Kehidupan dan Kematian di dalam Plak AterosklerotikTujuan Ulasan Perubahan massa sel dalam aterosklerosis menunjukkan perubahan yang terjadi dalam pembelahan sel, kematian sel dan migrasi/emigrasi sel, semuanya yang dapat muncul secara bersamaan dalam tipe sel yang berbeda pada waktu yang berbeda serta pada daerah yang berbeda dari sebuah plak. Hal ini menyebabkan pengukuran terhadap proses-proses individual ini serta pengukuran terhadap kinetik sel secara keseluruhan dalam proses aterosklerosis menjadi sangat sulit. Ulasan ini akan menunjukkan masalah-masalah yang berhubungan dengan menentukan proliferasi sel dan kematian sel, serta bagaimana proses-proses tersebut berhubungan dengan perubahan kinetik sel secara keseluruhan dan pengukuran umur biologis.

Temuan Terbaru Pembelahan sel dan kematian sel telah ditelaah secara rutin pada proses-proses spesifik dengan menggunakan penanda-penanda penentu-penyakit dan

nonspesifik. Penelitian-penelitian terbaru telah berpindah pada pemeriksaan secara kumulatif yang dapat mengukur tingkat secara keseluruhan melalui waktu, sehingga menghasilkan temuan umur biologis atau riwayat replikasi dari sebuah jaringan atau sel.

Kesimpulan Kompleksitas proses yang terlibat dalam pemeriksaan perubahan-perubahan kinteik sel pada aterosklerosis berarti bahwa kita harus bergerak menuju pemeriksaan kumulatif dari proliferasi sel, kematian sel dan penuaan biologis yang dapat diukur menggunakan kerangka waktu saat terjadinya aterosklerosis, dan untuk penelitian-penelitian yang secara selektif memanipulasi salah satu proses dalam tipe sel tunggal tanpa mempengaruhi proses lainnya.

Pendahuluan Plak aterosklerotik manusia adalah struktur yang dinamik. Walaupun plak membutuhkan waktu lebih dari satu dekade untuk terbentuk, peningkatan jumlah sel (yang diatur oleh proliferasi sel dan migrasi) dan penurunan jumlah sel (yang diatur oleh kematian sel dan kemungkinan emigrasi) adalah proses yang tetap.

Meskipun demikian, kita berpikir kita dapat mengukur frekuensi proliferasi sel dan kematian sel pada tipe sebuah sel pada waktu tetentu, namun terdapat masalahmasalah yang berhubungan dengan mengukur kinetik sel secara keseluruhan pada plak seiring dengan waktu. Terdapat juga miskonsepsi yang menetap dengan pengukuran-pengukuran yang telah dilakukan. Kinetik Sel Proliferasi sel adalah yang paling sering diukur menggunakan penanda yang dimasukkan ke dalam DNA pada fase S-phase (contoh,3

H-thymidine,

bromodeoxyuridine), atau protein yang berhubungan dengan sintesis DNA [contoh, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), Ki67]. Walaupun masingmasing penanda dapat menghasilkan persentase sel yang mengekspresikan penanda, angka-angka tersebut adalah gambaran frekuensi atau indeks proliferasi. Frekuensi ini tidak dapat digunakan untuk menggambarkan tingkat proliferasi melalui waktu yang dibutuhkan untuk berkembangnya plak. Pada banyak kasus, waktu yang dibutuhkan untuk terjadi proliferasi dan persentase siklus sel yang ditandai dengan teknik in vivo masih belum diketahui. Kesimpulannya, hanya karena satu sel membutuhkan waktu tertentu untuk mengalami mitosis in vitro di bawah kondisi tertentu, kita tidak dapat mengasumsikan waktu yang serupa terjadi pada in vivo.

Proliferasi sel Secara alternatif, proliferasi sel dapat dihitung dari studi massa sel, dimana perubahan pada jumlah sel diantara dua titik waktu sudah diketahui. Hal ini memperkirakan bahwa proses lain yang mengatur isi sel adalah tetap. Walaupun penghitungan ini dapat dilakukan in vitro, hal ini jarang dapat dilakukan dalam model hewan atau penyakit. Pengukuran secara bersamaan dari kinetik prosesproses yang mengatur massa sel di dalam lingkungan kompleks dari plak aterosklerotik sangat sulit dan jarang dicoba. Pemeriksaan proliferasi yang kumulatif telah dikembangkan untuk menghindari masalah tersebut. Pemeriksaan-pemeriksaan ini mengukur umur biologis dari sebuah jaringan atau sel, berdasarkan jumlah pembelahan sel yang telah terjadi. Contoh paling baru mengenai teknik seperti itu adalah pemeriksaan akumulasi14

C yang telah

dilepas ke atmosfer pada saat tes inti [1**]. Pekerja-pekerja ini menemukan bahwa inti nekrotik adalah adalah area tertua dari plak (12.9 3.0 tahun), regio bahu menengah (9.8 4.5 tahun), dengan regio kepala paling muda (6.4 3.2

tahun). Analisis aktivitas proliferatif dan tingkat apoptosis menunjukkan tidak ada tanda-tanda peningkatan aktivitas seluler pada kepala, menunjukkan bahwa isi14

C yang lebih rendah menggambarkan pembentukan plak pada waktu yang

lebih baru.

Keterbatasan yang menetap dari pemeriksaan adalah perkiraan bahwa tidak terdapat kehilangan dari sel atau isotop, sebagai contoh akibat kematian sel atau dilusi menjadi protein-protein non-seluler, dan aktivitas serupa dari protein nonseluler terjadi pada daerah yang berbeda dari plak. Hal ini tidak khas pada plak dimana sejumlah tipe sel mengsintesis matriks dan mensekresi matriks metalloproteinase. Sebagai tambahan, pemeriksaan ini hanya mengukur rerata umur biologis dari contoh jaringan komponen individu dari plak bisa jadi lebih tua atau lebih muda. Hal ini secara khusus dapat diaplikasikan pada daerah plak yang lebih superfisial, dimana migrasi monosit (sel termuda) terjadi pertama kali. Kebalikannya, seiring plak menjadi lebih berkembang, kepala mereka yang fibrous menjadi lebih tipis dengan hilangnya vascular smooth muscle cells (VSMCs). VSMCs pada kepala fibrous terdiri dari kompononen-komponen kecil dari plak simtopmatik, yang kemudian diperkirakan lebih tua dengan aktivitas yang lebih lambat. Umur biologis dapat juga diukur dengan tingkat kehilangan telomere seiring dengan waktu, dengan memperkirakan kehilangan telomere yang tetap setiap pembelahan sel. Telomere terdiri dari pengulangan pada akhir kromosom yang memendek pada setiap pembelahan. Pada manusia, kehilangan telomere beragam sesuai dengan lokasi arteri, dan pada beberapa pembulu darah tidak ada kehilangan telomere yang signifikan dengan umur, menunjukkan aktivitas sel yang sangat rendah. Meskipun demikian, terdapat heterogenesitas yang dapat ditandai pada panjangnya telomere dari tipe sel yang berbeda pada plak daerah yang sama, dan tipe sel yang sama pada daerah yang berbeda dari plak yang sama. Sebagai conttoh, kepala fibrous VSMCs diperkirakan telah mengalami 713 doubling tambahan yang ekuivalen dibandingkan dengan sel pada media yang tidak terlihat (Gambar 1). Heterogenesitas seperti ini mendukung konsep bahwa pemeriksaan jaringan secara keseluruhan (seperti inkorporasi dapat mengukur umur biologis dari sel individual.14

C) tidak

Kematian Sel Masalah yang sama timbul saat memeriksa kematian sel. Cara yang umum dari kematian sel, apoptosis, nekrosis, dan autofagi diatur secara berbeda (dengan jalur yang tumpang tindih diulas pada [4]), sehingga mempunyai penanda in vivo yang berbeda. Apapun cara kematiannya, penanda kematian sel [sebagai contoh Terminal deoxynucleotidyl transferasse biotin-dUTP Nick End Labeling (TUNEL), cleaved caspase 3] dapat mengukur frekuensi, menandai titik atau durasi berbeda dari proses, dan bahkan dapat positif pada sel lama setelah proses telah selesai, sebagai contoh, jika badan apoptotik belum bersih [5]. Penemuan ini penting dalam menjelaskan perubahan pada frekuensi kematian terhadap perubahan pada apoptosis atau pembersihan badan apoptotik; pembersihan adalah proses kinetik yang perlu diukur paling tidak pada dua titik waktu yang berbeda untuk tingkat yang bisa dihitung, dan memperkirakan tidak adanya perubahan pada pembentukan badan, serta tidak adanya perubahan pada durasi proses yang ditandai. Kami akhir-akhir ini menjelaskan sistem dimana kinetik dari pembershan VSMC dapat diperkirakan in vivo. Sistem ini bergantung pada rangsangan yang single, terbentuk, dan terbatas waktu untuk menginduksi apoptosis. Kami menemukan bahwa waktu paruh dari pembersihan badan apoptotik di dalam dinding pembuluh darah adalah kira-kira 3 hari, dimana hal ini dapat dihambat dengan pemberian makanan lemak pada hewan [6**]. Hal ini mengkonfirmasi bahwa frekuensi apoptosis yang diobservasi tergantung pada tingkat pembentukan dan tingkat pembersihan (clearance). Gambar 1 Imunohistochemistry gabungan dan hibridisasi fluoresensitelomere in-situ Gambar menunjukkan sinyal telomere (pink) pada inti sel (biru), ekspresi -SMA (hijau) untuk mengidentifikasi VSMCs, dan laminae elastika (kuning), pada media plak aterosklerotik manusia. SMA, smooth muscle actin; VSMCs, vascular smoot muscle cells.

Frekuensi kejadian Di sampung migrasi/emigrasi, proses seluler yang paling umum dilaporkan berkontribusi pada massa jaringan aterosklerosis dalah proliferasi sel,

senescence (proses penuaan), dan kematian sel.

Proliferasi sel Proliferasi sel rendah pada pembuluh darah normal [7,8], hal ini menunjukkan waktu aktivitas pada media yang diukur bertahun-tahun. Frekuensi proliferasi sel meningkat pada aterosklerosis, memuncak pada lesi awal tipe II dan menurun pada lesi tipe V, walaupun puncak sintesis DNA kedua muncul pada plak yang ruptur [9]. Karena paling mungkin diidentifikasi, sintesis DNA paling sering didapat dari sel busa yang diambil dari makrofag, khususnya pada daerah bahu dan area yang mengalami ruptur plak, walaupun proliferasi VSMC lokal muncul setelah ruptur plak atau disrupsi [10]. Meskipun demikian, kehilang telomere muncul bahkan pada atherosklerosis awal, menunjukkan bahwa proliferasi sel tidak dapat disamaratakan. Sejalan dengan ini, terdapat bukti proliferasi selektif pada aterosklerosis, baik pada patch sel intima yang telah ditentukan secara perkembangan, rekruitmen selektif VSMCs dari fenotip yang spesifik, atau alterasi genetik pada sejumlah kecil sel, yang berujung pada ekspansi klonal yang diobserbasi pada plak [11]. Selanjutnya VSMCs pada daerah-daerah yang berbeda berproliferasi pada laju yang sangat berbeda, pada waktu yang berbeda pada saat aterosklereosis. Penuaan sel Penuaan replikatif diartikan sebagai kemunduran yang irreversibel dari siklus sel, memproduksi berhentinya pertumbuhan yang tidak responsif terhadap mitogen. Secara definisi, penuaan membutuhkan tidak adanya proliferasi sel. Meskipun demikian, kebanyakan sel pada dinding pembuluh darah yang normal atau penyakit tidak membelah, namun mampu untuk memlah di bawah rangsangan yang tepat. Tidak adanya pembelahan sel bukan merupakan penanda penuaan sel yang pasti. Walaupun penanda positif dari penuaan sel sudah ada, kebanyakan merupakan penanda kerusakan DNA atau regulator siklus sel negatif, atau tidak spesifik untuk penuaan sel. Senescence-associated -galactosidase (SAG) adalah enzim yang sensitif terhadap pH dimana aktivitasnya meningkat ketika sel menjadi menua, dimana paling utama disebabkan oleh peningkatan massa lisosomal pada sel-sel tua [12]. Peningkatan jumlah sel SAG-positif dapat dilihat di aterosklerosis, termasuk pada model hewan dari penyakit vaskuler. Meskipun demikian, perhatian signifikan perlu dilatih dalam menggunakan penanda ini saja untuk

melihat penuaan sel. Pada sel-sel tikus, terdapat hubungan yang tidak konsisten antara pemendekan telomere atau disfungsi, pemberhentian repliatif, dan positifitas SaG. Walaupun hubungan ini lebih konsisten pada sel manusia, telah menjadi rekomendasi bahwa multipel positif (SaG, p21, p15/16, pemendekan telomere) dam negatif (tidak adanya penanda proliferasi) digunakan untuk menentukan sel yang menua pada pembuluh darah in vivo.

Panjangnya telomere melebihi titik yang ditentukan sering digunakan sebagai penanda untuk penuaan sel. Jika dapat ditunjukkan bahwa sel individual in vivo mempunyai panjang telomere di bawah panjang yang dilihat pada sel-sel tua in vitro, maka dapat diperkirakan bahwa sel tersebut tua in vivo. Meskipun demikian, kebalikannya tidak dibenarkan. Penuaan sel disebabkan baik oleh kelelahan replikatif dan stres sel termasuk kerusakan DNA dan ekspresi onkogen [stress-induced premature senescence (SIPS)]. Penuaan sel dapat muncul secara in vitro dan in vivo tanpa kehilangan telomere yang signifikan atau disfungsi. Sebagai contoh, stress oksidatif dapat menyebabkan SIPS dan kehilangan telomere yang dipercepat pada sel [3]. Pada VSMCs plak manusia, pemendekan telomere yang relatif, berhubungan lebih dengan aterosklerotik, hal ini kemungkinan karena perbedaan pada panjang telomere di antara individu satu dengan yang lain [3].

Kematian sel Cara utaman kematian sel yang diidentifikasi pada plak aterosklerotik adalah apoptosis, nekrosis, dan autofagi.

Apoptosis Apoptosis adalah kejadian yang tidak umum terjadi namun penting pada aterosklerosis. Frekuensi apoptosis hanya meningkat pada lesi lanjut (lesi tipe IVVI), paling utama pada inti lipid, atau rata terbagi antara inti lipid dan daerah yang mengalami ruptur plak [9]. Walaupun kebanyakan sel yang dapat teridentifikasi adalah makrofag, banyak sel mati tidak dapat diidentifikasi, karena penanda VSMC di down-reglasi di plak dan apoptosis sendiri dapat berujung pada hilangnya penanda. Seperti disebutkan diatas, frekuensi apoptotik sulit dikonversi dalam bentuk tingkat atau laju, karena waktu yang dibutuhkan untuk timbulnya

apoptosis dan persentase dari proses yang ditandai dengan sistem deteksi masing-masing (seperti TUNEL, CC3) secara in vivo masih belum diketahui. Nekrosis Nekrosis ditandai dengan pembengkakan sel, disrupsi organella, ruptur membran dan inflamasi, sebagian untuk melepas sitokin-sitokin proinflamatorik interseluler. Transimis analisis mikroskopik elektron dari plak karotid manusia menunjukkan bahwa banyak sel degenerasi yang mempunyai ultrastruktur yang mirip dengan kematian nekrosis [13], dan nekrosis sekunder yang mengikuti apoptosis juga kemungkinan muncul akibat pembersihan yang tidak efektif dari badan apoptotik pada plak [5, 6**]. Meskipun demikian, frekuensi sel nekrotik sulit dikonversi menjadi tingkat atau laju, karena waktu yang dibutuhkan dan penanda spesifik untuk nekrosis secara in vivo belum divalidasi penuh. Autofagi Autofagi ditandai dengan adanya vakuola autofagi yang bergabung dengan lisosom untuk membentuk autofagolisosom di dalam sel-sel yang akan mati yang bertanggung-jawab terhadap degradasi-sendiri. Autofagi terlibat baik pada aktivitas normal protein dan organella dan respon sel terhadap stress dan starvasi. Autofagi dapat dipicu dengan akumulasi organella yang rusak sebagai akibat penuaan atau ikutan stress eksternal seperti hipoksia, dan sel yang rusak irreversibel yang kemudan mengalami apoptosis.

Pada saat ini, peran dan frekuensi autofagi pada aterosklerosis masih tidak diketahui, sebagian hal ini disebabkan karena kami kurang dalam penanda yang diekspresikan secara berbeda yang dapat dipercaya, dan saat ini bergantung pada transmission electron microscopy (TEM) yang menunjukkan indentifikasi definitif (14, 15*]. TEM dalam memisahkan VSMCs pada kepala fibrous di plak eksperimental atau manusia menunjukkan gambaran autofagi seperti

pembentukan gambaran myelin dan vakuolisasi yang berat (Gambar 2) [15*]. Autofagi diregulasi dengan kaskade yang menyeluruh dari protein-protein yang berinteraksi (diulas pada [15*]), yang paling spesifik muncul adalah beclin-1 dan LC3-II. Protein dari plak manusia yang berkembang namun bukan arteri mamalia non-aterosklerotik menunjukkan peningkatan level LC3-II [sebuah bentuk yang diproses dari protein yang berhubungan dengan mikrotubuli yaitu light chain 3

(LC3)], menunjukkan adanya autofagi saat atherogenesis. Meskipun demikian, VSMC pada kultur sering menunjukkan level tinggi dari LC3-II [15*].

Seperti yang dituliskan di atas, terdapat tumpang tindih yang signifikan antara gambaran dan regulasi bentuk-bentuk kematian sel ini. Sebagai tambahan, terdapat hubungan yang beragam untuk melepaskan mediator inflamatorik, sebagian diakibatkan oleh aktivasi multimolekuler intraseluler komplek dengan caspase-1 aktif yang diketahui sebagai inflammasome. Inflammasome protein seperti NOD-like receptors (NLRs) terhubung secara rumit pada respon proinflamatorik maupun pada apoptosis dengan aspek-aspek proinflamatorik [16]. Apoptosis secara tradisional diperikrakan diam terhadap sistem imun, Kebalikannya, bentuk NLR-induced dari apoptosis-pyroptosis (caspase-1 dan ASC dimerization-dependent) dan pyronekrosis (ASC-dependent kecuali

caspase-1-independent) adalah bersifat inflamatorik, dan membagi sifat yang sama dengan nekrosis [17]. Baru-baru ini, kristal kolesterol pada aterosklerosis telah diketahui mengaktifasi inflammasome [18]. Hal ini secara potensial dapat mengatur kematian sel dan inflamasi secara bersamaan. Pada saat ini, frekuensi dan peran dari apoptosis-pyroptosis dan pyronekrosis pada aterosklerosis masib belum diketahui.

Gambar 2 Penampakan mikroskop elektron dari sel otot polos pembuluh darah yang sedang mengalami apoptosis atau autofagi Sel otot polos pembuluh darah mengalami apoptosis in vitro (a), menunjukkan kondensasi perifer dari kromatin inti dan pembengkakan membran yang intens dan pembentukan vesikel, atau sedang mengalami autofagi in vivo (b), menunjukkan pembentukan badan lamellar yang tipikal. Diadaptasi dengan ijin dari [4]. Efek perubahan jumlah otot polos pembuluh darah (vascular smooth muscle) Walaupun tingkat proliferasi VSMC dan kematian sel adalah rendah (