากับ
0.17,0.49และ0.34ในเพศเมียตามลำดับส่วนยีนคาลปาสตาตินมีความถี่อัลลิลGและAเท่ากับ0.28
และ0.72ในโคเพศผู้และเท่ากับ0.20และ0.80ในโคเพศเมียตามลำดับความถี่สนิปจีโนไทป์GG,
AGและAAเท่ากับ0.07,0.36และ0.56ในโคเพศผู้และเท่ากับ0.04,0.30and0.66ในโคเพศเมีย
ตามลำดับ การกระจายของความถี่สนิปจี โนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาติน พบว่าอยู่ ในภาวะ
ไม่สมดลุย์และสมดลุย์ของHardy-Weinbergequilibriumตามลำดบัความนุม่ของเนือ้สนันอกสว่นรบิอายของ
โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมือง50%จำนวน20ตัวได้จากการวัดค่าแรงตัดผ่านเนื้อหลังจากบ่มซาก14วัน
โคตัวผู้มีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ 5.96±3.36 กก. ส่วนในตัวเมียมีค่าเท่ากับ 11.87±2.83 กก. แสดงว่า
โคตัวผู้มีค่าแรงตัดผ่านเนื้อต่ำกว่าในตัวเมียอย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (p>0.05) ในโคที่มีสนิปจีโนไทป์
ของยีนคาลเปนเป็นCTและTTมีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ11.53±1.95และ6.31±4.17กก.ตามลำดับ
ซึ่งมีค่าเฉลี่ยไม่แตกต่างกันทางสถิติ (p=0.241) ส่วนในโคที่มีสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลปาสตาตินเป็น AA,
AGและGGมีค่าแรงตัดผ่านเนื้อเท่ากับ9.5±3.41,8.15±3.97และ9.05±3.51กก.ตามลำดับซึ่งมี
คา่เฉลีย่ไม่แตกตา่งกนัทางสถติิ(p=0.751-0.922)การทดลองในครัง้นี้สรปุได้วา่สนปิจีโนไทป์ของยนีคาลเปน
และคาลปาสตาตินมีอิทธิพลต่อความนุ่มของเนื้ออย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ(p>0.05)
คำสำคัญ:โคลูกผสมแองกัสxพื้นเมืองไทย50%คาลเปนคาลปาสตาตินความนุ่มของเนื้อสนิปจีโนไทป์
ณชัย ศราธพันธุ์1 สายใจ ชื่นสุข1 ณัฐนันท์ ศิริรัตนธัญญะกุล1
เลิศชัย จินตพิทักษ์สกุล2 และ กัลยา เก่งวิกย์กรรม1
1 สำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์ 2 สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสัตว์
อิทธิพลสนิปจีโนไทป์ของยีนคาลเปนและคาลปาสตาตินต่อลักษณะความนุ่มของเนื้อในโคลูกผสมแองกัส50%(Thai-Black)
95
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Abstract TheobjectiveofthisstudywastodeterminefrequencyandassociationofSNPgenotype
in calpain (CAPN1) and calpastatin (CAST) gene with meat tenderness. Sixty-six DNA
samplesfrom50%AngusxThai-Nativecrossbredbeefwereanalyzedtwosinglenucleotide
polymorphisms(SNPs)andSNPgenotypefrequencyofCAPN1and CASTgenebyCAPN1
4751andCAST-T1markersviaTaqManprobereal-timePCR.FrequencyofalleleCandTin
CAPN1 genewas0.55and0.45aswellas0.42and0.58inmale(n=29)andfemale(n=37)
animals,respectively.TheSNPgenotypefrequenciesofCC,CTandTTinCAPN1genewas
0.30,0.49and0.21,aswellas0.17,0.49and0.34inmaleandinfemaleanimals,respectively.
AllelefrequencyofGandAinCASTgenewas0.28and0.72aswellas0.20and0.80in
maleandfemaleanimals,respectively.TheSNPgenotypefrequencyofCASTgene,including
GG,AGandAAwas0.07,0.37and0.56inmale,aswellas0.04,0.30and0.66infemale
animals,respectively.TheSNPgenotypefrequencyoftheCAPN1andCASTgeneswerenot
andweredistributedaccordingtoHardy-Weinbergequilibriumproportions,respectively.Meat
tendernessofrib-eyesteakmuscleswasmeasuredbyWarner-BratzlerShearForce(WBSF)
at14dpostmortemageingfrom11maleand9femaleof50%AngusxThai-Nativecrossbred
beef.TheWBSFvalueswere5.96±3.36and11.87±2.83kginmaleandfemaleanimals,
respectively. It revealed that the rib eyesteakmuscleofmaleanimal hadnosignificantly
(p>0.05)moretenderthanthoseoffemaleanimals.Moreover,theWBSFvalueswere11.53±1.95
and6.31±4.17inanimalscarriedCTandTTgenotypeofCAPN1gene(p=0.241).Inaddition,
theWBSFvalueswere9.5±3.41,8.15±3.97and9.05±3.51inanimalscarriedAA,AGandGG
genotypeof CASTgene(p=0.751-0.922).Itwasconcludedthattherewasnosignificanteffect
oftheSNPgenotypeofCAPN1 and CASTgenesonmeattendernessinthisstudy.
Keywords:AngusxThai-native50%,Beef,µ-Calpain,Calpastatin,Gene,Meattenderness
Nachai Sarataphan1 Saijai Cheunsuk1 Nattanant Sirivattanatanyakul1 Lerdchai Chintapitasakul2 and Kalaya Kengvikkum1
1 Bureau of Biotechnology in Livestock Production, Pathumthani 1 National Institute of Animal Health, Bangkok, 10900
SNPGenotypicEffectofµ-CalpainandCalpastatin GenesonTendernessTraitin50%AngusCrossbred(Thai-Black)
96
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Introduction Meat tenderness is a critical trait in determining consumer satisfaction, and there
hasbeensignificantinterestingeneticselectiontodecreaseproblemswithmeattenderness
variation.However,theproblemofvariabilityinmeattendernesshasnotdiminished,inpart
becauseofaninabilitytoaccuratelyselectforincreasedtenderness.Identificationofgenetic
markersformeattendernessvariationwouldprovidesomeselectioncriteriatofacilitatege-
neticimprovementinthistrait.PreviousstudyidentifiedaQTLinfluencingmeattendernesson
chromosome29(Casasetal.,2000).Subsequently,thebovinecalcium-activatedneutralprotease
(CAPN1)gene,encodingtheprotease-calpain,wasmappedtotheQTLinterval(Smithetal.,
2000).Thisproteaseseemstobetheprimaryenzymeinpostmortemtenderization(Koohmaraie,
1996),suggesting frombothpositionalandfunctionalstandpoints thatvariation in thegene
sequencemightbeassociatedwithmeattendernessincattle.SequencingthebovineCAPN1
geneinamultibreedpanelofcattleidentified>150sequencevariationsspreadalong>11,000
bp.Twosingle-nucleotidepolymorphisms(SNP)predictvariationintheproteinsequenceofthe
protease(Pageetal.,2002).
Thephysiologicalchangeinmusclestructureduringthepostmortemperiodiscomplex
(Koohmaraie, 1994). The calpain/calpastatin system is an endogenous, calcium-dependent
proteinase system, theorized tomediate the proteolysis of keymyofibrillar proteins during
postmortemstorageofcarcassandcutsofmeatatrefrigeratedtemperatures(Koohmaraieet
al.,1995b).Calpainisresponsibleforthebreakdownofmyofibrillarproteins,whichareclosely
relatedtomeattenderness(WheelerandKoohmaraie,1994).Calpastatin(CAST)inhibitscalpain
activityand,therefore,regulatespostmortemproteolysis.IncreasedpostmortemCASTactivity
hasbeencorrelatedwithreducedmeattenderness(e.g.,Koohmaraieetal.,1995a;Pringleet
al.,1997).TheCASTgene,mappedtoBTA7(Bishopetal.,1993),isconsideredacandidate
gene forbeef tenderness.More recently,genetic tests formeat tenderness inbeef,which
utilizegeneticpolymorphismsintheCAPN1and/orCASTgenes,havebeenmadeavailable
byprivatecompanies.ExamplesaretheIGENITYTenderGENEtest(MerialLtd.,Atlanta,GA)
andtheGene-STARTenderness2test(GeneticSolutionsPty.Ltd.,Albion,Australia).The
objectiveofthisstudywastoassesstheassociationoftwoSNPsintheCAPN1andCAST
genewithmeattendernessinAngusxThai-native50%crossbredbeefcattle.
97
Journal of Biotechnology in Livestock Production
MaterialsandMethods Experimentalanimals
Sixty-six50%AngusxThainativecrossbredbeeffromtheprojectofahighquality
Thai-BlackbeefproductionundertheBureauofBiotechnologyinLivestockProduction(BBLP),
DepartmentofLivestockDevelopment(DLD)wereusedinthisstudy.Elevencastratedmale
ataverage1.71±0.08yrofagewith294.36±11.32kgand10femaleataverage1.66±0.07yrof
agewith295.10±15.37kgwereusedinexperimentofcarcassqualitytraits.Themalewere
fedwithstemsandsweetcornpulpsby-productofsweetcorncan.Fourteenpercentprotein
ofcommercialconcentratedfeedwereaddeddailyat4kgperanimal.Thefemaleanimalswere
fedwith14%proteinoftotalmixration(TMR)includingconcentratedanddryPangolahays.
DNAsamples
Bloodsamplesofeachanimalwerecollectedfromthejugularveininto6mlofEDTA
tube.Thebloodsampleswerekeptiniceboxandsubmittedtoourlaboratory.Twohundredml
ofeachbloodsamplewasextractedgenomicDNAbycommercialkit(AxyPrepBloodGe-
nomicDNAMiniprepkit:AxygenBioscience;USA).FrozensemensamplesofAngusbull
wereextractedDNAbyphenol:chloroformmethod(Sambrooketal.1989).Twentynanogram
oftheDNAsampleswerepreparedfordetectingtwoSNPsintheCAPN1andCASTgene.
SNPdetectionandgenotyping
ASNPofCAPN1gene,namelyCAPN14751,atthenucleotide6545accordingtoGenBank
accessionAF248054(g6545C>T)wasamplifiedbyprimerandspecificprobes.Theforward
primer:5’-tggcatcctccccttgact-3’,thereverseprimer:5’-cccccgtcacttgacaca-3’andtwoABITaq-
Manfluorogenicprobes:Probe1,5’-cgcctcGgttttc-3’andProbe2,5’-cgcctcAgttttc-3’weredesigned
accordingtoWhiteetal.(2005).ASNPofCASTgene,namelyCAST-T1,atthenucleotide
2959accordingtoGenBankaccessionAF159246(g2959A>G)wasalsoamplifiedbyprimer
andspecificprobes.Theforwardprimer:5’-ctcacgtgttcttcagtgttctg-3’,thereverseprimer:5’-caac-
ccaaagaaacatcaaacacagt-3’andtwoABITaqManfluorogenicprobes:Probe1,5’-cctttcctcttA-
gacttgt-3’,Probe2:5’-ctttcctcttGgacttgt-3weredesignaccordingtoBarendse(2002).
Real-timepolymerasechain reaction (PCR)mixture contained20ng (1 µl) ofDNA
sampletemplate,5µlofTaqManGenotypingMasterMix(2x),0.5µlofTaqMangenotyping
assaymix(20x)and3.5µlofDNase-free,RNAsefreewater.Real-timePCRwasperformed
inthethermalcyclermachine(StepOnePlus,ABI,USA).PCRreactionwasactivatedAmpliTaq
Goldenzymeat95oCfor10min,thenthermalcycleof40cyclesincludeddenaturationat
95oCfor15sandannealingat60oCfor1min.Theprobe1and2weretaggedwithVICand
98
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
FAMfluorescentdyeswhichshowedgreenandbluecolorofamplificationcurveinaresultof
analysisbyStepOnePlussoftware(StepOnePlus,ABI,USA).Aspecificmatchoftheprobe
sequencetothetargetsequencewillresultinamplification,duringwhichcleavageandrelease
ofthereporterdyeoccurs.Fluorescentsignalforoneortwodyesindicatedhomozygosityor
heterozygosityforaparticularalleleoftheSNP.
Carcassexamination
Ineachcarcass,ribeyearea(REA)musclebetweenthe10thto13thribwerecutand
submittedtoourlaboratoryfor14dofageing.OnehalfoftheREAmusclesampleswerecut
into250-300gofribeyesteakforREA,backfatthicknessandbeefmarblingscore(BMS)
measurement(0-9)usingAustralian’scorecard.Theotherhalfofthecarcassesweredeboned
andcutinto3x2x5cmoflongitudinalLongissimusdorsimuscleforsubmittingtomeasure
Warner-BratzlerShearForce(WBSF)usingthemachineofInstronModel1011(InstronCor-
poration,USA)attheChiangMai’smeatlaboratoryundertheDLD.
Statisticalanalyses
Gene-marker frequenciesforAngusxThainative50%crossbredbeefwithCAPN1
andCASTgenemarkerwereestimatedusingthegenotypedata.TestofdeviationfromHardy-
Weinbergequilibrium(HWE)wasperformedandtestedagainsttheirexpectationsusingthe
chi-squaredtestwithstatisticon1df.Allanalysesofcarcassqualitytraitswereperformed
usingtheGLMprocedureofSASmanual.Thecarcassqualitytraitsbetweentheexperimental
maleandfemaleanimalsaswellasgenotypesofCAPN1andCASTgeneswerecompared
byPROCMEANS.
ResultsandDiscussion ExpectedgenotypeandallelefrequenciesofCAPN1geneinmaleandfemaleAngusx
Thai-nativecrossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-of-fit
revealedthatthemaleandfemaleshowedsignificantdeparturefromHWEwhichmightbeto
systemicselectionforceinthepopulation.However,inbreedingcoefficient(F)werenegative
Fvalues(F<0)indicatingtheabsenceofinbreedingatthisgene.Incontrast,thisstudythe
resultofX2testofgoodness-offitinAngus100%bullwasinHWEandFvaluewasbelow
zeroindicatingoutbreedinginthesebulls.FavorablealleleCfrequencyofCAPN1gene(0.47)
hadbeenreportedinredAngus(VanEenennaametal.2007)whichsimilarlyvalue(0.42-0.55)
inthemaleandfemaleanimalsandlowervalue(0.60)thanBlackAngusinthisstudy.
99
Journal of Biotechnology in Livestock Production
ExpectedgenotypeandallelefrequenciesofCASTgeneinmaleandfemaleAngusxThai-nativecrossbredbeefwasshowninTable1.TheresultsoftheX2testofgoodness-of-fitrevealedthatthemaleandfemalewasinHWEandFvalueswerenegative(F<0)indicatingtheabsenceofinbreedingatthisgenesimilartoAngus100%bull.FavorablealleleAfrequencyofCASTgene(0.89)hadbeenreportedinAngus(VanEenennaametal.2007)whichwashighervalue(0.72-0.80)thaninthemaleandfemaleanimalsandlowervalue(0.95)thanBlackAngusinthisstudy.
TheWBSFvalueswere5.96±3.36and11.87±2.83kg(p=0.145)inmaleandfemaleanimals,respectivelyasshowninTable2.Itrevealedthattheribeyesteakmuscleofmaleanimalhadnosignificantly(p >0.05)moretenderthanthoseoffemaleanimals.Moreover,theWBSFwasalsonotassociatedwithperiodoffattening(p=0.453)andfinalliveweight(p=0.089)oftheanimalsinthisstudy(Table3).Theresultindicatedthattherewasnosignificanteffectofsex,periodoffatteningandfinalliveweightontendernesstrait.Interestingly,leptin5geneshowedasignificanteffect(p =0.035)ontendernessinAngusxThai-native50%crossbredbeef.Inaddition,leptin5 geneshowedahighlysignificanteffect(p=0.005)onbeefmarblingscore.Itwaspossiblethatphenotypicandgeneticrelationshipsbetweenmarblingandtender-nessarenotespeciallyhighbutshowafavorabledirection.Itindicatedthatgreatermarblingisslightlyassociatedwithgreatertenderness(Bertrandetal.,2001).
Intable3,thestudywasnotdetectsignificantassociationofCAPN1(p=0.241)andCAST (p=0.940)polymorphismswithmeat tenderness. In table4, theWBSFvalueswere11.53±1.95and6.31±4.17inanimalscarriedCTandTTgenotypeofCAPN1gene(p=0.241).Inaddition,theWBSFvalueswere9.5±3.41,8.15±3.97and9.05±3.51inanimalscarriedAA,AGandGGgenotypeofCASTgene(p=0.751-0.922).ItwasconcludedthattherewasnosignificanteffectoftheSNPgenotypeofCAPN1andCASTgenesonmeattendernessinthisstudy. InthisstudywassimilartobothstudiesofLonerganetal.(1995)andChungetal.(1999)thatassociationofCASTpolymorphismwerenotdetectedsignificantlywithmeattenderness.Itwaspossiblethatthesamplesizesweresmall,whichmayhavecontributedtothefailuretoidentifysignificantassociationbetweenthe CASTgenepolymorphismsandmeattenderness.However,thestudyofCasasetal.(2006)usingalargesamplesizesofcrossbredEuropeanbeef(n>500)andpurebreedBrahman(n=444)wasperformedtodetecttheCAPN1andCAST polymorphismsbythesameourmarkers.TheresultsshowedthatanimalsinheritingtheCCgenotypeofCAPN1genehadmeatthatwasmoretenderthanthoseinheritingtheTTgenotype.Inaddition,animalsinheritingtheAAgenotypeofCASTgenehadmoremeattendernessthanthoseinheritingtheGGgenotype.ItconcludedthattheCAPN14751andCAST-T1markersaresuitableforuseinidentifyingBos taurus x Bos taurus, Bos taurus x Bos indicuscrossbredandpurebreedBrahmanbeefwiththegeneticpotentialtoproducemeatthatismoretender.
100
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
References Barendse, W.G. 2002. DNA markers for meat tenderness. International patent
applicationNo.PCT/AU02/00122.WorldIntellectualPropertyOrg.Int.Publication
No.WO02/064820A1.
Bertrand,J.K.,Green,R.D.,Herring,W.O.andMoser,D.W.2001.Geneticevaluationof
beefcarcasstraits.J.Anim.Sci.79(SupplE):190–200.
Bishop,M.D.,Koohmaraie,M.,Killefer,J.andKappes,S.1993.Rapidcommunication:
Restriction fragment length polymorphisms in the bovine calpastatin gene.
J.Anim.Sci.71:2277.
Casas,E.,Shackelford,S.D.,Keele,J.W.,Stone,R.T.,Kappes,S.M.andKoohmaraie,
M.2000.Quantitativetraitlociaffectinggrowthandcarcasscompositionofcattle
segregatingalternateformsofmyostatin.J.Anim.Sci.78:560–569.
Casas,E.,White,S.N.,Wheeler,T.L.,Shackelford,S.D.,Koohmaraie,M.,Riley,D.G.,
Chase,C.C.,Johnson,Jr.,D.D.andSmith,T.P.L.2006.Effectsofcalpastatin
and{micro}-calpainmarkersinbeefcattleontendernesstraits.J.Anim.Sci.
84:520–525.
Chung,H.Y.,Davis,M.E.,Hines,H.C. andWulf,D.M. 1999.Relationship of a
PCR-SSCPatthebovinecalpastatinlocuswithcalpastatinactivityandmeat
tenderness.J.Anim.Sci.77(Suppl1):31.(Abstr.)
Koohmaraie, M. 1994. Muscle proteinases and meat aging. Meat Sci. 36:93–104.
Koohmaraie, M. 1996. Biochemical factors regulating the toughening and
tenderizationprocessofmeat.MeatSci.43:S193–S201.
Koohmaraie, M., Killefer, J., Bishop, M. D., Shackelford, S. D.,Wheeler, T. L. and
Arbona,J.R.1995a.Calpastatin-basedmethodsforpredictingmeattenderness.
Pages395–412inExpressionofMuscleProteinasesandRegulationofProtein
DegradationasRelatedtoMeatQuality.A.Ouali,D.Demeyer,andF.Smulders,
ed.AudetTijdschrifrenb.v.,Nijmegen,TheNetherlands.
Koohmaraie, M., Wheeler, T. L. and Shackelford, S. D. 1995b. Beef tenderness:
Regulationandprediction.Pages1–10inProc.Meat’95:CSIROMeatIndustry
Res.Conf.,Session4A.CSIROAustralia,Brisbane,Australia.
101
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Page,B.T.,Casas,E.,Heaton,M.P.,Cullen,N.G.,Hyndman,D.L.,Morris,C.A.,
Crawford,A.M.,Wheeler,T.L.,Koohmaraie,M.,Keele,J.W.andSmith,T.P.
L.2002.EvaluationofsinglenucleotidepolymorphismsinCAPN1forassociation
withmeattendernessincattle.J.Anim.Sci.80:3077–3085.
Pringle,T.D.,Williams,S.E.,Lamb,B.S.,Johnson,D.D.andWest,R.L.1997.
Carcasscharacteristics,theCalpainproteinasesystem,andagedtendernessof
AngusandBrahmancrossbredsteers.J.Anim.Sci.75:2955–2961.
Lonergan,S.M.,Ernst,C.W.,Bishop,M.D.,Calkins,C.R.andKoohmaraie,M.1995.
Relationshipofrestrictionfragmentlengthpolymorphisms(RFLP)atthebovine
calpastatin locus to calpastatin activity andmeat tenderness. J.Anim.Sci.
73:3608–3612.
Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratory
Manual.2nded.ColdSpringHarborLab.Press,NewYork,NY.
Wheeler,T.L.,andKoohmaraie,M.1994.Prerigorandpostrigorchangesintenderness
ofovinelongissimusmuscle.J.Anim.Sci.72:1232–1238.
White,S.N.,Casas,E.,Wheeler,T.L.,Shackelford,S.D.,Koohmaraie,M.,Riley,D.G.,
ChaseC.C.Jr.,Johnson,D.D.,Keele,J.W.andSmith,T.P.L.2005.Anew
single nucleotide polymorphism in CAPN1 extends the current tenderness
markertesttoincludecattleofBosindicus,Bostaurus,andcrossbreddescent.
J.Anim.Sci.83:2001–2008.
VanEenennaam,A.L.,Li,J.,Thallman,R.M.,Quaas,R.L.,Dikeman,M.E.,Gill,C.
A.,Franke,D.E.andThomas.M.G.2007.ValidationofcommercialDNAtests
forquantitativebeefqualitytraits.J.Anim.Sci.85:891–900.
102
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์
Table 1 AlleleandgenotypefrequencyofCAPN1andCASTgenederivedfromHardy-Weinberg
EquilibriumcalculationinAngus100%andAngusxThainative(AngusxTN)50%crossbred
beef
AngusxTN50%
-Male 29 0.30 0.49 0.21 0.55 0.45 13.14 2.8e-4** -0.673
-Female 37 0.17 0.49 0.34 0.42 0.58 13.76 2.07e-4** -0.609
Angus100% 10 0.36 0.48 0.16 0.60 0.40 3.40 0.065 0.583
AngusxTN50%
-Male 29 0.07 0.37 0.56 0.28 0.72 1.26 0.261 -0.208
-Female 37 0.04 0.30 0.66 0.20 0.80 2.39 0.121 -0.254
Angus100% 10 0.01 0.09 0.90 0.05 0.95 0.03 0.867 -0.053
CC CT TT C T x2 P F
Breed/ n
CAPN1gene:
Frequencyof
TestsfordeviationfromHardy-Weinbergequilibrium
X2 chi-square,P=Pearson’sgoodnessoffitchi-square,F=Inbreedingcoefficient,** p<0.05
Frequencyof
Breed/ n
CASTgene: CC CT TT C T x2 P F
2.50±0.15
2.10±0.13
Male(n=11)
Female(n=10)
Age(yr)Sex
5.96±3.36
11.87±2.83
425.36±17.75
400.90±22.14
LiveWeight(kg) WBSF(kg)
Cowgroups
Table 2 Mean±SEvaluesofageatslaughter,liveweightandWarner-BratzlerShearForce
(WBSF)ofmaleandfemale50%Angusxnativecrossbredbeef
abc Leastsquaremeanswithdifferent letterswithin thecolumnaresignificantlydifferent (P<0.01)AB Least square means with different letters within the row are significantly different (P<0.01)* Overallmeans
103
Journal of Biotechnology in Livestock Production
Table 3 Probabilityofdependentvariableofcarcassquality traits in50%Angusxnative
crossbredbeef
* p<0.05
Dependentvariableofcarcassqualitytraits
REA REA/100 Backfat BMS WBSF
Mean 62.24 15.26 7.08 2.28 14.63
R2 0.254 0.287 0.922 0.732 0.675
Probability(P)
Sex 0.827 0.767 0.021* 0.012* 0.145
Durationoffattening 0.287 0.322 0.062 0.010* 0.453
Finalweight 0.927 0.214 0.817 0.023* 0.089
Leptin5genotype 0.904 0.904- 0.859 0.005** 0.035*
CAPN1genotype 0.696 0.745 0.965 0.162 0.162
CASTgenotype 0.9990.9930.213 0.369 0.369
CAPN1 CC CT TT
nd 11.53±1.95ns 6.31±4.17ns
CAST AA AG GG
9.56±3.41ns 8.15±3.97ns 9.05±3.51ns
Warner-BratzlerShearForce(kg)
Mean±SE
GenotypeGene
Table 4 Independent genotypic effect of calpain (CAPN1) and calpastatin (CAST) gene on
Warner-BratzlerShearForceof22ribeyesteakmuscles
nd nodata,ns nonsignificance(p>0.05)
104
วารสารเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์