VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR THIAMIN-HCl DALAM

TABLET VITAMIN B1

Irawati Nurani, Latifah Nugraheni, Leonardo Caesar, M. Faisal Fadlia, M. Ilyas Ramadhani

Kelompok 4, Kelas XIII-2 SMK-SMAK BOGOR

ABSTRAK

Validasi metode penetapan kadar thiamin-HCl secara High Performance Liquid Chromatography

(HPLC) merupakan konfirmasi pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan atau

kesesuaian metode ini memenuhi maksud khusus atau tujuan pengukuran agar dapat memberikan data

analisis yang berguna pada penentuan kadar thiamin-HCl dalam sampel vitamin B1. Pengujian yang

dilakukan meliputi selektifitas, uji presisi, kisaran kerja linier, limit deteksi dan akurasi. Larutan deret

standar thiamin-HCl yang digunakan adalah 0-50 ppm dengan menggunakan larutan berupa campuran

buffer posfat dan metanol (55:45) sebagai fase gerak dengan laju alir 0,5 ml/menit,dan detektor VWD

pada panjang gelombang 254 nm.

ABSTRACT

Validation of method for the determination of Thiamine-HCl with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is confirmation testing and procurement objective evidence that the requirements or the suitability. of this method meets the specific intent or purpose for measurement data analyze can provide useful in determining levels of thiamine in a sample of vitamin B1. Parameter validation methods in the study include a test of selectivity test of precision, linear working range, detection limit, and accuracy test. Standard solutions of thiamine-HCl was used concentration from 0 to 50 ppm with using a mixture of buffer phosphat and methanol (55:45) solution as a mobile phase with flow rate 0,5 ml/min and Variable Wavelength Detector at a wavelength of 254 nm.

PENDAHULUAN

Menurut SNI 19-17025-2000, validasi metode adalah konfirmasi pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Sedangkan menurut Wood et al., 1998, validasi metode adalah proses penetapan kesesuaian sistem pengukuran untuk dapat memberikan data analisis yang berguna.

Dari definisi tersebut dapat disimpulkan bahwa validasi mengandung parameter konfirmasi secara pengujian terhadap suatu metode sehingga dapat melengkapi bukti-bukti untuk menyatakan kesesuaian metode terhadap persyaratan dan tujuan yang telah ditentukan. Pada pelaksanaannya terdapat beberapa metode yang harus divalidasi di laboratorium sebelum digunakan sebagai metode dalam analisis rutin, yaitu:

a. Metode non standar b. Metode yang didesain atau dikembangkan

oleh laboratorium c. Metode standar yang digunakan di luar

rentang yang ditentukan d. Metode standar yang mengalami modifikasi

Menurut Wood et al, 1998, mengadaptasi validasi metode kimia analisis dari Nordic Committee on Food Analysis sebagai prosedur NMKL No. 4, 1996, parameter yang direkomendasikan dalam validasi metode analisis adalah desain protokol validasi, penetapan selektifitas dan kurva standar, presisi yang dinyatakan sebagai ripitabilitas dan reproduksibilitas, akurasi, jangkauan kerja linear, limit deteksi, limit kuantitasi, robustness (ketahanan), evaluasi, dan dokumentasi laporan.

Mengadaptasi draft dokumen validasi EURACHEM, parameter-parameter yang

direkomendasikan dalam validasi metode adalah: selektifitas, limit deteksi, limit kuantitasi, recovery, jangkauan kerja linear, akurasi serta presisi sebagai ripitabilitas dan reproduksibilitas.

TINJAUAN PUSTAKA

Mengadaptasi Panduan Kesepahaman Validasi Metode Analisis secara In-House yang publikasikan oleh Thompson et al, 2002, parameter kinerja yang direkomendasikan adalah applicability (lingkup penetapan), selektifitas, kalibrasi dan linearitas, akurasi (trueness), presisi, limit deteksi, limit penetapan, sensitifitas, ketahanan, kesesuaian penggunaan, variasi matriks dan pengukuran ketidakpastian. Berikut dipaparkan beberapa parameter umum yang ditentukan dalam pelaksanaan validasi metode analisis:

a. Presisi

Presisi adalah derajat keterulangan suatu set hasil uji di antara hasil-hasil itu sendiri, dengan tujuan mengetahui kesalahan akibat operator. Presisi diterapkan pada pengukuran berulang yang menunjukkan hasil pengukuran individual didistribusikan di sekitar nilai rata-rata dengan mengabaikan letak nilai rata-rata terhadap nilai yang sebenarnya.

1. Uji ripitibilitas, adalah kesamaan antara pengukuran yang diulang dari contoh dengan analis, peralatan dan laboratorium yang sama pada waktu yang berdekatan. Penetapan ripitabilitas dapat dilakukan dengan analisis berulang suatu contoh oleh seorang analis, kemudian ditentukan nilai standar deviasi dan koefisien variasi contoh.

2. Uji reproduksibilitas, adalah kesamaan antara pengulangan pengukuran yang dikerjakan pada kondisi berbeda dalam hal laboratorium, analis, peralatan dan waktu. Penetapan dapat dilakukan dengan mengikuti uji banding antar laboratorium.

b. Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan antara nilai hasil uji suatu metode analisis dengan nilai sebenarnya. Akurasi sering dinyatakan sebagai persentase perolehan kembali. Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui adanya gangguan matriks di dalam contoh uji terhadap pereaksi yang digunakan atau untuk mengetahui ketepatan metode yang digunakan. Secara umum dikenal tiga cara yang digunakan untuk evaluasi akurasi metode uji, yaitu:

1. Uji Pungut Ulang (Recovery Test).

Uji dilakukan dengan mengerjakan

pengujian di atas contoh yang diperkaya

dengan jumlah kuantitatif analat yang

akan ditetapkan.

2. Uji Relatif terhadap akurasi metode

baku.

Uji dilakukan dengan mengerjakan

pengujian pararel atas contoh uji yang

sama menggunakan metode uji yang

sedang dievaluasi dan metode uji lain

yang telah diakui sebagai metode baku.

3. Uji terhadap Standard Reference

Material (SRM).

Uji terhadap SRM untuk mengevaluasi

akurasi suatu metode uji dilakukan

dengan menguji SRM dengan

menggunakan metode uji yang sedang

dievaluasi.

c. Sensitifitas

Sensitifitas dari suatu prosedur analisis merupakan perubahan besaran respon magnitude sebagai akibat perubahan konsentrasi. Dalam sebuah fungsi kalibrasi sensitivitas dinyatakan sebagai kemiringan kurva (slope). Semakin besar nilai kemiringan kurva maka dikatakan metode semakin sensitif.

d. Limit deteksi

Limit deteksi adalah jumlah analat yang memberikan respon sinyal pengukuran terendah dalam suatu derajat kepercayaan statistik yang dapat diterjemahkan sebagai indikasi terdapatnya analat dalam larutan (Wood et al, 1998). Dapat juga didefinisikan sebagai kepekatan terendah dari analat dalam contoh yang masih dapat memberikan respon sinyal signifikan tanpa dipengaruhi noise alat.

e. Limit Kuantitasi

Limit kuantitasi adalah konsentrasi analat terendah yang dapat ditetapkan dengan presisi atau ripitibilitas yang masih dapat diterima. Limit kuantitasi dapat ditetapkan dengan menganalisis secara berulang matriks contoh yang ditambah analat yang diketahui konsentrasinya untuk dapat mengetahui konsentrasi terendah yang dapat terdeteksi.

f. Jangkauan Kerja Linear

Jangkauan kerja linear merupakan kisaran konsentrasi analat yang secara eksperimen mampu memenuhi persyaratan mutu metode uji melalui penetapan presisi, akurasi dan lineritas pengujian (Wood et al, 1998). Jangkauan kerja linear menyatakan kemampuan metode uji untuk memberikan hasil yang proporsional terhadap kepekatan analat. Jangkauan kerja linear diperoleh dengan memplot nilai hasil uji terhadap kepekatan analat. Makin lebar interval jangkuan kerja linear maka metode uji makin praktis untuk digunakan.

g. Selektifitas

Selektifitas adalah kemampuan metode analisis untuk membedakan analat yang akan ditetapkan terhadap senyawaan lain yang terdapat dalam sampel (Wood et al, 1998). Selektifitas atau spesifitas suatu metode menyatakan kemampuan penetapan secara akurat dan khusus dari komponen lain yang dicurigai dapat mengganggu kondisi pengujian. Pengujian selektifitas dapat dilakukan dengan

menambahkan kepekatan senyawa pengganggu dengan jumlah yang diketahui.

Validasi metode analisis memiliki persyaratan umum, persyaratan metode uji dan persyaratan peralatan, yaitu:

a. Umum

Laboratorium harus mampu melakukan validasi metode uji dengan menetapkan parameter-parameter analisis meliputi: akurasi, presisi, selektifitas, limit deteksi, cakupan penerapan prosedur pengujian dan pengaruh zat asing terhadap penetapan. Parameter yang akan digunakan pada suatu aplikasi tertentu ditentukan oleh analis pelaksana.

b. Metode Uji

Pemilihan metode uji dilakukan dengan terlebih dahulu melihat unjuk kerja dan kesesuaian dengan melakukan perbandingan terhadap prosedur kerja yang telah mengalami validasi.

c. Peralatan

Peralatan yang digunakan dalam analisis harus diperiksa kondisinya secara berkala agar selalu memberikan unjuk kerja yang memuaskan.

METODE PENELITIAN

Dasar

Validasi metode penetapan kadar thiamin-HCl secara HPLC merupakan konfirmasi pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan atau kesesuaian metode ini memenuhi maksud khusus atau tujuan pengukuran untuk dapat memberikan data analisis yang berguna pada penentuan kadar thiamin-HCl dalam sampel vitamin B1

Alat yang digunakan yaitu:

1. Corong 9. Buret 2. Labu Ukur 50 ml 10. Statif 3. Labu Ukur 100 ml 11. Mortar 4. Piala Gelas 400 ml 12. Neraca 5. Piala Gelas 800 ml 13. Ketas saring

whatman No. 41

6. Pipet Volume 5 ml 14. Penyaring Milipore

7. Pipet Tetes 15. Kertas saring Milipore

8. HPLC Agilent 16. Vial 17. Syringe

Bahan-bahan yang digunakan yaitu:

1. Buffer Fosfat 0,04M 2. Aquabidest 3. Sampel vitamin B1 4. Standar Thiamin 1000 ppm 5. Kertas saring 6. Tissue

Cara Kerja:

a. Pembuatan Buffer Phosfat 0,04 M Ditimbang 10,8872 ±0,0005 gram KH2PO4, dimasukkan ke dalam labu ukur 2000 ml, diencerkan dengan aquabides, dihimpitkan, dihomogenkan, ditempatkan pada botol dan diberi label yang sesuai.

b. Persiapan Standar 1. Pembuatan larutan induk Thiamin 1000

ppm Ditimbang 0,1000 gram Thiamin-HCl. Dilarutkan dengan buffer fosfat dalam labu ukur 100 ml, dihimpitkan dan dihomogenkan.

2. Pembuatan deret standar Thiamin (0 -50 ppm) Dilakukan pengenceran dari standar induk 1000 ppm menjadi 100 ppm. Diturunkan dari buret standar induk thiamin 100 ppm sejumlah 0 ml; 2,5 ml; 5 ml; 7,5 ml; 10 ml; 15 ml; dan 25 ml ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dan dihimpitkan dengan buffer fosfat, dihomogenkan. Disaring dengan kertas milipore. Filtrat siap diinjeksikan dan diukur dengan HPLC.

c. Persiapan contoh Ditimbang 5 tablet vitamin B1 lalu dirata-ratakan bobotnya. Diambil 2 tablet vitamin B1, lalu dhaluskan. Ditimbang ± 0,2000 gram contoh vitamin B1. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, lalu ditambahkan buffer fosfat sampai tanda tera. Dikocok 5

menit, lalu dibiarkan mengendap. Disaring dengan kertas saring Whatman 41. Dipipet 5 ml filtrat ke dalam labu ukur 50 ml. Dikocok lalu disaring dengan kertas saring milipore. Filtrat siap diinjeksikan dan diukur dengan HPLC.

Penelitian yang dilakukan:

1. Selektifitas. Penetapan selektifitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram blanko, standar, contoh dan contoh spike.

2. Ripitabilitas. Penetapan ripitibilitas dilakukan dengan melakukan penetapan sampel sebanyak 10 kali pengulangan, dihitung nilai simpangan baku dan simpangan baku relatif sampel. Ripitibilitas dinyatakan sebagai simpangan baku relatif (RSD).

3. Limit deteksi. Penetapan limit deteksi instrumen (IDL) dilakukan dengan membaca nilai area spike sampel terendah sebanyak 10 kali pengulangan. Ditetapkan nilai IDL berdasarkan 3 kali nilai simpangan baku kemudian dikonversikan sebagai konsentrasi menggunakan area standar. Penentuan limit deteksi metode (MDL) ditentukan nilai estimasi 6 kali simpangan baku. Dikonversikan nilai area menjadi konsentrasi meng-gunakan kurva kalibrasi. Dibuat deret standar dengan konsentrasi 3SD, 6SD, dan 9SD kemudian dibaca nilai area pada KCKT. Ditentukan kon-sentrasi yang memberikan pembacaan di atas area estimasi sebagai limit deteksi metode (MDL).

4. Jangkauan Kerja Linear, Jangkauan kerja linear ditentukan dengan membuat deret standar tiamina-HCl dengan konsentrasi 5; 10; 15; 20; 30; 50; 75, 100; 150; 200; 250; 300; 400 dan 500 ppm. Disaring dengan millipore, diinjeksikan pada KCKT. Ditetapkan persamaan koefisien korelasi. Ditentukan konsentrasi maksimum yang masih memberikan nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,9995.

5. Pengujian Spike pada Contoh Ditimbang ± 0,2000 gram contoh. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Ke dalam contoh ditambahkan larutan standar dengan konsentrasi 5 ppm dan 10 ppm dengan peng-ulangan masing-masing sebanyak 10 kali. Ditambahkan larutan larutan buffer fosfat, dikocok selama 5 menit, diimpitkan hingga tanda tera. Dibiarkan mengenap dan disaring menggunakan kertas saring Whatman 41. Dipipet 5 ml filtrat ke dalam labu ukur 50 ml, diencerkan dengan larutan buffer fosfat, diimpitkan dan dihomogenkan. Diaring larutan dengan kertas saring millipore, injeksikan sebanyak 20 μL pada alat HPLC. Dihitung kadar tiamina-HCl dalam sampel spike.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Analisis

1. Uji Presisi

Tabel 1. Kadar thiamin-HCl dalam vitamin B1 tablet (KCKT)

No Kadar Thiamin (ppm)

1 11,68

2 11,80

3 11,80

4 11,92

5 11,83

6 11,79

7 11,74

8 11,67

9 11,74

10 11,84

Rata-rata 11,78

SD 0,0759

RSD 0,64%

x100%rataRata

SDRSD

Tabel 2. Rekomendasi Horwitz terhadap nilai RSD berdasarkan daerah konsentrasi pembacaan

Konsentrasi Ripitabilitas (% RSD)

100 % 1 %

10 % 1,5 %

1 % 2 %

0,1 % 3 %

0,01 % 4 %

10 ppm 6 %

1 ppm 8 %

10 ppb 15 %

2. Kisaran Kerja Linear

Tabel 3. Hubungan nilai luas area terhadap konsentrasi standar dalam penentuan daerah konsentrasi linear (KCKT)

Konsentrasi (ppm)

Luas Area Koefisien Korelasi

0 0 -

5 257,0605

10 497,4235 0,99978

15 756,3652 0,99988

20 991,2006 0,99988

30 1457,5432 0,99978

50 2437,9878 0,99993

75 3323,6598 0,99798

100 3356,3656 0,97509

Slope = 48,5397

3. Limit Deteksi

Tabel 4. Luas area standar 10 kali pembacaan pada penetapan limit deteksi instrumen (IDL) secara KCKT

Konsentrasi Standar (ppm)

Luas Area Pembacaan

0,2 26,14161

0,2 24,61180

0,2 23,74009

0,2 24,18138

0,2 25,25105

0,2 26,45929

0,2 26,76989

0,2 25,79672

0,2 26,34040

0,2 26,14161

Rata-rata 25,543384

SD 1,04448983

LOD/IDL 0,06455

LOQ 0,21518

slope

3SDIDL

slope

10SDLOQ

Tabel 5. Nilai pembacaan luas area pada penetapan limit deteksi metode (MDL) secara KCKT

Konsentrasi (ppm) Luas Area

0,05 0,00

0,1 0,00

0,2 20,00

0,3 38,71

0,4 42,20

0,5 50,65

4. Akurasi

Tabel 5. Hasil penentuan recovery spike 60 ppm (KCKT)

Tabel 6. Hasil penetuan recovery spike 5,00% (KCKT)

x100%spikeikonsentras

perolehanhasil%Recovery

B. Pembahasan

Uji presisi dapat ditunjukkan dengan ripitabilitas yang dinyatakan sebagai hasil presisi dibawah perlakuan yang sama. Pengujian dilakukan dengan menghitung nilai simpangan baku (SD) dan simpangan baku relatif terhadap pengukuran 10 kali pembacaan sampel. Dengan ,enggunakan tabel ripitibilitas Horwitz pada kisaran pembacaan 10 %, persyaratan ripitabilitas pada 1,5 %. Dengan demikian 0,64 % < 1,5 %, dan metode penetapan memenuhi persyaratan nilai presisi sebagai ripitibilitas.

Uji kisaran kerja linear dilakukan dengan membuat grafik persamaan regresi linear dengan maksud mendemonstrasikan hubungan linear antara sinyal analisis terhadap konsentrasinya. Koefisien korelasi yang disyaratkan adalah >0,9995.

Batas konsentrasi yang memberikan puncak yang dapat dideteksi secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk peralatan yang digunakan berada pada level 0,05-0,50 ppm. Pembacaan yang dihasilkan alat dihitung nilai standar deviasinya secara statistik untuk menghasilkan nilai limit deteksi instrumen (IDL). Nilai IDL didapatkan untuk penetapan secara KCKT adalah 0,5374 satuan area dari hasil 6 kali standar deviasi pengukuran area.

Uji akurasi dilakukan dengan proses spike terhadap sampel dan menghitung nilai perolehan kembalinya, spike dilakukan pada dua tingkat. Menggunakan metode yang sama dengan perlakuan pada metode spektrofotometri UV-VIS, secara KCKT dilakukan spike pada tingkat 2,5% dan 5,00%. Recovery rata-rata terhadap spike 2,50% adalah 92,91% sedangkan recovery rata-rata 5,00% spike 92,37%. Menggunakan nilai konsentrasi analat yang ditambahkan sebagai sampel spike dalam kisaran 1% maka nilai batas recovery yang direkomendasikan adalah 92 – 105 %. Dengan demikian recovery penetapan terhadap spike 2,50% dan spike 5,00% masih memenuhi persyaratan nilai batas recovery.

KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, pada uji presisi didapat rata-rata sebesar 11,781 dengan SD sebesar 0,0759 dan RSD sebesar 0,64%, hasil dibandingkan dengan tabel rekomendasi Horwitz dan menunjukan nilai ripitabilitas maksimal 1,5%, hal tersebut menunjukkan bahwa presisi dari alat tersebut baik. Pada kisaran kerja linear diperoleh hasil bahwa grafik masih linear pada konsentrasi 50 ppm dan mulai konsentrasi 75-100 ppm grafik mulai tidak linear yang menunjukan bahwa deret yang digunakan berkisar 0-50 ppm. Dalam uji limit deteksi dinyatakan bahwa pembacaan luas area terkecil yang dibaca oleh alat adalah dengan luas 25,54383, nilai IDL yaitu 0,06455

sedangkan nilai LOQ yaitu 0,21518 (alat sudah dapat membaca sampel pada konsentrasi 0,2 ppm). Untuk tingkat akurasi berdasarkan penentuan recovery spike pada konsentrasi 60 ppm diperoleh hasil 92,71%. Dilihat pada konsentrasi 120 ppm diperoleh hasil 92,37%. Dilihat dari recovery rata-rata pada konsentrasi 60 ppm dan 120 ppm yang cukup akurat, maka dapat dinyatakan tingkat akurasi metode ini baik.

REFERENSI

Zaenal, Arifin. 2011. Verifikasi Metode Analisis Secara HPLC. Bogor: http://zonazaenal.wordpress.com/2011/01/02/verifikasi-metode-analisis-secara-hplc/ (30 Agustus 2014 pukul 08:33).