2220

ABSTRAKEfek antineoplastik yang tepat dari kalsium dan vitamin D3 dalam usus besar manusia tidak jelas . Uji coba studi vitro menunjukkan bahwa kedua agen mengurangi stres oksidatif , namun temuan ini belum pernah diselidiki pada manusia . Untuk mengatasi hal ini , kami melakukan uji coba , acak , double-blind , placebo-controlled , 2 2 uji klinis faktorial untuk menguji efek kalsium dan vitamin D3 pada penanda kerusakan DNA oksidatif ,8 - hidroksi - 2' - deoxyguanosine ( 8 - OH - dG ) , di mukosa kolorektal normal. Pasien ( N = 92 ) dengan setidaknya satupatologi dikonfirmasi adenoma kolorektal diobati dengan 2 g / d kalsium dan / atau 800 IU / d vitamin D3 dibandingkan dengan plasebo selama 6 bulan . Secara keseluruhan pelabelan dan distribusi crypt kolorektal dari 8 - OH - dG di biopsi dari normal-muncul mukosa dubur yang terdeteksi oleh imunohistokimia otomatis standar dan dihitung dengan analisis citra . Setelah 6 bulan pengobatan , 8 - OH - dG label sepanjang panjang penuh kolorektal kriptus mengalami penurunan sebesar 22 % ( P = 0,15 ) dan 25 % (P = 0,10 ) dalam kalsium dan vitamin D3 kelompok , masing-masing , tapi tidak dalam kalsium ditambah kelompok vitamin D3 . Efek pengobatan diperkirakan adalah terkuat di antara peserta dengan usus crypt vitamin D yang lebih tinggi ekspresi reseptor baseline ( P = 0,05 ) . Secara keseluruhan , ini awal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kalsium dan vitamin D3 dapat menurunkan kerusakan DNA oksidatif dalam posisi normal mukosa kolorektal manusia , mendukung hipotesis bahwa 8 - OH - dG label di kriptus kolorektal adalah diobati oksidatif DNA kerusakan biomarker risiko neoplasma kolorektal , dan memberikan dukungan untuk penyelidikan lebih lanjut kalsium dan vitamin D3 sebagai agen kemopreventif terhadap neoplasma kolorektal . IntroduksiKanker kolorektal, penyebab kedua kanker kematian di Amerika Serikat (1), adalah penyakit yang sangat berkorelasi dengan paparan vitamin D rendah dan dengan Gaya Barat diet, yang ditandai dengan relatif. Konsumsi kalsium yang rendah (2). Variasi dua puluh kali lipat dalam tingkat kanker usus besar internasional, dan studi migrasi. Menampilkan diperoleh berisiko tinggi dalam satu generasi, menekankan pentingnya paparan lingkungan, terutama diet dan aktivitas fisik, dalam etiologi kanker kolorektal (2) dan dengan demikian untuk preventability nya.Saat ini, tidak ada kesepakatan lengkap seperti apa faktor makanan melindungi atau mempromosikan pengembangan kanker kolorektal maupun preneoplastic diterima biomarker risiko. Penyelidikan lebih lanjut potensi mekanisme dimana agen diet mengarah untuk klinis perubahan yang relevan dalam jaringan kolon normal dan pengembangan biomarker risiko yang berasal dari mekanistik seperti pemahaman sangat dibutuhkan.Ada yang kuat dan masuk akal secara biologis hewan percobaan bukti untuk perlindungan terhadap kolorektal kanker dengan kalsium dan vitamin D (3). Selain itu, dalam epidemiologi penelitian, jumlah asupan kalsium yang lebih tinggi telah secara konsisten dikaitkan dengan penurunan risiko untuk kolorektal neoplasma (4-8), dan suplemen kalsium berkurang kekambuhan adenoma (9). Juga, beredar lebih tinggi 25 - hydroxyvitaminD (25-OH-vitamin D) tingkat telah dikaitkan dengan mengurangi risiko neoplasma kolorektal (8, 10). Namun, efek antineoplastik kalsium dan vitamin D pada epitel kolorektal yang normal tetap tidak jelas.

Mekanisme yang diusulkan kalsium terhadap kolorektal kanker termasuk perlindungan terhadap colonocytes gratis empedu dan asam lemak (11), efek langsung pada siklus sel, dan modulasi dari APC karsinogenesis kolon jalur (12). Selain homeostasis kalsium, vitamin D mengatur peristiwa siklus sel, mempromosikan degradasi asam empedu; faktor pertumbuhan pengaruh sinyal, adhesi sel, dan perbaikan DNA, dan memodulasi> 200 gen (12, 13). Baru Bukti juga menunjukkan bahwa vitamin D dan vitamin D reseptor (VDR) yang terlibat dalam perlindungan terhadap oksidatif kerusakan (14-16).Meskipun bukti-bukti ilmu dasar, tidak ada diterbitkan percobaan manusia dari efek vitamin D dan / atau suplementasi kalsium pada penanda DNA oksidatif kerusakan, seperti 8-hidroksi-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), di mukosa kolorektal normal muncul. Untuk mengatasi hal ini, kami melakukan uji coba, acak, doubleblind, placebo-controlled, 2 2 faktorial kemoprevensi percobaan klinis dari suplemen kalsium dan vitamin D3, sendirian dan dalam kombinasi dibandingkan dengan plasebo selama 6 bulan, untuk memperkirakan kemanjuran agen ini pada panel biomarker (termasuk 8-OH-dG) di kolorektal yang normal mukosa. Kami berhipotesis bahwa kalsium dan vitamin D3, sendirian dan dalam kombinasi, penurunan epitel kolorektal kerusakan DNA oksidatif.Pasien dan MetodePopulasi Protokol rinci perekrutan dan prosedur penelitian diterbitkan sebelumnya (17). Secara singkat, memenuhi syarat pasien, usia 30 hingga 75 tahun, dalam kesehatan yang baik secara umum, mampu informed consent, dengan riwayat setidaknya satu patologi dikonfirmasi adenomatosa polip kolorektal dalam 36 bulan terakhir, dan tidak ada kontraindikasi untuk kalsium atau suplemen vitamin D atau biopsi rektal prosedur dan tidak ada kondisi medis, kebiasaan, atau obat penggunaan yang tidak akan mengganggu studi direkrut dari populasi pasien menghadiri Pencernaan Penyakit Klinik di Emory Clinic, Emory University. Rinci kriteria eksklusi studi tertentu disajikan tempat lain (17). Penelitian ini disetujui oleh Emory University Institutional Review Board. ditulis diinformasikan

persetujuan diperoleh dari masing-masing peserta studi.Protokol Uji Klinis

Antara April 2005 dan Januari 2006, 522 pasien lulus screening grafik awal untuk kelayakan , dan 224 ( 43 % ) pasien mengirimkan surat pengantar diikuti oleh sebuah wawancara telepon . Sebanyak 105 ( 47 % ) potensial peserta menghadiri kunjungan kelayakan selama mereka diwawancarai , menandatangani formulir persetujuan , selesai kuesioner , memberikan sampel darah , dan memulai 1 bulan placebo run- pada periode . Diet dinilai dengan kuesioner frekuensi makanan semikuantitatif ( 18 ) . Catatan medis dan patologi yang terakhir . setelah 30 hari placebo run- dalam persidangan , 92 ( 88 % ) peserta tanpa signifikan dirasakan efek samping dan yang telah mengambil minimal 80% dari tablet mereka yang memenuhi syarat untuk acak penugasan . Pesertanya kemudian menjalani biopsi rektal dasar dan secara acak ditugaskan untuk

empat kelompok perlakuan sebagai berikut : kontrol plasebo kelompok, 2,0 g unsur kalsium ( kalsium karbonat dalam dosis yang sama dua kali sehari ) kelompok suplementasi , 800 IU vitamin D3 kelompok suplementasi ( 400 IU dua kali sehari-hari ) , dan kalsium ditambah suplemen vitamin D. Kelompok mengambil 2,0 g kalsium elemental ditambah 800 IU vitamin D3 harian .

Semua tablet studi yang khusus diproduksi oleh Tishcon . Suplemen dan plasebo yang sesuai pil identik dalam ukuran , penampilan , dan rasa . plasebo bebas dari vitamin D , kalsium , magnesium , dan kelat agen . Rincian tambahan pada alasan untuk dosis dan bentuk kalsium dan suplemen vitamin D bentuk yang dijelaskan sebelumnya ( 17 ) . Masa pengobatan adalah 6 bulan , dan peserta kunjungan tindak lanjut dihadiri pada 2 dan 6 bulan setelah pengacakan dan dihubungi melalui telepon antara tindak lanjut kunjungan kedua dan final . Pil - mengambil kepatuhan dinilai dengan kuesioner , wawancara , dan jumlah pil . Peserta diminta untuk tetap berada pada mereka diet biasa dan tidak mengambil suplemen gizi tidak digunakan pada masuk ke ruang kerja . Pada masing-masing tindak lanjut kunjungan , peserta diwawancarai dan mengisi kuesioner . Pada kunjungan terakhir , semua peserta menjalani venipuncture dan prosedur biopsi rektal . Semua peserta diminta untuk menjauhkan diri dari penggunaan aspirin selama 7 hari sebelum setiap kunjungan biopsi . Semua kunjungan untuk peserta diberikan

dijadwalkan pada waktu yang sama dari hari untuk mengendalikan variabilitas sirkadian mungkin dalam ukuran hasil . Faktor-faktor yang diduga berhubungan dengan tingkat 8 - OH - dG di mukosa usus normal ( misalnya , mikronutrien antioksidan intake ) dinilai pada awal dan pada akhir tindak lanjut kunjungi . Peserta tidak harus berpuasa untuk mereka Kunjungan dan tidak mengambil persiapan pembersihan usus atau enema

Pengumpulan Jaringan dan Prosesing

Enam spesimen biopsi 1.0-mm-tebal sextant diambil dari dubur mukosa 10 cm proksimal eksternal aperture anal melalui sigmoidocsope kaku dengan cup jumbo tang endoskopi fleksibel dipasang pada batang semiflexible. Biopsi yang kemudian segera ditempatkan di PBS, berorientasi bawah mikroskop bedah dan ditempatkan di 10% formalin buffer normal, dan kemudian ditransfer ke 70% etanol 24 jam setelah penempatan awal di formalin.Within 1 minggu, biopsi diproses dan tertanam dalam blok paraffin dengan tiga biopsi per blok.Metode Laboratorium

Blok parafin dipotong menjadi beberapa bagian 3.0 - pM - tebal , dengan masing-masing level 40 pM terpisah . Lima slide dengan empat bagian tingkat per pasien per biomarker siap untuk immunostaining . Untuk mengungkap epitop , panas - dimediasi antigen Pengambilan digunakan : slide ditempatkan dalam dipanaskan Pretreatment Module ( Lab Vision ) dengan 100 buffer sitrat ( pH 6,0 ; DAKO S1699 ) dan dikukus untuk 40 min . Kemudian , slide ditempatkan dalam DAKO Otomatis Immunostainer dan imunohistokimia diproses menggunakan metode streptavidin - biotin diberi label untuk 8 - OH dG ( tikus antibodi monoklonal untuk 8 - OH - dG diproduksi oleh Abcam , jumlah clone N45.1 , pada konsentrasi 1:100 ; ref . 19 ) . Untuk setiap peserta , baseline dan tindak up slide biopsi yang bernoda di batch yang sama , dan setiap kelompok pewarnaan termasuk keseimbangan peserta dari masing-masing kelompok perlakuan . Slide yang tidak counterstained . Setelah pewarnaan , slide coverslipped dengan Leica CV5000 Coverslipper ( Leica Microsystems ) . Dalam setiap batch pewarnaan slide , positif dan slide kontrol negatif dimasukkan . Colon adenokarsinoma digunakan sebagai jaringan kontrol. Negatif dan slide kontrol positif diperlakukan identik dengan pasien slide, kecuali bahwa pengencer antibodi digunakan agak dari antibodi primer pada kontrol geser negatif . Untuk VDR , slide diproses seperti yang dijelaskan sebelumnya tapi menggunakan mouse monoklonal D - 6 antibodi mengangkat terhadap asam amino 344-424 dari VDR manusia ( SC - 13.133 , Santa Cruz Biotechnology ) pada konsentrasi 1:7,500 ( 20 , 21 ) .

Analisis Gambaran Immunohistochemically Detected Biomarker pada Kriptus Kolon Normal

Metode analisis citra kuantitatif ( " mencetak gol " ) adalah digunakan untuk mengevaluasi tingkat terdeteksi dari biomarker dalam usus kriptus , seperti yang digambarkan dalam Gambar . 1 . Peralatan utama dan perangkat lunak untuk prosedur analisis citra yang Scanscope CS scanner digital ( Aperio Technologies) , komputer , papan gambar digital , perangkat lunak Matlab ( Math - Pekerjaan ) , CellularEyes Gambar Analisis Suite ( DivEyes ) , dan MySQL ( Sun Microsystems ) . Pertama , slide yang dipindai dengan scanner digital Aperio Scanscope CS , dan gambar elektronik yang terakhir di CellularEyes program untuk mengidentifikasi kriptus usus dapat diterima untuk analisis . A " diberikan skor " crypt didefinisikan sebagai crypt utuh memperluas dari mukosa muskularis ke lumen usus ( 17 , 22 ) . Sebelum analisis , gambar kontrol negatif dan positif

slide diperiksa untuk pewarnaan kecukupan . standar pengaturan yang digunakan pada semua peralatan di seluruh mencetak prosedur . Teknisi terakhir slide dalam

CellularEyes Program dan memilih dua dari tiga biopsi dengan 16 sampai 20 " diberikan skor " hemicrypts (satu setengah dari crypt ) per biopsi . Menggunakan papan gambar digital, batas-batas setiap hemicrypt dipilih dijiplak . Program kemudian dibagi secara garis besar menjadi sama spasi segmen dengan lebar rata-rata colonocytes normal. Akhirnya , program mengukur background- dikoreksi densitas optik dari pelabelan biomarker di seluruh yang hemicrypt serta dalam setiap segmen . Kisaran densitas optik untuk 8 - OH - dG pelabelan ditetapkan antara 0,04 dan 0,20 . Semua data yang dihasilkan yang otomatis ditransfer ke dalam database MySQL . Kemudian , teknisi pindah ke hemicrypt diidentifikasi berikutnya dan diulang semua langkah analisis yang telah dijelaskan sebelumnya . keandalan A sampel kontrol yang sebelumnya dianalisis oleh pembaca yang dianalisa selama persidangan untuk menentukan intrareader mencetak reliabilitas dengan korelasi intraclass koefisien , yang 0,94 untuk 8 - OH - dG .

Protokol Menilai Kadar Vitamin D Serum

Semua tes laboratorium untuk serum 25-OH-vitamin D dan 1,25-dihydroxyvitamin D [1,25 - (OH) 2-vitamin D] adalah dilakukan oleh Dr Bruce Hollis (Medical University of South Carolina) menggunakan metode RIA seperti yang dijelaskan sebelumnya (23). Sampel serum untuk awal dan tindak lanjut kunjungan untuk semua mata pelajaran yang diuji bersama-sama, memerintahkan secara acak, dan diberi label untuk menutupi kelompok perlakuan, tindak lanjut kunjungan, dan ulangan kualitas kontrol. Rata-rata koefisien intra-assay variasi adalah 2,3% untuk serum 25-OH-vitamin D dan 6,2% untuk 1,25 - (OH) 2-vitamin D.Analisis Statistik

Kami menilai kelompok perlakuan untuk komparabilitas karakteristik pada awal dan pada akhir follow-up oleh Fisher exact test untuk variabel kategori dan ANOVA untuk variabel kontinyu. Beberapa variabel hasil didefinisikan untuk memperkirakan pelabelan secara keseluruhan dan distribusi dalam-crypt dari 8-OhdG dalam kriptus. Kepadatan optik rata-rata 8-OH-dG pelabelan dalam kriptus dihitung untuk setiap pasien di baseline dan 6 bulan follow-up dengan menjumlahkan semua kepadatan dari semua diabadikan dianalisis dari spesimen biopsi dan membaginya dengan jumlah kriptus dianalisis. Ukuran distribusi dalam-crypt marker dihitung untuk setiap pasien dengan mengambil cara dari kepadatan biomarker di berbagai zona bawah tanah (misalnya, bagian atas 40% dan bawah 60%).Analisis primer didasarkan pada pengobatan yang ditugaskan di saat pengacakan tanpa memandang status kepatuhan ( intent-to - treat ) . Rata-rata kepadatan biomarker yang dihitung untuk setiap kelompok perlakuan untuk baseline dan 6 bulan tindak lanjut kunjungan . Efek pengobatan dievaluasi dengan menilai perbedaan dalam kepadatan dari awal sampai 6 bulan kunjungan follow-up antara pasien dalam setiap kelompok pengobatan aktif dan plasebo kelompok dengan ukuran berulang linear efek CAMPURAN Model . Model ini termasuk mencegat , tindak lanjut kunjungan efek (baseline dan tindak lanjut ) , dan interaksi antara kelompok perlakuan dan kunjungan efek tindak lanjut ( mutlak efek pengobatan ) . Karena kepadatan optik diukur dalam unit sewenang-wenang , untuk memberikan perspektif tentang besarnya dari efek pengobatan , kami juga dihitung efek relatif, didefinisikan sebagai [ ( kelompok perlakuan tindak lanjut berarti ) / ( kelompok perlakuan awal berarti ) ] / [ ( placebo tindak lanjut berarti ) / ( plasebo awal berarti ) ] . Efek relatif memberikan perkiraan konservatif dari perubahan proporsional pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan pada plasebo kelompok . Interpretasi dari efek relatif agak analog dengan rasio odds ( misalnya , efek relatif 2.0 berarti bahwa perubahan proporsional dalam pengobatan kelompok adalah dua kali lebih besar seperti yang di plasebo kelompok ; ref . 17 , 24 ) . Karena kelompok perlakuan yang seimbangpada faktor-faktor risiko pada awal, tidak ada penyesuaian dibuatuntuk kovariat lain dalam intent-to -treat analisis primer.

Distribusi kepadatan pewarnaan 8 - OH - dG adalahgrafis dievaluasi menggunakan prosedur loess dengan parameter smoothing 0,5 dan pas kuadrat lokal . Pertama , jumlah bagian dalam hemicrypt a adalah standar untuk 50 . Kemudian , rata-rata untuk setiap bagian di semua diabadikan diperkirakan oleh model loess secara terpisahuntuk setiap pasien dan kemudian untuk setiap perlakuan kelompok dengan tindak lanjut kunjungan . Hasilnya diplot dalam grafik bersama dengan menghaluskan garis .

Sebuah oksidatif balance score kuesioner yang diturunkan ( OBS ) dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 25 , 26 ) . Secara singkat , variabel kontinyu yang mencerminkan pro - oksidan ( jenuh lemak dan total asupan zat besi ) dan antioksidan ( tokoferol keseluruhan , karotenoid , vitamin C , lycopene , lutein / zeaxanthin , dan - cryptoxanthin intake ) eksposur dibagi menjadi kategori tinggi dan rendah berdasarkan nilai median di antara semua peserta pada awal. peserta dengan rendah (di bawah rata-rata ) paparan pro - oksidan tertentu diberikan 1 poin , sedangkan mereka yang tinggi (di atasmedian ) paparan pro - oksidan yang sama diberikan 0 poin . Untuk paparan antioksidan , 1 poin dianugerahi untuk setiap tingkat tinggi ( di atas median ) eksposur dan 0 poin untuk setiap tingkat rendah (di bawah rata-rata ) eksposur . untuk dikotomis variabel ( "ya " versus " no " ) , peserta menerima 1 poin untuk setiap antioksidan eksposur ( regular penggunaan obat anti - inflamasi nonsteroid ( NSAID ) dan / atau aspirin , suplementasi dengan selenium , dan tidak pernah perokok ) . Kemudian , poin diberikan untuk setiap individu komponen OBS itu dijumlahkan untuk menghitung skor keseluruhan . Nilai OBS yang lebih rendah menunjukkan lebih tinggi prevalensi eksposur pro - oksidan , sedangkan yang lebih tinggi. Nilai OBS menunjukkan dominasi eksposur antioksidan . Kisaran OBS dasar dalam penelitian ini adalah antara 3 dan 10 , dan median adalah 6 . Kami dichotomized dasar OBS berdasarkan nilai median dan ditugaskan setiap peserta untuk OBS tinggi (di atas median , " Antioksidan " ) atau OBS rendah (di bawah rata-rata , " prooksidan " ) kategori . Demikian pula , variabel kontinyu (misalnya , usia dan ekspresi VDR ) yang dichotomized ( ke tinggi / kategori rendah) berdasarkan nilai median dalam semua belajar peserta pada awal. Analisis Kemudian , dikelompokkan dilakukan untuk mengeksplorasi efek perlakuan yang berbeda pada usia awal ( < 60 dan 60 tahun ) , ekspresi VDR ( tinggi / rendah ) , 8 - OH - dG pelabelan ( tinggi / rendah ) , OBS ( 6 dan > 6 ) , tingkat pertama riwayat keluarga kanker kolorektal (ya / ada ) , jenis kelamin ( pria / wanita ) , penggunaan NSAID secara teratur ( ya / tidak ) , serum. Tingkat D 25 - OH - vitamin ( < 22 dan 22 ng / mL ) , dan pil kepatuhan terhadap pengobatan ( < 80 % atau 80 % pengobatan diambil ) . Perbedaan antara kategori diuji dengan memasukkan istilah interaksi kategori - intervensi dalam Model .

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SAS Sistem software versi 9.1.3 ( SAS Institute) . Tingkat cutoff P 0,05 ( dua sisi ) digunakan untuk menilai statistik signifikansi .RESULT

Kelompok perlakuan tidak berbeda secara signifikan pada peserta karakteristik diukur pada awal ( Tabel 1 ) atau akhir penelitian ( data tidak ditampilkan ) . Usia rata-rata peserta adalah 61 tahun , 64 % adalah laki-laki , 71 % adalah Putih , dan 20 % memiliki riwayat keluarga kanker kolorektal dalam relatif tingkat pertama . Sebagian besar peserta adalah kelebihan berat badan , bukan perokok , lulusan perguruan tinggi , dan punya satu kecil adenoma tubular ringan displastik ( Tabel 1 ) . Kepatuhan untuk mengunjungi kehadiran rata-rata 92 % dan melakukan tidak berbeda secara signifikan antara empat kelompok perlakuan . Rata-rata , setidaknya 80 % dari pil diambil oleh 93 % dari peserta pertama kunjungan follow-up dan sebesar 84 % pada akhir kunjungan tindak lanjut . Tidak ada pengobatan atau biopsi komplikasi . Tujuh ( 8 % ) mangkir -up

karena intoleransi obat yang dirasakan ( n = 2 ) , keengganan untuk melanjutkan partisipasi ( 3 n = ) , saran dokter ( n = 1 ) , dan kematian penyakit kardiovaskuler ( n = 1 ) . putus sekolah termasuk satu orang dari suplemen vitamin D kelompok dan dua orang dari masing-masing tiga kelompok lainnya.

Pada awal, tidak ada perbedaan yang signifikan antara empat kelompok studi dalam serum 25-OH-vitamin D atau 1,25 - (OH) 2-tingkat vitamin D. Pada akhir studi, vitamin D dan kalsium ditambah vitamin D kelompok memiliki tingkat lebih tinggi dari serum 25-OH-vitamin D (P