研 究 用

KAPA HiFi DNA Polymerase

世界に誇る正確性、最速レベルの伸長性次世代シーケンスのライブラリー増幅でも数多くの実績

ハイファイ

KAPA HiFi HS ReadyMix

マスターミックスタイプ（ホットスタート）

KK2601 (100 回用 /25ul 反応 ) 1.25ml ¥9,000

KK2602 (500 回用 /25ul 反応 ) 6.25ml ¥35,000

KAPA HiFi DNA Polymerase（dNTPsミックス付き）

セパレートタイプ（非ホットスタート）

KK2103 トライアルキット 20units ¥5,300

KK2101 100units ¥21,000

KK2102 250units ¥52,500

セパレートタイプ（ホットスタート）

KK2500 トライアルキット 20units ¥3,700

KK2501 100units ¥22,100

KK2502 250units ¥55,000

1億種類以上の独自変異株から選抜された全く新しいエンジニア酵素

増幅性と正確性を両立した新酵素採用

（融合タンパクではありません）

世界最高レベルの正確性と卓越した伸張性

（30秒 /kb）

ATリッチ、GCリッチなど増幅困難なテンプレートにも対応

PCR反応時間を最大75％短縮

キャンペーン期間：2014年3月末日まで

Cat.No. 包装単位 キャンペーン価格（税抜）

Cat.No. 包装単位 価格（税抜）

KAPA HiFi DNA Polymeraseは、

業界トップレベルの正確性と性能を誇るPCR酵素です。

収量、感度、スピード、

増幅困難なテンプレートへの対応・・・

全てにおいて卓越した性能を発揮します。

プラスミドやλDNAで18kbまで、

ゲノムDNAで15kbまでの増幅が可能です。 • 卓越した正確性　‒ TaqDNAポリメラーゼの100倍 ‒

• ATリッチ、GCリッチなど増幅困難なテンプレートにも対応

• PCR反応時間は最速レベルを実現

次世代シーケンス専用の増幅酵素もございます。お気軽にお問い合わせください。

Error rates of DNA polymerases and blends 4.5 kb 5.0 kb 7.5 kb 9.0 kb 11.0 kb

ng 50 5.0 0.5 50 5.0 0.5 50 5.0 0.5 50 5.0 0.5 50 5.0 0.5

卓越した正確性 高い増幅性と感度

最先端の新バッファーシステム採用により、正確性の求められるアプリケーションにおいては特にその性能が発揮されます。PCRエラーによるミス塩基の取り込み頻度（エラー率）は、実際にシーケンスして解析した結果、17,724,794塩基中、わずか5塩基でした。これはTaqDNAポリメラーゼの100倍、I社製品PHの40倍、A社製品PUの3倍、F社製品Pの2倍の正確性を示します。

long-range アプリケーション用として販売されている二種類のポリメラーゼがブレンドされた製品は、本当に正確性を求めるPCRには適していません。理由は、それらの酵素の正確性は、TaqPolymeraseのエラー率よりもわずか三倍優れているに過ぎないからです。KAPA HiFi DNA Polymerase においては、長鎖で増幅困難なテンプレートでも驚くべき伸張スピードと感度はもちろん、非常に正確性の高い結果をもたらします。

KAPA HiFi DNA Polymerase

KAPA HiFi HotStart Supplier F - Fusion technology10.0 ng 1.00 ng 100 pg 10.0 pg 1.00 pg 100 fg 10.0 fg 10.0 ng 1.00 ng 100 pg 10.0 pg 1.00 pg 100 fg 10.0 fg

Supplier I - Polymerase blend Supplier R - Polymerase blend

最高の感度と正確性

増幅困難なテンプレートにも対応

校正機能付きポリメラーゼの弱点は、ヌクレオチドのダメージやプライマーの劣化により感度が低くなってしまう事です。KAPA HiFi DNA Polymerase においては、感度が劇的に向上しており他社製品と比べても群を抜く性能を発揮します。

KAPA HiFi HotStartを使用し、λDNA(10 ng ～ 10 fgDNA /25μl反応)の10倍希釈系列から増幅された2kb断片を増幅。通常の3ステップサイクル（35 cycles）にて、すべてメーカーのプロトコルに従い反応を実施した。

KAPA HiFi DNA Polymeraseは、GC含量の多いターゲットにおいても変わらず強力に増幅します。

フュージョン技術を用いたエンジニア酵素とおよび野生型Pfuと、KAPA HiFiの性能を比較するために、66-84%に及ぶGC含有を伴ったヒトのアンプリコンパネルを用いた。

KAPA HiFiは、GC含有84％までのターゲットに対し最高収量を実現した。ヒトゲノムDNAからのGCリッチなDNA断片を、KAPA HiFi HotStart（上段）、二本鎖DNA結合ドメインを結合した校正機能付の他社製ポリメラーゼ（中段）、野生型Pfu（下段）にて増幅。増幅産物の GC含量は、右側(赤)になるほど多くなる。 すべて、メーカーの推奨プロトコルに従い反応を実施した。他社製ポリメラーゼにGCバッファーを添加、野生型Pfuでは5%DMSOを添加した。全てヒトゲノムDNA鋳型25 ngを含む。

Ⅰ社製品PH

Taq KAPAHiFiA 社製品PU

F社製品P

KAPA HiFi HotStart DNA ポリメラーゼHuman TGFBR2 mutation analysisによるKAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼの正確性の検証

製　 品　 名

アプリケーション

ポリメラーゼのエラー率の比較

次世代シーケンサー（Roche FLX）解析データ

I社製品P-H

酵素の種類正確性が高いエンジニア酵素

単一製品正確性が高い酵素と

Taqポリメラーゼの混合製品

総シーケンス数（塩基）

総シーケンス数/総エラー数（塩基）

エラー率

I社製品P-H

Taq A社製品P-U

F社製品Ph

KAPA HiFi DNAポリメラーゼは、KapaBiosystems社が開発した全く新しいエンジニアPCR酵素で、1億種類以上の野生型DNAポリメラーゼ変異株から選抜され、卓越した正確性と増幅性能を併せ持っています。

実際にこのような正確性が高いPCR酵素のエラー率を数値化するためには、「相当数のシーケンスを実施してエラー率を算出する」、「大腸菌にクローニングしてブルー /ホワイトコロニー選択によりエラー率を算出する」など、かなりの手間や時間が必要とされます。今回は「正確にPCR増幅することが困難な100ｂｐ程度の配列」を実際にPCR/シーケンス解析することで、実際にお客様の使い方に沿った方法で、KAPA HiFi DNAポリメラーゼの正確性を他社製品と比較しました。今回実施したHuman TGFBR2 mutation analysisでは、配列中にAが10連続するWildTypeと、Aが9連続するMutantを解析する必要がありますが、同一塩基が連続して存在することが原因となり、正確にPCR増幅することが困難となっています。この場合、PCR産物を用いたシーケンスにおいて、良好なシーケンス結果が得られなくなります。そこで、KAPA Biosystems社 KAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼを含め、様々な市販のPCR試薬を用いてこの配列をPCR増幅し、シーケンス解析によりどのPCR試薬が最も正確に増幅できたか検証しました。

下記の参考文献に基づき、Human TGFBR2 mutation analysisを実施しました。1）Markowitz S, Wang J, Myeroff L, et al. Inactivation et al, Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability, Science 1995;268:1336-1338.2）Yamashita S et al, Methylation Silencing of Transforming Growth Factor-β Receptor Type II in Rat Prostate Cancers, Cancer Res 68:2112-2121, 2008

＜PCR＞●プライマー配列　Forward AAGCTCCCCTACCATGACT　Reverse TGCACTCATCAGAGCTACAG●増幅サイズ　118bp●PCR試薬1 KAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼ2 F社 製品Ph（ホットスタート仕様）3 T社 製品Pr （ホットスタート仕様）4 T社 製品Ko（ホットスタート仕様）5 野生型Taq DNA Polymerase

*Data courtesy of Dr. Phillip Buckhaults, University of South Carolina

●テンプレートDNA　配列情報が明らかな、以下の２種類のヒト前立腺癌由来細胞株から　精製されたゲノムDNAテンプレートを用いました。　（1）22Rv1 （A9 / Mutant）　（2）LNCaP （A10 / Wild）●反応組成　各社の推奨条件どおり実施しました。●サーマルサイクラー　Bioer社 LifePro（グラジエント機能付き）●サイクルプログラム　各社の推奨条件どおり実施しました。　アニーリングの最適温度を決定するため、グラジエントPCRを実施しました。

正確性

低

高KAPA HiFi

はじめに

方　法

17,724,794

3,544,959

2.82 E-07

7,273,424

89,795

1.11 E-05

KAPA HiFiTM

2.50 E-5

2.00 E-5

1.50 E-5

1.00 E-5

0.50 E-5

0.00 E-5

2.4 E-5

1.1 E-5

7.6 E-74.4 E-7

2.8 E-7

＜シーケンス＞シーケンス用テンプレートは、市販のキットを用いてPCR産物を精製し、調製しました。2種類のテンプレート（22Rv1、LNCaP）に対し、Forward、Reverseそれぞれシーケンスしました。●プライマー配列　　Forward CCCCTACCATGACTTTATTCT 　　Reverse TCATCAGAGCTACAGGAACAC

結　果

＜シーケンス＞

1 KAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼ2 F社 製品Ph（ホットスタート仕様）3 T社 製品Pr （ホットスタート仕様）4 T社 製品Ko（ホットスタート仕様）5 野生型Taq DNA Polymerase

＜PCR＞それぞれのPCR試薬についてグラジエントPCRを実施し、非特異増幅が見られず、最も増幅効率が良い最適アニーリング温度が決定されました。その結果、全てのPCR試薬で、最適条件により良好なPCR結果が得られました。シーケンス用テンプレートには、それぞれの最適条件で実施したPCR産物を使用しました。

KapaHiFiHotStartで最も良好な増幅が見られました。

LNCaP（A10）のデータ

10 20 30 40 50 60 70 80ANC T C T CTCC A AG TGC AT TATG AAG G AAAAAAAAAA GC C T G G TG AG AC T T T C T T C A T G T G T T C C T G TA G C T C T G A T G A G T G CA A A N

10 20 30 40 50 60 70 80GGAATC T C T CTCC A AG TGC AT TATG AAG G AAAAAAAAAA GC C T G G NG AG AC T T T C T T C A T G T G T N C C T G TA G C T C T G A T G A G T G CA A N

10 20 30 40 50 60 70 80C T C T CTCC AA G TGCAT TATGAAG GAAA A AAAAA GCC T G G TG A G AC T T T C T T C A T G T G T T C C T G TA G C TC T G A T GA G T GCAA A

10 20 30 40 50 60 70 80G A A C T C T C CC A A G TGC A T T A T G A AG G A AA A A AA A A AC C C N G G G N N NC C T T N C TC C N N G N G T C C C N G NA C C C C N N A N N A N N N CA A A N

10 20 30 40 50 60 70 80G N A A C TGC T C TCC A AG TGC A T T A T G A AG G A A A AA A A A A AN C C N G G N G AG AC T T N C T N CA N G T G T N C C T G T A N C N C T G A T G A G N G CA A N

KAPA HiFi HotStart DNAポリメラーゼ

F社 製品Ph（ホットスタート仕様）

T社 製品Pr（ホットスタート仕様）

T社 製品Ko（ホットスタート仕様）

野生型Taq DNA Polymerase

LNCaP（A10）のデータ

M 1 2 3 4 5

118bp

謝辞今回の検証実験で実施したHuman TGFBR2 Mutation Analysisにおいて、独立行政法人国立がん研究センター研究所エピゲノム解析分野　山下聡先生に数多くのご指導・ご助言を賜りました。ここに深く感謝申し上げます。

A10

A9

A10

A10

A10

KAPA

バックグラウンドが低く、非常に良好なシングルピークが得られました。また、A10の連続が確認されました。

Aが連続したところで、スリッピング（誤複製）が起り、その後のシーケンスデータのバックグラウンドが高くなっています。また、T社製品PrではAの連続が9となっています。

以上の結果から、KapaHiFiHotStartが最も良好なPCR増幅を示しました。かつ、シーケンスでも、４条件：”テンプレート２種類×両鎖”とも、スリッピング（誤複製）が少なく、最も正確なシーケンスデータが得られました。（データはLNCaPのForward解析のみ掲載）

KP2011APRHIFI

国立国際医療研究センターエイズ治療研究開発センター蜂谷敦子様、城谷茜様のコメントReady mixということで試薬の調整が簡便であり、またHot startが可能でしたので、とても使いやすかったです。RT領域を比較すると、L社では全く検出できなかったが、KAPAではT社と同様、すべて検出が可能であった。PR領域では目的とするバンドの検出が可能であった。

サンプル：ヒト血漿由来ゲノムDNA

HIV-1 Drug Resistance Assay

129* 561 613 890 927 NMPR RT

129 890 167 262 507 539 860 933 971 N

T社 高正確性DNA polymerase

KAPA HiFi HotStart Ready Mix

L社 野生型TaqDNA polymerase

129～971 ：サンプル N ：NTC M ：100bp ladder

HIV薬剤耐性試験として、PCR増幅後sequence解析を行い、薬剤のターゲットとなる部位にアミノ酸変化が生じたかどうかを確認しています。この用途において、2nd PCRで安定して産物が得られる酵素を検討しました。

PR：HIVのプロテアーゼ領域RT：HIVの逆転写酵素領域

*サンプル129について本検討においては３社全ての酵素で解析できなかったが、追試験ではKAPA HiFi HotStart Readymixで増幅され、解析が可能であった。（データ未掲載）

KAPA HiFi HotStart ReadyMix（KK2601）HIV薬剤耐性検査

製　 品　 名

アプリケーション

ヒト癌細胞由来ｃDNAサンプルからの標的遺伝子のクローニング

ヒト平滑筋細胞由来cDNAサンプルからの特定遺伝子のクローニング

他にも多数アプリケーションノートがございます。 （当社WEBよりダウンロード可能）

増幅させた遺伝子（1000bｐ）のGC含量は、全体では65%ほどですが、一箇所250bpほど90%近い（87%）GC richな部分がありました。そのせいで、他の酵素ではなかなか増幅されず、また、シーケンスでその部分だけ抜けてしまったり、ミスしていたりすることがありました。KapaHiFiHotStartReadyMixでは、30サイクルくらいで他の酵素を用いたときと同程度の増幅が確認できました。また、最終的にクローニングを行い、DNAシーケンスで配列を確認すると、ミスは全くありませんでした。校正機能つきのミックスなので、安心して使えお手軽なことは嬉しい限りです。入ってきたばかりの学生に実験を行ってもらったものではあるが、簡単に出来たので喜んでいました。

これまで、クローニングではT社高正確性酵素を中心に使用してきた。今回、KAPA HiFiを使用したところ、T社高正確性酵素と比較して速いスピードで増幅が可能であり、また、長鎖（3.9kb）のクローニングが可能であった。さらに、シーケンス解析により高い正確性が確認でき、クローニング用の酵素として有用であると思われる。

お客様のコメント

お客様のコメント

10PR1310D37K

本 社 ： 〒112-0004 東京都文京区後楽1丁目4番14号 後楽森ビル18F Tel. 03（3813）0961・ Fax. 03（3813）0962西日本営業所 ： 〒604-8277 京都府京都市中京区西洞院通御池下ル565番地 ラフィーネ御池3F Tel. 075（257）5421・ Fax. 075（257）5422

http://www.n-genetics.com

価格は2013年10月現在のものです。製品は改良のため予告なく変更する場合があります。

2013-03