NAMA : Adi Nugraha

NIM : 31111001

KELAS : Farmasi 4 A

Analisis Zat Aktif Dari Sampel Sediaan Farmasi Dengan Menggunakan Metode HPLC (High

Performance Liquid Chromatography)

Analisis suatu senyawa obat perlu dilakukan dalam setiap sediaan farmasi, hal ini

dilakukan untuk menentukan ada atau tidaknya senyawa tersebut, kepastian senyawa tersebut,

serta kadar senyawa (zat aktif) tersebut dalam sediaan farmasi agar nantinya sediaan tersebut

dapat memberikan efek farmakologi yang diharapkan. Pengujian senyawa tersebut dapat

dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengujian kualitatif dilakukan untuk mengetahui

ada atau tidaknya senyawa tersebut, pengujian dapat menggunakan reagen – reagen kimia,

maupun alat – alat instrumen yang ada. Misalnya menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC), KCKT merupakan teknik

pemisahan yang digunakan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu

sampel. KCKT berguna untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun

senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), penentuan molekul – molekul netral,

ionik, maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa – senyawa

yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa – senyawa dalam jumlah kecil dan

banyak, serta dalam sekala proses industri. Metode KCKT juga memiliki keterbatasan,

diantaranya untuk identifikasi senyawa – senyawa kecuali bila detektor dimodifikasi dengan

cara dihubungkan ke spektrofotometer massa (MS). Keterbatasan lain apabila sampel sangat

komleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh. (Rohman, 2007)

KCKT juga memiliki beberapa keuntungan diantaranya:

1. Kecepatan, waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat

dilakukan dengan waktu 15 – 30 menit, bahkan analisis yang tidak rumit hanya

memakan waktu kurang dari 5 menit.

2. Daya pisah, berbeda dengan KG, KCKT mempunyai dua fase tempat terjadinya

interaksi. Kemampuan zat padar berinteraksi secara selektif dengan fase gerak pada

KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

3. Sensitivitas detektor, detektor serapan UV yang digunakan dalam KCKT dapat

mendeteksi berbagai jenis senyawa dalam jumlah nanogram (10-9 gram). Detektor

seperti Massa, Indeks Bias, Radiometri, dll dapat digunakan dalam KCKT.

4. Kolom yang dapat digunakan kembali, berbeda dengan kromatogrfi klasik. Pada

KCKT kolom dapat dimodifikasi sesuai analisis, kolom dapat diganti dengan fase

polar (C8) dan fase nonpolar (C18) dan pertukaran ion. Biasanya kolom C18 banyak

digunakan karena analisisnya lebih mudah.

5. Molekul besar dan ion, senyawa – senyawa yang memiliki volatilitas rendah dapat

dianalisis oleh KCKT dengan jenis ekslusi dan perukaran ion ideal untuk

menganalisis molekul besar dan ion.

6. Mudah memperoleh cuplikan kembali, sebagian besar detektor yang digunakan pada

HPLC tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel sehingga sampel dapat

dikumpulkan kembali setelah analisis. Pelarut atau eluen dapat dihilangkan dengan

cara menguapkannya kecuali untuk detektor penukaran ion yang memerlukan

prosedur khusus.

Gambar Instrumen HPLC

Tahapan analisis suatu sampel obat dengan instrumen berupa:

Ekstraksi sampel dilakukan untuk memisahkan zat aktif yang ada pada sediaan

farmasi dari matrik atau eksipien, hal ini dilakukan agar pada saat analisis matrik tidak

mengganggu. Banyak matrik dari sediaan yang beragam sehingga proses ekstraksi perlu

dilakukan, matrik yang ada dapat berupa senyawa polar maupun non polar dan hal tersebut

dapat mengganggu analit berinteraksi dengan kolom. Proses ektraksi ada beberapa macam

yaitu ektraksi padat cair dan cair cair. Pada dasarnya prinsip kerja HPLC yaitu pemisahan

analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan

Sampel Ekstraksi zat aktif dari matrik

Zat aktif Analisis dengan Instrumen

larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi

lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran

analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor

(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-

puncaknya terpisah. Syarat lain suatu senyawa dapat dianalisis adalah ukuran partikel harus

kecil yaitu sekitar 045 µm dan bentuk sampel harus berupa larutan, agar nantinya sampel

dapat dibawa oleh eluen masuk ke dalam kolom yang dibantu dengan pompa bertekanan

tinggi.

Uji kualitatif, kuantitatif, dan interpretasi hasil HPLC analisis sampel dilakukan

dengan cara membandingkan waktu retensi (Time Retension), area bawah kurva (Area Under

Curve) dari sampel dengan pembanding zat aktif yang dianalisis.

Contoh Hasil Kromatogram

Gambar diatas merupakan contoh hasil kromatogram dari suatu sampel yang

dianalisis oleh instrumen HPLC, didapatkan TR dan AUC dari analisis tersebut. TR

merupakan parameter utama untuk pengujian kualitatif dengan instrumen tersebut, dimana

TR dari Standar Baku dibandingkan dengan TR Sampel. Apabila TR sama atau hampir sama

maka bisa dikatakan sampel tersebut merupakan zat aktif A, tiap zat akan menghasilkan TR

yang berbeda – beda karena kemampuan suatu zat berikatan dengan kolom berbeda.

Misalnya apabila kita menggunakan kolom fase terbalik (kolom C18 ) maka senyawa dengan

kepolaran tinggi akan terbawa lebih dahulu oleh eluen melewati kolom dan masuk ke

detektor. Pada detektor tiap senyawa akan dihitung jumlah kadarnya dan menghasilkan AUC,

luas AUC akan dianggap sebagai jumlah kadar senyawa yang diperiksa. Contoh perhitungan

AUC:

A. Standar Zat Aktif A

Nama zat Bobot (mg) Faktor pengenceran

Volume penyuntikan

Respon puncak (area)

A 50 50/0,5 x 50 20 μl 2359907450/1 x 50 3641511150/2 x 50 5253550350/3 x 50 6810494050/4 x 50 83579926

B. Data larutan sampel

Nama sampel Bobot (mg) Faktor pengenceran

Volume penyuntikan

Respon puncak (area)

X 3,2 g 10 kali 20 μl 36745298

C. Perhitungan

X(μg/ 20 μl) Y (AUC) XY X2

0,2008 23599074 4738694,0592 0,40160,4016 36415111 14624308,5776 0,80320,8032 52535503 42196516,0096 1,60641,2048 68104940 82052831,7120 2,40961,6064 83579926 134262793,1264 3,2128

jumlah 0,84336 52846911 55575028,6970 1,6867

a=n∑ ( XY )−(X )(Y )

n∑ ( X2 )−¿¿

¿5 (55575028,6970 )−(0,84336)(52846911)

5 (1,6867 )−(0,84336) ¿

¿ 277875143,485−44568970,6928,434−0,711

¿ 233306172,7937,722

= 30211834,062

b=n∑ (X 2)(Y )−(X )(XY )

n ∑ ( X 2)−¿¿

¿5 (1,6867 ) (52846911 )−(0,84336 ) (55575028,6970 )

5 (1,6867 )−(0,84336) ¿

¿ 445689706,923−46869756,2028,434−1,687

¿ 398819950,7216,747

=59111759,913

Y= bX + a

Y=59111759,913 X + 30211834,062

36745298 = 59111759,913 X + 30211834,062

X=36745298−30211834,06259111759,913

X= 6533463,93859111759,913

X=¿0,110527312

Kadar Zat A

= BM As . benzoatBM Na . benzoat

x X

Berat sampel x faktor pengenceran x

1000vol penyuntikan

x 98

%

= 122,12

144 x

0,1105273123,25

x 10 x 1000

20 x 98 %

= 14535,872 mg/kg

Dari contoh perhitungan diatas dapat disimpulkan bahwa senyawa A memiliki kadar

sebesar 14535,872 ppm.