julio martín - asem-esp.org · diagnóstico genético preimplantacional (dgp) definición y...
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AG
TCA
AG
GTC
TTCG
AG
ATA
GTA
AC
GTTG
AG
TCA
AG
GTC
TTCG
AG
ATA
GTA
AC
GTTG
TTCC
AG
AA
GC
TCTA
TCA
TTGC
AA
CTTC
CA
GA
AG
CTC
TATC
ATTG
CA
AC
Julio MartJulio Martíínn
DDiagnóstico GGenético PPreimplantacional
-
Índice
Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)
Definición y caracteristica principal
Contexto genética
Opciones reproductivas y cronología
Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP
Indicaciones, resultados y limitaciones del DGP
Conclusiones
-
Diagnóstico genético in vitro
Ovocitos
Embriones
Muestra de análisis
Biopsia de corpúsculos polares
Biopsia de embrión (blastómero o trofoectodermo)
Transferencia embriones genéticamente normales*
Definición
DGP
-
Característica principal
Evita pasar por decisiones de interrupción
del embarazo, pero requiere técnicas de
reproducción asistida
-
• Multifactoriales
• Monogénicas
• Cromosómicas
• Mitocondriales
• Mutaciones somáticas (cáncer)*
Clasificación de enfermedades genéticas
+ factores ambientales
Varón
-
Opciones reproductivas
– Ruleta reproductiva
– Sin descendencia
– Adopción
– Donación de gametos
– Diagnóstico prenatal (IVE)
– DiagnDiagnóóstico preimplantacionalstico preimplantacional
Sano Fallecido
14 meses
Amnio
IVE (20 sem)
CVS
IVE (14 sem)
?
-
¿Cronología?
Antes GESTACIAntes GESTACIÓÓNN DespuDespuéés GESTACIs GESTACIÓÓNN
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Índice
Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)
Definición y caracteristica principal
Contexto genética
Opciones reproductivas y cronología
Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP
Indicaciones, resultados y limitaciones del DGP
Conclusiones
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ETAPAS
I.Técnicas Reproducción Asistida
-ICSI-Biopsia embrionaria
II.II.TTéécnicas Biologcnicas Biologíía Moleculara Molecular
--
PCR FluorescentePCR Fluorescente--
Genotipado: RFLP, A. Genotipado: RFLP, A.
fragmentos, MiniSeq.fragmentos, MiniSeq.
-
Clínica
Ginecología
EmbriologíaTubing
FIV
-
Estimulación ovárica Tratamiento Hormonal (10-14 días)
Punción (D0)Obtención de ovocitos y espermatozoides
Inseminación de ovocitos ICSI
(D1)
Valoración de fecundación (D2)
Cultivo embriones (D3-D5)
biopsia embrionaria (D3)
Transferencia / congelación
(D5)
Tratamiento de reproducción asistida
-
Núcleo
-
0+
-
0+
-
A C
Blastómeras
0+
-
0+
-
B
1 2 3
Núcleo: ADN
INCUBADOR
©2003
©2003 ©2003
-20°
C
Tubing (FIV)
http://www.efg2.com/Lab/ImageProcessing/Magnifier.ZIPhttp://www.efg2.com/Lab/ImageProcessing/Magnifier.ZIP
-
BBiología mmolecular
•• TubingTubing: lisis celular para liberar material gen: lisis celular para liberar material genéético accesible a la PCR.tico accesible a la PCR.
•• Tipos de anTipos de anáálisis genlisis genééticosticos–– DirectoDirecto: detecci: deteccióón mutacionesn mutaciones–– IndirectoIndirecto: an: anáálisis familiar mediante marcadores polimlisis familiar mediante marcadores polimóórficos rficos
(haplotipo a riesgo)(haplotipo a riesgo)
•• TTéécnicas molecularescnicas moleculares–– AnAnáálisis Fragmentoslisis Fragmentos–– AnAnáálisis de restriccionlisis de restriccion
o RFLP o RFLP
–– MinisecuenciaciMinisecuenciacióónn: extensi: extensióón de un n de un úúnico nuclenico nucleóótidotidoa partir del producto de PCRa partir del producto de PCR
–– AnAnáálisis de lisis de curvas de curvas de MeltingMelting..–– ArraysArrays–– UltrasecuenciaciUltrasecuenciacióónn
AGTCAAGGTCTTCGAGATAGTAACGTTGAAACTAAGGTCTTCGAGATAGTAACGTTGCGTG
-
Antecedentes EMG ¿Es posible un
DGP?
¿Mutaciones identificadas?
NO ¿¿Acceso Acceso ADNADN
Probandus?Probandus?
¿Acceso a ADN
familiares?
TRABiopsia (D3)Transfer (D5-
6)
Prueba de informatividad
positiva
NO
¿Protocolo DGP disponible
?
NO
NO
Programaciónciclo RA + DGP
NO
¿Mutaciones identificadas?
NO
¿Haplotipo identificado?
NO
¿Nuevo protocolo
DGP?
NOGESTACIGESTACIÓÓNN
NO
NO
DGP inviable
DGP inviable
DGP inviable
DGP inviable
DPNI
Diagrama de flujo
-
DIAGRAMA. REPRODUCCIÓN ASISTIDA CON DGP
ESTIMULACIÓN OVÁRICA, PUNCIÓN
1
FECUNDACIÓN IN VITRO
2
Núcleo: ADN
Blastómeras
3
BIOPSIA EMBRIONARIA
0 +-
0 +-
©2003
-20°
C
MANIPULACIÓN BLASTÓMERO
4
TRANSFER DE EMBRIONES SANOS
EMBRIONES EN CULTIVO
5 6
PCRY ANÁLISIS GENÉTICO
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Índice
Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)
Definición y caracteristica principal
Perspectiva histórica
Contexto genética
Opciones reproductivas y cronología
Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP
Indicaciones,resultados y limitaciones del DGP
Conclusiones
-
RResultados GGenerales
•• Indicaciones principales de DGPIndicaciones principales de DGP--PCRPCR–– AR: bAR: b--talasemia/A.falciforme (82 cicleo); FQ (78); talasemia/A.falciforme (82 cicleo); FQ (78); AME AME (56).(56).–– AD: AD: DM1DM1
(98), HD (98), neurofibromatosis (21), (98), HD (98), neurofibromatosis (21), CMT1ACMT1A
(14).(14).
–– XX--l: X Fragil (75 ciclos), l: X Fragil (75 ciclos), DMD/BDMD/B
(43), Hemophilia A/B (11).(43), Hemophilia A/B (11).
•• Tasa de transferencia Embrionaria: 78% de ciclos con punciTasa de transferencia Embrionaria: 78% de ciclos con puncióón.n.
•• GestaciGestacióón : 26% por Puncin : 26% por Puncióón (33% por transferencia)n (33% por transferencia)
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Año ’02 ’03 ‘04 ‘05 ’06 ’07 ’08 ’09 ‘10
DGP (N)DGP (N) 22 1111 3232 6161 105105 126126 130130 149149 147147
Enfermedad(nueva/año)
2 6 (4)
16 (10)
25 (9)
39(14)
57 (18)
71 (14)
87 (16)
102(15)
Primeros RNV en España tras DGP para:FQ, Atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, X frágil, Poliquistosis renal AD & AR, Hemofilia A & B(varónes),
Neurofibromatosis 1, Esclerosis tuberosa 1 & 2, Neoplasia endocrina múltiple (MEN2A), etc.
Primeros RNV en EspaPrimeros RNV en Españña tras DGP para:a tras DGP para:FQ, Atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, X frágil, Poliquistosis renal AD & AR, Hemofilia A & B(varHemofilia A & B(varóónes),nes),
Neurofibromatosis 1, Esclerosis tuberosa 1 & 2, Neoplasia endocrina múltiple (MEN2A), etc.
Resultados
-
DGP MonogDGP Monogéénicas nicas ––
NEUROMUSCULARESNEUROMUSCULARES
FSHD
SMN1
DM1DMD
ATXN1
CMT1A
ATXN3
-
DGPmonogenicas
Distrofia miotónica 1Atrofia Muscular EspinalCharcot –Marie-Tooth 1ADMDuchenne / BeckerDistrofia Facioescapulohumeral
Representan ~30% de demandas de DGP
-
Programa clínico DGP: ENFERMEDADES
63; 41%
35; 22%
19; 12%
10; 6%
8; 5%6; 4%
15; 10%
DM1AMEDMD/BCMT1ASCAsFSHDOTRAS
-
PunciPuncióónn DGPsDGPs(%)(%)
TrnsferTrnsfer(%) (%)
GestaciGestacióónn(%)(%)
AbortoAborto(%)(%)
ENM*ENM* 284284 171171(60)(60)
140140(82)(82)
5555(39)(39)
88(14,5)(14,5)
OtherOther 821821 480480(58,5)(58,5)
391391(81,5)(81,5)
138138(35)(35)
2929(21)(21)
Resultados DGP-PCR
*DM1, AME, DMD, CMT1A, SCA, FSHD*DM1, AME, DMD, CMT1A, SCA, FSHD
-
% TRANSFER
86
91
8490
87,5
67DM1AMEDMD/BCMT1ASCAsFSHD
145 TRANSFER / 156 DIAGN145 TRANSFER / 156 DIAGNÓÓSTICOS (86%)STICOS (86%)
-
Proced. Punción Bp/DGP Tf G + Aborto
8989 7878(87%)(87%)
3838(49%)(49%)
2727(71%)(71%)
1111(41%)(41%)(14%)(14%)
��
33(27%)(27%)
Proced. Punción Bp/DGP Tf G + Aborto
5252 4545(86,5%)(86,5%)
3333(73%)(73%)
2929(88%)(88%)
99(31%)(31%)(20%)(20%)
��
11(11%)(11%)
Ciclos DGP en FRESCOFRESCO: Distrofia Miotónica
Parejas DM1 : 63 [VarParejas DM1 : 63 [Varóón=20 (32%); Mujer=43 (68%)] n=20 (32%); Mujer=43 (68%)]
-
DM1
DNA WT / exp CTG
DNA WT / WT
EMB. WT / MT
EMB WT / WT
EMB WT / WT
-
DM1
DNA WT / exp CTG
DNA WT / WT
EMB. WT
EMB.ANORMAL
EMB. ANORMAL
-
DMD con deleción
-
CMT1A
NORMAL
x2x2
ANORMAL
-
SCA1-TP-PCR
-
afecto
sano
*
**
*WT
WT
WT
WT
FSHD
ANORMAL
NORMAL
-
LLimitaciones en DGPDGP
••
Assisted reproduction techniquesAssisted reproduction techniques– COH (female age, analysed condition), quality and number of
embryos– Cleavage stage mosaicism
••
Genetics and PGDGenetics and PGD– Informativity (mutations, STR markers)
– Single-cell PCR methods– PCR (Allele Dropout, amplification failure, amplification efficiency)
ADO
-
EMBRYOS: quality and number
females ≤
37 (2003-2004)
Blastocyst Morula Blastocyst + Morula
G+ Impl 2 sac ≥3 sac G+ Impl 2 sac ≥3 sac G+ Impl 2 sac ≥3 sac
1 EMBRYO 30 32.6 7.7 - 8 7.1 - - - - - - -
2 EMBRYOS 63 43.9 41.1 - 11 5.2 - - 1m+1b 41 27.3 26.9 -
3 EMBRYOS 60.0 37.8 83.3 66.7 - - - - 2m+1b 50 33.3 100 -
1m+2b 80 33.3 25 -
-
EVOLUCIÓN tipo CASO DGP -
PCR
Día 1
10 ovocitos
Día 3
6 embriones (8 céls.)
Análisis de 2 céls.
Día 4
Diagnóstico
Embarazo (30-65 %)
Día 5-6
Transfer Embriones sanos
Día 2
8 ovocitos F!
No resultado
Libre de Mutacion
Libre de Mutación
Mutación
presente
Mutación
presente
Buena
Morfología
Buena
Morfología
Libre de Mutación
Mala
Morfología
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Índice
Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)
Definición y caracteristica principal
Perspectiva histórica
Contexto genética
Opciones reproductivas y cronología
Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP
Indicaciones,resultados y limitaciones del DGP
Conclusiones
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Conclusiones I
El diagnóstico preimplantacional
permite una detección muy precoz de herencia de
enfermedades hereditarias.
Evita pasar por decisiones de interrupción de
embarazo, pero son necesarias técnicas de
reproducción asistida.
-
Conclusiones II
DGP para ENM es alternativa real a diagnóstico
prenatal con nº
creciente de patologías en “cartera”
Se trata de una técnica especializada que requiere
colaboración multidisciplinar (ginecología,
embriología y genética).
Cada caso debe evaluarse de forma
individualizada
-
AG
TCA
AG
GTC
TTCG
AG
ATA
GTA
AC
GTTG
AA
AC
AG
TCA
AG
GTC
TTCG
AG
ATA
GTA
AC
GTTG
AA
AC
Gracias
por su atención
ParcParc
CientCientííficfic
UniversitatUniversitat
de de ValValèèncianciaC\ Catedrático Agustín Escardino, 9. Paterna (Valencia) Spain. +34 963905310 – Fax: +34 963902522
www.iviomics.com
http://www.iviomics.com/
Slide Number 1Slide Number 2Slide Number 3Slide Number 4Slide Number 5Slide Number 6Slide Number 7Slide Number 8Slide Number 13Slide Number 14Slide Number 15Slide Number 16Slide Number 17Slide Number 18Biología molecularSlide Number 20Slide Number 21Slide Number 22Resultados GeneralesSlide Number 24DGP Monogénicas – NEUROMUSCULARESDGPmonogenicasSlide Number 27Slide Number 28Slide Number 29Slide Number 30Slide Number 31Slide Number 32Slide Number 33Slide Number 34Slide Number 35Slide Number 36Limitaciones en DGPEMBRYOS: quality and numberSlide Number 39Slide Number 40Slide Number 41Slide Number 42Slide Number 43